informe molecular maca

7/27/2019 Informe Molecular Maca

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UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y FORESTALES

BIOTECNOLOGA

INFORME DE LABORATORIO DE PCR Y ENZIMAS

DE RESTRICCION

MACARENA ABARZUABEATRIZ AVENDAO

MATIAS BAHAMONDE ECHEVERRIANICOLAS MILLAHUEQUE

GRISELLE PROBOSTE

ALEJANDRA SANDOVALANA GUTIERREZ

BIOLOGIA MOLECULAR

TEMUCO CHILE

2012


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PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa).

La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica que se basa en

sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una

polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene

de la bacteria thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79C a 85C),

de ah su nombre comercial ms conocido: taq polimerasa. En la reaccin de

PCR se sintetiza el ADN y en un tubo se mezclan todos los ingredientes

necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos

estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar, los

oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores, oligos,

etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las

condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH,

determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden

necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa).

La amplificacin in vitro del DNA se logra en tres pasos bsicos:

a).-Desnaturalizacin del DNA a copiar (molde o diana). Ello se consigue

incrementando la temperatura para separar las dos cadenas que componen la

doble hlice del DNA.

b).-Hibridacin o apareamiento de los cebadores u oligos al DNA molde.

Para ello se baja la temperatura de reaccin, de forma que pequeas

secuencias de DNA de cadena sencilla (tpicamente, entre 10 y 30 bases o

meros) se unan a sus secuencias complementarias del DNA diana. Cada unode ellos se une a una de las cadenas del DNA diana, de forma que sus

extremos 3OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la secuencia a

amplificar.

c).- Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando

la temperatura de la reaccin a la ptima de la polimerasa de DNA utilizada.

Cada uno de los extremos 3OH de los oligos apareados a las cadenas directa

y reversa sern extendidos, generndose las cadenas hijas correspondientes.

El resultado son dos hlices completas Watson & Crick en la regin delimitada

por los oligos. Dicho de otra forma, se duplica el nmero inicial de molculas

de DNA.

Estos tres pasos de desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repiten

n veces, duplicndose en cada ciclo el nmero de cadenas delimitadas por

los oligos. Se trata, pues, de una amplificacin exponencial o logartmica, en

que las cadenas previamente sinterizadas pueden servir de molde a futuras

amplificaciones.


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Componentes de la reaccin.

Nucletidos (dNTPs 10Mm):

Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo

con 10mM Tris pH 7,7- 8,0, concentracin final). Si no, un pH cido promover

la hidrlisis del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de

polimerizacin de la DNA enzimtica. Los stocks son diluidos a 10 mM,

alicuotados y almacenados a -20 C.

Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.

La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR, es de tal

manera que aproximadamente el 50% permanece como dNTP despus de 50

ciclos.

Primers (forward y reverse):

Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios

que se unen a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.

La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin

en cadena de la polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio.

Criterios principales:

- Tamao ideal es de 20-25 nucletidos de longitud pero generalmenteson de 18-30 nucletidos.

- La base en el extremo 3 debe ser una G o C.- Temperatura de fusin 50-65 C.- El contenido GC debe ser de 40-60%.- La auto complementariedad debe ser evitada, para evitar la formacin

de estructuras secundarias y los dimeros de primer.

- Debe tener un 100% de apareamiento con el molde.

Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe

ser relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el

cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia

que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb

despus de la regin que codifica.


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Altas concentraciones de primer pueden incrementar la posibilidad de generar

un templado independiente llamado dimero de primer. Los productos no

especficos y los dmeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y

compiten con el producto deseado por la enzima, dNTPs y primers, resultando

en un bajo rendimiento del producto deseado.

Primers universales: (T7 Fw- SP6 Rv).

Templado:

Una de las caractersticas ms atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad

de la muestra de DNA sujeta a amplificacin no necesita ser alta. El criterio

esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que

abarque la regin que va a ser amplificada y que las impurezas sean

suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerizacin.

Taq DNA polimerasa:

Una ADN polimerasa es una holoenzima que utiliza los dNTPs para alargar el

terminal 3' de un primer complementado a una molcula de ADN que utiliza

como plantilla o molde.

