EVALUACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD DEL Staphylococcus aureus AISLADO EN CANINOS DEL MUNICIPIO DE SAN ALBERTO A ANTIBITICOS BETALACTAMICOS

CARLOS ARTURO HIGUITA VARGAS

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA BARRANCABERMEJA 20111

EVALUACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD DEL Staphylococcus aureus AISLADO EN CANINOS DEL MUNICIPIO DE SAN ALBERTOA ANTIBITICOS BETALACTAMICOS

CARLOS ARTURO HIGUITA VARGAS

Trabajo presentado como requisito para el segundo corte del bloque de investigacin

Tutor WILDER ORTIZ VEGA Mdico Veterinrio Zootecnista

INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA BARRANCABERMEJA 20112

CONTENIDO

pg.

1.PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2.JUSTIFICACION 3.OBJETIVOS 3.1OBJETIVOS GENERALES 3.2OBJETIVOSESPECIFICOS 4. MARCO REFERENCIAL 4.1 RELACIN DEL PH CUTNEO CON LA FLORA BACTERIANA 4.1.1 Importancia del pH cutneo canino 4.1.2 Flora normal bacteriana cutnea 4.1.3 S. aureus residente de la flora normal cutnea 4.2 CULTIVO E IDENTIFICACIN BACTERIANA PARA S. aureus 4.2.1 Agar manitol salado 4.2.2 Factor coagulasa para identificacin S. aureus 4.2.2.1 Prueba coagulasa 4.3 PRUEBA SUSCEPTIBILIDAD A LOS BETA-LACTAMICOS 4.3.1 Prueba susceptibilidad del S. aureus a la penicilina 4.3.2 Prueba susceptibilidad del S. aureus a la meticilina 4.4 RESISTENCIA A LOS ANTIBITICOS BETA-LACTAMICOS 4.4.1 Antibiticos beta-lactamicos 4.4.2 Resistencia a la Benzilpenicilina 4.4.3 Resistencia a la meticilina 5. DISEO EXPERIMENTAL 5.1 UBICACIN GEOGRFICA 5.2 MATERIALES Y MTODOS 5.2.1 materiales 5.2.2 mtodos 5.3 DISEO ESTADISTICO 6. PRESUPUESTO 7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES GLOSARIO BIBLIOGRAFA3

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9 9 9 10 10 10 11 11 12 12 12 12 13 14 14 15 16 16 16 16 16 17 18 18 20 25

LISTA DE TABLAS

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1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En la actualidad se dispone de medicamentos eficaces para curar casi todas las enfermedades infecciosas bacterianas, pero se corre el riesgo de perder esos valiosos medicamentos y la oportunidad de llegar a controlar muchas infecciones bacterianas debido a la resistencia.1 En San Alberto cesar, las personas del sector agropecuario estn usando los antibiticos para tratar distintas infecciones en sus animales sin un diagnstico bacteriolgico, esto hace que se evidencie el uso incorrecto de antibiticos, que promueven la generacin de resistencia bacteriana. Entre las bacterias de resistencia antibitica se tiene el Staphylococcus aureus, esta bacteria est aumentando el ndice de complicaciones en los tratamientos de pacientes, debido a la ineficacia de muchos antibiticos que normalmente se administraban para tratar determinadas infecciones.2 En las infecciones causadas por la cepa bacteriana del S. aureus, se le han administrado antibiticos, dentro de los ms comunes estn; los antibiticos betalactamicos con el fin de controlarlas como; Benzilpenicilina, Isoxazolilpenicilinas o penicilinas inhibidoras de beta-lactamasas etc. Sin embargo, se han evidenciado distintos grados de resistencia a dichos medicamentos y se le denomina S. aureus resistente a la meticilina (SARM), a las cepas de S. aureus multirresistente.3Para subsanar este problema se introdujeron al mercado frmacos veterinarios como las penicilinas inhibidoras de beta-lactamasas. Estudios recientes en otros departamentos colombianos como Meta, donde se evalu la susceptibilidad bacteriana del S. aureus frente a antibiticos beta-lactamicos; arrojaron resultados de un 49% de presencia de cepas de S. aureus meticilinoresistente, entre 976 aislamientos de muestras recolectadas.4 La aparicin de cepas del S. aureus resistentes a antibiticos beta-lactamicos en nuestra regin, hace necesario un procedimiento bacteriolgico para determinar la susceptibilidad antibitica del S. aureus. Teniendo en cuenta los anteriores eventos, se genera el siguiente interrogante; Cul es la susceptibilidad del Staphylococcus aureus aislado en caninos del municipio de San Alberto a antibiticos beta-lactamicos?

