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Efecto de aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación sobre la estructura
química y función de la insulina.
Resumen.
El “Estrés Oxidativo” (EO) modifica la estructura y función de biomoléculas como la LDL y la
Insulina, recientemente se demostró en un modelo in vitro, que la insulina humana
recombinante es modificada en su estructura al exponerla a radicales libres hidroxilo,
observándose una disminución en la función biológica. Se sabe que otro mecanismo de daño a
proteínas por EO es la formación de aductos (interacción de grupos aldehídos con grupos
amino) con productos de lipoperoxidación (LPx). Objetivo: fue determinar in vitro, el efecto de
los aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación (malondialdehído (MDA)) sobre la insulina
humana recombinante y determinar en un modelo animal, el efecto hipoglucemiante del aducto
insulina-MDA. Metodología: Para la formación de aductos se diseñó un sistema generador de
productos de lipoperoxidación el cual consistió en exponer ácidos grasos insaturados (linolénico
y linoléico) a RL (HO•) para obtener los aldehídos alifáticos (productos de lipoperoxidación) que
en presencia de insulina forman aductos. En otro sistema se preparó una solución de 1,1,3,3,-
tetrametoxipropano (Malondialdehído bis (dietilacetal)) 10 mM en ácido sulfúrico 1%, y ácido
clorhídrico (HCl) 0.2 N en presencia de 20 UI de insulina (1 mg). Los dos sistemas fueron
incubados a 40 °C durante 2 horas y al término de la incubación se precipitó con ácido
tricloroacético (TCA) al 10 %. La formación de aductos se determinó cuantificando: a) MDA
unido a la proteína (insulina) con ácido tiobarbitúrico, y b) los grupos carbonilo con
dinitrofenilhidrazina. Para el efecto hipoglucemiante se administró insulina nativa o insulina
modificada a ratas vía intraperitoneal y se midieron las concentraciones de glucosa a diferentes
tiempos con un glucómetro (Accu-Chek sensor, Roche. Bayer HealthCare). Resultados: La
formación de aductos formados entre los productos de LPx y la proteína insulina fue establecida
al exponer la insulina con el precursor de MDA y obtener 0.4587 ± 0.1015 nmol de MDA/mg de
insulina, la exposición de grupos carbonilos 36.53 ± 7.192 nmoles de osazonas/mg de insulina.
Lo que dió como consecuencia una disminución en la actividad biológica de la hormona de
aproximadamente el 10%. Conclusión: Existe una formación del aducto insulina-MDA, por lo
que el aducto formado entre el grupo amino de la insulina y el producto de lipoperoxidación
malondialdehído causa un daño indirecto a la proteína, demostrando que el aducto disminuye la
función biológica de la insulina aproximadamente en un 10 %. También se demostró que la
formación de aductos entre los productos finales de lipoperoxidación y la insulina humana
recombinante, puede ser un factor más, no descrito antes que contribuye a un mal
funcionamiento de la proteína y que se encuentra relacionado en enfermedades como la
diabetes y síndrome metabólico entre otras.
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1. Introducción
La Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) es uno de los principales problemas de salud en
México. Es la primera causa de muerte en adultos, se debe principalmente a factores
genéticos que predisponen a la persona a padecerla y que se incrementa en presencia
de sobrepeso u obesidad (generalmente con distribución visceral o abdominal de la
grasa corporal), sedentarismo, hipertensión arterial; en el caso de la mujer, ovarios
poliquísticos, edad, entre otros. Existen diferentes tipos de Diabetes; como la Diabetes
Mellitus tipo 1, tipo 2, gestacional, asociada a síndromes genéticos, inducida por
fármacos o agentes químicos, defectos genéticos de la célula beta, enfermedades del
páncreas exocrino, entre otras. En la Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2) existe producción
de insulina, pero esta puede presentar disminución en su acción o es secretada en
menor cantidad por parte de las células beta del páncreas; por lo que la glucosa tiene
menos capacidad para ingresar a las células (Barry et al, 2006; Escobar- Jiménez et al, 2000).
La diabetes Mellitus es una enfermedad caracterizada por alteraciones en el
metabolismo de los carbohidratos (hiperglucemia >126 mg/dl) (Tabla 1), lípidos
(aumento de grasas como colesterol y triacilglicéridos) y proteínas, que se acompaña
de complicaciones crónicas microangiopáticas (retinopatía, neuropatía)
macroangiopáticas (aterosclerosis) y neurológicas, causado por la disminución en la
actividad de la insulina, secundaria a la disminución en la acción de la proteína, ya sea
por que se produce poco, nada, esta defectuosa o a la sensibilidad de los tejidos a la
insulina.
Concentración de glucosa
en sangre (ayuno) (mg/dL)
Hipoglucemia ≤ 60-50
Normoglucemia 80 y ≤ 110
Glucemia en ayuno 110 y 125
Hiperglucemia ≥ 126
Intolerancia a la glucosa
Post-prandial ≥ 140 y < 200
Diabetes > 200
Tabla 1. Concentración de glucosa en sangre (NOM-015-SSA21994).
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1.1. Insulina
Estructura química de la insulina.
La insulina es una hormona proteíca constituida por una cadena α de 21 aminoácidos y una β con
30, también llamadas cadena A y B; estas están unidas por dos enlaces disulfuro intermoleculares
(un enlace entre el aminoácido 7 de cada una de las cadenas y el otro enlace en el aminoácido 20
de la cadena A y con el 19 de la B) y por un enlace disulfuro intramolecular en la cadena α, en los
aminoácidos 6 y 11, tiene una vida media plasmática de 6 minutos aproximadamente y
desaparece de la circulación de 10 a 15 minutos.
Síntesis de la insulina.
La insulina es sintetizada en las células β de los islotes de Langerhans del páncreas,
primero, los ribosomas acoplados al retículo endoplásmico traducen el ARN de la
insulina y forman una sola cadena de aminoácidos (preprohormona) llamada
preproinsulina de 81 aminoácidos con un peso molecular de 11,500 Daltones que es
procesada después de su traducción para dar una molécula biológicamente activa; el
precursor de la insulina es una cadena polipeptídica de aproximadamente 9000
daltones, llamado proinsulina. Después de haber completado la síntesis, la molécula de
proinsulina se pliega espontáneamente dando la configuración propicia para la
formación de puentes disulfuros. La conversión de proinsulina a insulina tiene lugar al
proceso de proteolisis, lo que origina la transformación de una proteína de peso
molecular aproximadamente de 6000 daltones y otra de 3000 (péptido C) (Barry et al, 2006;
Farías, 1999). Esta conversión ocurre en el momento de transporte de la proinsulina que se
sintetiza en los ribosomas del retículo endoplásmico y se transfiere al aparato de Golgi
donde se almacena en gránulos para ser liberada como insulina (Williams, 1984). La
secreción de la insulina es iniciada por numerosos estímulos, entre ellos; el incremento
de la concentración de glucosa, así como de aminoácidos y ácidos grasos en sangre
(Barry et al, 2006).
Importancia de la insulina para el almacenamiento de sustancias energéticas.
En el caso de los carbohidratos, hace que se almacenen en forma de glucógeno
principalmente en el hígado y los músculos. Induce el almacenamiento de lípidos en el
tejido adiposo. El exceso de carbohidratos que no puede almacenarse como glucógeno,
se transforma en lípidos por la estimulación insulínica y se almacena también en el
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tejido adiposo. En el caso de las proteínas, la insulina ejerce un efecto directo
promoviendo la captación de aminoácidos por las células y su conversión en proteínas
(Guyton y Hall, 2001).
Activación de los receptores de las células efectoras (blanco) por la insulina.
Para iniciar sus efectos sobre las células blanco la insulina debe ligarse a una proteína
receptora de la membrana con un peso molecular aproximado a 300,000 Daltones. El
receptor de insulina consta de cuatro subunidades que se mantienen unidas por
puentes disulfuro, dos subunidades alfa situadas en la parte externa de la membrana y
dos subunidades beta que atraviesan la membrana que sobresalen hacia el interior del
citoplasma celular. Es el receptor activado y no la insulina quien desencadena los
efectos.
La insulina se une a las subunidades alfa de la parte externa del receptor, pero debido a
los enlaces con las subunidades beta que se encuentran en la membrana se inicia la
autofosforilación y por lo tanto se convierte en una enzima activa: proteincinasa local
que produce la fosfori lación de otras enzimas intracelulares.
Los efectos finales de la estimulación insulínica son los siguientes:
1. Segundos después de la unión de la insulina a los receptores de las membranas
aproximadamente el 80% de las células del cuerpo aumenta la permeabilidad a la
glucosa. Esto ocurre en las células musculares, hígado y en los adipocitos, pero no
ocurre en la mayor parte de las neuronas del encéfalo. La glucosa, que entra a la célula,
se fosforila y sirve de sustrato para las vías metabólicas de los carbohidratos. La
aceleración del transporte de glucosa es consecuencia de una translocación de
numerosas vesículas intracelulares a la membrana de la célula; estas vesículas portan
varias moléculas de proteínas transportadoras de glucosa (GLUT 4), que se unen a la
membrana celular y facilitan el paso (captación) de glucosa al interior de la célula.
Cuando no está disponible la insulina, las vesículas se desprenden de la membrana
celular en aproximadamente de 3 a 5 minutos y regresan al interior de las células; este
ciclo se repite cuantas veces sea necesario.
2. La membrana celular se vuelve más permeable para muchos aminoácidos, iones
potasio y fosfato, cuyo transporte al interior de la célula se incrementa.
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3. En los 10 a 15 minutos siguientes se observan efectos más lentos que cambian la
actividad de muchas enzimas intracelulares. Estos efectos se deben, sobre todo a una
variación en los procesos de fosforilación enzimática.
4. Durante algunas horas e incluso días, tiene lugar efectos aún más tardíos. Estos
obedecen a los cambios en la velocidad de traducción de los ARN mensajeros dentro
de los ribosomas para dar nuevas proteínas, e incluso (los efectos más tardíos) a un
cambio de las velocidades de transcripción del ADN (Guyton y Hall, 2001).
