Universidad de AntofagastaFacultad Cs. De la SaludDepartamento BiomdicoBioqumica

Lisis Alcalina

Nicole Huacte - Patricia Jara Daniela RojoIntroduccinEl inters de realizar extracciones de DNA viene desde hace muchos aos atrs, el primero en lograr esto fue el Doctor Friedrich Miescher que esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composicin qumica de las clulas, para esto utilizo leucocitos obtenidos de la pus, recogidos en vendajes quirrgicos y obtuvo, mediante sus pruebas, precipitado de ADN. Hoy en da, la extraccin de DNA es un mtodo altamente utilizado a travs de kit preparados, o el seguir los pasos ya estructurados y muy bien probados. Una de las herramientas ms utilizadas en Biologa Molecular para realizar estudios o para la docencia, son las bacterias.Las bacterias son organismos procariontes, que poseen su DNA cromosomal, y adems contienen un tipo de DNA circular, al que se le denomina, plsmido, son de muy pocos pares de bases y son utilizados como vectores de clonaje. Al igual que el DNA cromosomal el plsmidico puede presentar las siguientes caractersticas, tiene una doble hlice, estabilizada por puentes de hidrgeno, en la clula generalmente se encuentra superenrollada.

Figura 1.- esquema de una bacteria solamente recalcando el DNA bacteriano y el DNA plasmidial.

Figura 2.- Esquema de un plsmido, que demuestra las regiones ms importantes, ORI, es el sitio de origen de replicacin, luego se encuentra la regin de resistencia a los antibiticos, y por ltimo el denominado Polylinker que es la seccin donde se puede insertar el DNA.

Figura 3.- Diferentes formas de enrollamiento del plsmido.Para poder obtener el DNA plasmidial, se utiliza un mtodo llamado lisis alcalina, el cual ser mencionado con mayor profundidad en la seccin de mtodos.MtodoPara la obtencin de un plsmido se utiliza la tcnica de lisis alcalina, la cual se produce una desnaturalizacin alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS)

Figura 4.- Estructura molecular del SDS (dodecil sulfato de sodio.Se basa en las diferencias con respecto a la forma y tiempo de desnaturalizacin y renaturalizacin del DNA de plsmido versus el DNA cromosomal. Hay que tener en claro que el DNA se puede desnaturalizar, gracias a el calor, pH, la concentracin de iones, ya que influyen en la estabilidad de la doble hlice. Lo que ocurre es que deshace su estructura nativa, es decir se eliminan sus puentes de hidrgeno, pero hay que tener en claro que estas se pueden volver a unir.

Figura 5.- Proceso de desnaturalizacin y renaturalizacin

Los pasos de la lisis alcalina son: 1. Resuspensin:Se utiliza un Buffer que contiene EDTA Tris-Cl, adems de utilizar RNAsa que es una enzima que degrada el RNA que se liberar en pasos posteriores.2. Lisis:Se utiliza una alta concentracin de SDS e hidrxido de sodio, la funcin del detergente SDS es lisar la membrana celular y la del NaOH es desnaturalizar el DNA. El DNA cromosomal se desnaturaliza ms rpidamente que el DNA del plsmido (cerrado).

Figura 6.- El NaOH desnaturaliza el DNA del plsmido y cromosomal.3. Neutralizacin:El lisado es neutralizado adicionando acetato de potasio acidificado, as se provoca la renaturacin del DNA del plsmido. Lo que ocurre es que hace regresar a un pH menos drstico y se vuelven a formar los puentes de hidrgeno. Sin embargo, el DNA cromosomal es muy largo y por tanto no logra establecer bien sus puentes de hidrgeno y forma un agregado junto con el SDS y las protenas bacterianas, el cual precipita. Al centrifugar, en el sobrenadante queda el DNA del plsmido y en el fondo el cromosomal.4. Aclaracin del lisado:Aqu se obtiene el DNA del plsmido a travs del sobrenadante, que luego se precipita con etanol al 70% y para asegurar se adiciona luego etanol absoluto.

Figura 7.- Esquema de la tcnica Lisis Alcalina

Materiales1. Bacterias E.coli, se entregaron dos tubos con bacterias que contienen plsmidos diferentes el cual se selecciono el denominado P, que es el que contiene el conocido pGLO. Este fue el que posteriormente se cargaron en el gel para realizar la electroforesis.2. Buffer P1, que contiene EDTA Tris-Cl3. RNAsa A4. Buffer P2, que contiene SDS y NaOH5. Buffer P3, que contiene Acetato de Potasio y cido Actico6. Etanol 70% 7. Etanol Absoluto8. Micropipetas9. Tubos Ependorff10. Centrifuga11. Estufa12. Cubeta con hielo13. Agua libre de nucleasa

ResultadosPara poder cuantificar y observar los resultados obtenidos se realiza una electroforesis en gel de agarosa, esta consiste en una separacin de tamao molecular al ser expuesto por una carga elctrica, adems se utiliza en el mismo gel un colorante que es intercalante a los cidos nuclicos, que es el bromuro de etidio.La muestra utilizada fue la denomida P, y que fue cargada en el posillo nmero dos del gel.Al da siguiente se fue a ver los resultados, que se muestran en la figura nmero 8, donde claramente se ve la banda del DNA del plsmido.

Figura 8.- Gel de agarosa obtenido en la parte experimental.ConclusinEn la experiencia de extraccin de lisis alcalina, se deben tomar ciertas precauciones para obtener un resultado esperado que es la obtencin de DNA del plsmido.Es muy fcil que la muestra se contamine, ya sea por una mala manipulacin o por los reactivos que no funcionan bien. Es por ello que cada paso se debe tomar con cuidado y adems se debe mantener en la muestra una temperatura baja.