1 2

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA. Resistencia del S. Aureus a los antibiticos. 2003 COMISION EUROPEA. Resistencia a los antibiticos.2009. 3 CERNENADO, Emilia y CANTON, Rafael. Procedimientos En Microbiologa Clnica. 2011 4 PEREZ, Norton, PAVAS, Norma y RODRIGUEZ, Isabel. Resistencia de Staphylococcus aureus a los antibiticos en un hospital de la Orinoquia colombiana. 2010.

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Alrededor del anterior cuestionamiento se generan una serie de interrogantes como:

Cul es la susceptibilidad de las cepas de S. Aureus aislados en caninos a la penicilina?

Cul es el porcentaje de cepas de S. aureus resistentes a la meticilina (SARM) aisladas en caninos?

Comparar los dos antibiticos usado en la prueba de sensibilidad y determinar menor sensibilidad en las cepas de S. aureus?

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2. JUSTIFICACION

Esta investigacin se realiza con el fin de conocer a cerca de los grados de susceptibilidad a los antibiticos beta-lactamicos que presentan las cepas de S. aureus encontradas en la piel normal de los caninos en nuestra regin del magdalena medio. Se realiza como aporte para Mdicos Veterinarios yo Zootecnista que laboran en las clnica canina o independientemente, en donde a travs de la eleccin del antibitico adecuado segn las pruebas de sensibilidad se pretende impartir un tratamiento especfico y recuperar el estado sanitario del animal y desde el punto de vista tico ya que con el correcto uso de los antibiticos se est protegiendo la salud pblica tambin.

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3. OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la susceptibilidad del Staphylococcus Aureus aislado en caninos sanos del municipio de san Alberto a los antibiticos beta-lactamicos,

3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS

Evaluar la susceptibilidad de las cepas de S. aureus aislados en caninos a la Benzilpenicilina (Penicilina G) Evaluar la susceptibilidad de las cepas de S. aureus aislados en caninos a las Isoxazolilpenicilinas (meticilina)

Comparar los dos antibiticos usados durante la prueba de susceptibilidad y determinar la menor sensibilidad a las cepas de S. aureus

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4. MARCO REFERENCIAL

4.1 RELACIN DEL PH CUTNEO CON LA FLORA BACTERIANA

La piel es el rgano de mayor tamao de un canino, y se compone de dos capas principales; la capa externa del epitelio escamoso conocida como; epidermis y la capa interna de tejido conjuntivo llamada; dermis. La interaccin de estas capaz ofrece una barrera cerrada contra la prdida de agua, electrolitos y macromolculas. Asimismo, aporta proteccin mecnica contra el ambiente y su elasticidad posibilita el movimiento. Sin embargo, a pesar de sus rasgos protectores, los nervios sensoriales permiten la percepcin del calor y fro, presin, dolor y picazn. El tegumento es responsable de la regulacin trmica y almacenamiento de vitaminas, electrolitos, agua, grasas, carbohidratos y protenas. La superficie cutnea posee propiedades antibacterianas y anti fngicas, como la acidez cutnea o pH, el cual crea un ambiente hostil para microorganismos invasores y la continua descamacin de clulas provenientes de las capas ms profundas, existiendo entre ellas a la vez, interconexiones que evitan la penetracin de cualquier microorganismo hacia el interior.5

