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7/27/2019 Informe Molecular Maca
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UNIVERSIDAD DE LA FRONTERA
FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS Y FORESTALES
BIOTECNOLOGA
INFORME DE LABORATORIO DE PCR Y ENZIMAS
DE RESTRICCION
MACARENA ABARZUABEATRIZ AVENDAO
MATIAS BAHAMONDE ECHEVERRIANICOLAS MILLAHUEQUE
GRISELLE PROBOSTE
ALEJANDRA SANDOVALANA GUTIERREZ
BIOLOGIA MOLECULAR
TEMUCO CHILE
2012
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PCR (Reaccin en cadena de la polimerasa).
La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica que se basa en
sintetizar muchas veces un pedazo o fragmento de ADN utilizando una
polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene
de la bacteria thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79C a 85C),
de ah su nombre comercial ms conocido: taq polimerasa. En la reaccin de
PCR se sintetiza el ADN y en un tubo se mezclan todos los ingredientes
necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del organismo que queremos
estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos sintetizar, los
oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores, oligos,
etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin, dinucletidos (dNTPs), y las
condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH,
determinadas cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden
necesitarse otras sales o reactivos, dependiendo de cada polimerasa).
La amplificacin in vitro del DNA se logra en tres pasos bsicos:
a).-Desnaturalizacin del DNA a copiar (molde o diana). Ello se consigue
incrementando la temperatura para separar las dos cadenas que componen la
doble hlice del DNA.
b).-Hibridacin o apareamiento de los cebadores u oligos al DNA molde.
Para ello se baja la temperatura de reaccin, de forma que pequeas
secuencias de DNA de cadena sencilla (tpicamente, entre 10 y 30 bases o
meros) se unan a sus secuencias complementarias del DNA diana. Cada unode ellos se une a una de las cadenas del DNA diana, de forma que sus
extremos 3OH apuntan el uno hacia el otro, delimitando la secuencia a
amplificar.
c).- Copia de las cadenas delimitadas por los cebadores. Se consigue elevando
la temperatura de la reaccin a la ptima de la polimerasa de DNA utilizada.
Cada uno de los extremos 3OH de los oligos apareados a las cadenas directa
y reversa sern extendidos, generndose las cadenas hijas correspondientes.
El resultado son dos hlices completas Watson & Crick en la regin delimitada
por los oligos. Dicho de otra forma, se duplica el nmero inicial de molculas
de DNA.
Estos tres pasos de desnaturalizacin, hibridacin y polimerizacin se repiten
n veces, duplicndose en cada ciclo el nmero de cadenas delimitadas por
los oligos. Se trata, pues, de una amplificacin exponencial o logartmica, en
que las cadenas previamente sinterizadas pueden servir de molde a futuras
amplificaciones.
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Componentes de la reaccin.
Nucletidos (dNTPs 10Mm):
Los nucletidos se diluyen en agua, la solucin debe ser protegida (por ejemplo
con 10mM Tris pH 7,7- 8,0, concentracin final). Si no, un pH cido promover
la hidrlisis del dNTP en dNDP y dNMP y los har intiles para las reacciones de
polimerizacin de la DNA enzimtica. Los stocks son diluidos a 10 mM,
alicuotados y almacenados a -20 C.
Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.
La estabilidad de los dNTP durante ciclos repetidos de PCR, es de tal
manera que aproximadamente el 50% permanece como dNTP despus de 50
ciclos.
Primers (forward y reverse):
Los oligonucletidos iniciadores o primers son fragmentos complementarios
que se unen a cada una de las dos cadenas separadas del templado de ADN.
La seleccin de oligonucletidos iniciadores es muy importante en la reaccin
en cadena de la polimerasa. De este paso depende el xito en el laboratorio.
Criterios principales:
- Tamao ideal es de 20-25 nucletidos de longitud pero generalmenteson de 18-30 nucletidos.