La insulina tiene efectos en diversos tejidos. Sin embargo, el hígado, el músculo y el
tejido adiposo son los blancos más importantes para su acción, en los cuales promueve
la síntesis de carbohidratos, proteínas, lípidos y ácidos nucleicos (Guyton y Hall, 2001), por lo
que el déficit de la insulina provoca; a) una lipólisis de la grasa almacenada, con
liberación de los ácidos grasos libres, b) un aumento en las concentraciones
plasmáticas de colesterol y de fosfolípidos, c) un consumo exagerado de lípidos, lo que
provoca cetosis y acidosis, d) una disminución de las proteínas y un aumento de los
aminoácidos en el plasma, y e) el efecto más conocido que es la hiperglucemia.
1.2. Hiperglucemia
La Diabetes mellitus es una enfermedad caracterizada por la hiperglucemia que se
destaca por la persistencia de una alta concentración de glucosa sanguínea en ayuno
(glucemia >126 mg/dl) como consecuencia de la baja, absoluta o relativa, eficiencia de
la insulina, asociada con la resistencia a la insulina, este estado metabólico también se
encuentra relacionado al incremento en la producción de radicales libres.
La hiperglucemia es la causa clave en el desarrollo de complicaciones vasculares,
retinopatía, neuropatía, daño al riñón y en diabetes.
Múltiples vías bioquímicas y mecanismos de acción son las fuentes productoras de
especies reactivas de oxígeno, en estás vías se incluyen: la autoxidación de la glucosa,
activación de la proteína cinasa C (PCK), formación y glicación de meti lglioxal,
metabolismo de la hexosamina y formación de sorbitol (Robertson P, 2004).
La activación de la proteína cinasa C está asociada con el incremento de factor de
crecimiento transformante β1 (TGF-β1), factor de crecimiento endotelial, endotelina-1 y
a la sobreproducción de superóxido que induce la síntesis de novo de la enzima
NADPH oxidasa, que a su vez contribuye significativamente a la producción de anión
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superóxido. En la reacción de glicación, la glucosa reacciona no-enzimáticamente con
las proteínas para formar los productos de glicación temprana, también llamados de
Amadori o fructosamina. Metilglioxal, 3-deoxiglucosona y sorbitol, son dicarbonilos
reactivos que forman productos de glicación avanzada por reaccionar con los grupos
aminos de proteínas intra y extracelulares (Sera B et al., 2001).
Las concentraciones altas de glucosa incrementan el gradiente de protones en la
mitocondria como resultado de la sobreproducción de electrones por el ciclo del ácido
tricarboxílico, lo cual incrementa la producción de anión superóxido en la mitocondria
(Robertson P, 2004).
1.3. Radicales Libres (RL)
En los elementos y en las moléculas, los electrones se encuentran pareados y cada uno
muestra una rotación o espín (giro opuesto) sobre la misma capa orbital del átomo. Los
orbitales son las regiones del espacio que rodean a un núcleo atómico, cada orbital
atómico contiene dos electrones como máximo, los cuales tienen tres números
cuánticos iguales (n, l y m) se diferencian en el cuarto número, que es el espín (s) y
corresponde al valor del giro. Tales valores son de +1/2 ó -1/2, y dos electrones en el
mismo orbital deben presentar giros antiparalelos. De acuerdo con el principio de
exclusión de Pauli, no pueden existir dos electrones con los cuatro números cuánticos
iguales en un mismo átomo, ya que estarían en el mismo lugar en el espacio. Un radical
libre (RL) es una especie química que contiene uno o más electrones no pareados, ya
sea por pérdida o ganancia de uno de ellos (Hicks, 2007), condición que los hace muy
reactivos y que presenten una vida media del orden de milisegundos, aunque varía
según el tipo de radical libre (Simic et al, 1988). La característica física del RL se expresa por
un punto a la derecha del compuesto, como superíndice y puede preceder a una carga
(Hicks, 2007).
En el organismo humano y en condiciones fisiológicas la producción de los RL es
permanente y esta asociada con el metabolismo celular del oxígeno y las reacciones de
oxido-reducción. La producción controlada de RL permite la realización de la
fertilización del óvulo por el espermatozoide y la activación de genes; también participan
en los mecanismos de defensa del organismo durante una infección, favoreciendo lisis
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bacteriana. Sin embargo, un aumento en la concentración de los radicales libres que no
pueda ser controlado por los mecanismos antioxidantes conducirá a efectos adversos.
El aumento de RL puede ser de origen endógeno o exógeno, dentro de los de origen
endógeno la principal fuente productora de radicales libres es la respiración
mitocondrial, consiste en una serie de acarreadores de electrones; la mayoría se
compone de proteínas integrales de membrana, con diferentes grupos prostéticos
capaces de aceptar o donar uno o dos electrones.
Los tipos de acarreadores de electrones son los siguientes: 1) ubiquinona, que puede
aceptar hasta dos electrones para generar la forma reducida (Dihidro ubiquinona UQH2)
y dos tipos diferentes de ferroproteínas (citocromos y ferrosulfoproteínas). Cada
elemento de esta cadena puede aceptar electrones del acarreador precedente y
transferirlos al siguiente en una secuencia. Se han descrito tres modalidades mediante
las cuales las moléculas son capaces de transferir electrones en los sistemas
biológicos:
1. Transferencia directa de electrones como en la reducción de Fe3+ a Fe2+.
2. Transferencia de electrones como átomos de hidrógeno (constituido por un
protón y un electrón).
3. Transferencia desde un donador de electrones a un aceptor en forma de iones
hidruro, que portan dos electrones.
Además de los acarreadores de electrones mencionados antes, existen los complejos
proteínicos de la cadena respiratoria y se dividen en cuatro:
Complejo I. NADH-ubiquinona-reductasa (cataliza la reducción de ubiquinona a
ubiquinol)
Complejo II. Succinato-ubiquinona-reductasa (reducción de ubiquinona a
ubiquinol, a partir de dos electrones)
Complejo III. Ubiquinol-citocromo c reductasa
Complejo IV. Citocromo c oxidasa
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En el diagrama 1 se ejemplifican las fuentes de los radicales libres:
Diagrama 1. Fuente de radicales libres de origen endógeno y exógeno.
1.4. Formación de Radicales Libres
Los radicales libres se pueden formar por tres mecanismos:
1. Por rompimiento homolítico: se rompe un enlace covalente de una molécula
estable, de modo que cada fragmento retiene un electrón no pareado (de los dos
que formaban el enlace), proceso que requiere un aporte energético.
X:Y X• + Y•
2. En contraste, en la ruptura heterolítica un fragmento retiene ambos electrones.
X:Y X+ + :Y-
3. Por pérdida o ganancia de electrones.
A + e- A•-
La fisión homolítica y la transferencia de electrones se realizan por uno de los
siguientes mecanismos: a) absorción de energía de diferentes tipos, como las
Fuente de RL
Endógena Exógena
-Contaminación: humo de tabaco,
leña, emisiones de automóviles,
humo de fábricas, etc.
-Radiación ionizante, UV, rayos X,
alfa, beta, gama.
-Fármacos
-Respiración mitocondrial
-Daño renal (hemólisis:liberación del
grupo hemo)
-Enfermedades crónico degenerativas:
-Diabetes (hiperglucemia)
-EPOC (inflamación)
-Asma (inflamación)
-Artritis (inflamación/estallido
respiratorio: leucocitos, neutrófilos)
-Infarto del miocardio (isquemia-
reperfusión)
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radiaciones ionizantes, ultravioleta, visibles y térmicas; b) reacciones redox, como la
transferencia no enzimática de electrones mediadas por metales de transición y c)
reacciones catalizadas por enzimas, por ejemplo la formación de óxido nítrico por la
óxido nítrico sintasa o del anión superóxido por la NADPH oxidasa (Medina-Navarro et al, 2001).
1.5. Especies reactivas de oxígeno (ERO)
El concepto especies reactivas de oxígeno incluye a radicales libres de este elemento y
a ciertos agentes oxidantes fácilmente convertibles en radicales (por ejemplo, HOCl,
HOBr, O3, ONOO-, H2O2). En otras palabras, todos los radicales libres de oxígeno son
ERO, pero no todas las ERO son radicales libres de oxígeno, sin embargo todas se
forman por la reducción incompleta del oxígeno molecular (Hicks, 2007).
Entre las ERO de interés para la medicina y la biología en general, se encuentran:
a) Oxígeno molecular (O2)
La molécula de oxígeno puede originar cierta confusión por que sus electrones están
distribuidos de tal forma que dos de ellos no están pareados. Por esta razón se
considera un birradical; tal característica no le permite reaccionar tan rápido como otros
radicales. Los dos electrones no pareados del oxígeno presentan giro (espín) paralelo,
por lo que las moléculas o átomos con los que reaccione, deben aportar una a uno los
dos electrones faltantes en los orbitales y ser antiparalelos a los no pareados presentes,
por lo que un sólo átomo no puede proporcionar los dos electrones, pues por definición
tienen que ser antiparalelos entre sí (Hicks, 2007).
..
: O =
..
O:
b) Anión superóxido (O2●-)
El O2●- es el producto de la reducción monovalente del oxígeno molecular, es decir
cuando una molécula de oxígeno acepta un electrón, se convierte en un radical con
carga negativa, conocido como anión superóxido.
El oxígeno utilizado por los organismos aeróbicos se reduce hasta agua mediante el
sistema de transporte de electrones; que incluye al de las coenzimas y al de los
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citocromos de la cadena respiratoria mitocondrial. A este nivel, el O2●- lo produce el
complejo I (NADH:ubiquinona óxido-reductasa), en la interfase entre la ubiquinona y el
complejo III (ubiquinol:citocromo C óxido-reductasa). Esta producción de O2●- se debe a
la formación del intermediario semiubiquinona, que es un radical libre capaz de reducir
de manera monoelectrónica al O2 (Hicks, 2007).
El O2●- se puede producir durante las reacciones de varias moléculas de manera directa
con el oxígeno, por ejemplo la adrenalina, la dopamina, el tetrahidrofolato, los
citocromos, entre otros (Hicks, 2007). También es producido por las células del sistema
inmune durante la descarga respiratoria de los procesos fagocíticos (neutrófilos,
monocitos, macrófagos, eosinóflos) como parte del mecanismo empleado para destruir
organismos extraños, generalmente bacterias, a través de un complejo enzimático
denominado NADPH oxidasa que cataliza la reducción del oxígeno en anión
superóxido. Ésta es esencial para la destrucción del material fagocitado, aunque en
ocasiones una activación excesiva de los fagocitos puede producir daño tisular, como
en la artritis reumatoide y en la colitis inflamatoria (Cohen et al., 1986).
