aislamiento, identificaciÓn y caracterizaciÓn de...
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UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGíA
LAB. DE BIOTECNOLOGíA DE MICROORGANISMOS
“ SIXTO DAVID ROJO”
AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE BIFIDOBACTERIAS PRESENTES EN HECES DE LACTANTES.
TRABAJO ESPECIAL DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE LICENCIADA EN BIOLOGÍA.
REALIZADO POR LA BACHILLER INGRID MARÍA MEDINA GUTIERREZ.
TUTOR: GUILLERMO LÓPEZ CORCUERA.
Mérida, Mayo de 2002.
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A mis Queridos Padres, hermanos y sobrinos.
A mi Esposo.
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Indice.
Pg.
Agradecimientos..................................................................................................... III
Resumen.................................................................................................................IV
Abstract....................................................................................................................V
I. Introducción.......................................................................................................... 1
II.1 Justificación..................................................................................................... 22
II.2 Hipótesis.......................................................................................................... 23
II.3 Objetivos.......................................................................................................... 24
III. Materiales y Métodos.
III.1 Aislamiento y procesamiento de la muestra.................................................. 25
III.2 Medio de cultivo para las bacterias aisladas................................................. 26
III.3 Medio de conservación................................................................................... 27
III.4 Condiciones de cultivo.................................................................................... 28
III.5 Identificación del género Bifidobacterium....................................................... 29
III.5.1Morfología célular......................................................................................... 29
III.5.2 Tinción de Gram.......................................................................................... 29
III.5.3 Tinción de esporas...................................................................................... 29
III.5.4Tinción ácido-resistente................................................................................ 29
III.5.5 Prueba de catalasa...................................................................................... 29
III.5.6 Capacidad de licuación de la gelatina......................................................... 30
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III.5.7 Producción de ácido y gas a partir de glucosa............................................ 30
III.5.8 Reducción de nitrato.................................................................................... 31
III.5.9 Descomposición de aminoácidos, producción de indol................................32
III.5.10 Vía metabólica, Rojo de metilo (RM) y Voges Proskauer (VP).................. 32
III.5.11 Requerimientos de oxígeno: Oxido-fermentación (OF)............................. 33
III.5.12 Crecimiento a 30° C................................................................................... 34
III.5.13 Determinación de la enzima Fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa (F6PPK)... 34
III.5.14 Reacciones de fermentación propias del género Bifidobacterium ........... 36
III.6 Caracterización de las cepas aisladas............................................................ 37
III.6.1 Resistencia a lisozima (l00µg /ml)............................................................... 37
III.6.2 Resistencia a valores bajos de pH. ......................................................... ...38
III.6.3 Resistencia a sales biliares......................................................................... .39
III.6.4 Actividad antimicrobiana sobre microorganísmos patógenos...................... 39
IV Resultados y Discusión.
IV.1 Aislamiento e identificación de las Bifidobacterias......................................... 41
IV.2 Caracterización de las cepas aisladas................................................ ...........49
V. Conclusiones y Recomendaciones................................................................... 65
VI. Anexos............................................................................................................. 68
VII. Bibliografía....................................................................................................... 74
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Agradecimientos.
A Dios en primer lugar, por protegerme y guiar cada paso de mi vida. Al profesor Guillermo López, por permitirme realizar este trabajo en las instalaciones del Lab. de
Biotecnología de Microorganismos “Sixto David Rojo”, y por toda su ayuda la cual siempre fue mas allá de
su responsabilidad de tutor.
Al profesor Julio Otoniel Rojas, por todo su apoyo y colaboración, en la realización de este trabajo. A los profesores Zarack Chacón, Balmore Guerrero, y Ramón Moreno: por sus consejos y recomendaciones.
A Pacheco, cuya labor facilita el trabajo de investigación en el laboratorio. Al Dr. José Barroso (Hospital Sor Juana Inés de la Cruz), por habernos permitido el contacto con sus pacientes, para la recolección de las muestras. Al Dr. León Hernandez (Fac. de Farmacia), por su valiosa ayuda incondicional.
Al Sr. Silverio Díaz, por todo el apoyo brindado durante la utilización del sonicador.
A Karina y Carolina, por su colaboración y por ceder algunos reactivos requeridos. A los laboratorios: Gequimcel, Labiomex, Enzimología de parásitos, Inmunología de parásitos, y al personal que allí labora por toda la colaboración prestada. Al Dpto. de Biología y a los miembros que lo conforman, por la aceptación de este proyecto de investigación. Al Sr. Guillermo, a la Sra. Ligia y a Marisela (BIECI); por todo su cariño. A Liliana y Guillermo, por su invalorable paciencia, amor, por creer siempre en mi. A Vivian, Carlos, Guillermo y Yasmin; espero este logro sea uno de los muchos que compartamos juntos.
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A Ervigio, por creer en mi, y en mis logros que también son tuyos.
A mis compañeros de Laboratorio, especialmente a mis queridas amigas: Soveida, por sus consejos y amistad incondicional, por guiarme en el uso de algunas técnicas utilizadas en el desarrollo de este trabajo; María Elisa, por su agradable compañía y consejos en todo momento. A Mirian, por su amistad infinita la cual me brindó un importante apoyo.
Resumen.
A partir de heces de lactantes sanos de veinte días de nacidos y
alimentados con leche materna se aislaron cuatrocientas colonias en placas con agar TPY. Luego de una selección inicial sólo se conservaron 20 de estas cepas, a partir de cultivos puros se continuó el proceso mediante
siembra en tacos, descartándose siete cepas que no lograron desarrollarse en estas condiciones, las restantes se sometieron a crecimiento en
aerobiosis y a distintas pruebas de identificación específicas del género Bifidobacterium. De ésta manera se descartaron siete cepas más, se procedió a realizar la prueba de la enzima F6PPK propia del género y
finalmente dos del total de las cepas aisladas se suponen pertenecientes al género Bifidobacterium; una de ellas fue sometida a condiciones hostiles a
fin de caracterizarla, encontrando que resiste valores de pH de 2 y 3, durante tres horas, concentraciones de 0,3 % de sales biliares durante 48
horas, y 100 µg/ml de lisozima durante 15 minutos. En cuanto a las
propiedades antimicrobianas contra Listeria monocytogenes CVCM 445,
Escherichia coli pol I A (ULA), Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Enterococcus fecalis ATCC 29212 no fue posible demostrarlas in vitro, aun
con concentraciones de 50% de sobrenadante. Con estos resultados podemos afirmar que la cepa aislada presenta algunas de las cualidades
deseables en un microorganismo probiótico que la hacen apropiada para ser incluida en la elaboración de un producto lácteo.
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Palabras Clave: Bifidobacterium sp, microflora intestinal, heces, probióticos, leche materna, lactante, productos lácteos fermentados, lisozima, sales biliares, antimicrobianos.
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Abstract.
Four hundred colonies were initially isolated, on agar TPY plates, from the
feces of breast fed babies of twenty days old. From these, twenty colonies were
growed on deep agar. Seven colonies failed to grow and the remaining thirteen
were subjected to aerobic and other growing conditions specific for the genus
Bifidobacterium. This yielded six surviving strains in which fructose-6-phosphate-
phosphoketolase activity was tested, and two strains were finally considered as
belonging to the genus Bifidobacterium. One of these strains lost its viability and
the remaining one successfully resisted hostile growing condition which included
pH 2 and 3 for three hours, 0,3% of bile salts during 48 hours, and incubation in
the presence of 100 µg/ml lysozyme for 15 minutes. Its antimicrobial properties
against Listeria monocytogenes CMCV 445, Escherichia coli pol I A (ULA),
Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Enterococcus fecalis ATCC 29212 could
not be demostrated by in vitro experiments, even under treatment with 50% of
supernate. So, we may affirm that our isolated strain has some of the desired
properties of a probiotic microorganism, which make it adequate to be included in
the manufacture of a dairy product.
Key words: Bifidobacterium sp, intestinal microflora, feces, probiotics, breast milk,
breast fed baby, fermented dairy products, lysozyme, bile salts, antimicrobial.
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l.- INTRODUCCION.
Las bifidobacterias fueron descubiertas en 1899–1900 por el Dr. Henry
Tissier, del Instituto Pasteur de Francia. Son habitantes normales del tracto
gastrointestinal humano (Charteris y col., 1998), y están presentes durante toda
nuestra vida, apareciendo a los pocos días después del nacimiento (Grondlund y
col., 1999). Constituyen uno de los diversos géneros predominantes de la
microflora del colon (90%), junto con Peptoestreptococos, Eubacterias, Clostridios
y Bacteroides, y se encuentran presentes en niveles que van desde 108 hasta 1011
bacterias por gramo de material del colon (Wielkorstanje y Winkler, 1970; Mitsuoka
y Kaneuchi, 1977; Mitsuoka, 1984; Allison y col., 1989; Charteris y col., 1998,
Simmering y Blaut, 2001).
Cuando Tissier aisló por primera vez las bifidobacterias, a partir de heces
de lactantes, las denominó Bacillus bifidus, basado en la morfología de éste
microorganismo. También han sido aisladas del intestino, de la vagina y de la
boca de humanos adultos, al igual que del tracto intestinal de varios animales:
ganado vacuno, ovejas, cerdos, pollos, ratones y conejos (Mitsuoka y Kaneuchi,
1977).
Las bifidobacterias son de morfología variada presentan células en forma
de bacilos: cortas, ramificadas en Y, bifurcadas, aisladas, o dispuestas en V, de
allí que se denominen bifidobacterias por presentar forma bífida. Moro (citado en
Shah, 1997a) un científico Italiano descubrió también un grupo de bacterias en las
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condiciones similares a las descritas por Tissier y clasificó al organismo cómo
perteneciente al género Lactobacillus. Aunque existían diferencias entre esos dos
microorganismos, Holland (citado en Shah, 1997a) propuso llamarlas Lactobacillus
bifidus.
En 1924 Orla-Jensen (citados en Mitsuoka y Kaneuchi, 1977; Shah, 1997a)
clasificaron estos microorganismos basándose en criterios fisiológicos y
metabólicos; además de la presencia de enzimas características del género y
requerimientos nutricionales durante el metabolismo.
En 1967 De Vries y Stouthamer (citados en Shah, 1997a) descubrieron la
presencia de la enzima fructosa-6-fosfato-fosfo-cetolasa (F6PPK) en las
bifidobacterias (Scardovi., 1986) y la ausencia de 2 enzimas: aldolasa y glucosa-
6-fosfato-deshidrogenasa, las cuales están presentes en bacterias del género
Lactobacillus (Bezkorovainy y Miller-Cathpole., 1989). La presencia de otras dos
enzimas la α-galactosidasa; de importancia fisiológica por que hidroliza di y
trisacaridos que contienen residuos de galactosa, como por ej. rafinosa y
estaquiosa (Tochikura, citado en Chevalier y col., 1990) y la α-glucosidasa se
encuentran en las bifidobacterias y podrían ser utilizadas cómo rápido método de
identificación y diferenciación (Chevalier y col., 1990; Al-saleh y col., 1998).
Sebald (citado en Shah, 1997a) descubrió que el % de (G+C) en el ADN de
las bifidobacterias difiere del encontrado en el género Lactobacillus. Desde
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entonces no se justificaba la clasificación de las bifidobacterias dentro del género
Lactobacillus (Scardovi, 1986 ; Shah, 1997a; Bezkorovainy y Miller-Cathpole,
1989), por otro lado la composición de fosfolípidos de las bifidobacterias (Iwasaki y
col., 1990) también difiere del encontrado en las bacterias pertenecientes al
género Lactobacillus; ya que las bifidobacterias contienen: poliglicerolfosfolipidos,
alanilfosfatidilglicerol, y lisoderivados del difosfatidilglicerol, último criterio que
permitió la completa individualización de ambos géneros.
La relación molar entre las bases (G+C) presente en el ADN de las
bifidobacterias es del 58 %, esto para las cepas de origen humano, el resto de
especies presenta una relación molar del 55 al 66 % (G+C) (Shah, 1997a).
La ubicación taxonómica de las bifidobacterias ha cambiado desde que
fueron descritas por primera vez, han sido asignadas como pertenecientes a los
géneros: Bacillus, Bacteroides, Nocardia, y Corynebacterium. Hoy día por el alto
contenido en (G+C) de su ADN, y sobre la base de las secuencias de ADNr 16S
(Mitsuoka y Kaneuchi, 1977; Mitsuoka, 1984; Matsuki y col., 1999) el género ha
sido readscrito a la familia Actinomycetaceae, la cual consiste de 5 géneros,
incluyendo 29 especies descritas de acuerdo a su origen ecológico(Law, 1997;
Wood, 1999): 14 especies aisladas a partir de humanos, 12 especies aisladas a
partir de animales, y 3 encontradas en abejas.