- La base en el extremo 3 debe ser una G o C.- Temperatura de fusin 50-65 C.- El contenido GC debe ser de 40-60%.- La auto complementariedad debe ser evitada, para evitar la formacin
de estructuras secundarias y los dimeros de primer.
- Debe tener un 100% de apareamiento con el molde.
Cuando el objetivo a amplificar es un locus, la posicin de los iniciadores debe
ser relativa a los codones de inicio y terminacin. Es recomendable que el
cebador "forward" se encuentre mas o menos a 35 pb del inicio de la secuencia
que codifica, de la misma forma el cebador "reverse" debe localizarse 35 pb
despus de la regin que codifica.
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Altas concentraciones de primer pueden incrementar la posibilidad de generar
un templado independiente llamado dimero de primer. Los productos no
especficos y los dmeros de primers son por si mismos sustratos para PCR y
compiten con el producto deseado por la enzima, dNTPs y primers, resultando
en un bajo rendimiento del producto deseado.
Primers universales: (T7 Fw- SP6 Rv).
Templado:
Una de las caractersticas ms atractivas de la PCR es que la cantidad y calidad
de la muestra de DNA sujeta a amplificacin no necesita ser alta. El criterio
esencial es que la muestra contenga al menos una cadena de DNA intacta que
abarque la regin que va a ser amplificada y que las impurezas sean
suficientemente diluidas como para no inhibir la polimerizacin.
Taq DNA polimerasa:
Una ADN polimerasa es una holoenzima que utiliza los dNTPs para alargar el
terminal 3' de un primer complementado a una molcula de ADN que utiliza
como plantilla o molde.
Su temperatura ptima, en que se observa su actividad mxima, es entre 75 y
85 C
Todas las ADN polimerasa conocidas sintetizan el ADN en la direccin 5' a 3'.
Ninguna ADN polimerasa conocida es capaz de comenzar una nueva cadena.
Ella slo puede aadir un nucletido en un grupo 3'-OH que ya existe. Por esta
razn la ADN polimerasa necesita un cebador al grupo 3' -OH del cual puede
aadir el primer nucletido.
Concentracin de Magnesio:
El MgCl2 principalmente es un cofactor necesario para la actividad enzimtica
de las DNA polimerasa.
Afecta el alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las
cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad del
producto, la formacin de dmeros de primer y la actividad y fidelidad de la
enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unin con el
templado, los primers y los dNTPs. La presencia de EDTA u otros quelantes enel stock del primer o del templado puede alterar la concentracin ptima
aparente de magnesio.
Buffer:
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Una solucin tampn (buffer) es el que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de el ADN polimerasa. El buffer es exclusivo para su marca de
enzima.
*Todos los reactivos se guardan a -20 C.
Protocolo:
En un tubo ependorf de 500ul (0,5 ml) para PCR, se agregan por cada reaccin:
x4
Buffer 10x 2,5 ul 10 ul
MgCl2 50 mM 0,5 ul 2,0 ul
dNTPs 10mM 1 ul 4 ul
Primer Fw (10 uM) 0,625 ul 2,5 ul
Primer Rev (10Um) 0,625 ul 2,5 ul
Taq DNA polimerasa 0,125 ul 0,5 ul
Templado DNA (1ng) 0,1 ul El ADN no se multiplica
El templado problema es el 25M20.
Llevar a un volumen final de 78 ul aforando con ADESI.
Luego realizar un spin, despus de los 78 ul repartir a3 tubos ependorf con
24,9 ul que luego se completan a 25 ul con el templado de DNA 0,1 ul. La
micropipeta no fue capas de obtener 0,1 ul, asi que se procedi a obtener 0,2
ul de templado de DNA.