Se ha estimado que en una célula del cuerpo humano se producen 1 x 1010 moléculas
de O2●- por día y en el organismo completo las concentraciones van de 1 nM a 0.1mM
(Ames et al., 1993).
c) Peróxido de Hidrógeno (H2O2)
El Peróxido de Hidrógeno (H2O2) no es un radical libre como tal, pues no posee
electrones no pareados en su última capa u orbital. Es la forma menos reactiva de las
especies reactivas de oxígeno. Su importancia recae en el hecho de que participa en
numerosas reacciones que dan lugar a la generación de radicales libres. Además,
atraviesa con facilidad las membranas biológicas, con lo que puede dar lugar a
reacciones de oxidación en puntos de la célula más alejados de su lugar de producción.
El peróxido de hidrógeno puede ser formado secundariamente por la dismutación
(proceso de óxido-reducción) del O2●- que es catalizada por la enzima superóxido
dismutasa o ser producto de la reducción bivalente del oxígeno: la adición de un
segundo electrón conduce a la formación de peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno, o
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también puede formarse en medio acuoso, donde el oxígeno se dismuta de manera
espontánea (Bannister y Rotillo, 1987).
Reacción 1.
2 O2●- + 2 H+ H2O2 + O2
La vida media del H2O2 en los seres vivos depende de las enzimas que lo metabolizan,
como son la catalasa (CAT) o la glutatión peroxidasa (GSH-Px).
El H2O2 puede difundir a través de las membranas celulares al espacio extracelular,
donde existen pocos mecanismos de defensa antioxidante, el H2O2 con un fuerte poder
oxidante, en presencia del ión ferroso (Fe2+), se descompone en el ión OH- y en radical
hidroxilo (HO●) capaz de modificar las estructuras orgánicas más estables.
d) Radical hidroxilo (HO●)
El radical hidroxilo (HO●) es la especie más reactiva derivada de oxígeno y se forma a
partir del peróxido de hidrógeno en presencia de metales de transición (por ejemplo:
hierro o cobre) y es la llamada reacción de Fenton, en donde el peróxido de hidrógeno
se reduce formando radical hidroxi lo y anión hidroxi lo, y el metal correspondiente se
oxida por cesión de un electrón a la especie que se reduce (Haber y Weiss, 1932). Este
proceso puede representarse con la siguiente reacción:
Reacción 2.
H2O2 + Fe+2 HO• + HO- + Fe+3
La reactividad de los radicales HO● tiene una vida media de 10-9 segundos y su radio de
acción es de 3 nm (Hicks, 2007) de modo que reacciona muy cerca de su lugar de
formación con la mayoría de las biomoléculas.
El radical hidroxilo puede formarse in vivo a consecuencia de radiación de alta energía
(rayos X, rayos γ) que puede provocar ruptura homolítica del agua corporal (reacción 3).
La luz UV no tiene suficiente energía como para escindir una molécula de agua, pero
puede dividir el peróxido de hidrógeno en 2 moléculas de radical hidroxilo (reacción 4).
Reacción 3) H2O + radiación HO● + H●
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Reacción 4) H2O2 + luz UV 2 HO●
Aunque la velocidad de esta reacción es demasiado baja para ser de importancia
fisiológica, los metales de transición como el hierro o el cobre pueden actuar como
catalizadores de la misma, acelerando la velocidad de la reacción (Halliw ell y Gutteridge, 1989).
En la fagocitosis, los neutrófilos al estar en contacto con partículas fagocitables, existe
una estímulación y una aceleración en el consumo de oxígeno, que cataliza la
reducción de éste y la generación de peróxido de hidrógeno que participan en la
producción del radical hidroxilo. Otra manera de producir radicales HO● es la interacción
entre el O2●- y el óxido nítrico (NO●), que es una especie reactiva de óxidos de nitrógeno
y por lo cual produce peroxinitrito (ONOO-), que al hidrolizarse se escinde en dos
moléculas: una de radical hidróxilo y una de bióxido de nitrógeno.
Reacción 5.
O2●- + NO● ONOOH + H+ HO● + NO2
●
e) Singulete de oxígeno (1O2*)
El Singulete de oxigeno se forma cuando uno de los dos electrones libres del O2 capta
energía y modifica su giro y se aparea de inmediato con el otro electrón libre, pero en
diferente orbital. Se forma sobre todo, cuando algunos pigmentos biológicos se iluminan
por excitación electrónica en presencia de oxígeno, por ejemplo en clorofila, retinal,
flavinas, porfirinas y quinonas. El singulete tiene una gran capacidad oxidante frente a
muchas moléculas biológicas, sobre todo lípidos de las membranas. Se forma en
cantidades importantes en tejidos y órganos sometidos a radiaciones ionizantes
terapéuticas (Hicks, 2007).
Entre los daños a macromoléculas que puede ejercer el 1O2*, está el daño al ADN,
debido a la oxidación de residuos guanina a 7-hidro-8-oxo desoxiguanosina (8 oxo-Gu).
Este nucleótido induce la mutación de G:C a T:A, provocando así mutaciones que
pueden llevar a la muerte celular (Ríos, 2003).
f) Ozono (O3)
La luz ultravioleta y las descargas eléctricas rompen los dos enlaces covalentes en la
molécula del O2 produciendo oxígeno atómico (O), el cual se combina de inmediato con
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el O2 para generar el ozono (O3), gas que en la estratósfera evita que la luz ultravioleta
llegue a la superficie terrestre, e impide el daño a los organismos por este tipo de
radiación. Sin embargo, el O3 también se puede generar a nivel de la superficie terrestre
por efecto de la luz sobre el dióxido de nitrógeno (NO2), este se descompone en NO y
O; y este último reacciona con el O2 para formar el O3, que a su vez puede
interaccionar con biomoléculas, como los lípidos y las proteínas, e incluso generar otras
especies reactivas (Hicks, 2007).
g) Radicales alcoxilo (RO●) y peroxilo (ROO●)
Estos radicales pueden generarse por la acción de un radical libre de oxígeno (O2●-,
OH●) sobre las cadenas de los ácidos grasos poliinsaturados. Los radicales peroxi son
conocidos por ser menos reactivos y más selectivos que los radicales OH●. Tienen una
vida media relativamente larga (segundos), e llos son el origen de las reacciones en
cadena ya que constituyen el proceso de la base de la lipoperoxidación (LPx) de las
membranas celulares (Punchard and Kelly, 1996).
h) Óxido nítrico (NO●)
El óxido nítrico pertenece al grupo de especies reactivas de óxidos de nitrógeno es un
gas lipofílico e hidrosoluble, cuya vida media es relativamente larga (3-5 segundos) en
comparación a otras ERO. Su formación tiene lugar por una reacción enzimática, en la
que la enzima óxido nítrico sintasa cataliza la conversión de L-arginina a L-citrulina
dando como producto NO● en numerosos tipos celulares (Moncada et al, 1991; Bush et al, 1992).
Dicha enzima presenta tres isoformas: La neuronal nNOS (tipo I) y la endotelial eNOS
(tipo III) se expresan constitutivamente y su actividad esta regulada por la concentración
intracelular de calcio (Bredt et al., 1991; Lamas et al., 1992). La inducible iNOS (tipo II) la expresan
los macrófagos y otros tipos celulares cuando son estimulados por citocinas,
lipopolisacáridos u otras sustancias inmunológicas, siendo su expresión regulada tanto
a nivel transcripcional como postranscripcional, en lo cual participan factores de
transcripción sensibles al estado redox como el factor nuclear κB (NF- κB) o las proteín-
cinasas activadas por mitogeno (MAPK-cinasas) (Winther et al., 2005).
El óxido nítrico juega un papel fundamental en numerosos procesos fisiológicos, entre
ellos, actúa como regulador del flujo sanguíneo local, inhibidor de la agregación
plaquetaria, se produce por los macrófagos activados contribuyendo a la defensa
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inmunitaria primaria y también actúa como neurotransmisor, siendo el cerebro el órgano
con mayor actividad óxido nítrico sintasa (Moncada et al., 1986; Czapski y Goldstein, 1995).
Otro efecto del NO• es su capacidad de reacción con el hierro de hemo-proteínas
intracelulares, tales como hemoglobina, mioglobina y proteínas mitocondriales. Puede
reaccionar con ácidos nucleicos dando lugar a mutaciones y roturas del DNA, también
puede producir necrosis, entre otros fenómenos. Sin embargo, cuando las
concentraciones de NO• aumentan, este tiene efectos indirectos, a través de los
metabolitos derivados de él, pudiendo reaccionar con el oxígeno o el radical superóxido,
lo cual ocurre en situaciones de inflamación. Así pues, un exceso de óxido nítrico es
citotóxico. Parte de su citotoxicidad se cree que es debida al O2•-, con el que reacciona
para dar lugar a anión peroxinitrito (ONOO-).
i) Peroxinitrito (ONOO-)
El peroxinitrito no es un radical, pero sí un intermediario oxidante que puede protonarse
y descomponerse con facilidad de modo que es altamente reactivo (Janssen et al., 1993; Lipton et
al., 1993) y es formado de la siguiente forma:
Reacción 6.
O2•- + NO• ONOO-
El peroxinitrito está en equilibrio con su ácido conjugado (ONOOH). En soluciones
neutras es un potente agente oxidante, capaz de oxidar grupos tioles, de nitrar residuos
de tirosina (Goldstein et al., 2000), de nitrar y oxidar guanosina, de degradar carbohidratos, de
iniciar peroxidación lipídica y de fragmentar ADN. Los residuos de tirosina son oxidados
por los radicales derivados del peroxinitrito formando el radical tirosilo, que a su vez
reacciona con el NO• para formar 3-nitrotirosina (Beckman et al., 1994; 1996).
1.6. Estrés Oxidativo (EO)
La formación de Especies Reactivas de Oxígeno es un proceso normal e inevitable, ya
que son producto de reacciones químicas imprescindibles para la vida celular (Slater, 1984).