Del total de las especies de bifidobacterias sólo 5 son las más ampliamente
utilizadas en la elaboración industrial de productos lácteos: Bifidobacterium
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adolescentis, Bf. Bifidum, Bf. Breve, Bf. infantis y Bf. Longum. Desde el punto de
vista tecnológico las cepas a usar deben tener rápida tasa de crecimiento, rápida
producción de ácido y baja post acidificación durante el almacenamiento (Daigle y
col., 1998; Macfarlane y Cummings, 1999).
No existe una prueba presuntiva que permita distinguir entre las especies
de origen animal y las especies de origen humano. Entre las especies de
bifidobacterias encontradas en humanos tenemos (Mitsuoka y Caneuchi, 1977;
Matsuki y col., 1999):
Bifidobacterium bifidum (biovar a y b). Bf. angulatum.
Bf. infantis. Bf. denticum.
Bf. breve. Bf. catenulatum.
Bf. longum (biovar a y b). Bf. pseudocatenulatum.
Bf. adolescentis (biovar a, b, c y d).
A partir de animales vacunos y porcinos se han aislado: Bf. pseudolongum
tipo a, y Bf.thermophilum; mientras que en aves de corral (pollos) se han
encontrado: Bf. pseudolongum tipo a, b, c y Bf. thermophilum. El resto de
especies se encuentran también en el tracto intestinal de varios animales e
insectos incluyendo abejas (Scardovi, 1986).
Otras características de las bifidobacterias es que son microorganismos
gram positivos, no móviles, no esporulados, anaerobios estrictos (Rada y Koc,
2000), pocas especies pueden tolerar el oxígeno en presencia de CO2 (Caplan y
col., 1999). En general no pueden utilizar el O2 como aceptor final de electrones
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porque carecen de citocromos terminales. A pesar de que la mayoría son catalasa
negativos, algunas especies como por ej. Bf. Indicum, Bf. asteroides poseen una
débil actividad catalasa (Scardovi, 1986). Generalmente la toxicidad del oxígeno
resulta por la activación de compuestos como superóxidos, radicales hidróxidos y
H2O2, dos enzímas la superoxidodismutasa y la catalasa resultan necesarios para
la defensa del organismo ante el efecto tóxico de dichos compuestos, estas
enzimas están ausentes en las bifidobacterias. Por otra parte el H2O2 inactiva la
enzima principal responsable del metabolismo de los carbohidratos, la F6PPK
(Shah, 1997a).
Estas bacterias no solamente producen ácido láctico a partir del
metabolismo de los carbohidratos, sino también ácido acético, y se consideran
microorganismos exigentes ya que requieren factores específicos para el
crecimiento (Shah, 1997b) entre estos se citan: amino azucares, digerido
enzimático de caseína y extracto de levadura (Medio TPY- Tripticaseina-Peptona
de soya-Extracto de levadura ) (Al-saleh y col., 1998)
Las bifidobacterias de origen humano crecen a una temperatura por encima
de 36° C, siendo él optimo 37° C, mientras que las de origen animal crecen desde
41° C hasta 43° C (Mitsuoka y Kaneuchi, 1977). El crecimiento cesa a
temperaturas menores o iguales a 30° C y no son termo resistentes aun a 46° C.
El pH para el crecimiento es de (6,5 – 7), no crecen a valores menores de (4,5 –
5), ó por encima de (8,0 – 8,5).
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El carbono en sus formas carbonato o bicarbonato (o gas CO2) pueden ser
fácilmente utilizados por las bifidobacterias como fuente de carbono. No utilizan
ácidos grasos o ácidos orgánicos como fuente de carbono. La cisteína o la cistina
resultan una fuente de nitrógeno importante para el crecimiento de las
bifidobacterias. Bf. adolescentis, puede utilizar un amplio rango de carbohidratos,
seguido por Bf. breve, Bf. infantis y Bf. longum pueden utilizar entre otros fructosa,
galactosa y lactosa (Roy y Ward, 1990). Todas las especies de origen humano
pueden utilizar la glucosa, galactosa, y generalmente fructosa. La utilización de
carbohidratos varía de especie a especie, así Bf. bifidum fermenta sólo cuatro
carbohidratos mientras que Bf. adolescentis puede fermentar 19 carbohidratos.
Todas las bifidobacterias fermentan la lactosa y lo hacen por la vía denominada
ruta bífida, la enzima principal que interviene en este proceso es la F6PPK
(Scardovi, 1986; Bezkorovainy y Miller-Cathpole., 1989 ; Chevalier y col., 1990;
Nebra y Blanch, 1999).
Las bifidobacterias son capaces de utilizar sales de amonio como fuente de
nitrógeno (Shah, 1997a; Scardovi, 1986). Bf. cuniculi y Bf. suis requieren en el
medio de crecimiento nitrógeno orgánico. Las bifidobacterias de origen animal
presentan alta actividad ureasa, Bf. suis es altamente ureolítico mientras que Bf.
bifidum presenta poca o casi nada de esta actividad. Las bifidobacterias no
reducen el nitrato, ni forman indol, de igual manera responden de manera negativa
frente a los ensayos de: licuefación de la gelatina, y fermentación de glicerol,
adonitol, sorbosa, eritritol y dulcitol (Mitsuoka y Kaneuchi, 1977; Wood, 1999).
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Son resistentes a la kanamicina, neomicina, sulfato de paramomixina, ácido
nalidíxico y al sulfato de polimixina B (Shah, 1997a).
Tissier, a través de sus estudios dedujo que las bifidobacterias en alto
número, podrían ser ingeridas por vía oral, para el tratamiento de la diarrea infantil
(Petschow y Talbott, 1990; Caplan y col., 1999). Desde entonces la atención de
los investigadores se ha centrado en tratar de dilucidar cómo éstas bacterias
contribuyen a mejorar la salud (Matteuzzi y col., 1990; Fuller, 1997; Ouewhand y
col., 1999).
La microflora intestinal humana está constituida por una población
bacteriana compleja, aproximadamente 400 especies de bacterias han sido
aisladas a partir de las heces y los porcentajes corresponden a: Bacteroides (86 %
del total de la flora intestinal), Eubacterias (6–19 %), Bifidobacterias ( 6–36 %),
Peptococos (2–14 %), Enterobacterias (trazas, menos de 5,3 %), Estreptococos y
Lactobacilos (trazas)(Law, 1997; Allison y col., 1989).
El intestino del feto es estéril, pero inmediatamente después del nacimiento
(1 ó 2 días) se inicia la colonización por parte de varios microorganismos que
provienen principalmente de la madre, ya que el niño al pasar por el canal natural
del parto se contamina por contacto con la flora vaginal y anal (Gronlund y col.,
1999; Ouwehand y col., 1999; Mejía, 2001), apareciendo numerosos
microorganismos: Coliformes, Enterococos y Clostridios.
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Después de 48 h de nacido el infante contiene en sus heces más de 1010
ufc/g. Las bifidobacterias comienzan entonces a desarrollarse constituyéndose
cómo la microflora predominante (95 % en el recién nacido y 25 % en un individuo
adulto) (Macfarlane y Cummings, 1999). Existen numerosas controversias para
tratar de establecer cuál es la flora que predomina entre bebes alimentados con
leche materna y bebes alimentados con biberón (fórmula) (Balmer y col., 1989;
Balmer y Wharton 1989; Caplan y col., 1999; Wood, 1999). Yuhara (citado en
Shah, 1997a) reportó a la especie Bf. bifidum como una de las especies más
frecuentemente aislada a partir de heces de infantes alimentados con leche
materna. Beerens (citado en Shah, 1997a) encontró la especie Bf. longum como
la más frecuentemente aislada en heces de bebes alimentados con biberón, en
contraposición Biavati (citado en Shah, 1997a) aisló Bf. bifidum, Bf. infantis, Bf.
longum y Bf. breve a partir de heces de infantes, irrespectivamente estuviesen
alimentados con biberón o leche materna, sin embargo, los infantes alimentados
con biberón presentaron un alto número de Enterobacteriaceas, Estreptococos,
Bacteroides y otros anaerobios, con respecto a las bifidobacterias presentes.
Las bifidobacterias se ha demostrado crecen más vigorosamente en
presencia de leche humana (Shah, 1997a ; Balmer y Wharton, 1989) que en
presencia de leche de vaca, siendo esta la razón que explique el por qué infantes
alimentados con leche materna presentan una alta población de bifidobacterias.
Por otro lado en el intestino de estos infantes existe un pH más bajo, hecho que
desfavorece la implantación de bacterias patógenas (Petschow y Talbott, 1990;
Caplan y col., 1999).
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La leche materna contiene lo que se conoce como factores bifidógenos que
estimulan el crecimiento de las bifidobacterias entre estos encontramos: n-acetil-
D-glucosamina involucrado en la síntesis de la pared celular así como
oligosacáridos y glicoproteínas (Petschow y Talbott, 1990; Shah, 1997b). De esta
manera las bifidobacterias se ven favorecidas incrementando en número y
bloqueando el crecimiento de bacterias gram negativas como: E. coli, Shigella,
Bacteroides fragilis, Staphylococcus aureus y protozoarios, por la producción de
ácido a partir de la fermentación de la lactosa.
Las paredes del colon proveen a las bifidobacterias un ambiente ecológico
especial para su proliferación. Algunas cepas cómo por ej., Bf. infantis segregan
polisacaridos, los cuales pueden iniciar la adhesión de estas bacterias a las
células epiteliales del intestino (Nakazawa y Hosono, 1992; Shah, 1997a;
Charteris y col., 1998; Sanders, 1999). Así mismo los ácidos lipoteicóicos
asociados a la pared de las bacterias gram positivas pueden iniciar el proceso de
adhesión a las células epiteliales. También en estos procesos participan proteínas
y glicoproteínas (Sato, citado en Ouwehand y col., 1999) que pueden unir
fracciones de ácidos grasos de los ácidos lipoteicóicos. La adhesión ocurre sobre
la superficie de las células intestinales sin ocasionar alteraciones morfológicas en
las mismas (Caplan y col., 1999; Macfarlane y Cummings, 1999; Ouwehand y col.,
1999).
La interacción mediada por factores proteicos, se ha evidenciado por la
disminución de la adherencia luego de un tratamiento con tripsina sobre la
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superficie bacteriana. Además se ha determinado que existen carbohidratos en la
superficie de la bacteria involucrada en la adhesión ya que luego de un tratamiento
con periodato la capacidad de adherencia sufre igualmente una importante
disminución. La adherencia de las bifidobacterias al epitelio intestinal aunque no
es indispensable es importante para modificar la respuesta inmune del huésped,
impidiendo que se adhieran otras bacterias patógenas (Simmering y Blaut, 2001).
Las bifidobacterias se caracterizan por constituir la flora predominante del
colon de bebes lactantes (Al-saleh y col., 1998), especialmente en la región
proximal (yeyuno) del colon, mientras que las bacterias del género Lactobacillus
se encuentran principalmente ocupando la región distal (Ileon) del intestino
delgado (Coconnier, citado en Simmering y Blaut, 2001). Sin embargo, éste nivel
de bifidobacterias disminuye a medida que se incluyen cambios en la dieta
(Petschow y Talbott, 1990; Hosoda y col., 1998).
En la población de tercera edad las bifidobacterias disminuyen
extremadamente (Ouwehand y col., 1999), incrementando así las bacterias
patógenas como por ej., Coliformes, Enterobacterias y Clostridios. Esto se debe a
la disminución de la secreción de los jugos gástricos en personas de edad
avanzada, como resultado de esto padecen de constipación o estreñimiento con
frecuencia.
Numerosos estudios realizados establecen que las bifidobacterias ejercen
efectos beneficiosos sobre la salud (Charteris y col., 1998), reduciendo la
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constipación por reemplazo de la flora existente en el colon. Entre otros efectos
beneficiosos de las bifidobacterias se ha encontrado que: suprimen bacterias
patógenas, excretan vitaminas al medio (B1, B2, B6, B12, ácido fólico, biotina,
niacina, ácido pantoténico y vitamina K) (Macfarlane y Cummings, 1999),
estimulan la digestión y absorción, a la vez que aumentan el sistema defensivo del
huésped por su acción sobre las placas de Peyer en el intestino, aumentando los
anticuerpos específicos frente a agentes infecciosos: Ig G en la sangre y de Ig A
en el lumen intestinal (Hosoda y col., 1998; Chen y col., 1999; Ko y col., 1999;
Matzuki y col., 1999; Ouwehand y col., 1999; Sanders, 1999; Simmering y Blaut,
2001).