* No olvidar agregar un control negativo (sin templado).
http://es.wikipedia.org/wiki/Tamp%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Tamp%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/PH -
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Los tubos con el master mix ingresan al termociclador y se programan con el
siguiente perfil trmico:
Denaturacin inicial 5 minutos a 98 C 1 ciclo
Extensin final 5 minutos a 72C 1 ciclo
Fundamento etapas:
Desnaturalizacin: Para que pueda iniciarse la reaccin es preciso que lasmolculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto seconsigue calentando a temperatura de 98 a 94C para que produzca la roturade los enlaces puente de hidrogeno (esta t depende de la cantidad G-C queposea el fragmento), para asegurar la completa separacin de la doble cadenadel ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo sedesnaturaliza parcialmente ste tender a renaturalizarse muy rpidamentedificultando con esto el proceso de hibridacin.
Hibridacin: Una vez que el ADN est desnaturalizado se disminuye latemperatura de la reaccin hasta los 58 C(T7 Fw y SP6 Rev) para que sepueda producir la hibridacin especfica del cebador a la secuencia flanqueantedel fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que se realiza estaetapa depende de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas
inferiores a la ptima producirn hibridaciones inespecficas de los cebadores ytemperaturas superiores nos dificultarn la eficiencia de la misma).
Extensin: Durante esta etapa la ADN polimerasa (termo resistenteproveniente de bacteria Thermus aquaticus) incorpora nucletidos en elextremo 3 del cebador utilizado como molde la cadena de ADN previamentedesnaturalizada.La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reaccin suele ser de 72Cya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su mximaactividad. Normalmente una extensin de 20 segundos es suficiente parafragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmentos
por encima de 1.2 kb. Al finalizar cada uno de los ciclos el nmero de copiasobtenidas se duplica y despus de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1milln de copias de cada una de las molculas molde iniciales ADN.
Denaturacin - 30 segundos a 94 C
Hibridacin 30 segundos a 58 C 35 ciclosExtensin 1,5 minutos a 72 C
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Gel para visualizar PCR
Se usa un gel de agarosa 1%.
1. Preparacin del gel 1%, agregamos 0,5gr de agarosa y 50 ml de bufferTAE/ADESI en un frasco. Mezclar y fundir en el microondas hasta obtener unamezcla homognea libre de grumos.
2. Esperar que enfre un poco y agregar 0,5 ul del fluoroforo gel red, vaciaren el pocillo que moldeara el gel con la peineta puesta o ponerla luego,esperar al cambio de coloracin de este (gel) a uno ms blanco (lo que indicaque est en estado slido).
3. Despegar el gel del molde y poner en la cmara de electroforesis,agregar el buffer de corrida TAE-ADESI hasta cubrir el gel y quitar la peinetacon mucha precaucin evitando que formen burbujas en el gel y romperlo.
4. En parafilm agregar 1ul de buffer de carga 6x por cada una de lasmuestras en este caso son 1 ul por 1 ul de control, 1 ul para 1 ul del tubo 5*y 1 ul para 1 ul del tubo 5 *.
5. Depositar esto en cada uno de los pocillos. Despus de depositadas
todas las muestras en el primer carril poner el marcador de peso que en estecaso corresponde a uno de 1 Kb (este comienza a migrar muy rpido por esose deposita en ltimo lugar).
6. Encender la cmara electrofortica, tapar y dejar correr durante 48 min.a 80 volts.
Resultado PCR:
Ciclos PCR, donde 1 es denaturacion inicial, 1 es
denaturacion, 2 es hibridacin y 3 extensin.
1 2 3 4 5 6
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Diseo de partidores Primers, Cebadores o Oligonucletidos.
Detectan sitios especficos de una hebra doble para unirse cada uno a
una secuencia nica en direccin 3-5 para aadir nucletidos en direccin 5-
3.Para el diseo de partidores preferentemente se utilizan partidores con 14a 24 pb que se consideran como un tamao optimo. En la secuencia la
cantidad de A-T y G-C determina la temperatura de denaturacion de la cadena
entre mayor sea la temperatura mayor ser la especificidad de la reaccin. Los
partidores comerciales se disean en primera instancia en un programa que las
determina como Amplifix 1.4 luego se mandan a fabricar a E.E.U.U para su uso
en investigacin.