4.1.1 Importancia del pH cutneo canino. El pH cutneo es el principal factor que regula el crecimiento de microorganismos, este pH de la piel es resultado de una combinacin de factores de las clulas epidrmicas y glndulas sebceas apcrinas (sudorparas) y ecrinas (sebceas). Este sistema acta como un manto lpido compuestos de molculas cidas y alcalinas que mantienen el pH de la piel dentro de un rango normal. Las molculas que contribuyen a la acidez de la piel incluyen productos de las clulas epiteliales queratinizadas, como el cido urocnico y los cidos carboxlicos, y aminocidos derivados del sudor, sebo y el estrato corneo. Adems, lpidos cidos como sulfato de colesterol y cidos grasos libres, tambin presentes. Estos cidos grasos pueden surgir de secreciones sebceas o ser sintetizados por degradacin bacteriana del sebo, los cidos grasos tambin es sintetizado por la epidermis durante la diferenciacin terminal de queratinocitos. Los cidos del sudor y otros componentes de la piel, tambin contribuyen al pH cido. Ejemplos de estos son el cido lctico que puede ser descompuesto en actico y propionico y el cido butrico. Las molculas que aumentan la alcalinidad de la piel tambin estn presentes. Un ejemplo es el amonaco, que es producido por las glndulas de sudor ecrinas. El dixido de carbono y el bicarbonato del sudor tambin pueden aumentar el pH cutneo. Aunque los factores de mantenimiento del pH de la piel son complejos, la combinacin de estas molculas cidas y alcalinas, son las que en definitiva, determinan el nivel de pH de la piel .Este pH en la piel de los caninos, cuya acidez5

OMEGNA, Carolina. Determinacin del pH normal en la piel de caninos. 2004

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es la que permite el crecimiento controlado una flora bacteriana saludable que a su vez protege a la piel de microbios invasores.6

4.1.2Flora normal bacteriana cutnea. Los microorganismos saprofitos pertenecientes a la flora bacteriana normal o transitoria cutnea, inhiben el desarrollo de microorganismos invasores mediante la secrecin de sustancias nocivas que los destruyen y la ocupacin de los nichos ecolgicos. Generalmente los microorganismos invasores para iniciar la infeccin deben primero colonizar los epitelios. All, seguramente compiten con los integrantes de la flora normal por factores tales como receptores celulares y nutrientes. La flora normal transitoria cutnea canina est compuesta por Staphylococcus intermedius, Staphylococcus aureus, Estreptococos alfa-hemolticos, Clostridium, Bacteriodes y Fusobacterium entre los ms aislados.7

4.1.3 Staphylococcus aureus residente de la flora bacteriana cutnea. Una de las bacterias saprofitas de mayor inters de la flora normal o transitoria en la piel de los caninos es el S. aureus, esta es una bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva, productora de coagulasa y catalasa, perteneciente a la familia Micrococaceae, que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo en hombre y animales. Este microorganismo coloniza con frecuencia la piel y membranas mucosas sin causar infeccin. No invade la piel sana, pero mnimas roturas de la barrera cutneo-mucosa le permiten penetrar en los tejidos y causar una gran variedad de infecciones que van desde leves procesos dermatolgicos como; abscesos, Piodermis, hasta casos de compromiso vital como Endocarditis, Septicemia, Abscesos profundos, Neumona y meningitis.8

4.2 CULTIVO E IDENTIFICACIN BACTERIANA PARA Staphylococcus aureus

Los cultivos bacterianos son los mtodos ms importantes para la identificacin y estudio de los microorganismos en crecimiento dentro de sustancias alimenticias artificiales, estas sustancias alimenticias en lo que se desarrollan estos microorganismos se les denomina medios de cultivo bacteriolgicos. Dentro de los cultivos para la identificacin y seleccin para el S. aureus est; el agar manitol salado, estafilococo medio 110, entre otros.

6 7

OMEGNA, Op cit. PORTAL DE VETERINARIA ARGOS. 2011. Infecciones Cutneas en Perros. 2011 8 UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, Op cit.

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4.2.1 Agar manitol salado.Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva o S. aureus hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos (S. intermedius, S. epidermis, etc.), presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. En el cultivo agar manitol salado, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, al adicionar cloruro de sodio al 7.5% al Agar Rojo de Fenol y Manitol, se observa crecimiento de cepas patgenas de estafilococos coagulasa positivo. El rojo fenol es el indicador de pH; Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.9

4.2.2 Factor coagulasa para identificacin del S. aureus. La coagulasa libre es un pro fermento que en presencia de protrombina y/o de un confector del plasma sangunea (coagulase rating factor a CRF). Forma un complejo con actividad proteoltica que transforma el fibringeno en fibrina y produce la coagulacin del plasma sanguneo a su vez se liberan fibrinopeptidos que presentan accin sobre la fibra muscular lisa. Se considera relacionada con la virulencia pues la mayora de cepas de S. aureus la producen (98 %). Interviene en el proceso inflamatorio y en la formacin del coagulo intravenoso factor fundamental en la produccin de sepsias. Existe adems una protena de la pared celular que presenta una accin semejante (clumping factor a coagulasa combinada). Que se ha supuesto que sera la causa de la formaci6n de una cubierta protectora de fibrina responsable de la agrupacin de los estafilococo dorado o S aureus y probablemente de su acci6n inhibidora de la fagocitosis. En la actualidad no se considera relacionado con la virulencia. En el laboratorio la prueba de la coagulasa en tubo se utiliza para diferenciar S. aureus del Staphylococcus epidermis10.