El consumo de leches fermentadas con bifidobacterias (Hosoda y col.,
1998) conduce a la reducción de los niveles de ciertas enzimas fecales cómo la β-
glucuronidasa implicada en la conversión de procarcinógenos en carcinógenos, se
ha encontrado que las bifidobacterias son efectivas en descomponer estos
compuestos, reduciendo de esta manera el riesgo de contraer cáncer de colon
(Benno y col., 1989; Marteau y col., 1990; Norin y col., 1991; Hosoda y col., 1998;
Caplan y col., 1999; Macfarlane y Cummings, 1999; Parodi, 1999; Sanders, 1999),
El consumo de leche con bífidos además permite eliminar nitritos y
nitrosaminas procarcinógenas a través de mecanismos enzimáticos e
intracelulares, enlazan aminas heterocíclicas (carcinógenos que se forman al
cocinar la carne roja) que pueden ser eliminadas en las heces, Además
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disminuyen otros metabolitos que provocan la putrefacción fecal (Hosoda y col.,
1998; Reddy, 1999) como son: ρ-cresol (producido a partir de la tiroxina), indol y
el amoniaco (Rowland y Goldin, citados en Parodi, 1999). Más recientemente el
interés se ha centrado en la posible reducción del riesgo de contraer cáncer
mamario, verificado por la inhibición del crecimiento de una línea celular de cáncer
mamario debido al consumo de leche fermentada con bífidos (Salminen, citado en
Sanders, 1999; Macfarlane y Cummings, 1999).
Cuando la bifidobacterias forman parte de la microflora del colon afectan la
inmunidad sistémica y local del huésped a través de productos con propiedades
inmunomoduladoras. Interactúan con el sistema inmune en muchos niveles; en la
producción de citokinas, proliferación de monocitos, fagocitosis por macrófagos,
inmunidad celular y modulación de la autoinmunidad. In vitro inducen la formación
de Ig A (Macfarlane y Cummings, 1999; Sanders, 1999).
En los últimos años se ha observado un creciente interés tanto por parte de
la comunidad científica cómo por parte de la población en general, hacia el papel
que estos microorganismos pueden desempeñar en el mantenimiento de la salud
y en la prevención y tratamiento de diferentes enfermedades. A éstos
microorganismos entre otros se les denomina probióticos (Shah, 1997a) es decir,
microorganismos vivos que una vez ingeridos en cantidad suficiente y alojados en
el colon ejercen efectos beneficiosos sobre la salud (Al-saleh y col., 1998; Daigle y
col., 1998; Hosoda y col., 1998; Simmering y Blaut, 2001).
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Para que se tome en consideración a un microorganismo cómo probiótico
éste debe cumplir con las siguientes condiciones .
Debe demostrarse que no es patógeno.
Debe ser resistente a la bilis y a la actividad gástrica.
Debe tener la propiedad de adherencia a las células epiteliales del colon;
provocando exclusión competitiva contra bacterias patógenas por la adhesión a
los mismos receptores de los epiteliocitos (Ouwehand y col., 1999).
Debe producir sustancias antimicrobianas; inhibiendo patógenos mediante la
producción de ácidos orgánicos, ácidos grasos volátiles, así cómo
bacteriocinas, esto último para el caso de las bacterias pertenecientes al
género Lactobacillus (Petzchow y Talbott, 1990; Caplan y col., 1999; Ko y col.,
1999).
Debe modular la respuesta inmune.
Debe ser capaz de ejercer una influencia positiva en las actividades
metabólicas del huésped. Ej,. Asimilación del colesterol, actividad β-
galactosidasa (que favorece la asimilación de la lactosa) (Sanders, 1999),
actividad β-glucanasa, (favorece la asimilación de los β-glucanos de los
cereales), producción de vitaminas.
Debe ser resistente a los procesos tecnológicos a los que se le expone.
El término probiótico fue propuesto por primera vez, por el premio Nobel Elie Metchnikoff (Bibel, citado en Sanders., 1999): Quién afirmó que la longevidad y la existencia de una vida saludable en los pueblos Búlgaros era el resultado de consumir frecuentemente productos lácteos fermentados (Matzuki y col., 1999; Sanders, 1999). Entre las bacterias ácido lácticas más ampliamente utilizadas cómo probióticos se tiene a las pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium (Kimoto y col., 2000).
90
El crecimiento de los probióticos es estimulado por sustancias no digeribles por el hombre, denominadas prebióticos y para que éstos sean efectivos deben escapar de la digestión del tracto intestinal superior, llegar al intestino grueso y ser utilizados selectivamente por un estricto grupo de microorganismos: las Bifidobacterias (Chevalier y col., 1990; Macfarlane y Cummings, 1999; Simmering y Blaut, 2001). Entre los prebióticos que cumplen con estos criterios se tiene a un grupo de oligosacáridos como la inulina un fructooligasacárido presente en: cebolla, ajos, puerros y cereales; (el consumo de 15 g/día de éstos oligosacaridos incrementa 10 veces el número de bifidobacterias en el intestino); oligosacaridos de soya: rafinosa (fructosa-galactosa-glucosa) y estaquiosa (fructosa-galactosa-galactosa-glucosa), presentes en legumbres; pirodextrinas: que son una mezcla compleja de oligosacáridos de glucosa; oligosacaridos trans-galactosilados, galacto-oligosacaridos, xilo-oligosacaridos, isomalto-oligosacaridos y lactulosa (4-Oβ-galactopiranosil-D-fructosa) (Marteau y col., 1990; Rosenthal y Bernstein, 1998; Macfarlane y Cummings, 1999; Nebra y Blanch, 1999): Éste último es un disacárido que se origina por isomerizacion de la lactosa en medios básicos; no se encuentra en la leche cruda pero los tratamientos térmicos a los que se somete la leche en la industria dan lugar a la formación de lactulosa que llega intacta al colon ya que las enzimas presentes en el intestino delgado no son capaces de degradarla, en el colon es metabolizada por las Bifidobacterias favoreciendo su crecimiento.
En cuanto a los productos del metabolismo las bifidobacterias producen a partir de la degradación de los carbohidratos ácido acético y ácido láctico en una relación molar de 3:2 (Chevalier y col., 1990), además se producen pequeñas cantidades de ácido fórmico, etanol y ácido succínico. La formación de ácido láctico y acético tiende a disminuir el pH del intestino inhibiendo así el crecimiento de levaduras y bacterias que causan la putrefacción intestinal (Caplan y col., 1999; Reddy, 1999; Parodi, 1999).
Por los beneficios encontrados al consumir Bifidobacterias los
investigadores apuntan en la actualidad a que las leches fermentadas con bífidos
ejercen numerosos efectos beneficiosos sobre los niños más que cualquier otra
bebida láctea (Rosenthal y Bernstein, 1998; Nebra y Blanch, 1999), esto debido
por una lado a que estas bacterias producen ácido láctico. El ácido láctico juega
un papel preponderante en el metabolismo humano. Es la principal fuente de
energía del músculo cardiaco al tiempo que interviene en la respiración celular del
hígado, riñón, cerebro y músculos estriados.
Se puede identificar al ácido láctico, bajo tres formas D(-), L(+), y DL, ésta
última forma es inactiva ópticamente. El cuerpo humano metaboliza solamente el
isómero que el mismo puede sintetizar, o sea el ácido láctico L(+), razón por la
cual se le denomina ácido láctico fisiológico. La gran capacidad de asimilación de
91
éste isómero hace que se pueda ingerir en los alimentos sin ningún tipo de
restricciones. Entre los microorganismos que sintetizan ácido láctico L(+)
tenemos: Sc. thermophilus, Bf. bifidum, y Lb. lactis, y éste es metabolizado
rápidamente por niños menores de un año de edad. Los productos lácteos
fermentados con otros microorganismos: Lb. delbrueckii ssp bulgaricus, Lb. lactis,
y algunas especies de Leuconostoc contienen ácido láctico D(-), el cual es menos
metabolizable por los infantes y adultos en general.
La alta producción de este isómero conduce a disturbios metabólicos, entre
ellos acidosis, lo cual afecta sobre todo a los infantes. En cuanto a la degradación
de éste isómero D(-) hay opiniones encontradas, se dice que el cuerpo humano lo
puede reabsorber pero es eliminado en gran parte sin ninguna modificación,
debido a que el hombre no posee en su intestino ninguna enzima para
metabolizarlo. Lo poco que se metaboliza es degradado muy lentamente,
representando al organismo un gran esfuerzo. Por esto se recomienda la
ausencia de éste isómero en los alimentos infantiles y para un individuo adulto el
consumo no debe excederse de 100mg/kg de peso corporal diario.
En cuanto al isómero DL, este es sintetizado por las especies Lb.
acidophilus Lb. helveticus, y Lb. yoghurti. La preponderancia de uno u otro
isómero dependen de la especie y edad del cultivo. Se ha atribuido al ácido
láctico L(+), la propiedad de disminuir el crecimiento de tumores malignos. Las
células tumorales logran utilizar de nuevo el oxígeno transportado a través de los
92
eritrocitos, si se les suministra ácido láctico L(+), todos estos aspectos favorecen
el consumo de leches fermentadas que contengan Bifidobacterias (Shah, 1997a).
La supervivencia de las bifidobacterias en los productos fermentados
(leches fermentadas) y el paso a través del estómago ha sido también objeto de
numerosos estudios, ya que el ingreso de las bacterias al tracto intestinal se ve
inhibido en la mayoría de los casos por la liberación de diversas sustancias
provenientes de la estimulación de los procesos digestivos, constituyendo la
primera barrera del huésped frente a microorganismos que ingresen por la cavidad
oral (Charteris y col., 1998).
La segunda barrera importante a superar por los microorganismos que
llegan al intestino delgado, la constituye las sales biliares. Estos son esteroides
producidos por el hígado cómo ácidos biliares y son segregados al lumen del
duodeno a través de la vesícula biliar formando micelas con los ácidos grasos
producidos por la digestión de la lipasa pancreática, contribuyendo enormemente
a la digestión y absorción de los lípidos.
Las sales biliares son segregadas por el conducto biliar en cantidades de
500-700 ml/día, en forma de ácidos biliares primarios: Ácido biliar cólico y
Chenodeoxicólico, que mezclados con los aminoácidos Glicina o Taurina, son
entonces segregados a la bilis en forma de ácido biliar conjugado. Los ácidos
biliares son reabsorbidos por la parte baja del íleon, regresando al hígado para ser
segregados de nuevo a la bilis. Los no reabsorbidas escapan a lo largo del
93
intestino y son desconjugadas por las bacterias intestinales hasta ácidos biliares
secundarios: Ácido deoxicólico proveniente del ácido cólico y Ácido litocólico
proveniente del ácido chenodeoxicólico. El ácido deoxicólico es reabsorbido por la
mucosa a lo largo del intestino y es otra vez conjugado en el hígado y segregado
en la bilis (Kobayashi y col., 1988; Tadushi, citado en Nakazawa y Hosono, 1992;
Parodi, 1999).
Las sales biliares por sus propiedades detergentes actúan sobre los
microorganismos afectando la estabilidad de la membrana ocasionando su
destrucción (Kimoto y col., 2000; Mejía, 2001).
Floch (citado en Kobayashi y col., 1988); sugirió que las sales biliares
ejercen un efecto homeostático sobre la flora intestinal. Las bifidobacterias
pueden tolerar las sales biliares y las desconjugan a formas libres, estas ejercen a
su vez acción inhibitoria sobre el crecimiento de bacterias indeseables. Aunque
ciertas cepas como: Bf. bifidum, Bf. breve, Bf. longum y Bf. adolescentis, pueden
ser inhibidas, disminuyendo su crecimiento (Kobayashi y col., 1988; Shah, 1997a).
En 1940, se desarrolló por primera vez un producto con bifidobacterias
“leche con Bifidus”, utilizada para el tratamiento de la desnutrición en infantes,
encontrándose que la flora intestinal podía ser modificada positivamente (Law,
1997; Wood, 1999). En 1970, comienza la comercialización de diversos productos
que contienen bifidobacterias viables. Desde entonces el consumo de productos
lácteos que contienen bifidobacterias ha aumentado vigorosamente. Japón es el
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país líder en el ámbito mundial en la elaboración de productos sobre la base de
bífidos. En 1971 se elaboró una leche fermentada que contenía cultivos de Bf.
longum y Sc. thermophilus, en cantidades de 107 bacterias/ml. Hoy día existen
más de 70 productos en el ámbito mundial con bífidos, incluyendo; yogur, leches,
galletas, postres congelados, crema ácida y mantequilla (Shah, 1997b; Asperger y
Saad, 1999; Daigle y col., 1999).
Las especies comúnmente utilizadas en la elaboración de las leches
fermentadas incluyen Bf. bifidum, Bf. breve, y Bf. longum. Entre los factores que
influyen en la comercialización de éstos está principalmente la dificultad de
propagación de los cultivos a escala industrial (Sanders, 1999). Debido a que no
toleran condiciones de acidez, el crecimiento de la mayoría de las cepas cesa a
pH menores de 4,5. En la mayoría de los casos el pH del producto final se
mantiene alrededor de 4,6 y para el yogur por regla en la elaboración del producto
el pH debe ser menor de 4,5, ésta es la razón fundamental por la cual las
bifidobacterias declinan su crecimiento.