1. Buscamos una secuencia de un gen especfico en la base de datos NCBI,
en este caso nuestro gen fue DSM 4304 perteneciente a Arhaeoglobus
fulgidus.
El pocillo 1 muestra el marcador de peso; los pocillos 6, 7 y 8
corresponden al grupo 4 de lab.; corresponde analizar los
pocillos 2, 3 y 4. El pocillo 2 presenta el control que no
debera marcar ya que no hubo amplificacin; los pocillos 3 y
4 presentan leves bandas poco visibles, que indican
amplificacin.
Bandas de
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2. Escogemos el gen e ingresamos en l para obtener nuestra secuencia
nucleotdica en formato fasta, tal como se muestra en la impresin
siguiente
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3. La secuencia nucleotdica se copia en el programa Amplifix 1.4 que nos
disear los partidores necesarios para el corte de la secuencia que le
pidamos.
4. Nuestra secuencia posee 1314 nucletidos lo que est bastante bien
para nuestro diseo. Luego de nos vamos a la opcin primers -> diseo
de primers para darle los parmetros de seleccin.
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5. En esta instancia en criterio general le damos los parmetros a los
primers al momento de la accin:
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Longitud del primer, 18 min - 24 max. ya que es esta la cantidad
optima de pb para que la unin sea optima.
Mxima diferencia de temperatura, entre forward y reverse en
este caso la diferencia adecuada debe ser de 1C e ir
aumentando hasta encontrar primers de buena calidad en casoque no resulte con 1C.
Calidad mnima del primer, 90% mnimo, aunque siempre se debe
exigir el 100%, en caso de que el programa no encuentre primers
este rango se debe bajar como en este caso que lo dejamos en
98%.
Nmero de la mejor pareja de primers escogidas, se coloca 10
para que el programa nos muestre los 10 mejores primers para
los parmetros dados.
Luego en los casilleros del lado escoger los parmetros de corte de la
secuencia:
Primer forward, se selecciona el nmero de nucletidos que
queremos que nuestro primer reconozca y se site en el, entre el
valor total de la muestra que en este caso es de 1314 nucletidos
le pedimos que corte entre 50 y 1200, asegurndonos de que no
tome los extremos que estos son ms inestables ya que por lo
general presentan secuencias de mala calidad y as nos
aseguramos sea un buen corte.
Primer reverse, lo mismo es en este caso, desde 50 a 1200
nucletidos.
En el sitio de fragmento amplificado desde, le indicamos al programa
que el sitio que amplifique sea desde un mnimo de 100 nucletidos entre los
50 y 1200 y un mximo de 1000 nucletidos tambin incluidos en la secuencia
que excluye los primeros y ltimos 50 nucletidos que es el sitio que posee
ms estabilidad nucleotdica.
Luego de esto clic en Find, y aparecer una lista de los 10 mejores
primers escogidos por el programa segn los parmetros dados. Hacemos clicen Amplifix 1,4 primer list para que nos muestre los dos primeros que
escogimos y nos mostrara sus similitudes y cualidades como primer en nuestro
caso se llaman Pr0001 y Pr0002 y los marcamos por separado para analizarlos.
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6. En este momento nos aseguramos que los primers encontrados son los
indicados ya que en todas las categoras la temperatura el porcentaje
de GC, estabilidad del fin 3, dimeros etc. Son buenas, es entonces una
buena eleccin de primers para mandar a fabricar.
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Enzimas de restriccin:
Las enzimas de restriccin tienen su origen y son extradas a partir debacterias, las cuales las utilizan para defenderse degradando ADN forneo que
entra a la bacteria. El fundamento de esta tcnica se basa en la capacidad
natural de estas enzimas para cortar el ADN en lugares definidos segn su
secuencia nucleotdica. El tamao del rea de corte depender de la enzima y
de su especificidad. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia de
nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortan los enlaces fosfodiester
del ADN de forma especfica en un punto llamado sitio de restriccin, el cual
cuenta entre 4 y 12 pb. El corte da lugar a dos extremos de ADN. Estos
pueden ser:
Romos: Enlaces rotos coinciden.