Su temperatura ptima, en que se observa su actividad mxima, es entre 75 y

85 C

Todas las ADN polimerasa conocidas sintetizan el ADN en la direccin 5' a 3'.

Ninguna ADN polimerasa conocida es capaz de comenzar una nueva cadena.

Ella slo puede aadir un nucletido en un grupo 3'-OH que ya existe. Por esta

razn la ADN polimerasa necesita un cebador al grupo 3' -OH del cual puede

aadir el primer nucletido.

Concentracin de Magnesio:

El MgCl2 principalmente es un cofactor necesario para la actividad enzimtica

de las DNA polimerasa.

Afecta el alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las

cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad del

producto, la formacin de dmeros de primer y la actividad y fidelidad de la

enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unin con el

templado, los primers y los dNTPs. La presencia de EDTA u otros quelantes enel stock del primer o del templado puede alterar la concentracin ptima

aparente de magnesio.

Buffer:


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Una solucin tampn (buffer) es el que mantiene el pH adecuado para el

funcionamiento de el ADN polimerasa. El buffer es exclusivo para su marca de

enzima.

*Todos los reactivos se guardan a -20 C.

Protocolo:

En un tubo ependorf de 500ul (0,5 ml) para PCR, se agregan por cada reaccin:

x4

Buffer 10x 2,5 ul 10 ul

MgCl2 50 mM 0,5 ul 2,0 ul

dNTPs 10mM 1 ul 4 ul

Primer Fw (10 uM) 0,625 ul 2,5 ul

Primer Rev (10Um) 0,625 ul 2,5 ul

Taq DNA polimerasa 0,125 ul 0,5 ul

Templado DNA (1ng) 0,1 ul El ADN no se multiplica

El templado problema es el 25M20.

Llevar a un volumen final de 78 ul aforando con ADESI.

Luego realizar un spin, despus de los 78 ul repartir a3 tubos ependorf con

24,9 ul que luego se completan a 25 ul con el templado de DNA 0,1 ul. La

micropipeta no fue capas de obtener 0,1 ul, asi que se procedi a obtener 0,2

ul de templado de DNA.

* No olvidar agregar un control negativo (sin templado).
http://es.wikipedia.org/wiki/Tamp%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Tamp%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/PH


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Los tubos con el master mix ingresan al termociclador y se programan con el

siguiente perfil trmico:

Denaturacin inicial 5 minutos a 98 C 1 ciclo

Extensin final 5 minutos a 72C 1 ciclo

Fundamento etapas:

Desnaturalizacin: Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que lasmolculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto seconsigue calentando a temperatura de 98 a 94C para que produzca la roturade los enlaces puente de hidrogeno (esta t depende de la cantidad G-C queposea el fragmento), para asegurar la completa separacin de la doble cadenadel ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo sedesnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse muy rpidamentedificultando con esto el proceso de hibridacin.

Hibridacin: Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye latemperatura de la reaccin hasta los 58 C(T7 Fw y SP6 Rev) para que sepueda producir la hibridacin especfica del cebador a la secuencia flanqueantedel fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza estaetapa depende de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas

inferiores a la ptima producirn hibridaciones inespecficas de los cebadores ytemperaturas superiores nos dificultarn la eficiencia de la misma).

Extensin: Durante esta etapa la ADN polimerasa (termo resistenteproveniente de bacteria Thermus aquaticus) incorpora nucletidos en elextremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamentedesnaturalizada.La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin suele ser de 72Cya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mximaactividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es suficiente parafragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmentos

por encima de 1.2 kb. Al finalizar cada uno de los ciclos el nmero de copiasobtenidas se duplica y despus de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1milln de copias de cada una de las molculas molde iniciales ADN.

Denaturacin - 30 segundos a 94 C

Hibridacin 30 segundos a 58 C 35 ciclosExtensin 1,5 minutos a 72 C


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Gel para visualizar PCR

Se usa un gel de agarosa 1%.

1. Preparacin del gel 1%, agregamos 0,5gr de agarosa y 50 ml de bufferTAE/ADESI en un frasco. Mezclar y fundir en el microondas hasta obtener unamezcla homognea libre de grumos.