El pH del producto final continúa disminuyendo durante el almacenamiento
debido a procesos post-acidificación, esto ha sido demostrado por numerosos
investigadores (Shah, 1997a), dicha post-acidificación afecta la viabilidad de las
bifidobacterias. Para eliminar éste inconveniente algunos productores de yogur
utilizan para su elaboración una combinación de Lb. acidophilus, bifidobacterias y
Sc. thermophilus, cómo cultivos iniciadores, y para mantener viables a las
bifidobacterias empleadas utilizan cultivos de Lb. acidophilus, bifidobacterias, y
95
una mezcla de Sc. thermophilus y Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus (Rosenthal y
Bernstein, 1998), Sin embargo, el uso de dichos cultivos iniciadores incrementa
significativamente el periodo de incubación. La lenta tasa de crecimiento de las
bifidobacterias puede ser compensada añadiendo altos niveles de preinóculos del
(5–10%). La tasa de crecimiento de las bifidobacterias se realza también por la
adición de cepas proteolíticas, en este caso se ha recomendado la cepa antes
mencionada Lb. delbrueckii spp. bulgaricus añadida cómo cultivo iniciador.
Se han utilizado técnicas de microencapsulamiento utilizando gelatina o
goma vegetal, para proteger las células de bifidobacterias de la sensibilidad al
ácido (Matteuzzi y col., 1990; Charteris y col., 1998). Esto podría ser utilizado
cómo medio de protección contra las condiciones de acidez que se producen
durante el almacenamiento de los productos, cuando son refrigerados y durante el
paso a través del estómago.
Otro factor que interviene en la elaboración de productos lácteos es la
sensibilidad que presentan las bifidobacterias al oxígeno, esto constituye un serio
problema ya que resulta extremadamente tóxico. Durante la elaboración del yogur
el oxígeno se disuelve fácilmente en la leche; por ello las bifidobacterias crecen
lentamente, y se ha preferido entonces adicionarlas al yogur ya elaborado (Onggo
y Fleet, 1993; Asperger y Saad, 1999). Para disminuir el efecto del oxígeno se
recomienda el uso de botellas de vidrio o el uso de empaques laminados con
aluminio (Shah, 1997a) de manera que se impida su permeación, pudiéndose
mantener cultivos que contengan: Lb. acidophilus, y Bifidobacterium ssp, durante
96
35 días a 4° C. Además se requieren equipos especiales para excluir el oxígeno
durante la elaboración del producto, que logren mantener las condiciones de
anaerobiosis. El oxígeno disuelto puede ser utilizado por Sc. thermophilus
mejorando la viabilidad de las bifidobacterias.
En este trabajo pretendemos aislar e Identificar bacterias del género
Bifidobacterium a partir de heces de lactantes sanos de 15 a 20 días de nacidos.
Posteriormente las cepas aisladas serán caracterizadas tomando en cuenta
ciertos parámetros que permitirán la futura aplicación de las mismas en la
elaboración de un producto lácteo con propiedades probióticas. Entre las pruebas
de caracterización se encuentran: Resistencia frente a valores bajos de pH,
resistencia a diversas concentraciones de sales biliares , y resistencia a la
lisozima. También se demostrará mediante ensayos in-vitro si existe o no algún
tipo de actividad antimicrobiana frente a varios microorganismos patógenos para el
hombre.
97
II.1 Justificación.
Cuando se ingieren leches fermentadas con Bifidobacterias o Bífidos como
corrientemente se les conoce, estas proporcionan beneficios a la salud del
consumidor. Las investigaciones realizadas hasta la fecha sugieren que el criterio
de selección principal de las especies y de las cepas de Bifidobacterias ha sido su
supervivencia, tanto dentro de los productos alimenticios como a lo largo del tubo
intestinal después de su consumo. Se pretende entonces seleccionar cepas; cuyo
uso potencial sea aprovechado por la Industria alimenticia y farmacéutica tanto en
la producción de alimentos fermentados que permitan controlar daños graves en la
flora gastrointestinal, como en la elaboración de medicamentos en base a Bifidos.
98
II.2 Hipótesis.
Sí las bacterias del género Bifidobacterium constituyen uno de los grupos
más numerosos en la flora intestinal de infantes alimentados con leche materna,
entonces podrán aislarse a partir de heces de lactantes sanos, posibles cepas con
propiedades probióticas.
99
II.3 Objetivos.
Generales.
Aislar e identificar taxonómicamente bacterias del género Bifidobacterium,
presentes en heces de lactantes.
Específicos.
Conservar las cepas aisladas.
Determinar resistencia a sales biliares.
Determinar resistencia a lisozima.
Estudiar la sobrevivencia de las cepas aisladas frente a valores bajos de pH.
Caracterizar tecnológicamente las cepas aisladas.
Demostrar que las Bifidobacterias poseen propiedades antimicrobianas contra
microorganismos patógenos.
100
III. Materiales y Métodos.
III.1 Aislamiento de las cepas y procesamiento de las muestras:
Los microorganismos se obtuvieron a partir de heces de lactantes sanos,
alimentados exclusivamente con leche materna, con edad de veinte días de
nacidos; las muestras fueron recolectadas en el hospital “ Sor Juana Inés de la
Cruz”, en la ciudad de Mérida, Edo. Mérida. El tiempo transcurrido entre la
recolección de la muestra y su procesamiento en el laboratorio fue de
aproximadamente 20 minutos.
Las muestras se recolectaron utilizando una inyectadora estéril de 20 cc,
evitándose en todo momento la formación de burbujas de aire (Wielkorstanje y
Winkler, 1970; Sébald, citado en Casanovas, 1977). Inmediatamente se
trasladaron al laboratorio, se colocó una porción de las heces directamente en
tubos con l0 ml de caldo TPY, donde fueron resuspendidas, luego los tubos
inoculados se incubaron a 37°C, durante 48 horas en atmósfera anaerobia
haciendo uso de una jarra para anaerobiosis (Sistema Gaspack, BBL).
Transcurrido el tiempo de incubación se realizaron diluciones seriadas (10-5 ,
10-6 , 10-7 ) en el mísmo medio y se sembró por duplicado 0,05 ml de cada
dilución en superficie sobre placas TPY, posteriormente fueron incubadas a
37°C, en anaerobiosis (Sistema Gaspack, BBL), durante 4 días.
101
El número total de colonias crecidas fue de 400, se escogieron entonces
colonias que presentaran diferencias morfológicas marcadas, (forma. elevación,
y borde) (Hosoda y col., 1998), aislándose y sembrándolas en 10 ml de caldo
TPY, incubando a 37° C, en anaerobiosis durante 4 días.
Posteriormente a partir de los caldos crecidos de cada una de las cepas se
sembraron en tacos de agar TPY (siembra en profundidad) (Sébald citado en
Casanovas, 1977), incubándose por 5 días. Luego de ese tiempo las células
obtenidas se incubaron de nuevo en medio TPY y en placa, pero esta vez, fuera
de la Jarra Gaspack, esto para descartar microorganismos que no sean
anaerobios estrictos, que presenten algún tipo de microaerofilia (Hosoda y col.,
1998). Los tubos y las placas se incubaron a 37° C, durante 3 días.
III.2 Medio de cultivo para las bacterias aisladas:
Las bacterias aisladas fueron crecidas en medio TPY, y su composición por
litro es la siguiente.
Triptona 10 g Soya peptona 5 g
Glucosa 5 g
Extracto de levadura 2.5 g
Tween 80 1 ml
L-Cistina 0,5 g
Fosfato de potasio dibásico 2 g
Cloruro de magnesio 6 H2O 0,5 g
102
Sulfato de zinc 7 H2O 0,25 g
Cloruro de calcio 0,15 g
Tricloruro de hierro 0,03 g
pH final después de esterilizar 6,5
El pH del medio se ajustó con HCl 4 M (pHmetro Orion Modelo 230 A). En
aquellos casos en que se necesitaba preparar el medio en forma sólida se
adicionaban 15 g de agar (Scardovi, 1986). Este medio se esterilizaba a 121° C
durante 15 minutos (Autoclave automático portatil WAF. Modelo 25X).
III.3 Medio de Conservación.
Cómo método de conservación a corto plazo, las cepas se guardaron a 4°C en tacos de agar TPY, con
repiques cada 15 días para mantenerlas viables. Para la conservación a largo plazo se almacenaron a una
temperatura de –20°C, en caldo TPY con glicerol al 30% (Chevalier y col., 1990; Charteris y col., 1998;
Mejía, 2001).
Las cepas aisladas y caracterizadas fueron cuidadosamente almacenadas, para ello células
provenientes de un cultivo de 48 horas, a 37° C y anaerobiosis, se centrifugaron a 6480 g, durante 20 min.,
a 4° C, y se resuspendieron en 2 ml de caldo TPY, suplementado con 20% de leche descremada UHT, 5%
de sacarosa y 0,35% de ácido ascórbico, de acuerdo al método utilizado por Roy y Ward , 1990.
Seguidamente se llevaron a
enfriamientos lentos (cada 10 min) y sucesivos (Temperatura ambiente, 10° , 4°, 0° y –20° C,
respectivamente) para evitar causar daños a las células por congelamiento bruzco.
Las cepas se mantuvieron debidamente rotuladas a una temperatura de –20° C, hasta su próximo uso.
III.4 Condiciones de cultivo.
103
Para los ensayos de identificación y caracterización las bacterias aisladas se crecieron a 37°C en tubos de vidrio con tapa de bakelita; la cual se mantuvo floja para permitir el intercambio de gases dentro de los mísmos (Nieves y Gabaldon, 1992). Cada tubo contenía 10 ml de medio TPY, y un inóculo del 1% v/v. La incubación se mantuvo sin agitación y en atmosfera anaerobia, empleando para ello un sobre Anaerogen 3.5 litros (Oxoid) para la generacion de condiciones anaerobias y la jarra para anaerobiosis GasPack (BBL) (Al-saleh y col., 1998; Rosenthal y Bernstein, 1998) (anexo 1). Además se utilizó como indicador de anaerobiosis una solución de resazurina 50 mg/L, a partir de ésta se agregó 0.2 ml a un tubo con 10 ml de medio TPY, pasando de violeta a incoloro cuando las condiciones de anaerobiosis se han establecido por completo.
III.5 Identificación del género Bifidobacterium:
Para determinar qué cepas pertenecían al género Bifidobacterium se
realizaron las siguientes pruebas distintivas del género:
III.5.1-. Morfología célular: Se observaron al microscopio óptico cultivos de
48 horas y se tomó en cuenta su morfología, motilidad, y arreglo celular. (Nebra
y Blanch, 1990).
III.5.2-. Tinción de Gram: En cultivos frescos de 24 h se realizó la tinción de
Gram usando el método correspondiente (Manual BBL, 1994).
III.5.3-. Tinción de esporas: En cultivos de 3 a 4 días de crecimiento se
realizó la tinción de esporas según el método de Dorner ( Bailey y Scott, 1970).
104
III.5.4-. Tinción ácido resistente: Se realizó en cultivos frescos de 24 h
según el método de Ziehl-Neelsen (Koneman y col., 1999).
III.5.5-. Prueba de la Catalasa: Para ello se colocó una gota de reactivo de
catalasa (mezcla en partes iguales de tween 80 al 1% y peróxido de hidrógeno
al 30%), sobre una placa sembrada con la cepa y se observa si había
producción o no de burbujas.
III.5.6-. Capacidad de licuación de la gelatina: Se utilizó el medio gelatina
nutritiva, su composición por litro es:
Peptona de gelatina 5 g Extracto carne de res 3 g Gelatina 120 g pH final 6,8
Se inocularon tubos que contenían 5 ml de medio, la siembra se realizó con
un asa de platino hasta una profundidad de 2 a 2,5 cm. se incubaron en
anaerobiosis, a 37° C, durante siete días. Antes de hacer la lectura se llevó el
tubo a 4° C, durante 30 minutos. El medio licuado indicará una reacción
positiva, con presencia de gelatinasas.
III.5.7-. Producción de ácido y gas a partir de glucosa: Se utilizó el medio
glucosa rojo fenol para detectar la producción de ácido y gas a partir de la
fermentación de la glucosa. Su composición por litro es:
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Extracto de carne 1 g
Peptona proteosa 10 g
NaCl 5 g
Rojo fenol 0,018 g
Glucosa 10 g
pH final 7
Las cepas se inoculan en 10 ml de medio líquido con tubos Durham
invertidos, incubándose a 37° C, en anaerobiosis durante 48 h. La producción
de gas se comprueba observando el desplazamiento del liquido en el tubo
invertido y la acidificación por el viraje de color del indicador rojo fenol, de rojo a
amarillo (Koneman y col., 1999).
III.5.8-. Reducción de nitrato: Permite determinar la capacidad de los
microorganismos para reducir el nitrato a nitrito o nitrógeno libre. Esto tiene
lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las que el nitrato es el
aceptor final de electrones y de hidrógeno.