Figura 1: Corte de EcoRI dejando extremos romos.
Cohesivos o pegajosos: Con tendencia a volver a unirse.
Figura 2: Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.
El gen que se insert se llama 31E8 y tiene X pares DE BASES. El vector que se
utiliz fue pAGEN-1, el cual posee 4117 pares de bases, un origen de
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X= 6,6 ul de ADN
Unidades de enzimas de restriccin que se requieren para la reaccin:
1000ng 3U de enzima
2000ng XU de enzima
X= 6U de enzima de restriccin (NotI y EcoRI).
Cuantos microlitros de enzima se tienen que pipetear para obtener las 6U deenzima requerida:
10U de enzima 1ul de enzima
6U de enzima Xul de enzima
X= 0,6ul de enzima (NotI y EcoRI)
Se requiere 1ul de buffer (el cual es el mismo para las dos enzimas de
restriccin utilizadas), ya que el buffer se encuentra a 10X y debe quedar a 1X.
Materiales
1ul buffer 3 a 10X
0,6 ul enzima NOTI
0,6 ul enzima EcoRI
6,66 ul DNA
1,14 ul H2O
10ul Total.
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El buffer se descongela en hielo el cual se encuentra a 4C y las enzimas se
guardan a -20C y se sacan solo cuando se van a usar. Jams colocarlas en
hielo, ya que el cambio de temperatura favorece la denaturacin. Luego de
agregar las enzimas EcoRI y NotI se dejan a temperatura ambiente.
Vector: pAGEN-1 ( 4117 pb)
Gen: 31E8
Paso 1: Agregar 6,66 ul de ADN.
Paso 2: Agrega 1ul de buffer 3, el cual mantiene el pH estable y adecuado
para que las enzimas EcoRI y NotI puedan actuar. Todas las enzimas requieren
distintas condiciones para actuar, por ende se ocupan diferentes tipos de
buffer dependiendo de la enzima. El buffer 10x corresponde a 10% de la
reaccin, por lo que se agregan 1 ul
Paso 3: Agregar 0,6 ul de cada enzimas de restriccin
Paso 4: Agregar 1,14ul de agua destilada desionizada. La reaccin contiene
en total 8,86 ul, se completa con ADESI.
Nota: Cumplido el tercer paso se realiza un spin, luego se agregan las enzimas
EcoRI y NOTI.
Rotulacin del tubo
La reaccin se almacena a 37C durante 2 horas. Finalmente se almacena a
4C para detener la reaccin y la enzima deje de cortar.
Electroforesis Gel 1%
30 ml de buffer gel
0,3 gr de agarosa
0,3 ul de fluorforo gel red.
1ul de burffer de carga + 1 ul de muestra.
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Marcador de peso 1kb.
Buffer TAE- ADESI hasta cubrir el gel.
Se corri 40 minutos a 80 volts
Mtodo:
1. Preparacin del gel 1%, agregamos 0,3gr de agarosa y 30 ml de bufferTAE en un frasco. Mezclar y fundir en el microondas hasta obtener unamezcla homognea libre de grumos.
2. Esperar que enfre un poco y agregar 0,3ul del fluorforo gel red, vaciaren el pocillo que moldear el gel con la peineta puesta, esperar alcambio de coloracin de este (gel) a uno ms blanco.
3. Despegar el gel del molde y poner en la cmara de electroforesis,agregar el buffer de corrida TAE-ADESI hasta cubrir el gel y quitar la
peineta con mucha precaucin evitando que formen burbujas en el gel yromperlo.4. En parafilm agregar 1ul de buffer de carga 6X por cada una de las
muestras en este caso son un ul por 1ul de nuestra construccin quecontiene nuestra secuencia del gen 31E8 y otro ul por nuestro genaislado que nos servir como patrn de reconocimiento al visualizarnuestro gel de electroforesis.