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ALBRAN, Carlos. Manual de procedimientos para la determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos. 2011 10 PUMAROLA, A., RODRIGUEZ, A., GARCIA, J., & PIEDROLA, G.Microbiologa y Parasitologa Medica. 2 ed.

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4.2.2.1 Prueba coagulasa. Esta prueba consiste en la exposicin del cultivo de S. aureus a un caldo CCC (caldo cerebro corazn) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubo de ensayo previamente esterilizado, luego se tapa el tubo de ensayo con algodn hidrofilacio y lo llevamos a bao Mara a 37 C durante una hora, observando la muestra cada 15 minutos, al completa la hora, sacamos las muestras y se observa si hay cogulos adheridos al frasco. El objetivo es buscar el factor de aglutinacin de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma mediante la observacin de coagulacin.

4.3 PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDADA LOS BETA-LACTAMICOS

4.3.1Prueba de susceptibilidad del S aureus a penicilinas. Esta prueba se basa en la tcnica de defuncin por disco impregnado con 10U de penicilina (penicilina G) frente a un cultivo de S. aureus sobre una placa de Petra, el antibitico se difunde y crea as concentraciones progresivamente decrecientes a partir del disco. En aquella zona donde la concentracin de antibiticos es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria, aparece un halo de inhibicin que rodea el disco, el cual se mide el dimetro de inhibicin, segn (tabla 1.) 11

Tabla 1. Patrones de estndar del halo de inhibicin para S.aureus Dimetro del halo de Antimicrobiano Carga de inhibicin (mm) Cepa bacteriana beta-lactamico disco (g) resistencia sensible S. aureus ATCC 25923 Penicilina G 10 U

20

S. aureus ATCC 29213

oxacilina

30 g

Fuente: Procedimiento de microbiologa clnica disponible en: www.seimc.org/documentos/protocolos/ microbiologa.html

4.3.2Prueba de susceptibilidad del S aureus a la meticilina. El mtodo de difusin por disco puede ser utilizado para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana de S. aureus, con ciertas modificaciones. El inculo debe prepararse usando el mtodo de suspensin directa de colonias. Este mtodo se prefiere a los caldos de cultivo porque crecen lentamente. Por las mismas11

PROCEDIMIENTOS DE MICROBIOLOGIA. Mtodos Bsicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos. 2000

12

razones, ste debe completar 24 horas de incubacin antes de determinar la susceptibilidad a la meticilina. Por ltimo, las zonas de inhibicin de meticilina deben medirse con luz transmitida en vez de reflejada. El uso de luz transmitida permite una mejor deteccin de MRSA heteroresistentes ya que stas subpoblaciones podran ser visibles solo como una ligera patina en el crecimiento. Los MRSA homogneos presentan un crecimiento que confluye alrededor del disco de antibitico. Recientemente se ha recomendado el uso de lmites alternativos en la prueba de susceptibilidad de disco de cefoxitina u oxacilina, como un mtodo ms preciso para predecir la resistencia a meticilina mediada por mec-A en S. aureus. El mtodo estndar de difusin por disco de cefoxitina o oxacilina de 30 g se usa con los siguientes lmites de interpretacin: Aislamientos de S. aureus con dimetros de la zona de antibitico mayores o iguales al lmite apropiado (mayor de 20mmS. aureus ATCC 29213), deben reportarse como susceptible a meticilina, encambio aislamientos con dimetros menores o iguales al lmite apropiado (menores de 19mmS. aureus ATCC 43300), deben reportarse como resistentes a Meticilina con resistencia a la oxacilina, nafcilina e inhibidores de betalactamasas.12