2. Esperar que enfre un poco y agregar 0,5 ul del fluoroforo gel red, vaciaren el pocillo que moldeara el gel con la peineta puesta o ponerla luego,esperar al cambio de coloracin de este (gel) a uno ms blanco (lo que indicaque est en estado slido).

3. Despegar el gel del molde y poner en la cmara de electroforesis,agregar el buffer de corrida TAE-ADESI hasta cubrir el gel y quitar la peinetacon mucha precaucin evitando que formen burbujas en el gel y romperlo.

4. En parafilm agregar 1ul de buffer de carga 6x por cada una de lasmuestras en este caso son 1 ul por 1 ul de control, 1 ul para 1 ul del tubo 5*y 1 ul para 1 ul del tubo 5 *.

5. Depositar esto en cada uno de los pocillos. Despus de depositadas

todas las muestras en el primer carril poner el marcador de peso que en estecaso corresponde a uno de 1 Kb (este comienza a migrar muy rpido por esose deposita en ltimo lugar).

6. Encender la cmara electrofortica, tapar y dejar correr durante 48 min.a 80 volts.

Resultado PCR:

Ciclos PCR, donde 1 es denaturacion inicial, 1 es

denaturacion, 2 es hibridacin y 3 extensin.

1 2 3 4 5 6


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Diseo de partidores Primers, Cebadores o Oligonucletidos.

Detectan sitios especficos de una hebra doble para unirse cada uno a

una secuencia nica en direccin 3-5 para aadir nucletidos en direccin 5-

3.Para el diseo de partidores preferentemente se utilizan partidores con 14a 24 pb que se consideran como un tamao optimo. En la secuencia la

cantidad de A-T y G-C determina la temperatura de denaturacion de la cadena

entre mayor sea la temperatura mayor ser la especificidad de la reaccin. Los

partidores comerciales se disean en primera instancia en un programa que las

determina como Amplifix 1.4 luego se mandan a fabricar a E.E.U.U para su uso

en investigacin.

1. Buscamos una secuencia de un gen especfico en la base de datos NCBI,

en este caso nuestro gen fue DSM 4304 perteneciente a Arhaeoglobus

fulgidus.

El pocillo 1 muestra el marcador de peso; los pocillos 6, 7 y 8

corresponden al grupo 4 de lab.; corresponde analizar los

pocillos 2, 3 y 4. El pocillo 2 presenta el control que no

debera marcar ya que no hubo amplificacin; los pocillos 3 y

4 presentan leves bandas poco visibles, que indican

amplificacin.

Bandas de


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2. Escogemos el gen e ingresamos en l para obtener nuestra secuencia

nucleotdica en formato fasta, tal como se muestra en la impresin

siguiente


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3. La secuencia nucleotdica se copia en el programa Amplifix 1.4 que nos

disear los partidores necesarios para el corte de la secuencia que le

pidamos.

4. Nuestra secuencia posee 1314 nucletidos lo que est bastante bien

para nuestro diseo. Luego de nos vamos a la opcin primers -> diseo

de primers para darle los parmetros de seleccin.


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5. En esta instancia en criterio general le damos los parmetros a los

primers al momento de la accin:


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Longitud del primer, 18 min - 24 max. ya que es esta la cantidad

optima de pb para que la unin sea optima.

Mxima diferencia de temperatura, entre forward y reverse en

este caso la diferencia adecuada debe ser de 1C e ir

aumentando hasta encontrar primers de buena calidad en casoque no resulte con 1C.

Calidad mnima del primer, 90% mnimo, aunque siempre se debe

exigir el 100%, en caso de que el programa no encuentre primers

este rango se debe bajar como en este caso que lo dejamos en

98%.

Nmero de la mejor pareja de primers escogidas, se coloca 10

para que el programa nos muestre los 10 mejores primers para

los parmetros dados.

Luego en los casilleros del lado escoger los parmetros de corte de la

secuencia:

Primer forward, se selecciona el nmero de nucletidos que

queremos que nuestro primer reconozca y se site en el, entre el

valor total de la muestra que en este caso es de 1314 nucletidos

le pedimos que corte entre 50 y 1200, asegurndonos de que no

tome los extremos que estos son ms inestables ya que por lo

general presentan secuencias de mala calidad y as nos

aseguramos sea un buen corte.