Para ello se prepararon tubos con 5 ml de agar nitrato en cuña. La
composicion de éste medio por litro es:
Extracto de carne 3 g
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Peptona 5 g
Nitrato de potasio 1 g
Agar 12 g
Una vez preparados los tubos se procedió a inocular con una asada del
microorganismo aislado en cultivo puro, se incubó a 37° C, en atmósfera
anaerobia durante 48 h, transcurrido éste tiempo se procedió a agregar 0,5 ml
de reactivo A de nitrito (α naftilamina 0,5 % + Ac. acético 5 N, 30 %) y 0,5 ml de
reactivo B de nitrito (Ac. sulfanílico 0.8 % + Ac. acético 5 N, 30 %). La
formación de un complejo rojo en la superficie del agar indica una respuesta
positiva (Koneman y col., 1999).
III.5.9-. Descomposición de aminoacidos, producción de Indol: Las
bacterias que poseen triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el
triptofano con producción de indol. Para realizar el ensayo se preparó caldo
triptofano al 1 %. siendo su composición por litro, la siguiente:
Peptona 2,0 g Triptofano 10,0 g NaCl 0,5 g
Una vez inoculados los tubos con 10 ml de caldo triptofano se llevaron a
incubación a 37° C, en anaerobiosis durante 48 h. Después de este lapso de
tiempo se agregó al medio 15 gotas del reactivo de Kovacs, por la pared del
tubo. la formación de un anillo rojo en la superficie indica una reacción positiva
(Koneman y col., 1999).
107
Reactivo de Kovacs:
Alcohol amílico puro 150 ml p-dimetilaminobenzaldehido 10 g
HCl concentrado 50 ml
III.5.10-. Vías metabólicas, Rojo de metilo (RM) y Voges Proskauer (VP):
Estas pruebas son complementarias y se basan en el metabolismo de la
glucosa. Pone de manifiesto si el carbohidrato fue hidrolizado por la vía de los
ácidos mixtos, o por la vía butilenglicol.
Para realizar este ensayo se prepararon tubos con caldo glucosado, la composición por litro, se describe a continuación:
Peptona 7 g
Glucosa 5 g Fosfato de potasio dibásico 5 g pH final 6,9
Una vez inoculados los tubos se incubaron a 37° C, en atmosfera anaerobia
durante 48 h. Seguidamente se procedió a realizar la prueba Voges-Proskauer,
la cual detecta la presencia de acetil-metil-carbinol (acetoína), que es un
producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Para ello se
tomó 1 ml del cultivo y se agregó 0,6 ml de α-naftol al 6 %, y 0,2 ml de KOH al 4
%, seguidamente de agitó suavemente, dejándose reposar por 15 min. La
aparición de un color fuscia indica una reacción positiva, de lo contrario se
coloreará con un tono pardo amarillento. Al resto de cultivo se le agregó
108
directamente 5 gotas del indicador de pH: rojo de metilo, la formación de una
nube roja en la superficie indica un resultado positivo (Koneman y col., 1999).
III.5.11-. Requerimientos de oxígeno, OF (óxido-fermentación): Este ensayo
demuestra el tipo de degradación sobre la glúcosa, ya que ésta puede ser
degradada por vía oxidativa o por vía fermentativa, dependiendo de los
requerimientos de oxigeno y fosforilación inicial.
El medio OF, utilizado para visualizar este ensayo, presenta la siguiente
composición, por litro.
Peptona 2 g NaCl 5 g Glucosa 10 g Azul de bromotimol 0,03 g Fosfato dipotásico 0,3 g Agar 3 g pH final 7,1
Los tubos con medio OF se inocularon mediante asa recta y por
duplicado, a uno de los tubos se le adicionó en la parte superior 1 ml de
parafina esteril, para evidenciar si el microorganismo sigue una via fermentativa
para la degradación de la glucosa, y al otro tubo no se le adiciona parafina.
Ambos se incubaron a 37°C, durante 4-5 días, sin introducirlos en la jarra para
anaerobiosis Gaspack. Se realizaron observaciones diarias, hasta completarse
los 5 días de incubación (Koneman y col., 1999). El viraje del indicador del azul
al amarillo evidencia una reacción positiva.
109
III.5.12-. Crecimiento a 30 °C: Se inocularon con una asada tubos que
contenían 10 ml de caldo TPY, y se incubación a 30° C durante 48 h, en
anaerobiosis.
III.5.13-. Determinación de la enzima fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa.
(F6PPK): Las bacterias pertenecientes al genéro Bifidobacterium fermentan las
hexosas por una vía denominada “ ruta bifida”. Este ensayo se realizó con
células crecidas en 10 ml de caldo TPY, en condiciones anaerobias (Gaspack,
BBL), a 37° C, y durante 4 días. Se procedió entonces a centrífugar a 6480 g, a
una temperatura constante de 4° C, durante 15 min. (Centrífuga Beckman, USA
J2-Mc).
El método utilizado y descrito a continuación es el diseñado por Scardovi
(1981, 1986), citado en (Chevalier y col., 1990; Nebra y Blanch, 1999).
Reactivos utilizados para la determinación de la enzima fructosa-6-fosfato-
fosfocetolasa (F6PPK):
Solución 1.- Buffer fosfato 0,05 M pH 6,5 + Cistina-HCl 500 mg/l.
2.- NaF 6 mg/ml + Iodoacetato de sodio 10 mg/ml.
3.- Fructosa-6-fosfato (F6P) 80 mg/ml en agua.
4.- Hidroxilamina-HCl 13,9 g/100 ml en agua (neutralizado con
NaOH pH 6,5).
110
5.- Acido tricloroacético (TCA) 15 % en agua.
6.- HCl 4 M.
7.- Fe Cl3 6H2O 5 % P/V en 0,1 M HCl.
La solución 1 adicionada con cistina se preparó momentos antes de su uso,
lo mismo para el sustrato F6P, manteniéndose en frío a 4° C, junto a la solución
2. Para iniciar el ensayo, las células centrifugadas fueron lavadas dos veces
con la solución 1, inmediatamente se sonicaron (Sonicador Lab-line Ultratip
Labsonic System N9100) a intervalos de dos minutos para un total de 20 min,
manteniéndose en frío. Transcurrido el tiempo se añadió 0,25 ml de la solución
2 y 0,25 ml de la solución 3, se dejó incubando a 37° C durante 30 min la
reacción fue entonces detenida con 1,5 ml de la solución 4, al termino de 10 min
y en incubación a la misma temperatura se añadió 1 ml de las soluciones 5 y 6,
respectivamente. Esta mezcla de reacción se llevó a 37° C durante 5 min, y
finalmente se agregó 1 ml de la solución 7. Se mezcló suavemente el tubo,
invirtiendolo. Un resultado positivo de éste ensayo esta indicado por el
desarrollo de un precipitado violaceo en el fondo del tubo, formado por el
quelato férrico del hidroxamato determinándose así la presencia de la F6PPK,
que cataliza la reacción hacia la producción del acetil fosfato a partir de la F6P.
III.5.14-. Reacciones de fermentación propias del género Bifidobacterium:
Para demostrar la capacidad fermentativa de las cepas se utilizó el medio agua
de peptona rojo fenol, su composición por litro es la siguiente:
111
Peptona 10 g NaCl 5 g Rojo fenol 0,025 g Carbohidrato a ensayar 1 % pH final. 7,1
Los sustratos a ensayar fueron: Lactosa, Rhamnosa, Sorbosa, Glicerol,
Adonitol, Dulcitol, éstos se esterilizarón por separado a 110° C durante 10 mn.
Para el preinóculo las cepas fueron crecidas durante 24 h a 37° C en
anaerobiosis, y luego fueron inoculadas con asa de platino en 10 ml del medio
descrito. Se incubaron a 37° C, sin agitación, en anaerobiosis durante 5 días
con observación diaria, el cambio de color del medio de rojo a amarillo, se toma
como una reacción positiva.
III.6 Caracterización de las cepas aisladas.
III.6.1-. Resistencia a lisozima (100 µg/ml): En esta prueba se partió de un
preinóculo de 48 h, a partir de éste se inocularon tubos que contenian 10 ml de
caldo TPY, se mantuvieron en incubación a 37° C, y en anaerobiosis durante
48h. Al termino de éste tiempo las células fueron centrifugadas estérilmente a
6480 g durante 20 min y a una temperatura constante de 4° C . El pellet fue
lavado dos veces con buffer fosfato 0,05 M pH 6,5 y resuspendido estérilmente
en la siguiente solución: Lisozima 100µg/ml (Sigma)(Schomburg y Salzmann,
1990) en buffer fosfato 0,05 M pH 6,5, suplementado con NaCl al 1%. La
112
enzima fue esterilizada por filtración a través de un filtro (Millipore) con un poro
de 0,45 µm y un diámetro de 25 mm),
Una vez resuspendidas las células en el filtrado estéril se mantuvieron a
tres temperaturas diferentes: 25° C, 30° C y 37° C, respectivamente y por
duplicado. Esto con la finalidad de observar el comportamiento de la enzima
frente a las condiciones a la que se expone. Seguidamente se tomaron a
distintos tiempos de incubación : 0, 15, 30, 45 y 60 min. inóculos del 1 % y se
llevaron a tubos que contenian 5 ml de caldo TPY, posteriormente cada tubo se
incubó a 37° C, en anaerobiosis, durante 48 h (Kimoto y col.,2000) tiempo al
cual se midió absorbancia a 610 nm., (Espectrofotómetro Milton Roy, Modelo
Espectronic 20D).
Este método también resultaria viable realizando conteo en placa, a cada
una de los tiempos establecidos; sin embargo en el laboratorio donde se
desarrollo este trabajo no se contaba con un equipo especial que permitiera la
colocación de las placas a intervalos definidos de tiempo, al contrario se
contaba con dos jarras Gaspack (BBL), y los sobres de anaerogen (Oxoid)
utilizados para la generacion de las condiciones de anaerobiosis resultan
extremadamente costosos, por ello se recurrió a realizar siembra en medio
liquido, después de los tratamientos con lisozima.
113
III.6.2-. Efecto de diversos valores de pH sobre el crecimiento de la cepa
Bf. 1: Este ensayo fue realizado con una de las cepas aisladas en este trabajo y
que se consideró la más adecuada, la misma se identificó como Bf. 1. La
experiencia se realizó según el método de Jin y col, citados en (Kimoto y col.,
2000), las células colectadas por centrifugación como se describió
anteriormente, fueron resuspendidas en 2 ml de buffer fosfato 0,05 M a valores
de pH de 1, 2, 3, y 4 ajustado con HCl 4 N.
Después de resuspendidas las celulas se llevaron a incubación a 37° C durante
0,5; 1; 2 y 3 horas, respectivamente. A cada tubo se le adicionó en la superficie
1 ml de parafina estéril, para impedir intercambio de oxígeno con el medio
líquido, adicionalmente se le colocó algodón para mantener en todo caso las
condiciones de esterilidad. Después de transcurrido el tiempo de incubación se
inocularon tubos que contenían caldo TPY, y se llevaron nuevamente a 37° C,
en anaerobiosis (Gaspack, BBL), durante 48 h, tiempo al cual se midió la
absorbancia a 610 nm.
III.6.3-. Resistencia a sales biliares: Se examinó el crecimiento de las cepas
en tubos que contenian caldo TPY, con concentraciones desde 0.1 % hasta 1 %
de bilis de buey (Merck), a cada uno de los tubos se les agregó un preinóculo
del 1 % del microorganismo de prueba, proveniente de un cultivo fresco. Se
incubaron a 37°C, en anaerobiosis, durante 48 h. El crecimiento se cuantificó
114
midiendo la turbidez de cada tubo a 610 nm., (Bezkorovainy y Miller-Cathpole.,
1989; Petschow y Talbott, 1990; Al-Saleh y col., 1998; Kimoto y col., 2000).
III.6.4-. Actividad antimicrobiana de las cepas seleccionadas sobre
microorganismos patógenos: Los microorganismos de prueba utilizados en
este estudio provienen de la colección de cepas de este laboratorio y los
mismos fueron:
Listeria monocytogenes CVCM 445.
Escherichia coli pol I A Lab. Microbiología ULA.
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Enterococcus fecalis ATCC 29212.
Para las cuales se utilizó cómo medio de crecimiento caldo BHI (Brain heart
infussion broth, Himedia), el cual se esterilizó a 121°C, durante 15 min, y cuyo
pH final era de 7,4.
Las bacterias pertenecientes al género Bifidobacterium, seleccionadas
para este ensayo fueron crecidas en 10 ml de caldo TPY a 37° C, un pH inicial
de 6,5, y anaerobiosis, durante 12, 24 , y 48 h, respectivamente. Transcurridos
los tiempos de incubación los cultivos se centrífugaron en las mismas
condiciones anteriores, manteniéndose la esterilidad.
115
El sobrenadante estéril se agregó en una concentración final de 10, 20, 30,
40 y 50 % (Técnica de dilución en tubo: Este método no distingue entre un
agente bactericida y uno bacteriostático, por que el agente esta siempre
presente en el medio de cultivo a lo largo de todo el periodo de incubacion,
Madigan y col., 1999), a 2 ml de caldo BHI, a éste se le agregó finalmente un
preinóculo del 1 % de cada uno de los microorganismos arriba indicados. Se
incubó por 12 h a 37° C, sin agitación. La ausencia de crecimiento era indicio
de la presencia de compuestos con actividad antimicrobiana.