4.4 RESITENCIA A LOS ANTIBIOTICOS

La resistencia antibitica constituye un problema de gran importancia clnica, pues obliga al desarrollo y utilizacin de nuevos agentes antimicrobianos, siempre ms costosos y muchas veces ms txicos que los empleados habitualmente en el tratamiento de las infecciones; adems ha obligado a abandonar y eliminar del arsenal teraputico a muchas drogas que inicialmente fueron muy tiles 13. La resistencia antibitica es la capacidad de un microorganismo para resistir los efectos de un antibitico. La resistencia se produce naturalmente por seleccin natural a travs de mutaciones producidas por azar, pero tambin puede inducirse artificialmente mediante la aplicacin de una concentracin leve o temporal de un antibitico a una poblacin bacteriana.14 En los aos 50 se observ el siguiente fenmeno: cuando un cultivo bacteriano de una cepa sensible a un antibitico se pone en contacto con ese antibitico, al cabo del tiempo se observa que las cepas bacterianas de dicho cultivo se reproducen en presencia de un ambiente antimicrobiano. Esto demuestra que lo nico que12 13

14

MALBRAN, Op Cit. COMSION EUROPEA, Op Cit.UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, Op cit.

13

hace el antibitico es seleccionar y destruir las cepas bacterianas sensibles, pero no afecta las cepas mutantes resistentes espontneos que surgen en la poblacin bacteriana independientemente de la presencia del agente selectivo. Las mutaciones genticas se dice que son espontneas cuando ocurren sin intervencin de procedimientos mutagnicos experimentales. Las mutaciones bacterianas espontneas son aleatorias, y afectan a un gen cualquiera en la clula. Esta es precisamente la base gentica del surgimiento de ciertas cepas patgenas resistentes a antibiticos: el frmaco inhibe o mata las bacterias silvestres sensibles, pero no afecta a los pocos individuos que por mutacin espontnea hayan adquirido un alelo resistente; estos individuos se multiplican, de modo que al final son los ms prevalentes. La resistencia microbiana de S. aureus a un antimicrobiano al que originalmente era susceptible involucra necesariamente la aparicin de un cambio permanente en el material gentico del microorganismo, que se transmite a sus descendientes, los que por este motivo resultan tambin insensibles al antimicrobiano en cuestin.15

4.4.1 Antibiticos beta-lactamicos. Estos antibiticos son; las Penicilinas, Cefalosporinas, Cefamicinas, Oxacefeminas, Clavaminas, Carbapeneminas y Monobactamicos. Se denominan beta-lactamicos por que comparten en su forma natural estructural un anillo B-lactama. Estos antibiticos en su mecanismo de accin, previenen la formacin de la pared celular bacteriana al interferir con el estadio final de la sntesis de peptidoglicanos. Estos antibiticos inhiben la actividad de las transpeptidasa y otras encimas peptidoglicano-activas que se denominan protenas ligadoras de penicilina (PBP) (transpeptidasa, carboxipeptidasas), las cuales catalizan el entrecruzamiento de las unidades de polmeros glucopeptidicos que forman la pared celular, causando la lisis celular especialmente en las clulas que estn bajo la sntesis activa de la pared celular.16

4.4.2. Resistencia a la Benzilpenicilina. El S. aureus adquiri la resistencia a las penicilinas mediante la secrecin a nivel extracelular de beta-lactamasas o penicilinasas mediadas por plsmidos, estas son encimas que degradan a los antibiticos; mediante la ruptura del anillo beta-lactamico el cual induce a la mayora de penicilinas a la perdida de actividad bacteriana y as evitar la fijacin del antibitico a las protenas fijadoras de penicilina (PBP), presentes en el extremo de la membrana citoplasmtica. La resistencia a la penicilina est conformada por la produccin de una Beta-lactamasas 2a TEM-1, dentro del grupo de Bush. Los grupos de Bush se identificaron con los perfiles de hidrolisis de sustrato por ejemplo; Benzilpenicilina, cefaloridina, ceftazidima, cefotaxima, aztreonam, imipenem y en funcin a la inhibicin al cido clavulanico y EDTA. El15 16

UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANA, Op Cit. PRESCOTT, John F, BAGGOT, Desmont J y WALKER, Robert. Teraputica Antimicrobiana en Medicina Veterinaria. 3 ed., 2002.