Primer reverse, lo mismo es en este caso, desde 50 a 1200

nucletidos.

En el sitio de fragmento amplificado desde, le indicamos al programa

que el sitio que amplifique sea desde un mnimo de 100 nucletidos entre los

50 y 1200 y un mximo de 1000 nucletidos tambin incluidos en la secuencia

que excluye los primeros y ltimos 50 nucletidos que es el sitio que posee

ms estabilidad nucleotdica.

Luego de esto clic en Find, y aparecer una lista de los 10 mejores

primers escogidos por el programa segn los parmetros dados. Hacemos clicen Amplifix 1,4 primer list para que nos muestre los dos primeros que

escogimos y nos mostrara sus similitudes y cualidades como primer en nuestro

caso se llaman Pr0001 y Pr0002 y los marcamos por separado para analizarlos.


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6. En este momento nos aseguramos que los primers encontrados son los

indicados ya que en todas las categoras la temperatura el porcentaje

de GC, estabilidad del fin 3, dimeros etc. Son buenas, es entonces una

buena eleccin de primers para mandar a fabricar.


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Enzimas de restriccin:

Las enzimas de restriccin tienen su origen y son extradas a partir debacterias, las cuales las utilizan para defenderse degradando ADN forneo que

entra a la bacteria. El fundamento de esta tcnica se basa en la capacidad

natural de estas enzimas para cortar el ADN en lugares definidos segn su

secuencia nucleotdica. El tamao del rea de corte depender de la enzima y

de su especificidad. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia de

nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortan los enlaces fosfodiester

del ADN de forma especfica en un punto llamado sitio de restriccin, el cual

cuenta entre 4 y 12 pb. El corte da lugar a dos extremos de ADN. Estos

pueden ser:

Romos: Enlaces rotos coinciden.

Figura 1: Corte de EcoRI dejando extremos romos.

Cohesivos o pegajosos: Con tendencia a volver a unirse.

Figura 2: Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.

El gen que se insert se llama 31E8 y tiene X pares DE BASES. El vector que se

utiliz fue pAGEN-1, el cual posee 4117 pares de bases, un origen de


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X= 6,6 ul de ADN

Unidades de enzimas de restriccin que se requieren para la reaccin:

1000ng 3U de enzima

2000ng XU de enzima

X= 6U de enzima de restriccin (NotI y EcoRI).

Cuantos microlitros de enzima se tienen que pipetear para obtener las 6U deenzima requerida:

10U de enzima 1ul de enzima

6U de enzima Xul de enzima

X= 0,6ul de enzima (NotI y EcoRI)

Se requiere 1ul de buffer (el cual es el mismo para las dos enzimas de

restriccin utilizadas), ya que el buffer se encuentra a 10X y debe quedar a 1X.

Materiales

1ul buffer 3 a 10X

0,6 ul enzima NOTI

0,6 ul enzima EcoRI

6,66 ul DNA

1,14 ul H2O

10ul Total.


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El buffer se descongela en hielo el cual se encuentra a 4C y las enzimas se

guardan a -20C y se sacan solo cuando se van a usar. Jams colocarlas en

hielo, ya que el cambio de temperatura favorece la denaturacin. Luego de

agregar las enzimas EcoRI y NotI se dejan a temperatura ambiente.

Vector: pAGEN-1 ( 4117 pb)

Gen: 31E8

Paso 1: Agregar 6,66 ul de ADN.

Paso 2: Agrega 1ul de buffer 3, el cual mantiene el pH estable y adecuado

para que las enzimas EcoRI y NotI puedan actuar. Todas las enzimas requieren

distintas condiciones para actuar, por ende se ocupan diferentes tipos de

buffer dependiendo de la enzima. El buffer 10x corresponde a 10% de la

reaccin, por lo que se agregan 1 ul

Paso 3: Agregar 0,6 ul de cada enzimas de restriccin

Paso 4: Agregar 1,14ul de agua destilada desionizada. La reaccin contiene

en total 8,86 ul, se completa con ADESI.

Nota: Cumplido el tercer paso se realiza un spin, luego se agregan las enzimas

EcoRI y NOTI.