116
IV. Resultados y Discusión.
IV.1-. Aislamiento e identificación preliminar:
En los estudios realizados se aislaron veinte colonias del total de las 400
crecidas en las distintas placas TPY, lo que representa la raiz cuadrada del total
presente, y que garantizaría se estuviera escogiendo un minimo representativo
de la mayoría de los microorganismos allí presentes (Chamba y col., 1994).
Las colonias presentaron como rasgos morfológicos las siguientes
características: Forma circular, con borde ondulado; en algunos casos entero y
en otros irregular, de color beige, con elevación lisa, en unas y rugosa en otras,
así mismo, algunas colonias presentaban un punto hacia el centro. El diámetro
de las colonias oscilaba entre 1 a 6 mm.
A partir de las colonias aisladas se obtuvieron cultivos frescos crecidos
como se indica en la metodología, es importante resaltar que el medio fue
mantenido dentro de tubos de vidrio con tapa de bakelita cuyo volumen final era
tal que permitiera que se mantuvieran las condiciones de anaerobiosis, es decir
se disminuía la superficie del medio en contacto con el aire, evitándose que
ocurriera la reoxigenación del medio.
Otro factor que interviene en la reoxigenación de los medios es el tiempo
que transcurre entre la preparación de estos y su utilización, por ello se
117
inoculaban inmediatamente después de esterilizar. Para evitar la reoxigenación
del medio se utilizó un inóculo del 1%, proveniente de un cultivo en fase
exponencial, adicionado con sustancias reductoras por ejemplo: cistina.
El uso de medios sólidos (tacos) también resulta conveniente pués se
reoxigenan más lentamente. Los microorganísmos a su vez, excretan al medio
externo durante su metabolismo en fase exponencial, ciertos metabolitos que
permiten mantener bajo el potencial REDOX del medio de crecimiento,
permitiendo así el crecimiento de los anaerobios presentes (Casanovas, 1977).
Es importante señalar que las heces además de haber sido aisladas a partir
de bebes lactantes sanos, de veinte días de nacidos; se consideraron también
otros aspectos que garantizaran una alta probabilidad de encontrar en estas
muestras bacterias que pertenecieran al género Bifidobacterium entre las que
se cuentan: Bebes a los cuales no se les había administrado ningún tipo de
tratamiento con antibióticos, con una dieta exclusiva: basada en leche materna
y por último nacidos por el canal natural del parto.
En las observaciones en fresco realizadas al microscopio, de cada una de
las veinte colonias aisladas, se pudieron apreciar formas bacilares, con
diferente disposición célular; se observaron bacilos aislados curvos, bacilos en
forma de Y, bacilos con ramificaciones y por último algunos cocobacilos.
118
Se hizo una primera preselección realizando siembra en profundidad (tacos)
de cada una de las cepas, descartándose de esta forma siete que no lograron
crecer bajo las condiciones a las que fueron expuestas.
La siembra en agar profundo permite observar las colonias que
verdaderamente corresponden a anaerobios, pués su crecimiento cesa por
debajo de la superficie del medio, por ello cuando se aislan anaerobios en
superficie, hace falta verificar para cada colonia su modo de crecimiento en
agar profundo, a fin de diferenciar anaerobios extrictos de anaerobios
facultativos que no pueden crecer en estas condiciones (Casanovas, 1977).
Las cepas que crecieron en agar profundo fuerón enumeradas desde la 1 a
la 13. Para estas también hacia falta observar el crecimiento en aerobiosis,
sembrando en superficie en placas TPY, y en caldo, en ambos casos no se
obtuvo crecimiento alguno.
Siguiendo con la primera etapa de identificación se procedió entonces a
realizar la tinción de Gram, resultando todas gram positivas como se muestra
en la Tabla 1. A fin de identificar a qué género pertenecian las bacterias
aisladas se realizaron las pruebas indicadas en la metodología, encontrándose
que no todas presentaban las características propias del género
Bifidobacterium; las cuales responden de manera negativa frente a los ensayos
119
catalasa, gelatinasa, reducción de nitrato, entre otros. Estos ensayos
permitieron descartar las cepas cuyos resultados no coincidian con lo reportado.
El esquema para la diferenciación fenotípica de las especies que puedan
pertenecer al género Bifidobacterium , se encuentran incluidas en la Tabla 1.
En cuanto a la producción de ácido a partir de glucosa las bacterias que
pertenecen al género de interés responden de manera positiva a este ensayo.
Se pensó por un momento que se contaba con varias cepas del género hasta el
momento en el cual se obtienen los resultados para el ensayo OF, donde se
descarta la mayoría.
Se obtuvo que las cepas enumeradas como 9 y 12 arrojan resultados
parciales positivos, para el ensayo producción de ácido a partir de la glucosa;
esto no indica que las cepas no pertenezcan al género de nuestro interés. Estas
bacterias de morfología bífida degradan la glucosa por via fermentativa
exclusivamente, mediante la utilización de la fructosa-6-fosfato (anexo 2),
proceso en la cual la fructosa-6-fosfato fosfocetolasa cataliza la reacción
obteniéndose como productos acetil fosfato y eritrosa-4-fosfato. Los productos
finales se forman a través de una transaldolasa, transcetolasa y xilulosa-5-
120
fosfato, adicionalmente pueden tambien formarse ácido fórmico, ácido láctico y
ácido acético a partir del piruvato.
Tabla 1: Resultados de pruebas de identificación del género Bifidobacterium:
Prueba Bf. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Siembra en profundidad + + + + + + + + + + + + + + Crecimiento aerobico - - - - - - - - - - - - - - Gram + + + + + + + + + + + + + + Endosporas - - - - - - - - - - - - - - Tinc. acido resistente - - - - - - - - - - - - - - Catalasa - - - - - - - - - - - - - - Gelatinasa - - - + - - - - - - - - - - Acido a partir de glucosa
+ - + + + - + - + +/- - + +/- +
Gas a partir de glucosa - - - - - - - - - - - - - - Reduccion de nitrato - - - - - - - + - - - - - - Producción de Indol - - - - - - - - - - - - - - RM ? - + + - - - + - + - + - - VP - - - - - - - - - - - - - - OF -/+ - + + - - + + + -/+ - + -/+ - F6PPK + +/- ** ** +/- +/- ** ** ** + +/- ** + +/- Crecimiento a 30° C - ** ** ** ** ** ** ** ** - ** ** - ** Lactosa + ** ** ** ** ** ** ** ** + ** ** + ** Rhamnosa - ** ** ** ** ** ** ** ** - ** ** - ** Sorbosa - ** ** ** ** ** ** ** ** - ** ** - ** Glicerol - ** ** ** ** ** ** ** ** - ** ** - ** Adonitol - ** ** ** ** ** ** ** ** - ** ** - ** Dulcitol - ** ** ** ** ** ** ** ** - ** ** - **
** Indica no probadas ya que fueron descartadas, RM: Rojo metilo (+/- Se toma como resultado
parcial positivo), VP: Vogues-Proskauer, OF: óxido-fermentación (-/+, No-oxiativo/Sí-Fermentativo; -, No-
oxidativo/No-fermentativo; +, Oxidativo/fermentativo), F6PPK: fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa (+/-, indica
resultado negativo). Bf. Características fenotipicas propias del género.
121
La producción de ácidos durante este proceso tiende por lo general a virar
el color del indicador rojo fenol. Un resultado parcial como el arriba reportado
puede estar atribuido a una causa posible: el poco crecimiento debido a que
estos microorganismos se caracterizan por ser de crecimiento exigente. Para
comprobar esta suposición sería conveniente hacer el ensayo en un medio más
complejo que el descrito para la prueba.
Hasta este punto se descartan entonces las cepas enumeradas como: 2, 3,
6, 7, 8, y 11, respectivamente.
Continuamos entonces con la identificación de las cepas restantes (1, 4, 5,
9, 10, 12 y 13). Para ello se procedió a realizar la determinación de la actividad
de la enzima fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa (F6FFK), obteniéndose que las
cepas enumeradas como 9 y 12, dan una reacción positiva, observada por la
aparición de un color violaceo fuerte hacia el fondo del tubo de reacción.
Las cepas 1, 4, 5, 10 y 13, señaladas en la Tabla 1, cómo (+/-) para este
ensayo, no dieron un resultado positivo observándose un ligero precipitado
blanco hacia el fondo del tubo de reacción, y no un precipitado violeta como se
esperaría, por tal razón se asumen cómo negativas, aunque, podría ser esto
debido quizas a la poca cantidad de células presentes.
122
Estas cepas fueron perdiendo la viabilidad cada vez que se trasladaban a
nuevo medio para su reactivación, operación que se hacía por lo menos cada
quince días. Si esto no se hacia las células declinaban su viabilidad debido a
que provenian de cultivos en los que el pH final después de 48 horas de
incubación descendia a 4,5. El hecho de que se mantuvieran almacenadas en
estas condiciones por lo menos durante 15 días, causaba perdida casi total de
viabilidad.
Este procedimiento de reactivación también trajo como consecuencia que
las cepas fueran perdiendo cada vez más su característica forma bífida inicial.
No hay que olvidar que ciertos anaerobios pueden presentar un dimorfismo en
su morfología, incluso en cultivos puros, así por ejemplo, bacilos alargados
pueden aparecer más cortos, y formas filamentosas y ramificadas pueden
volverse semiesféricas, por ello los repiques sucesivos contribuyen a la perdida
de las formas bífidas.
Sin embargo, este resultado negativo de las cepas en relación a la actividad
de la F6PPK, no se tomó cómo definitivo, entonces se trató de obtener
nuevamente células a partir de estas cepas utilizando preinoculos de cultivos
que provenian de incubación de 48 h, y de los almacenados a 4° C, en tacos, y
en caldo, así cómo también de los conservados en glicerol al 30% y a una
temperatura de -20° C, pero en todos los casos no se observó crecimiento.
123
A partir de éste momento se continuo con las cepas 9 y 12,
respectivamente. Para evitar que estas cepas perdieran viabilidad aun durante
el almacenamiento a una temperatura de -20° C, en glicerol al 30%, se procedió
a utilizar un medio tamponado. Así el medio TPY fue suplementado con
KH2PO4 4,5 g/L y Na2HPO4 6 g/L, utilizado también por otros investigadores
(Petschow y Talbott, 1990).
Los medios tamponados con buffer fosfato proveen optimas condiciones de
crecimiento durante 24 a 48 horas de incubación y minimiza la declinación en la
viabilidad de las células, el cual resulta por la acidificación del medio de
crecimiento durante la incubación. Se obtuvo, que para 48 horas de incubación
el pH final se mantuvo en un valor de 5,4, y no disminuyó hasta 3,9 como
ocurriría en un cultivo de ese tiempo de incubación en medio TPY no
suplementado con estos fosfatos.
El cuanto a la incubación de las células a temperaturas de 30° C, resulta
también de importancia, ya que las bifidobacterias aisladas a partir de heces de
humanos no crecen a temperaturas menores o iguales a ésta.
Como última prueba de identificación se realizó la prueba de fermentación
de diversos sustratos, para los cuales las bacterias del género Bifidobacterium
responden de forma negativa (Tabla 1).
124
Estos sustratos denominados ternarios por algunos autores, son de
importancia para finalizar con el proceso de identificación de esta especie
anaerobia. Las cepas 9 y 12, respondieron de manera negativa al ensayo
producción de ácido a partir de: ramnosa, sorbosa, adonitol, dulcitol, y glicerol.
Estas bacterias no pueden utilizar estos sustratos ya que no poseen un
sistema enzimático que les permita ingresar estos sustratos a su metabolismo
fermentativo.
IV.2.- Caracterización de las cepas aisladas.
De las cepas aisladas, se mantuvierón aún viables las enumeradas cómo 9
y 12, sin embargo, la cepa número 9 presentaba crecimiento más vigoroso que
la 12, y por ello se caracterizó sólo ésta, denominada a partir de este momento
como Bf 1, por ser la única cepa aislada perteneciente al género
Bifidobacterium (anexo 5).
IV.2.1-. Resistencia de la cepa Bf 1 frente a lisozima (100µg/ml).
La lisozima presente en la cavidad oral es uno de los primeros sistemas
defensivos del hospedador ante las bacterias, ya que puede lisar bacterias
gram positivas. Es importante resaltar que la concentración de lisozima
utilizada en éste ensayo (100µg/ml) es mucho mayor a las concentraciones
125
fisiológicas del cuerpo (Kimoto y col., 2000). Los valores reales presentes en
la cavidad oral se supone se encuentren por debajo de la utilizada, por otro
lado no se encontraron otros reportes acerca del valor real.