5. Depositar esto en cada uno de los pocillos. Despus de depositadastodas las muestras en el primer carril poner el marcador de peso que eneste caso corresponde a uno de 1 Kb ya que este comienza a migrarmuy rpido por eso se deposita en ltimo lugar.
6. Encender la cmara electrofortica, tapar y dejar correr durante 40 min.
a 80 volts.
Gel electroforesis de digestin enzimtica
Mp 2 3 4 5
Marcador de Peso Gen F21 Digestin Gen 31E8
Digestin
1Kb F21
31E8
____________ ___________ __________ __________ __________
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Resultados y discusin.
En el pocillo nmero uno el marcador de peso corri de manera irregular por
lo que se dificulta la interpretacin de los dems pocillos. El carril nmero 2 y 3
pertenece al grupo nmero 4 de lab. En tanto que el pocillo 4 corresponde al
gen 31E8 sin cortar y el carril 5 muestra nuestra digestin enzimtica del gen
31E8. Por lo tanto se puede concluir que en el pocillo numero 5 si se observa
digestin comparndola con la banda que aparece en el carril 4, ambas (4 y 5)
tienen cantidades en pares de bases parecidas, la banda final corresponde al
gen 31E8 como resultado de la digestin enzimtica con las enzimas EcoR1 y
NOT1.
SOUTHERN BLOTTING
Edward M. Southern 1975 inventa la tcnica de southern blot el nombre deriva
en parte del apellido Southern del investigador que la desarroll y de la palabra
en ingls Blot que significa traspasar
Esta tcnica permite la identificacin de secuencias especficas de DNA,
mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridacin utilizando sondas
especificas. Para analizar una muestra de DNA cromosomal sta debe ser
previamente fragmentada, por ejemplo utilizando enzimas de restriccin. Los
fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamao mediante una
Digestin
enzimtic
a gen
31E8
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electroforesis en gel de agarosa. Una vez terminada la electroforesis y sin teir
el gel, los fragmentos de DNA se traspasan aun filtro de nitrocelulosa a una
membrana de nylon .A continuacin, el filtro se incuba con una sonda
marcada, especfica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es
una secuencia de cido nucleico, DNAds RNAm, que reconocer a la
secuencia de DNA inmovilizada en el filtro, a travs del reconocimiento desecuencias complementarias de cidos nucleicos. El traspaso de las muestras
desde el gel al filtro es una etapa esencial, porque el reconocimiento de bases
complementarias entre sonda y secuencias de DNA en el gel es muy
ineficiente.
Pasos a seguir para realizar southern blot
1. Extraccin del ADN
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Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano, animal y vegetal.
2. Fragmentacin del ADN
Se fragmentar el ADN en porciones ms pequeas a travs de enzimas de
restriccin.
3. Electroforesis en gel de agarosa
Tras la digestin del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan
tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis,
las molculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo
positivo. Al avanzar las molculas de ADN, su velocidad de migracin se ve
reducida por la matriz del gel de agarosa. Las molculas menores se mueven
ms deprisa a travs de los poros del gel que las de mayor tamao. Como
resultado, se produce una separacin continua de los fragmentos de ADN de
acuerdo con su tamao, de modo que los fragmentos ms pequeos avanzan
la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicacin de la muestra.
4. Desnaturalizacin
Tras la electroforesis, las molculas de ADN separadas se desnaturalizan
mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando ste con una
disolucin alcalina.
5. trasferencia del ADN a un soporte slido
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El ADN resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon o
nitrocelulosa realizando as una copia o "calco".
6. hibridacin de la sonda
El ADN inserto en el gel que fue transferido a un filtro de nitrocelulosa o nylon
con esto, en el filtro queda representada una rplica de la disposicin de los
fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuacin el filtro se incuba
durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un
fluorocromo); durante la incubacin la sonda se va hibridando a las molculas
de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La
sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el
filtro de una forma sencilla mediante una exposicin a una pelcula de rayos
X para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula sensible a la luz, para
el caso de sondas marcadas con fluorocromo.