Rotulacin del tubo

La reaccin se almacena a 37C durante 2 horas. Finalmente se almacena a

4C para detener la reaccin y la enzima deje de cortar.

Electroforesis Gel 1%

30 ml de buffer gel

0,3 gr de agarosa

0,3 ul de fluorforo gel red.

1ul de burffer de carga + 1 ul de muestra.


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Marcador de peso 1kb.

Buffer TAE- ADESI hasta cubrir el gel.

Se corri 40 minutos a 80 volts

Mtodo:

1. Preparacin del gel 1%, agregamos 0,3gr de agarosa y 30 ml de bufferTAE en un frasco. Mezclar y fundir en el microondas hasta obtener unamezcla homognea libre de grumos.

2. Esperar que enfre un poco y agregar 0,3ul del fluorforo gel red, vaciaren el pocillo que moldear el gel con la peineta puesta, esperar alcambio de coloracin de este (gel) a uno ms blanco.

3. Despegar el gel del molde y poner en la cmara de electroforesis,agregar el buffer de corrida TAE-ADESI hasta cubrir el gel y quitar la

peineta con mucha precaucin evitando que formen burbujas en el gel yromperlo.4. En parafilm agregar 1ul de buffer de carga 6X por cada una de las

muestras en este caso son un ul por 1ul de nuestra construccin quecontiene nuestra secuencia del gen 31E8 y otro ul por nuestro genaislado que nos servir como patrn de reconocimiento al visualizarnuestro gel de electroforesis.

5. Depositar esto en cada uno de los pocillos. Despus de depositadastodas las muestras en el primer carril poner el marcador de peso que eneste caso corresponde a uno de 1 Kb ya que este comienza a migrarmuy rpido por eso se deposita en ltimo lugar.

6. Encender la cmara electrofortica, tapar y dejar correr durante 40 min.

a 80 volts.

Gel electroforesis de digestin enzimtica

Mp 2 3 4 5

Marcador de Peso Gen F21 Digestin Gen 31E8

Digestin

1Kb F21

31E8

____________ ___________ __________ __________ __________


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Resultados y discusin.

En el pocillo nmero uno el marcador de peso corri de manera irregular por

lo que se dificulta la interpretacin de los dems pocillos. El carril nmero 2 y 3

pertenece al grupo nmero 4 de lab. En tanto que el pocillo 4 corresponde al

gen 31E8 sin cortar y el carril 5 muestra nuestra digestin enzimtica del gen

31E8. Por lo tanto se puede concluir que en el pocillo numero 5 si se observa

digestin comparndola con la banda que aparece en el carril 4, ambas (4 y 5)

tienen cantidades en pares de bases parecidas, la banda final corresponde al

gen 31E8 como resultado de la digestin enzimtica con las enzimas EcoR1 y

NOT1.

SOUTHERN BLOTTING

Edward M. Southern 1975 inventa la tcnica de southern blot el nombre deriva

en parte del apellido Southern del investigador que la desarroll y de la palabra

en ingls Blot que significa traspasar

Esta tcnica permite la identificacin de secuencias especficas de DNA,

mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridacin utilizando sondas

especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal sta debe ser

previamente fragmentada, por ejemplo utilizando enzimas de restriccin. Los

fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamao mediante una

Digestin

enzimtic

a gen

31E8


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electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teir

el gel, los fragmentos de DNA se traspasan aun filtro de nitrocelulosa a una

membrana de nylon .A continuacin, el filtro se incuba con una sonda

marcada, especfica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es

una secuencia de cido nucleico, DNAds RNAm, que reconocer a la

secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a travs del reconocimiento desecuencias complementarias de cidos nucleicos. El traspaso de las muestras

desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases

complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy

ineficiente.

Pasos a seguir para realizar southern blot

1. Extraccin del ADN


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Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano, animal y vegetal.

2. Fragmentacin del ADN

Se fragmentar el ADN en porciones ms pequeas a travs de enzimas de

restriccin.

3. Electroforesis en gel de agarosa

Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan

tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis,

las molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo

positivo. Al avanzar las molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve

reducida por la matriz del gel de agarosa. Las molculas menores se mueven

ms deprisa a travs de los poros del gel que las de mayor tamao. Como

resultado, se produce una separacin continua de los fragmentos de ADN de

acuerdo con su tamao, de modo que los fragmentos ms pequeos avanzan

la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicacin de la muestra.