Estas especies reactivas no causan daño oxidativo en condiciones no fisiopatológicas
debido a que la célula está provista de mecanismos antioxidantes (enzimáticos por
ejemplo: glutatión peroxidasa (GSH-Px), catalasa (CAT), paraoxonasa y no enzimáticos
15
como el: ácido úrico, vitamina C, E, entre otros). Un antioxidante es una sustancia que
incluso en concentraciones muy pequeñas, comparados con las de un sustrato
oxidable, disminuye o evita la oxidación del sustrato sin que el antioxidante quede
inestable y por lo tanto no es reactivo, este puede considerarse un donador de
electrones capaz de evitar una reacción en cadena de oxidoreducción. Cuando los
sistemas productores de ERO sobrepasan la capacidad neutralizante de los sistemas
antioxidantes del organismo, debido a una disminución de la capacidad antioxidante
(enzimática y no enzimática) o a un incremento en la producción de radicales
(patologías diversas, exposición a radiaciones ionizantes, radiación UV, entre otros) se
establece el estado de desequilibrio denominado Estrés Oxidativo (EO), estado
metabólico que se vincula con diversas enfermedades como aterosclerosis, artritis
reumatoide, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma, cáncer, entre otras. En
estas condiciones las ERO y las especies reactivas de óxido de nitrógeno (ERON)
pueden reaccionar con diversas biomoléculas, como son los ácidos nucleicos, los
lípidos y las proteínas, alterándolas en su estructura química y función (Hicks, 2007).
1.7. Daño a biomoléculas por Estrés Oxidativo (EO)
1.7.1. Daño a ácidos nucleicos
En las células eucariontes las moléculas con menor frecuencia de alteración inducida
por el EO, son los ácidos nucleicos, debido a su localización celular (núcleo) y a que
están protegidos por las moléculas que los rodean al producir su empaquetamiento
(cromosomas); pero cuando las ERO interactúan con los ácidos nucleicos se producen
hidroxilaciones de las bases nitrogenadas, el entrecruzamiento y la escisión de las
cadenas de DNA, lo que causa daños irreversibles como mutaciones e inhibición de la
síntesis de proteínas, nucleótidos y ácidos nucleicos (Alberts B et al., 1989).
El radical hidroxilo interacciona tanto con las bases púricas y pirimídicas, como con la
desoxirribosa, y es capaz de generar rupturas del DNA y mutaciones. Normalmente, los
productos del daño a DNA son eliminados por enzimas de reparación y excretados por
orina, como base libres o derivados de nucleósidos (glucotimidina y 8-
hidroxidesoxiguanosina).
La desnaturalización del ADN puede tener consecuencias sobre la replicación del
mensaje genético, así como en la síntesis de proteínas. Los productos de
16
lipoperoxidación también forman aductos con el DNA, mostrando acción genotóxica y
mutagénica. El más genotóxico es el 4-hidroxinonenal, mientras que el más
mutagénetico es el malondialdehído (Droge W, 2002).
1.7.2. Daño a carbohidratos
La oxidación de los carbohidratos al reaccionar con el radical hidroxilo propicia la
formación de enedioles, los cuales en presencia de metales de transición generan
especies reactivas, como el anión superóxido, el radical hidroxilo y el peróxido de
hidrógeno (Hicks, 2002). Este proceso se da, por ejemplo, en la Diabetes Mellitus, donde,
por la hiperglucemia sostenida se forman productos de glicación avanzada entre el
grupo aldehído de la glucosa y un amino de la proteína de acuerdo a la reacción de
Maillard (Miyata, 2002).
1.7.3. Daño a lípidos
Los Lípidos representan al grupo más susceptible a reaccionar con los RL debido a la
presencia de dobles enlaces en los ácidos grasos insaturados, evento denominado
lipoperoxidación (LPx). Los radicales libres que pueden iniciar esta reacción son los
radicales hidroxilo (HO●), el peroxilo (ROO●), el alcoxilo (RO•) y el alquílico (R•).
La lipoperoxidación comienza (iniciación) con el ataque de un radical libre a alguno de
los carbonos vecinos a los dobles enlaces de los ácidos grasos no saturados debido a
que la unión carbono-hidrógeno se debilita por la presencia de un doble enlace
carbono-carbono. (Figura 3). El radical (ejemplo HO●) sustrae un átomo de hidrógeno
((H•, protón y electrón) que constituía un enlace covalente (C ••H) en la cadena del ácido
graso) para su transformación en agua (), dejando el carbono con un solo electrón
dando lugar a un radical lípidico ().
Reacción 7.
Lípido-H + HO● Lípido• + H2O
A continuación se presenta un rearreglo interno que resulta en que el carbón vecino
queda con un electrón no pareado (C•) (). El átomo de carbono transformado en un
radical dentro del ácido graso, tiende a estabilizarse mediante un rearreglo molecular
para producir un dieno conjugado (dobles enlaces en arreglo secuencial) (). El radical
17
formado en la cadena del ácido graso, reacciona rápidamente con el O2 para dar origen
a un radical peroxilo (ROO●) ().
Reacción 8.
Lípido• + O2 Lípido_O2•
Radical ROO●
Propagación: Tanto los radicales peroxilo como los alcoxilos estimulan la reacción en
cadena al sustraer átomos de hidrógeno de otros lípidos con una cadena insaturada
intacta, por la adición de un hidrógeno al peroxilo se forma un hidroperóxido ().
Reacción 9.
Lípido_O2•+ Lípido Lípido_O_OH + Lípido•
Hidroperóxido
Los hidroperóxidos lipídicos son moléculas reactivas, que pueden finalmente
(terminación) formar una gran variedad de productos de lipoperoxidación como son:
alcanos, aldehídos como el Malondialdehído (MDA) y este a su vez reaccionar con los
grupos Thiol (SH) o aminos (NH2) de las proteínas. Por otro lado los peroxilo en
presencia de hierro reducido (Fe2+) originan radicales alcoxilo (Lípido_O•) (Negre et al., 2007).
Reacción 10.
Lípido_O_OH + Fe2+ Fe3+ + OH- + Lípido-O•
Radical alcoxilo
También es posible la reacción de los radicales peroxilo con los compuestos de fierro III.
Reacción 11.
Lípido-OO • + Fe3+ Lípido_O2- + Fe2+
El RL iniciador produce sólo efectos locales y limitados, el radical secundario ocasiona
la formación de los RL con efectos amplificados a distancia del sitio donde se formó el
primer RL (Luczaj y Skrzydlewska, 2003).
La oxidación de ácidos grasos poliinsaturados genera α, β- hidroxialquenales
insaturados altamente reactivos tales como 4-Hidroxinonenal (4-HNE) y 4-
Hidroxihexenal (4-HHE). La oxidación de ácidos grasos n-6 (ácido linoléico y ácido
18
araquidónico o sus hidroperóxidos en concentraciones de 1 M a 5 mM (Van Kuijk et al; 1990,
Esterbauer et al, 1991)) conduce a la formación del producto de lipoperoxidación 4-HNE,
mientras la oxidación de ácidos grasos n-3 (ácido docosahexaenoico, ácido
eicosapentaenoico y ácido linolénico (Van Kuijk et al; 1990)) genera 4-HHE. Los indicadores de
daño oxidativo a lípidos más empleados son el malondialdehído y el 4-hidroxinonenal.
1.7.4. Daño a proteínas
La oxidación de proteínas es definida como la modificación covalente de las proteínas
inducida directamente por ERO o indirectamente por reacción con bioproductos del
estrés oxidativo.
Todas las cadenas laterales de los aminoácidos que constituyen a las proteínas son
sensibles al estrés oxidativo. La lisina, prolina y arginina, se oxidan de forma directa por
los radicales libres (HO●) dando lugar a grupos carbonilo.
Otros aminoácidos como histidina, cisteína y metionina, presentan daño oxidativo de
manera indirecta por los productos generados durante la lipoperoxidación
(malondialdehído, 4-hidroxinonenal, entre otros), pero no forman derivados de tipo
carbonilo (Stadtman et al., 1992). El aminoácido fenilalanina puede formar orto-tirosinas, meta-
tirosinas o para-tirosinas (Pennathur et al., 2001) en presencia de los RL (HO●), las tirosinas al
hidroxilarse por los RL dan lugar a 3,4-dihidroxifenilalaninas que en presencia de
metales de transición forman ortoquinonas. Con la unión de dos radicales tirosilo se
producen las ditirosinas.
En consecuencia, la exposición de las proteínas a los radicales libres conduce a
modificaciones de la estructura primaria y secundaria y como consecuencia la terciaria
que, a su vez, puede da lugar a una pérdida de la función. Este daño es irreversible (Dean
et al., 1993). Algunos ejemplos son: en la albúmina sérica bovina se oxidan los residuos del
triptofano y de la cisteina con lo cual pierde su capacidad antioxidante (Silver et al., 1998).
Otro ejemplo es la gonadotropina equina que in vitro, tanto su estructura como su
19
función es alterada, esta alteración se manifiesta como una pérdida en su capacidad
para inducir la ovulación (Ortega-Camarillo et al., 1999).
La LDL también es afectada tanto en su parte proteica como lipídica y en esta condición
(LDL-oxidada) participa en la formación de la placa de ateroma. Recientemente se ha
descrito que la insulina pierde función por la oxidación de fenilalaninas y tirosinas (Olivares
et al., 2005 a, b).
Las proteínas dañadas por las ERO no deben ser consideradas como productos finales,
ya que estas son capaces de dañar otras biomoléculas, como fue demostrado al
exponer el ácido linoleico y un tripéptido (Glu-Ala-Tir) al radical-albúmina-sérica bovina,
dando como resultado la formación de dienos conjugados y ditirosinas respectivamente
(Ostad, 2002).
Las proteínas además de verse afectadas por los radicales libres, también resultan
sensibles al reaccionar con productos de lipoperoxidación tales como el
malondialdehído (MDA), el 4-hidroxinonenal (4-HNE) y la acroleina, entre otros. Estos
productos finales pueden reaccionar con los grupos amino libres y grupos sulfhidrilos de
las proteínas y formar aductos (unión del grupo aldehído de los productos de Lpx y el
grupo amino libre o sulfhidrilo de las proteínas), la cual es otra forma de alterar una
proteína por estrés oxidativo (Moncada, 2003). Por ejemplo, el 4-HNE presenta gran afinidad
por los residuos cisteina, lisina e histidina originando un aducto estable de Michael con
una estructura hemiacetal (Schaur, 2003, Peterson and Doorn, 2004, Esterbauer, 1991, Uchida et al, 2003) y
forma un pirrol, lo cual ha sido determinado en dos tipos de Albúmina Sérica Bovina (α y
.globulinas) (Hidalgo F; et al, 1998) ץ
La concentración fisiológica en el organismo humano del producto 4-HNE es <1 M. Se
ha demostrado que modifica la Apo lipoproteína B de la LDL, al reaccionar con los
residuos de lisina y en menor grado a histidinas y cisteinas (Jürguens et al; 1986).