En los gráficos 1(a, b, y c), se tiene que Bf. 1, presentó resistencia frente a
la concentración de lisozima a la que fue expuesta. El gráfico 1(a), que
corresponde al tratamiento de las células a 25° C , se consideró el más
importante; ya que éste se corresponde al valor de temperatura óptima a la cuál
funciona la enzima perfectamente (25° C, tomado de Sigma).
Las experiencias representadas en el gráfico 1(b y c), se realizaron
adicionalmente para observar el comportamiento de la enzima, ya que se
conoce que esta presenta buena actividad incluso a 37° C, esto también se
obtuvo en nuestro caso, pero a diferencia, obtuvimos que presenta mayor
actividad a 25° C que a 37° C.
Por tal motivo nos inclinaremos sólo a dar explicacion al comportamiento
mostrado por Bf. 1, frente a 100 µg/ml de lisozima, incubada a 25° C.
La incubación de las células a diferentes tiempos con esta enzima
hidrolítica trae como consecuencia una reducción en la capacidad del
crecimiento, suponemos que esto sea inducido por maltrato a la integridad de la
pared célular. Este efecto se hace evidente a partir de 30 min.
126
Gráfico 1: Efecto de la lisozima (100µg/ml) sobre el crecimiento de Bf. 1, para tres temperaturas diferentes . Gráfico 1a: Representa los tratamientos de incubación de las células a 25° C con lisozima y sin lisozima (control), gráfico 1b: Representa los tratamientos a 30° C con lisozima y sin lisozima (control), gráfico 1c: Representa los tratamientos a 37° C con lisozima y sin lisozima (control). Luego de los tratamientos las células se incubaron como se indica en materiales y métodos.
0
0.5
1
1.5
2
15 30 45 60
Abs
orba
ncia
610
nm
.
30° C Control
0
0.5
1
1.5
2
15 30 45 60
Abs
orba
ncia
610
nm
.
25° C Control
0
0.5
1
1.5
2
15 30 45 60
Tiempo de tratamiento (min)
Abs
orba
ncia
610
nm
.
37° C Control
Gráfico 1 a.
Gráfico 1b
Gráfico 1c
127
Lo importante de estos resultados es que para 15 min., se obtuvieron
valores de absorbancia que indican la presencia de un número de celulas
similares a las presentes en el control, al cual no se le agregó lisozima. Para
dicho tiempo es posible que las células se encuentren menos deterioradas,
pudiendo alcanzar en termino de 48 horas, un valor de absorbancia comparable
al valor inicial cuando las células eran llevadas a la solución de lisozima
(absorbancia 1,5).
Se han tomado tiempos de incubación relativamente cortos, en lo que
respecta a los tratamiento con lisozima, esto fundamentado en que el paso de
los alimentos que contendría estas bacterias, a través de la cavidad oral sería
sumamente rápido, por tal razón el simple hecho de que esta bacteria haya
sobrevivido durante todo el tiempo de tratamiento, nos garantiza que pueda
llegar al estómago sin daño significativo aparente, restaría por corroborar estos
mismos resultados con experimentos In vivo.
IV.2.2.- Resistencia a sales biliares y a valores bajos de pH.
La acidez gástrica y las sales biliares son barreras a superar por los
microorganismos que puedan actuar como probióticos (Charteris y col., 1998;
Mejía, 2001). De aquí parte nuestro interés en realizar el crecimiento de las
cepas aisladas en diferentes medios que resultan hostiles.
128
Con respecto al efecto de diversos valores de pH sobre el crecimiento de
Bf. 1, se escojieron condiciones de acidez que simulararan las condiciones
del aparato digestivo humano, desde el momento en que se inicia la digestión
donde numerosos fluidos digestivos son liberados. El valor de pH para estos
fluidos va desde 1,5 hasta 2,5 ó 3, luego al paso por el duodeno debido a la
segregación pancreática, el pH se vuelve más alcalino 6,5 (Nakazawa y
Hosono, 1992; Charteris y col., 1998). Por tanto las bacterias que se ingieren
por vía oral deben ser capacez de resistir estos cambios bruscos de pH, por lo
menos durante 90 min, tiempo promedio estimado para que el alimento pase
desde el estómago hacia la parte inicial del intestino delgado (Parodi, 1999).
La cepa Bf 1 respondió positivamente al estrés al que fue expuesta,
logrando un elevado porcentaje de sobrevivencia después de haber estado
suspendida en una solución a valores de pH de 2, 3 y 4 respectivamente
(Gráficos 2 a y 2 b); comparado con el control, en el cual las células se
mantuvieron a pH 6,5 (pH óptimo de crecimiento) con una absorbancia casi
contante.
En todos los casos se partió de cultivos que provenian de un crecimiento de
48 horas, cuya absorbancia a 610 nm correspondia a un valor de 1,5. En cuanto
al otro tratamiento, se tomó como valor extremo pH 1 (Gráfico 2a),
Obteniéndose frente a éste valor tan bajo, poco crecimiento con una
129
Gráfico 2: Efecto de diversos valores bajos de pH sobre el crecimiento de Bf. 1 . Gráfico 2a: Representa los tratamientos con soluciones a pH 1 y pH 2 durante tres horas, gráfico 2b: Representa los tratamientos a pH 3 y pH 4, respectivamente. Los valores de pH 6,5 corresponden al control. Luego de los tratamientos las células se incubaron como se indica en materiales y métodos.
0
0.5
1
1.5
2
30 60 120 180
Abs
orba
ncia
610
nm
.
pH 1 pH 2 pH 6,5
0
0.5
1
1.5
2
30 60 120 180
Tiempo de tratamiento (min).
Abs
orba
ncia
610
nm
.
pH 3 pH 4 pH 6,5
Gráfico 2a
Gráfico 2b
130
disminución de la absorbancia hasta un valor de 0,3, lo que indica que, aunque
poco, logra resistir éstas condiciones de ácidez.
Muchos microorganísmos son destruidos por valores bajos de pH, y por las
concentraciones del HCl del estómago, las bacterias ácido lácticas entre ellas
las pertenecientes al género Lactobacillus son consideradas como ácido
tolerantes y las pertenecientes al género Bifidobacterium son consideradas
como poco ácido tolerantes, incluso algunas cepas de Bifidobacterias son no
ácidotolerantes ej Bf. bifidum, siendo el efecto bactericida del estómago
evidenciado a valores de pH menores de 2,5.
Es importante aclarar que los graficos 2a y 2b corresponden a datos
obtenidos a partir de experimentos en los cuales después de someter las
células al estrés de las soluciones con diferentes valores de pH, se tomaron
inóculos de tal manera que las celulas pudieran continuar su crecimiento y
cuantificarlo mediante la lectura de la absorbancia después de 48 horas de
incubación, el efecto se tradujo siempre en una disminución del crecimiento.
El daño a las células fue mayor a medida que mayor fue el tiempo de
tratamiento (ya que el inóculo siempre fue el mismo) y radica posiblemente en
la condición fisiológica en la que se encuentran las células las cuales para 48
horas de incubación después de los tratamientos, no logran alcanzar el titulo
inicial.
131
El efecto importante ejercido sobre las bifidobacterias al exponerlas a estas
condiciones de bajo pH se puede atribuir a la desestabilización del “modelo de
reciclaje de energia” utilizado por estos microorganismos, afectando dos
parámetros importantes para el normal crecimiento de estas bacterias: El
potencial de membrana y el gradiente de pH. Esto ocasiona un estado de
desestabilización total para el intercambio de solutos y de protones entre el
medio externo e interno de la célula (Bezkorovainy y Miller-Catchpole, 1989).
Sin embargo, y debido a que no se encontraron valores de absorbancia
menores a 0,5, esto implica una posibilidad: aumentando la cantidad de
bacterias podrían tenerse incrementos importantes en la sobrevivencia de las
mismas.
Berrada y col., 1991, obtuvieron resultados similares a los nuestros. En sus
experimentos utilizaron una cepa de Bifidobacterium aislada a partir de una
leche fermentada, ésta sobrevivió después de incubación in vitro en una
solución a pH 3, durante tres horas, mientras que las demás cepas presentes
en el producto no lograron sobrevivir, este mismo resultado fue posteriormente
confirmado en humanos, encontrando que el 30% de bifidobacterias
consumidas por vía oral, eran luego encontradas vivas en las heces.
Nuestros experimentos demuestran que Bf. 1 pudiera pasar a través del
estómago en su paso hacia el intestino, manteniendose aún viable, esto en
caso que sea introducida por vía oral sin utilizar agente protector alguno.
132
En cuanto al efecto de las sales biliares sobre las Bifidobacterias, se expuso
a la cepa Bf. 1 a concentraciones crecientes de bilis de buey deshidratada
desde 0.1 hasta 1%, obteniéndose como lo indica el gráfico 3, una disminución
en los valores de absorbancia a medida que se aumentan las concentraciones
de sales biliares, ésta disminución se hace drástica hasta un valor de 0.3% de
sales biliares, y tiende a mantenerse constante hasta una concentracion de 0,6
%, respectivamente. Lo importante de estos resultados es que aún a una
concentracion de 0.3% de sales biliares se observa crecimiento, aunque menor
comparado con el control, sin sales biliares, donde la absorbancia presenta el
máximo valor (Gráfico 3).
Para la realización de éste tipo de ensayos que garantizen resultados no
muy alejados de la realidad algunos autores recomiendan el uso de 0,3% de
sales biliares o menos (Kimoto y col., 2000), es por ello que se tomaron valores
mayores y menores a 0,3%, para observar cómo se comporta esta cepa frente
a concentraciones crecientes de sales biliares
El crecimiento en presencia de bilis varia mucho aún dentro de las especies
pertenecientes al género Bifidobacterium, observando una disminución o
incluso un aumento en el crecimiento de estas bacterias en presencia de sales
biliares (Al-saleh y col., 1998; Charteris y col., 1998).
133
Gráfico 3: Efecto de diversas concentraciones de sales biliares, sobre el crecimiento de Bf 1.
0
0,5
1
1,5
2
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Sales Biliares %.
Abs
orba
ncia
610
nm
.
134
Jiang (citado en Al-saleh y col., 1998) reporta que las Bifidobacterias toleran
mejor la bilis en comparación con otras bacterias ácido lácticas como por
ejemplo; Sc. termophilus o Lb. delbrueckii ssp bulgaricus. A partir de otros
estudios obtuvo que las especies: Bf. longum, Bf. pseudolongum y Bf.
thermophilum, lograban crecer bién es medios que contenian sales biliares,
mientras que Bf. bifidum, Bf. breve, resultaban inhibidas, mostrando poco
crecimiento.
De alguna manera este parece ser nuestro caso, es posible que Bf. 1
pertenezca a una de éstas especies que presentan mayor susceptibilidad al
efecto de cualquier componente de los ácidos biliares.
Otros investigadores han encontrado que el crecimiento de la flora intestinal
en presencia de bilis o de cualquier componente de las sales biliares, puede
ejercer un efecto inhibitorio ya que los acidos biliares desconjugados inhiben el
crecimiento de ciertas bacterias anaerobias (Kobayashi y col., 1988). La bilis
deshidratada empleada para este ensayo posee una mezcla de ambos tipos de
sales: conjugadas y desconjugadas (Mejía, 2001), también se ha demostrado
en numerosos ensayos realizados in vitro y en vivo, que las
Bifidobacterias pueden desconjugar acidos biliares a formas libres (Shah,
1997a) (anexo 4).
135
Sin embargo se tienen valores de 0,4 de absorbancia para concentraciones
de 0,3% de sales biliares, en un cultivo de 48 horas de incubación; tiempo
suficiente en el que se permite ocurra la estabilización del crecimiento, sea que
aumente o disminuya. Podemos afirmar con plena certeza que Bf 1, sobrevive
cuando es expuesta in vitro a concentraciones de 0,3% de sales biliares durante
48 horas, hecho que favorece la idea de que puedan pasar a través del intestino
delgado, hasta llegar al sitio exclusivo para su proliferación in vivo el colon.
En cuanto a la actividad 7-α-deshidrolasa, enzima que actua sobre las sales
biliares conjugadas desconjugándolas, existen opiniones encontradas, hay
autores que opinan que la presencia de esta actividad hidrolítica para las sales
biliares no es deseable en una bacteria probiótica, ya que las formas
desconjugadas podrian sufrir modificaciones posteriores en el intestino y se
supone participan en procesos responsables en el desarrollo de cáncer de
colon (De Boever, Suskovic citados en Mejía, 2001). Sin embargo otros
investigadores reportan que haciendo ensayos in vitro empleando cepas de Lb.
reuteri con actividad hidrolasa sobre las sales biliares, no se detectaron efectos
perjuduciales, atribuyéndose esta propiedad probablemente a que las sales
desconjugadas se absorben sobre la superficie célular del lactobacilo,
disminuyendo así su biodisponibilidad (De Boever, citado en Mejía, 2001), éste
mecanismo también podria estar presente en las bacterias del género
Bifidobacterium.