4. Desnaturalizacin

Tras la electroforesis, las molculas de ADN separadas se desnaturalizan

mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando ste con una

disolucin alcalina.

5. trasferencia del ADN a un soporte slido


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El ADN resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon o

nitrocelulosa realizando as una copia o "calco".

6. hibridacin de la sonda

El ADN inserto en el gel que fue transferido a un filtro de nitrocelulosa o nylon

con esto, en el filtro queda representada una rplica de la disposicin de los

fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuacin el filtro se incuba

durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un

fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando a las molculas

de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La

sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el

filtro de una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos

X para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para

el caso de sondas marcadas con fluorocromo.

Luego de la incubacin se lava para quitar el mximo de hibridaciones

inespecficas.

7. Autorradiografa.
http://es.wikipedia.org/wiki/Nitrocelulosahttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Nitrocelulosahttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_X


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Las posiciones de hibridacin de la sonda radiactiva sobre la membrana del

ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografa En esta tcnica, la

membrana de nailon o nitrocelulosa se coloca, una vez lavada, junto a una

pelcula de rayos X dentro de una caja que las asle de la luz. La pelcula

registra las posiciones donde hay desintegracin radiactiva. Tras su exposiciny el revelado fotogrfico, el registro resultante de la hibridacin de Southern se

conoce como autor radiografa.

Ejemplo.

Anlisis de Southern blot de los reordenamientos de IGH. Resultados obtenidos

por Southern blot en las muestras LLC1 (C) y LLA1 (A) y linfocitos CD3 (G,

control germinal) digeridas con las diferentes combinaciones de enzimas (BglII,

BamHI-HindIII, HindIII y XbaI) e hibridadas con la sonda IGHJ6. En ambas

muestra tumorales se detectan un mismo reordenamiento biallico (dos

bandas de reordenamiento) de tamao idntico, indicando la existencia de unamisma clula diana tumoral comn para ambas poblaciones. Nota: asteriscos

blancos indican las bandas germinales (no reordenadas); flechas simples

indican el reordenamiento VDJH; flechas rayadas indican el reordenamiento

DJH. El reordenamiento VDJ (DH5-18/JH4) no se puede ver en la digestin con

BglII debido a su tamao inesperadamente pequeo (


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Norther n Blot

Es una tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de una

secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Para ello, se toma la mezcla

de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos

en base a su tamao. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto,

a una membrana cargada positivamente en la cual se efecta la hibridacin de

una sonda molecular marcada radiactiva o qumicamente.

El nombre de la tcnica deriva de la deteccin de cido

desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su

descubridor; de este modo, al desarrollarse la tcnica equivalente para ARN se

empleo el punto cardinal opuesto Northern.

El Northern Blot permite observar un patrn particular de expresin gentica

entre tejidos, rganos, estadios del desarrollo, niveles de estrs ambiental,

infecciones causadas por patgenos y durante el curso del tratamiento de las

mismas. Esta tcnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresin de

oncogenes y la desregulacin de genes supresores tumorales en clulas

cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.

.

Pasos a seguir para realiza Nothern Blot

Esta tcnica es muy similar a southern blot, por lo tanto se sigue los mismopasos para su realizacin lo nico que cambia es el paso 1, por que en vez de

extraer a ADN (southern blot) se extrae ARN.

Ejemplo:
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gelhttp://es.wikipedia.org/wiki/Sonda_molecularhttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiactividadhttp://es.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blothttp://es.wikipedia.org/wiki/Gen_supresor_tumoralhttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosashttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosashttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gelhttp://es.wikipedia.org/wiki/Sonda_molecularhttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiactividadhttp://es.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blothttp://es.wikipedia.org/wiki/Gen_supresor_tumoralhttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosashttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosas


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Anlisis de Northern blot donde se observa la regulacin positiva del oncogn

Wnt sobre AnexinaI. (Lneas celulares (-) parental, (W) expresa el

oncogn Wnt1 constitutivamente)

informe molecular maca

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