La formación de aductos inducen disfunciones en las proteínas y alteran la respuesta
celular (Zarcovic, 2003; Peterson and Doorn, 2004). Se ha visto que el 4-HNE puede contribuir a los
mecanismos de obesidad y resistencia a la insulina, modificando proteínas reguladoras
del adipocito (Grimsrud et al, 2007). En la enfermedad de Parkinson el 4-HNE participa en la
disfunción mitocondrial y degeneración de las células dopaminérgicas (Jenner, 2003) y
puede reaccionar con las proteínas neuronales de la sustancia nigra (Yoritaka et al, 1996).
20
La presencia de aductos 4-HNE y MDA en pacientes dializados es considerado como
un factor de riesgo adicional para complicaciones cardiovasculares (Carluccio et al, 2002). Se
ha descrito que estos aductos, son detectados en cartílago sinovial de pacientes
osteoartríticos (Shah et al, 2005), en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, en la
aterosclerosis (kaur et al., 1997), en desórdenes neurodegenerativos (Negre S; et al, 2007), en el
alzheimer (Sayre et al., 1997), en el parkinson(Castellani et al., 1996) , en el cáncer (Halliw ell et al, 2004), en
daño retinal (Romero F; et al, 1998), diabetes (Odani et al, 1996, Portero-Otin et al, 1995) entre otras.
Cuando existe un incremento de los aductos formados con MDA y 4-HNE se presenta
una relación inversa con respecto a las concentraciones de antioxidantes como el
glutatión, la vitamina E y C; es decir se encuentra un imbalance entre las enzimas
antioxidantes y los productos de lipoperoxidación que pueden generar aductos (Loguercio
and Federico, 2003).
En relación con el producto Malondialdehído (MDA) es el mayor compuesto carbonílico
genotóxico, generado por la lipoperoxidación de los ácidos grasos poliinsaturados y es
también un subproducto del metabolismo del ácido araquidónico en la síntesis de
prostaglandinas, del ácido eicosapentaenoico y del ácido docosahexaenoico (Esterbauer et
al, 1991). Se ha mostrado que es cancerígeno en roedores y mutagénico en bacterias y en
células mamarias. El MDA reacciona con el grupo amino de la lisina y produce
dihidropiridinas (Kikugaw a and Ido, 1984), también forma base de Schiff que modifican las
lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Esterbauer et al, 1993).
2. Antecedentes
La Diabetes mellitus es una enfermedad que cursa con el estado metabólico de estrés
oxidativo, condición que puede afectar a las biomoléculas, entre ellas las proteínas. Los
aminoácidos que forman las proteínas pueden ser modificados por el estrés Oxidativo
(EO), ya sea directamente por los radicales libres o indirectamente al reaccionar con
aldehídos alifáticos producidos durante la lipoperoxidación. Como consecuencia de
estas condiciones, las proteínas pueden alterar su función.
Con base en lo anterior, Olivares y colaboradores en el año 2005 propusieron que el EO
presente en los pacientes con Diabetes Mellitus tipo 2 puede oxidar a la hormona
proteica insulina. Mediante un modelo in vitro expusieron insulina humana recombinante
a los radicales libres HO• formados mediante la reacción de Fenton con H2O2 y CuSO4,
resultando en la proteína la hidroxilación de fenilalaninas formando tirosinas y a partir
21
de estas y de las otras cuatro ya existentes en la insulina, se dió lugar a la formación de
catecoles y ortoquinonas, presentándose un incremento en la exposición y formación de
grupos carbonilos libres por la modificación de la estructura primaria y secundaria de la
proteína, con lo que se concluyó que el radical hidroxilo in vitro, es capaz de inducir
modificaciones moleculares en la hormona (Olivares 2005a), condición que llevó a la
pérdida de un 40% de la actividad biológica de la hormona, lo cual fue demostrado en
un sistema de radiorespirometría, utilizando tejido dependiente de insulina y glucosa
marcada con 14C (Olivares 2005b).
3. Planteamiento del trabajo
En este trabajo se plantea la posibilidad de que la insulina no sólo sea modificada en su
función por la interacción directa con los RL, también podría ser modificada mediante la
formación de aductos con los productos de lipoperoxidación como el malondialdehído
(MDA), debido a que algunos de sus aminoácidos (1 lisina y los 2 aminos terminales de
las dos cadenas peptídicas) son susceptibles a ser modificados químicamente por este
producto de lipoperoxidación.
Por lo que nuestra pregunta a responder es:
¿La exposición de la insulina a productos de lipoperoxidación in vitro, conduce a
cambios químicos y funcionales de la hormona?
4. Justificación
En la Diabetes Mellitus coexisten la formación de RL y de productos de
lipoperoxidación, por lo tanto es posible que la insulina no sólo sea modificada por la
interacción con los RL como ya se ha demostrado (Olivares 2005a), también podría ser
modificada al formar aductos con los aldehídos alifáticos producidos por el evento de
lipoperoxidación.
Esto sería una evidencia más de que el estrés oxidativo debe ser controlado en los
pacientes con resistencia a la insulina, Diabetes y síndrome metabólico entre otros, con
la finalidad de que la insulina que están sintetizando funcione eficientemente.
22
5. Hipótesis
La formación de aductos entre la insulina recombinante humana y aldehídos alifáticos
productos de lipoperoxidación, modifica su estructura química y por lo tanto disminuye
su función.
6. Objetivo general
Determinar in vitro, el efecto de los aldehídos alifáticos productos de lipoperoxidación
sobre la insulina humana recombinante.
6.1. Objetivos particulares
-Determinar, in vitro, la formación de aductos entre la hormona insulina y el producto de
lipoperoxidación, malondialdehído.
-Determinar en rata, el efecto hipoglucemiante del aducto insulina-MDA.
7. Material y Métodos
7.1. Reactivos
La insulina (Origen ADN recombinante, (Humulin*R. Lilly)) fue obtenida de los
laboratorios Lilly Lab. México. Carbonato de sodio (Na2CO3), tartrato de sodio, hidróxido
de sodio (NaOH), sulfato de cobre (CuSO4), folín-Ciocalteu, albúmina bovina, 1,1,3,3-
tetrametoxipropano (Malondialdehído bis (dimetilacetal)), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido
tiobarbitúrico (TBA), trizma PRE-SET, ácido clorhídrico (HCl), 2,4-Dinitrofenilhidrazona,
ácido tricloroacético (TCA), etanol, acetato de etilo, guanidina hydrochloride, fosfato de
potasio mono y dibásico, buffer de fosfatos, ácido linolénico, ácido linoléico y peróxido
de hidrógeno (H2O2) fueron obtenidos del laboratorio Sigma (St. Louis, MO, USA).
7.2. Sujetos experimentales
Se utilizaron 54 ratas macho adultas de la cepa Wistar con peso aproximado de 300 +/-
5 gramos obtenidas del bioterio del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias
(INER). Se mantuvieron con libre acceso a comida y agua; con un período de
luz/oscuridad de 12 h.
23
7.3. Formación de aductos entre insulina y aldehídos alifáticos.
Para la formación de aductos se siguieron dos estrategias metodológicas:
(a). En la primera se diseñó un sistema generador de productos de lipoperoxidación el
cual consistió en exponer ácidos grasos insaturados (linolénico y linoléico) a RL (HO•)
para obtener los aldehídos alifáticos (productos de lipoperoxidación) que en presencia
de insulina forman aductos.
El procedimiento fue el siguiente:
Se mezclaron los ácidos grasos insaturados a una concentración de 90 mM en Trizma
Pre-set 7.2 mM, pH 8 y de esta emulsión se tomaron alícuotas de 20 L que fueron
mezcladas con 40 UI (Unidad Internacional: la 22ª parte de un mg de insulina) de
insulina (2 mg), peróxido de hidrógeno 5 mM, sulfato de cobre 4 mM (estos dos últimos
son los componentes de la reacción de Fenton, la cual produce radicales HO•) en un
amortiguador de fosfatos pH 7.4, 50 mM, ajustando un volumen final de 2 mL.
Los grupos experimentales fueron:
1) Insulina + Amortiguador,
2) Insulina + Ácidos grasos,
3) Insulina + H2O2,
4) Insulina + CuSO4,
5) Insulina + H2O2 + CuSO4,
6) Ácidos grasos,
7) Insulina + Ácidos grasos + H2O2 + CuSO4.
Se incubó por 2 horas a 40 °C. Al término de la incubación se adicionó 1 mL de ácido
tricloroacético (TCA) al 10 % y se centrifugó a 1409 Xg durante 10 minutos, este
procedimiento se realizó dos veces más con TCA al 5 %.
(b). En la segunda estrategia se preparó una solución de 1,1,3,3,-tetrametoxipropano
(Malondialdehído bis (dietilacetal)) 10 mM en ácido sulfúrico 1 %, el cual es un
precursor de MDA, y de esta solución se tomaron 250 L en presencia de 20 UI de
insulina (1 mg) y se aforó a 1 mL con HCl 0.2 N para dar una concentración final de 2.5
mM del precursor. Se incubó a 40 °C durante 2 horas y al término de la incubación se
adicionó 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) al 10 % y se centrifugó a 1409 Xg durante
10 minutos, este procedimiento se realizó dos veces más con TCA al 5 %. En los dos
24
diseños, la proteína (insulina) precipitada fue utilizada para cuantificar el MDA unido a la
proteína mediante las técnicas del ácido tiobarbitúrico (TBA) y la de grupos carbonilos
para demostrar la formación de aductos. Se tomaron como grupos control la insulina +
el ácido clorhídrico y el malondialdehído + el ácido clorhídrico.
7.4. Cuantificación de Malondialdehído
La formación de aductos fue evaluado cuantificando el MDA unido a la proteína
(insulina) y se realizó de acuerdo al método de Yagi (1998) con ácido tiobarbitúrico
(TBA) (Fig. 6). Se utilizó la insulina precipitada disuelta en 500 μL de Trizma Pre-set 7.2
mM, pH 8; se le adicionó 1 mL de TBA 0.375 % en HCl 0.2 N y 500 μL de HCl 0.2 N, fue
incubada por 15 minutos en baño María. Terminado el tiempo se centrifugó 2 veces a
1409 Xg durante 8 minutos, se separó el sobrenadante y este fue leído a 529 nm. Como
estándar se uti lizó 1,1,3,3,-tetrametoxipropano 0.1 mM.