136
Con los resultados obtenidos podemos afirmar que Bf 1, puede resistir
valores de pH de 2 y 3, durante tres horas, tiempo superior al que estaria en el
estómago en condiciones normales. Al mísmo tiempo crece bién a
concentraciones de sales biliares de 0.3 %, durante 48 horas, y resiste la acción
hidrolítica de la lisozima (100 µg/ml) durante 15 min., que son algunas de las
propiedades que la hacen apropiada para ser empleada en la elaboración de un
producto con propiedades probióticas.
IV.2.3-. Ensayo de las propiedades antimicrobianas frente a varios
patógenos de prueba.
Como se indicó en la metodología se tomaron sobrenadantes a partir de
cultivos de 12, 24 y 48 h , presentando valores de absorbancia a 610 nm; de 1,4
; 1,5 ; y 1,7 respectivamente. El valor de pH de cada uno de los sobrenadantes
antes de realizar las diluciones con el medio BHI era de 4,5 para 12 h, 4,02
para 24 h y 3,94 para 48 h. Al realizar la mezcla de sobrenadante al 50 % , el
pH final aumentó a un valor tal (5,77 ; 5,06 y 4,80, respectivamente) que
permitió el crecimiento de todas las cepas patógenas probadas, las cuales
crecen bién a partir de pH 4,8 (Tabla 2), para todos los sobrenadantes
(Correspondientes a las diluciones al 10, 20, 30 y 40 %) se obtuvo también un
importante incremento de pH y tampoco en esos casos se observo inhibición de
los microorganismos de prueba.
137
La principal propiedad antimicrobiana de las especies pertenecientes al
género Bifidobacterium radica en la producción de ácido en el medio de
crecimiento: ácido láctico y ácido acético principalmente, sin embargo, en
nuestros ensayos la mezcla de los sobrenadantes con el medio de cultivo de los
patógenos ocasiona como ya se indicó un incremento importante del pH
alcanzándose valores que permiten el crecimiento de los patógenos ensayados.
En cultivos con mayor tiempo de incubación, es probable que hubiera
valores más bajos de pH pudiéndose así obtener inhibición de crecimiento
aunque esto implica una disminución en la viabilidad de las Bifidobacterias, por
la acidificación del medio después de 48 horas.
A pesar de este resultado aparentemente negativo, no habría que olvidar
que son ensayos in vitro, no sería extraño que en pruebas In vivo los resultados
fueran otros.
Algunas cepas de Bifidobacterias excretan sustancias antimicrobianas
incluso con un espectro de actividad muy amplio (Simmering y Blaut, 2001).
Estos reportes indican que a pH 4,5 las Bifidobacterias comienzan a segregar
dichas sustancias, sin embargo en nuestro caso, con los experimentos
realizados in vitro no fue posible demostrar que B1 presenta propiedades
138
antimicrobianas frente a las bacterias patógenas probadas. Un ejemplo a cerca
de una Bifidobacteria productora de sustancias antimicrobianas de amplio
espectro es Bifidobacterium bifidum.
Los mecanísmos por medio de los cuales las Bifidobacterias alteran la
miclofora patógena intestinal, no se han determinado aun con total claridad. La
explicación más aceptada está relacionada con la producción de acido acético y
ácido láctico, siendo el ácido acético más bacteriostático que el ácido láctico, al
mismo valor de pH, pudiendo así explicarse el efecto antimicrobiano que
causan la Bifidobacterias.
139
Tabla 2: Resultados del ensayo de las propiedades antimicrobianas frente a los
patógenos de prueba, utilizando 50% de sobrenadante.
Cultivo. pH final. Tiempo de
Incubación (horas).
Abs. (610 nm) Sobrenadante. Sobrenadante + BHI.
Dilución 50%.
Patógenos Crecimiento
12 1,424 4,50 5,74 +
24 1,524 4,02 5,06 +
48 1,740 3,94 4,80 +
+: Indica, crecimiento positivo de los patógenos de prueba.
140
V. Conclusiones y Recomendaciones.
En el presente trabajo se ha seleccionado a partir de veinte cepas, sólo una
perteneciente al Género Bifidobacterium, aislada a partir de heces de lactantes
sanos de veinte días de nacidos y alimentados exclusivamente con leche materna.
Basados en esto se emiten entonces las siguientes conclusiones:
1. La cepa aislada fue identificada hasta género. La identificación hasta especie
no fue posible ya que no se contaba con los materiales necesarios para la
realización de la misma.
2. Se ha demostrado la posibilidad de utilizar la cepa de Bifidobacterium sp cómo
probiótico, basados en la realización de algunos experimentos in-vitro tales
como: Resistencia a 100 µg/ml de lisozima durante 15 min, resistencia a
valores de pH 2 y 3 durante tres horas, resistencia a concentraciones de 0,3%
de sales biliares durante 48 horas. Esto indica que la cepa aislada podría
llegar viable a su sitio de acción el colon, después de ser ingerida y pasar a
través del tracto gastrointestinal.
3. En base a los experimentos realizados in-vitro no fue posible demostrar que la
cepa Bifidobacterium sp presenta propiedades antimicrobianas frente a las
bacterias patógenas probadas, utilizando incluso 50% de sobrenadante que
provenía de un cultivo de 48 horas.
Basándonos en estos resultados planteamos las siguientes perspectivas:
141
1 Utilizar cámaras especiales para mantener las condiciones de anaerobiosis,
aún durante la manipulación de las muestras, ya que esto pudiera representar
una variable importante que estaría afectando el aislamiento del total de
Bifidobacterias presentes en las heces.
2 Identificar la especie a la que pertenece la cepa aislada, mediante el uso de
técnicas de taxonomía molecular.
3 Realizar una caracterización más amplia a fin de detectar in-vitro las
propiedades antimicrobianas que pueda presentar la cepa aislada.
4 Incluir en un producto lácteo la cepa aislada a fin de corroborar in-vivo,
mediante el uso de animales de laboratorio las propiedades probióticas
ensayadas in-vitro y su posterior uso en humanos.
5 Bifidobacterium sp, es un microorganismo de crecimiento sumamente
exigente; se propone el uso del mismo medio (TPY) suplementado con
KH2PO4 4,5 g/L y Na2HPO4 6 g/L, para proveer óptimas condiciones de
crecimiento durante la incubación, minimizando el declive de las células
viables, el cual se ve principalmente afectado por la rápida acidificación del
medio.
6 Conservar la cepa en medio TPY suplementado con 20% de leche
descremada UHT, 5% de sacarosa y 0,35% de ácido ascórbico, medio
previamente reducido que también puede ser utilizado para someterlas a
procesos de liofilización. Almacenar a bajas temperaturas.
7 El uso de estos microorganismos asegura un futuro promisorio desde el punto
de vista médico; por tal motivo se espera que éste trabajo sea retomado en
búsqueda de nuevas respuestas que permitan aportar la información
142
necesaria para la elaboración de un producto en base a bífidos, dentro de las
instalaciones del Laboratorio de Biotecnología de Microorganismos “Sixto
David Rojo”.
143
VI. Anexos.
1. SISTEMA ANAERÓBIO EMPLEADO.
Sobre Anaerogen 3.5 L (0xoid, Ltd England): Cuando un sobre
anaerogen (fig. 1) se coloca dentro de la jarra cerrada (GasPack), el oxigeno
atmosférico circundante es rápidamente absorbido con la generación
simultánea de CO2. El nivel de oxígeno se reducirá por debajo del 1% en
treinta minutos. El nivel resultante de CO2 oscilará entre 9 y 13%. El
componente activo que contiene el sobre Anaerogen es el ácido ascórbico,
cuya reacción con el oxígeno es sumamente exotérmica.
Figura 1: Sobre anaerogen (Oxoid) y jarra para anaerobiosis (Gaspack, BBL).
Jarra Anaeróbica GasPack: Fue proyectada por Brewer y Allgeier (citados
en Manual BBL, 1994) para simplificar el aislamiento y cultivo de microorganismos
anaeróbicos. El sistema está constituido por una resina de policarbonato: un
144
termoplástico durable, rígido y dimensionalmente estable, pinza, tapa con tornillo y
soporte para placas de Petri. La jarra es irrompible, de peso ligero transparente y
soporta esterilización en autoclave. Difiere de todas las demás jarras anaeróbicas
en que no tiene conexiones externas. Está especialmente diseñada para ser
utilizada con el sobre desechable generador de CO2, eliminando la necesidad de
bombas de vacío, tanques de gas, y reguladores de presión (Fig., 1) (Manual
BBL., 1994).
2. RUTA BÍFIDA: REPRESENTACIÓN ESQUEMÁTICA.
Las Bifidobacterias metabolizan la glucosa vía Fructosa-6-fosfato-
fosfocetolasa (F6PPK) (Fig., 2) debido a la presencia de células asociadas 2,1-
beta-D-fructan-fructanohidrolasas, que hidrolizan la fructosa por el extremo no
reducido de algunos azucares en posición β-2-1, originando cómo principales
productos finales acetato y lactato (Bezkorovainy y Miller-Cathpole, 1989).
A continuación se presenta la figura 2.
145
2 ATP 2 ADP
Glucosa-6-fosfato
Fructosa-6-fosfatoFructosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato
Fructosa
ADP ATP
A
B B J
C Pi
Pseudoheptulosa 7-fosfato Ribosa-5-fosfato Ribulosa-5-fosfato
G
E Xilulosa-5-fosfatoXilulosa-5-fosfatoGliceraldehido 3-fosfato
+
I 2 Pi
2 Acetato
2 ADP 2 ATP F
2(Gliceraldehido-3-fosfato)
2 (1,3-acido difosfoglicérico)
2 Fosfoenolpiruvato
2 NADH 2 NAD
K 2 Pi
2 ADP 2 ATP 2ADP 2ATP
2 Piruvato 2 Lactato
2 NADH 2 NAD
D
H
Figura 2: Ruta bífida para la fermentación de la glucosa, las enzimas involucradas son las siguientes: A, hexokinasa; B, glucosa-6-fosfato isomerasa; C, fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa; D, transaldolasa; E, transcetolasa; F, acetato kinasa; G, ribosa-5-fosfato isomerasa; H, ribulosa-5-fosfato epimerasa; I, xilulosa-5-fosfato-fosfocetolasa; J, fructokinasa; K, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. Las enzimas no identificadas corresponden a las mismas encontradas en la vía glicolítica. Todos los azúcares son D-isómeros.
71
3. Características de la enzima F6PPK, aislada a partir de Bifidobacterium globosum y Bifidobacterium dentium (Schomburg y Salzmann, 1990).
Nombre sistemático: D-fructosa-6-fosfato-D-eritrosa-4-fosfato-liasa.Nombre común: Fructosa-6-fosfato-fosfocetolasa. Sinónimos: Fosfocetolasa, fructosa-6-fosfato. Reacción catalizada: D-fructosa-6-fosfato+ortofosfato
acetil fosfato + D-eritrosa-4-fosfato + H2O. Tipo de reacción: Eliminación de un acetaldehido. Sustratos: Fructosa-6-fosfato + fosfato inorgánico. Productos: Acetil fosfato + D-eritrosa-4-fosfato + 2
gliceraldehido-3-fosfato + acetil fosfato. Inhibidores: Hidroxilamina, NADPH, sulfato de amonio,
fosfoenolpiruvato, ρ-hidroxi-mercuriobenzoato, citrato, iodo-benzoato, acetil-CoA, dodecanoil-CoA.
Activadores: Mg+2, Mn+2. Actividad específica (U/mg de proteína):
30 (Bf. dentium); 20 (Bf. globosum).
Km (mM): 1,4 (F6P, Bf. globosum); 0,87 ortofosfato; 39 (F6P Bf. dentium); 1,25 (xilulosa-5-fosfato).
ph óptimo: 5-6 (Bf. globosum); 7 (Bf. dentium). Rangos pH: (4,5-7,4); (4-9). Temperatura óptima ° C: 37 ° C. Peso molecular: 160.000 (filtración en gel): Bf. dentium.
290.000 (filtración en gel): Bf. globosum. Subunidades: Glicoproteína/lipoproteína. Estabilidad ° C: 57 Enzima de Bf. globosum, no afectada.
Bf. dentium pierde 40% de actividad. 80 Destruida después de 5 min, (Bf. dentium), Pierde 85% de actividad, pespués de 5 min., (Bf. globosum).
72
4. Sales biliares desconjugadas por las Bifidobacterias: Conversión reductiva de las sales biliares primarias hasta secundarias (Bezkorovainy y Miller-Cathpole., 1989).
Cholato conjugado. Ácido deoxicólico.
Ácido biliar primario. Ácido biliar secundario.
Amidasa
R NH2
HO
HO OH
N RC
O
H
C
OHHO
HO
OOH
Deshidrolasa
H2O
OOH
HO
HO
C
73
Fotografías tomadas a la cepa aislada y caracterizada Bifidobacterium sp.,
(B1): Mediante Microscopio (Zeiss, con cámara incorporada), filtro azul.
74
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