Luego de la incubacin se lava para quitar el mximo de hibridaciones
inespecficas.
7. Autorradiografa.
http://es.wikipedia.org/wiki/Nitrocelulosahttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Nitrocelulosahttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_Xhttp://es.wikipedia.org/wiki/Rayos_X -
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Las posiciones de hibridacin de la sonda radiactiva sobre la membrana del
ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografa En esta tcnica, la
membrana de nailon o nitrocelulosa se coloca, una vez lavada, junto a una
pelcula de rayos X dentro de una caja que las asle de la luz. La pelcula
registra las posiciones donde hay desintegracin radiactiva. Tras su exposiciny el revelado fotogrfico, el registro resultante de la hibridacin de Southern se
conoce como autor radiografa.
Ejemplo.
Anlisis de Southern blot de los reordenamientos de IGH. Resultados obtenidos
por Southern blot en las muestras LLC1 (C) y LLA1 (A) y linfocitos CD3 (G,
control germinal) digeridas con las diferentes combinaciones de enzimas (BglII,
BamHI-HindIII, HindIII y XbaI) e hibridadas con la sonda IGHJ6. En ambas
muestra tumorales se detectan un mismo reordenamiento biallico (dos
bandas de reordenamiento) de tamao idntico, indicando la existencia de unamisma clula diana tumoral comn para ambas poblaciones. Nota: asteriscos
blancos indican las bandas germinales (no reordenadas); flechas simples
indican el reordenamiento VDJH; flechas rayadas indican el reordenamiento
DJH. El reordenamiento VDJ (DH5-18/JH4) no se puede ver en la digestin con
BglII debido a su tamao inesperadamente pequeo (
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Norther n Blot
Es una tcnica de deteccin de molculas de cido ribonucleico (ARN) de una
secuencia dada dentro de una mezcla compleja. Para ello, se toma la mezcla
de ARN y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos
en base a su tamao. Tras esto, se transfiere el contenido del gel, ya resuelto,
a una membrana cargada positivamente en la cual se efecta la hibridacin de
una sonda molecular marcada radiactiva o qumicamente.
El nombre de la tcnica deriva de la deteccin de cido
desoxirribonucleico (ADN), denominada Southern blot en honor a su
descubridor; de este modo, al desarrollarse la tcnica equivalente para ARN se
empleo el punto cardinal opuesto Northern.
El Northern Blot permite observar un patrn particular de expresin gentica
entre tejidos, rganos, estadios del desarrollo, niveles de estrs ambiental,
infecciones causadas por patgenos y durante el curso del tratamiento de las
mismas. Esta tcnica se ha utilizado para mostrar la sobreexpresin de
oncogenes y la desregulacin de genes supresores tumorales en clulas
cancerosas cuando son comparadas con tejidos normales.
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Pasos a seguir para realiza Nothern Blot
Esta tcnica es muy similar a southern blot, por lo tanto se sigue los mismopasos para su realizacin lo nico que cambia es el paso 1, por que en vez de
extraer a ADN (southern blot) se extrae ARN.
Ejemplo:
http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gelhttp://es.wikipedia.org/wiki/Sonda_molecularhttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiactividadhttp://es.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blothttp://es.wikipedia.org/wiki/Gen_supresor_tumoralhttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosashttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosashttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_ribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis_en_gelhttp://es.wikipedia.org/wiki/Sonda_molecularhttp://es.wikipedia.org/wiki/Radiactividadhttp://es.wikipedia.org/wiki/Qu%C3%ADmicahttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleicohttp://es.wikipedia.org/wiki/Southern_blothttp://es.wikipedia.org/wiki/Gen_supresor_tumoralhttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosashttp://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lulas_cancerosas -
7/27/2019 Informe Molecular Maca
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Anlisis de Northern blot donde se observa la regulacin positiva del oncogn
Wnt sobre AnexinaI. (Lneas celulares (-) parental, (W) expresa el
oncogn Wnt1 constitutivamente)