7.5. Cuantificación de grupos carboniloSe utilizó la técnica de 2,4-
dinitrofenilhidrazina (DNPH) (Dalle-Donne et al., 2003) (Fig. 7). A la proteína (insulina)
precipitada, se le resuspendió en 500 μL de 2,4-dinitrofeni lhidrazina 10 mM en HCl 2.5
M y fueron incubadas a temperatura ambiente por una hora a obscuras. Terminada la
incubación se adicionó TCA al 10 % y se centrifugaron 8 minutos a 1409 Xg, de nuevo
se agregó 1 mL de TCA pero ahora al 5 % y de igual forma se centrifugó a las g
mencionadas. La proteína fue lavada con 1.5 mL de etanol-acetato de etilo (1:1) (v/v),
en el caso de la insulina incubada con el precursor este paso se omitió. La pastilla fue
disuelta en 500 μL de clorhidrato de guanidina 6 M y finalmente estas fueron incubadas
por 10 minutos a 37 °C; los carbonilos totales fueron medidos a una longitud de 375 nm.
El coeficiente de extinción molar de la dinitrofenilhidrazina fue utilizado para calcular la
concentración de carbonilos ε= 22,000/M-1 cm-1=22,000/106 nmol/ml.
7.6. Efecto hipoglucemiante
Para determinar la función biológica de la insulina modificada, se utilizó como modelo
experimental ratas macho de la cepa Wistar de 300 ± 5 g, en condiciones adlibitum y se
distribuyeron al azar en 6 grupos independientes de 9 sujetos cada uno. Los animales
experimentales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (50 mg/kg) por vía
25
intraperitoneal (i.p). Se les administró por vía i.p uno de los siguientes tratamientos en
un volumen final de 500 L de amortiguador:
1) 500 L de amortiguador Krebs Ringer (como grupo control).
2) 0.3 UI de insulina nativa.
3) 0.015 mg de insulina modificada por el precursor (1,1,3,3,-tetrametoxipropano
(MDA)).
4) insulina incubada previamente con la mezcla de los ácidos grasos insaturados
(linolénico y linoléico).
5) 0.015 mg de proteína oxidada por radicales HO• (insulina+Fenton).
6) insulina oxidada y con el aducto (insulina+Fenton+ácidos grasos).
Antes de la administración (tiempo 0) a los 6 grupos se les midió la glucemia basal en
sangre, (para lo cual se les hizo una incisión en la cola y se tomó una gota de sangre
que se colocó en un glucómetro; después de ser administradas las soluciones se evaluó
la glucemia a los 10, 20, 30 y 40 minutos, la medición se realizó con un glucómetro
(Accu-Chek sensor, Roche. Bayer HealthCare) al término del experimento los sujetos
experimentales fueron sacrificados por el personal del bioterio (Diagrama 1).
7.7. Análisis estadístico.
Los resultados son expresados como promedios ± DE. Los resultados de MDA,
carbonilos y área bajo la curva (ABC) fueron examinados por un Análisis de Varianza,
(ANOVA) con una prueba de Bonferroni con el programa Prism 4.0 (GraphPad, San
Diego, CA, USA). Para el ABC se utilizó winnonlin noncompartmental analysis program,
versión 2 (v02.0a) con el método o regla del trapezoide.
Las diferencias entre las pendientes fueron analizadas con el programa Pharm PCS
versión 4, 2da edición (Manual of pharmacology calculations computer program de
Ronald Tallarida and Murria).
26
Diagrama 1. Medición del efecto hipoglucemiante en ratas.
8. RESULTADOS
Para poder demostrar la formación de aductos entre los productos de Lpx (aldehídos
alifáticos) y la insulina se implementó una metodología que puede cuantificar la cantidad
de MDA unido a la proteína. Un grupo aldehído del MDA puede interactuar con el grupo
amino libre de algún aminoácido de la insulina, esta interacción resulta en una base de
shiff formando el aducto, la cual es una reacción inestable. Este aducto en un medio
ácido y a temperaturas altas, se disocia quedando libre el MDA y tiene la posibilidad de
reaccionar con el ácido tiobarbitúrico (TBA) produciéndose un compuesto colorido que
puede detectarse espectrofotométricamente de acuerdo a la metodología de Yagi
(1998). En la literatura se ha descrito que la cuantificación de Malondialdehído o
también llamado compuestos reactivos al ácido tiobarbitúrico (CRAT) pueden
detectarse a diferentes longitudes de onda, esto debido posiblemente a los diferentes
procedimientos metodológicos, por lo que el rango que se maneja es de 527 a 534 nm.
Krebs Ringer N=9
Insulina Nativa N=9
Insulina+ Fenton
N=9
Insulina+ Ác.grasos
N=9
Insulina+ MDA N=9
Insuli+fento+ ác. grasos
N=9
Ratas macho Wistar (300 +/- 5 g)
N=54
Glucemia después de la administración de los tratamientos
a los 10, 20, 30 y 40 minutos
Glucemia basal
27
En este trabajo se realizó primeramente una curva estándar con un precursor del MDA,
el 1,1,3,3-tetrametoxipropano (Malondialdehído bis (dimetilacetal)), con dos finalidades,
una con la intención de determinar la longitud de onda en la cual buscaríamos el
compuesto MDA bajo nuestras condiciones metodológicas y para determinar el rango
óptimo de concentraciones de MDA que se pueden utilizar para obtener lecturas
confiables. Los resultados nos indican que la longitud adecuada es de 529 nm.
El siguiente paso fue determinar la concentración de insulina (0-3 mg) adecuado a
utilizar cuando se expone al sistema generador de productos de lipoperoxidación. Este
procedimiento sirvió para; 1) determinar que el diseño metodológico para formar
aductos era funcional, 2) determinar las concentraciones óptimas de los componentes
del fenton (sulfato de cobre y peróxido de hidrógeno) y 3) el tiempo de incubación
óptimo (0–4 Hrs) para nuestros fines. La concentración escogida para el resto de los
experimentos fue de 2 mg (40 UI) de insulina, con la cual las lecturas son confiables.
Las respuestas obtenidas analizando los tiempos de incubación mostraron una relación
directa, se decidió incubar 2 horas ya que las lecturas eran confiables y reproducibles
además de que de este modo el experimento completo se podía realizar en el mismo
día.
8.1. Cuantificación de aductos entre la hormona insulina y el aldehído alifático
malondialdehído.
Con las condiciones experimentales ya establecidas (2 mg de insulina, incubado
durante 2 horas y leído a 529 nm de longitud de onda), se procedió a repetir el
experimento (n=14) con los controles respectivos. Se encontró que la insulina, en
presencia de los ácidos grasos forma aducto, pero que la formación de aductos es
mayor si el rompimiento de los ácidos grasos (Lpx) es inducida mediante una reacción
de Fenton (H2O2 y CuSO4). En los controles: insulina + CuSO4, insulina + H2O2 y en el
fenton + insulina se muestra que no hay tal formación del aducto.
La gráfica 1 muestra los valores de malondialdehído (MDA) expresados en nmoles/mg
insulina. Como grupo control, la insulina nativa (insulina sin modificación alguna), en la
28
segunda barra de la gráfica se muestra que la insulina incubada en presencia de ácidos
grasos insaturados, presenta una media de 0.252 ± 0.11 nmoles MDA/mg insulina, la
cual es aproximadamente el 50 % del valor obtenido en el grupo de insulina + Fenton
en presencia de los ácidos grasos insaturados (0.458 ± 0.10) siendo esta diferencia
estadísticamente significativa de p<0.001. En esta gráfica (1) se incluye la
concentración de MDA detectado cuando la insulina fue incubada directamente con el
precursor de MDA (insulina-MDA), los valores fueron estadísticamente diferentes (p<
0.001) con un valor de 2.977± 0.3438 nmoles MDA/mg insulina con respecto al grupo
control y al de la insulina expuesta al Fenton y ácidos grasos. Al comparar la barra 3 y
la 4 (insulina-MDA) la diferencia observada puede deberse a que el MDA disponible en
la barra 3 para formar el aducto fue menor, dado que en la oxidación de los ácidos
grasos se pueden formar otros aldehídos diferentes además del MDA que pueden
competir por las mismas aminas libres de la insulina (Medina-Navarro R, y col 2007). El número
de la muestra para cada grupo se presenta dentro de cada barra. A los datos se les
realizó un análisis de varianza (ANOVA) con prueba post-hoc de Bonferroni.
Las maneras de formar carbonilos en una proteína expuesta a estrés oxidativo son: a)
por rompimiento de enlaces, b) por glicación c) por interacción directa con RL y d) por
formación de aductos con productos de Lpx. De tal forma que en el sistema con fenton
y ácidos grasos pudo haber formación de carbonilos por radicales libres (Olivares y col 2005a)
o por formación de aductos. En la gráfica 2 se muestran los valores obtenidos para los
grupos carbonilos (375 nm), observándose que la formación de grupos carbonilo en la
insulina al exponerla a Fenton (H2O2 y CuSO4) es menor que en la insulina + Fenton +
ácidos grasos. Esta diferencia entre estos dos grupos es debida entonces a la
formación de aductos.
29
Gráfica 1. Cuantificación de MDA unido a la insulina. Los datos se presentan en promedio ± DE
(n ≥7). El análisis de varianza (ANOVA, prueba de Bonferroni) indica diferencias estadísticas
*(p<0.001), entre el grupo control (insulina nativa, valor=0) vs todos los grupos y entre el análisis
intergrupal.
En la gráfica 2 se presentan los promedios con sus respectivas DE de los grupos
carbonilos, expresados en nmoles de osazonas formadas por mg de insulina. La
hormona incubada en presencia de la reacción de Fenton presentó una media de 30.72
± 6.76 nmol de osazonas/mg de insulina (barra 3) con un valor de p <0.001 al
compararse con la insulina nativa. La insulina, en presencia de ácidos grasos
insaturados más la reacción de Fenton dió un valor de 36.53 ± 7.19 nmol de
osazonas/mg de insulina (barra 4), mientras que la insulina incubada con el precursor
del MDA presentó 6.14 ± 2.11 nmoles/ mg (barra 5). Esto puede interpretarse que la
media de la barra 4 es el resultado de la suma de la barra 3 y 5 (30.72 + 6.14 = 36.86),
ins n
ativa
ins-a
. gra
sos
ins-a
. gra
so-Fento
n
ins-M
DA
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0.2520.110
0.4580.101
2.9770.343
7 7 14 23
*p<0.001
MDA
*
**
*
MD
A
nm
ole
s/m
g i
ns
uli
na
30
por lo tanto es la suma de los grupos carbonilos formados por los radicales hidroxi lo
más los carbonilos formados de manera indirecta por los productos de lipoperoxidación
(aductos).
Gráfica 2. Cuantificación de grupos carbonilos formados por la interacción con los RL y la
formación aductos, Las diferencias estadísticas (* p< 0.001) entre el grupo control (insulina
nativa) y los diferentes tratamientos se muestran con corchetes dentro de la gráfica.
ins n
ativa
ins+a. g
raso
ins+Fento
n
ins+a. g
raso+Fento
n
ins+M
DA
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45 *
0.5860.605
30.726.76
36.537.192
Carbonilos
7 9 14 14
6.142.11
10
*p<0.001
*
*
*
*
nmol
es o
sazo
nas/
mg
insu
lina
31
En la tabla 2 se resumen los valores del MDA que reaccionó con el TBA, que fue la
primera forma de demostrar que hubo formación de aductos. También se resumen los
valores obtenidos de carbonilos formados en la insulina, siendo la segunda forma de
demostrar la interacción entre el grupo amino de la insulina y el aldehído alifático. Se
presentan como promedios ± DE.
Grupos MDA
(nmol/mg insulina) (529nm)
C=O (nmol osazona/
mg insulina) (375nm)
Insulina+ácidos grasos
0.252 ± 0.110 0.586 ± 0.605
Insulina+ácidos grasos
+Fenton
0.458 ± 0.101 36.56 ± 7.192
Insulina+MDA
2.977 ± 0.343 6.140 ± 2.115
Insulina+Fenton -- 30.72 ± 6.766
Insulina nativa 0 0
Tabla 2. Cuantificación de MDA y grupos Carbonilos (C=O) expresados en promedio ± SD.
8.2. Función biológica.
Una vez identificada la formación de aductos, se procedió a establecer si la insulina
modificada por la formación del aducto, tenía una función diferente a la nativa y a la
oxidada por radicales libres. La manera de demostrar lo anterior fue determinando la
función hipoglucemiante de la hormona en un modelo animal (rata).
En la gráfica 3 y en la tabla 2 se presentan los resultados obtenidos del efecto
hipoglucemiante de la insulina en la rata. La glucemia basal (tiempo 0) de todos los
grupos fue de 79.4 ± 2.9 mg/dL. A los treinta minutos después de la administración de
los tratamientos, la glucemia en el grupo control (amortiguador) fue de 70.37 ± 5.91
mg/dL, en el grupo insulina + Fenton + ácidos grasos de 67.77 ± 4.89, en el grupo
insulina + Fenton de 63.87 ± 8.02 mg/dL, mientras que la insulina + MDA fue de 47.09 ±
9.44 mg/dL y la insulina nativa fue de 39.75 ± 7.77 mg/dL. En todos los casos la
glucemia del minuto treinta fue menor que el tiempo cero.
32
Efecto hipoglucemiante
0 10 20 30
35
45
55
65
75
85
ins nativa
ins-MDA
ins-fentonins-a.grasos-fentonamortiguador
ins-ac.grasos
minutos
glu
ce
mia
(m
g/d
L)
pendientes
0 10 20 30 40
35
45
55
65
75
85
amortiguador
ins nativa
ins-MDA
ins-fentonins-a.grasos-fenton
ins-ac.grasos
tiempo(min)
glu
ce
mia
(m
g/d
L)
B)
A)
Gráfica 3. A) Efecto hipoglucemiante de la insulina nativa e insulina modificada por EO,
administrada vía intraperitoneal en rata macho Wistar en condiciones adlibitum. B) Análisis de
regresión lineal tomando las pendientes como punto de comparación. Se omiten las DE por
facilidad de representación (datos mostrados en la tabla 3).
Los valores de las pendientes obtenidas se muestran en la tabla 3, presentando
diferencias estadísticamente significativas (p<0.001) entre todos los grupos, estas
pendientes nos indican la velocidad de utilización de la glucosa en un tiempo
determinado.
33
Grupos Valor de la pendiente (mg/dL min-1)
Glucemia (mg/dL) al tiempo 0´
Glucemia (mg/dL) al tiempo 30´
Amortiguador -0.3238 ± 0.0857 81.2 ± 5.7 70.37 ± 5.91
Insulina+Fenton+
ácidos grasos -0.4556 ± 0.0912 81.8 ± 6.4 67.77 ± 4.89
Insulina+Fenton -0.5825 ± 0.1912 81.3 ± 8.5 63.87 ± 8.02
Insulina+MDA -0.9918 ± 0.0998 76.1 ± 6.6 47.09 ± 9.44
Insulina nativa -1.3690 ± 0.1318 80.5 ± 6.7 39.75 ± 7.77
Tabla 3. Valor de pendientes y concentración de glucemia (antes y después de la
administración) para los diferentes tratamientos (datos presentados en promedio ± DE).
Si se toma como 100 % la actividad hipoglucemiante de la insulina nativa (39.75 ± 7.77
mg/dL a los treinta minutos), la insulina + Fenton + ácidos grasos pierde su actividad
hipoglucemiante en un 70.5 %, representando sólo el 29.5 % de la insulina nativa. La
insulina + Fenton representa una pérdida de 60.69 %. La insulina + MDA pierde su
función un 18.46 % y la suma de la disminución de la actividad biológica del aducto
insulina-MDA y la insulina + Fenton proporciona un valor inhibitorio de 79.15 %, el cual
es un valor aproximado al encontrado con la insulina + Fenton + ácidos grasos.
Lo que nos indica nuevamente que los aductos participan en el mal funcionamiento de
la insulina.
Los resultados obtenidos indican que la insulina puede perder función biológica por la
oxidación con los RL (Olivares-Corichi y col., 2005a, 2005b) y por la formación de aductos con MDA.
Además, esta función se ve disminuida en mayor proporción cuando coexisten ambos
mecanismos de daño. Cabe mencionar que estas condiciones experimentales de EO
son similares a las que se presentan en los pacientes diabéticos.
Los resultados obtenidos en el efecto hipoglucemiante, fueron analizados con el
programa Winnonlin noncompartamental con la finalidad de obtener el Área Bajo la
Curva (ABC) para cada uno de los tratamientos administrados; en el estadístico se
observan diferencias significativas entre el grupo control y los diferentes tratamientos,
así como en el análisis intergrupal con un valor de p<0.001. Los valores obtenidos del
ABC se expresan en promedio ± DE (tabla 4), la cinética muestra los efectos de
inhibición de la actividad biológica de la insulina, es decir; que entre menos área
34
ocupada mayor es la eficiencia del tratamiento; por lo tanto el tratamiento que tenga una
similitud con el amortiguador será menos eficiente.
Grupos ABC (mg/dL min-1) p<0.001
1. Amortiguador 2928.08 ± 145.95 1 VS 2, 3, 4
2. Insulina nativa 2087.22 ± 303.59 2 VS 5, 6
3. Insulina+MDA 2312.54 ± 287.15 3 VS 5, 6
4. Insulina + ácidos grasos 2033.32 ±195.16 4 VS 5, 6
5. Insulina+Fenton 2784.81 ± 422.92
6. Insulina+Fenton+ácidos grasos 2857.76 ± 201.47
Tabla 4. Integración de datos individuales del área bajo la curva para cada tratamiento
experimental, con una diferencia estadística (p<0.001) (datos expresados en media y DE).
La proteína insulina presenta tres sitios de unión capaces de reaccionar con el producto
de lipoperoxidación malondialdehído (βLis29, αGli1, αFen1). Sin embargo, presenta más
sitios de unión donde existe la posibilidad de reaccionar con los aldehídos alifá ticos, por
lo tanto si tomamos en cuenta una relación mol a mol con respecto a los lugares
disponibles de la insulina para formar un aducto, dicha proteína presenta 1.033 x 10 -6
moles de grupos disponibles/mg de proteína que corresponderían al 100%. Por lo que
al interaccionar con el precursor del MDA se ocupa el 0.289%/mg de proteína, que en la
metodología utilizada (2 mg de proteína) representa el 0.578%. En relación a la
interacción de la insulina con los aldehídos generados en la mezcla de los ácidos
grasos más el fenton se encontró sólo ocupado el 0.088%. Este porcentaje es menor
que el anterior, puesto que cabe la posibilidad de que se generen otros productos
adicionales al MDA por la reacción del fenton hacia los ácidos grasos. La interacción de
la insulina con los ácidos grasos, representa aproximadamente la mitad del anterior
(0.0489% del sistema), debido a la ausencia de radicales libres (Tabla 5).
35
Grupos moles de grupos
disponibles
%
/mg insulina
Insulina nativa 1.03 x 10-6 100
Insulina+MDA 2.977 x 10-9 0.289
Insulina+ac grasos 0.252 x 10-9 0.024
Insuli+fent+ac grasos 0.458 x 10-9 0.044
Tabla 5. Sitios disponibles en la insulina para interaccionar con los aldehídos alifáticos.
9. DISCUSIÓN
El estrés oxidativo es un estado metabólico presente en enfermedades crónico
degenerativas como la aterosclerosis, artritis reumatoide, enfermedad pulmonar
obstructiva crónica, asma, cáncer y diabetes. Este estado se caracteriza por un
imbalance entre la producción de radicales libres y defensas antioxidantes conduciendo
daño en los tejidos. El daño al tejido es una consecuencia final de los cambios
moleculares oxidativos en las biomoléculas como a) adición de nuevos grupos
funcionales (hidroxilación (Olivares et al, 2005b), nitración), b) formación de dímeros de
ditirosina, c) rompimiento de ácidos grasos insaturados, lo cual conduce a la formación
de productos reactivos capaces de interaccionar con otras biomoléculas para formar
aductos y d) formación de grupos carbonilo (Dalle-Done et al, 2003).
En relación a los grupos carbonilo, estos pueden formarse por a) la oxidación de
algunos residuos de aminoácidos (lisina, arginina y prolina) (Amici et al, 1989; Uchida et al, 1990),
por el rompimiento de enlaces peptídicos de la estructura primaria de la prote ína, por el
rompimiento de enlaces o puentes de hidrógeno de la estructura secundaria (Garrison, 1987),
b) o por reacciones con carbohidratos reductores (glicación) (Mullarkey et al, 1990; Miyata, 2002), c)
por interacción directa con RL y d) por reacciones secundarias (formación de aductos)
(Medina-Navarro et al, 2007) de algunas cadenas laterales de los aminoácidos (lisina) con
productos de LPx como el 4-hydroxy-2-nonenal y MDA (Negre et al, 2007). Se ha visto que las
proteínas dañadas por las ERO no deben ser consideradas como productos finales, ya
que estas son capaces de dañar otras biomoléculas, como fue demostrado al exponer
el ácido linoléico y un tripéptido (Glu-Ala-Tir) a radical-albúmina-sérica bovina, dando
como resultado la formación de dienos conjugados y ditirosinas respectivamente (Ostad,
2002).
36
Recientemente se ha descrito que la insulina pierde función por la oxidación de
fenilalaninas y tirosinas (Olivares et al., 2005 a, b), por lo que se piensa que lo mismo podría
ocurrir al exponer a la insulina con los aldehídos alifáticos productos de
lipoperoxidación.
En este caso se observó la formación de los aductos (MDA), probablemente entre el
grupo amino de la insulina y el aldehído del producto de lipoperoxidación, mostrando un
incremento significativo comparado con la insulina nativa (p < 0.001), respecto a la
cuantificación de grupos carbonilo, la formación fue de 36.53 ± 7.19 nmoles de
osazonas formadas por mg de insulina.
La formación de aductos con el producto MDA se demostró incubando la insulina con la
mezcla de la reacción de Fenton y los ácidos grasos insaturados (linolénico y linoléico)
a temperatura de 40 ºC para producir los aldehídos alifáticos que en presencia de la
insulina formaron los aductos (0.45 ± 0.10 nmol/mg insulina). Otra forma fue al exponer
la insulina con el precursor de MDA, con lo cual se observo un incremento en la
formación del aducto (2.97 ± 0.34 nmol/mg insulina). Esto pudo deberse a que cuando
se expone la insulina a la reacción de fenton y a los ácidos grasos se pueden generar
otros aldehídos reactivos (4-HNE, 4-HHE), además del MDA que incluso pueden
competir por las mismas aminas libres de la insulina (Medina-Navarro R et al, 2007). Los aductos
fueron cuantificados con la técnica del ácido tiobarbitúrico (el cual genera un aducto
cuantificable a 529 nm) y grupos carbonilos, en ambos casos se observó un incremento
en su formación.
De los aminoácidos que se han descrito en la literatura como susceptibles a
modificaciones por estrés oxidativo, en el caso de la hormona insulina esta proteína
consta de 51 aminoácidos y contiene en su estructura primaria 22 con posibilidad de ser
modificados, ya sea de manera directa por los radicales libres o de forma indirecta por
los productos de lipoperoxidación. De estos aminoácidos, cinco (βLis29, αGli1, αFen1,
βHis5, 10) pueden formar aductos con diferentes productos de lipoperoxidación mediante
la interacción del grupo amino libre o terminal de los aminoácidos con el grupo aldehído
de los productos de LPx. Debido a que la insulina presenta en su estructura primaria 3
de las 5 posibilidades de reaccionar con el producto de lipoperoxidación
malondialdehído (ya sea con los aminos terminales de la glicina y fenilalanina o con el
amino de libre de la lisina), se determinó la relación mol a mol de los lugares disponibles
37
de la insulina para formar un aducto. Esta proteína presenta 1.033 x 10-6 moles de
grupos disponibles/mg de proteína que corresponderían al 100%, por lo que al
interaccionar con el precursor del MDA se ocupa el 0.289%/mg de proteína, que en la
metodología utilizada (2 mg de proteína) representa el 0.578% de grupos que han
reaccionado. En la relación a la interacción de la insulina, los ácidos grasos y el fenton
se ocupa el 0.088%, el porcentaje se vió disminuido puesto que existe la posibilidad de
generarse más productos de lipoperoxidación por la reacción del fenton hacia los ácidos
grasos. La interacción de la insulina con los ácidos grasos, representa
aproximadamente la mitad del anterior (0.0489% del sistema), debido a la ausencia de
radicales libres. Esto puede parecer poco, sin embargo en el análisis del efecto
hipoglucemiante, se observó una disminución importante en el efecto de la hormona. La
insulina sometida a la reacción de Fenton indujo una hipoglucemia de 63.87 ± 8.02
mg/dl que representa una actividad 60.69 % menor cuando se compara con la actividad
de la insulina nativa a 30 minutos; el efecto de la incubación de la insulina en una
reacción de Fenton incubada con los ácidos grasos insaturados produjo la menor
actividad hipoglucemiante de la hormona (67.77 ± 4.83 mg/dL) representando solo el
29.5 % de la eficiencia en comparación de la insulina nativa, la insulina que formo un
aducto con MDA fue 18.46 % menos eficiente en su actividad biológica (47.09 ± 9.44
mg/dL).
Con respecto al área bajo la curva (concentración-tiempo), la cual es la integración de
los datos individuales tras la administración de una dosis única para cada grupo
experimental, se observa el mismo patrón en el efecto hipoglucemiante; siendo la
insulina expuesta a los ácidos grasos y al fenton quien presenta una mayor ABC
(2857.76 ± 201.47) al igual que la pérdida de la función (70.5%), siguiendo la insulina+
fenton con un área de 2784.81 ± 422.92 y una pérdida de 60.69%.
Con este trabajo se corrobora que el daño a la molécula de insulina, inducido in vitro por
un sistema generador de radicales hidroxilo, (Olivares-Corichi y col., 2005a, 2005b) disminuye la
actividad biológica de la hormona (Olivares-Corichi y col., 2005b), al modificar la actividad
hipoglucemiante de la insulina demostrado en la rata, observándose que tal efecto es
afectado debido a la formación de aductos, participando diferentes productos de
lipoperoxidación (Medina-Navarro y col., 2007), siendo probable que el MDA sea el producto de
LPx que participe en mayor medida en condiciones patológicas debido a que se
encuentra en mayor concentración que otros productos como el HNE y la acroleina; se
38
ha descrito que la función hipoglucemiante de la insulina puede ser disminuida en
aproximadamente un 25% cuando es expuesta in vitro a la acroleína (Medina y col., 2006). Por
lo tanto se demuestra que la disminución en la función biológica de la insulina
cuantificada como efecto hipoglucemiante se agrava más cuando coexisten ambos
mecanismos de daño, debido a un daño directo por la generación de ERO y por un
daño indirecto por la formación de aductos producidos durante la lipoperoxidación.
Entonces se podría decir que la suma de los efectos indirectos y directos sobre la
insulina, además de la baja capacidad antioxidante del paciente diabético y el estrés
oxidativo en el que permanece, podría inducir la alteración en la función biológica de las
proteínas, incluyendo a la insulina.
Todas estas características de daño molecular pueden contribuir a las complicaciones
del diabético incluyendo a la aterosclerosis asociada, y a las disfunciones endotelial y
vascular. Se ha reportado que las complicaciones de la diabetes como la neuropatía y
la retinopatía, están relacionadas con el estrés oxidativo, lo que nos hace pensar que
una mejor capacidad antioxidante del paciente diabético no sólo disminuiría las
complicaciones, sino que la insulina no sería dañada y su función biológica mejoraría.
La capacidad antioxidante de los pacientes no sólo se centraría en compuestos que
inactiven a los radicales libres, también se incluirían a los compuestos con la capacidad
de evitar la formación de aductos como es el caso de la piridoxamina, esta molécula
evita la formación de aductos con el residuo lisina y por lo tanto la formación de pirroles
(Amarnath et al, 2004).
Tomando en cuenta que la función de la insulina es modificada in vitro tanto por los
radicales libres como por los productos de lipoperoxidación, condiciones similares a las
que se encuentran los pacientes con Diabetes Mellitus, Montes y colaboradores (2007,
sometido) expusieron insulina humana recombinante a sangre de pacientes diabéticos
con hiperglucemia (>300 mg/dl) con la finalidad de observar si la función de la insulina
es modificada bajo estas condiciones, demostrando que la insulina fue hidroxilada,
formó quinonas, dímeros de tirosinas (ditirosinas) y aumento en la concentración de
carbonilos por lo que la hormona perdió un 33% de su actividad hipoglucemiante en un
modelo animal. En este trabajo se menciona que el daño pudo deberse tanto al efecto
oxidante de los RL producidos por las células (neutrófilos) y a la formación de aductos
con los productos de lipoperoxidación, debido a la interacción que hubo con los diversos
aldehídos alifáticos que se pudieron haber formado, entre ellos el MDA.
39
10. CONCLUSIONES.
- El malondialdehído, producto de lipoperoxidación, modifica la estructura química
de la insulina al formar aducto.
- La formación del aducto disminuye la actividad hipoglucemiante de la hormona,
comparado con la insulina nativa.
11. PERSPECTIVAS.
En este trabajo, además de haber concluido que existe un cambio químico en la
estructura de la insulina humana recombinante, al reaccionar con los aldehídos
alifáticos y de haber formación de aductos que interfieren en la actividad biológica de la
proteína; se pretende realizar geles de poliacrilamida no desnaturalizantes para:
a) Determinar la posible existencia de un cambio electroforético entre la insulina
humana recombinante y la insulina con el aducto, lo cual indicaría de una mejor manera
la modificación en la estructura química de la proteína.
b) Cuantificar diferentes tipos de aldehídos alifáticos e inhibir la formación de aductos
con la insulina por medio de fármacos como la piridoxamina o el piridoxal, entre otros.
12.- IMPACTO
Estos resultados son parte de la búsqueda de un marcador predictor de resistencia a la
insulina. Si logramos detectar que los pacientes que cursan con resistencia la insulina,
desde obesidad hasta síndrome metabólico, tienen elevadas concentraciones de
insulina modificada (por estrés oxidativo) circulando, a comparación de la gente sana,
esto nos indicaría que parte de la insulina de la que se está sintetizando está siendo
modificada y que sería una de las causas por las que el páncreas se ve obligado a
trabajar más, lo que daría posiblemente el proceso de hiperinsulinemia.
40
12. BIBLIOGRAFÍA.
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