14

tipo de beta-lactamasas 2a, son resistentes a las Benzilpenicilina; (penicilina G, penicilina procaina y penicilina benzatina), Amidinopenicilinas; (mecilinam y pivmecilinam), carboxipenicilinas; (carbenicilina, ticarcilina, Carindacilina y Carfecilina).17

4.4.3 Resistencia a la meticilina. Definen como penicilinas antiestafilococicas a las Isoxazolilpenicilinas (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) o penicilinas resistentes a las penicilinasas producidas por S. aureus resistente a la meticilina (SARM). Esta resistencia es cromosmica y se debe a la transcripcin del gen mecA que genera una nueva protena fijadora de penicilina (PBP) denominada PBP2a, con muy baja afinidad por los antibiticos beta-lactamicos actualmente disponibles para uso clnico. El gen mecA es transportado por un elemento gentico mvil denominado cassette cromosmico mec (SCCmec). Estas cepas del S. aureus son tambin heteroresistentes a otros beta-lactamicos (cefalosporinas, Cefamicinas, Oxacefeminas, Clavaminas (inhibidores de betalactamasas), Carbapeneminas, Monobactamicos, amino glucsidos, macrobios y tetraciclinas.18

17 18

PRESCOTT, Op Cit. PRESCOTT, Op Cit.

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5. DISEO EXPRIMENTAL

5.1 UBICACIN GEOGRFICA

La tienda de mascotas est ubicada dentro del municipio de san Alberto cesar en el barrio centro, coordenadas; 74533.85 N y 732339.25 O, con una elevacin de 115 msnm, una humedad de 88% y una temperatura de 21 C aproximadamente.

5.2MATERIALES Y MTODOS

5.2.1 Materiales. La recoleccin de muestras ser asptica; y se utilizaran los siguientes elementos: 50 Guantes ltex 01 solucin de yodo 01 mango de bisturi N 4. 50 hojas de bisturi N 22, para cada raspado. 50 bolsas NASCOS estril, para trasportar cada muestra. 50 caninos. La poblacin total canina del municipio de san Alberto es aproximadamente de 1547 perros sin limitacin en edad, sexo y raza. Los 50 caninos a los que se pretende extraer las muestras suponen un 1,6% de la poblacin canina presente en el municipio. Con el fin de desarrollar este experimento, en una tienda de mascotas dentro del municipio de san Alberto, se determinara como punto de recoleccin de muestras de raspados cutneos tomados de los caninos sin procesos dermatolgicos

5.2.2 Mtodos. La recoleccin de muestras se har en una poblacin canina de cincuenta ejemplares al azar, pertenecientes a distintas razas, edades, sexos y sin ningn proceso dermatolgico. Los caninos para la muestra se deben inmovilizar teniendo en cuenta que las personas que intervengan deben presentar tapabocas y guantes para evitar la contaminacin de patgenos indeseados, para recolectar las muestras de la flora normal sin contaminacin alguna. Con un bistur se har un raspado cutneo o el retiro de un pliegue de piel, cambiando cada cuchilla para cada muestra previniendo la contaminacin de cada muestra, una vez tomada la muestra se introducir dentro de la bolsa tipo nasco estril y sellada inmediatamente.16

En el laboratorio cada muestra cutnea se cultivara independientemente en un medio de agar manitol salado, para permitir el crecimiento y desarrollo del S. aureus cuya cepa es la nica de inters. Posteriormente se confirmara la presencia de S. aureus por medio de la prueba coagulasa Luego de 24 horas sern sometido a las pruebas de susceptibilidad microbiana; susceptibilidad a las penicilinas (penicilina G), susceptibilidad a las meticilina (oxacilina).

5.3 DISEO ESTADSTICO

Se utilizara la estadstica descriptiva en un diseo completamente al azar el cual se seleccionara una poblacin canina de 50 ejemplares sin diferencias de edad, sexo o raza, y se le extraer una muestra de piel; 50 muestras de piel que sern cultivadas en 50 placas de petry con agar manitol salado (medio selectivo para S. aureus), estas cepas bacterianas sern las unidades experimentales homogneas a la cual se sometern a la prueba de antibiticos para medir la variable susceptibilidad a la penicilina (disco de penicilina G) o susceptibilidad a la meticilina (disco de Oxacilina) cuyos resultados sern un porcentaje de cepas resistentes a las penicilinas o resistencia a la meticilina y su comparacin del antibitico de menor sensibilidad las cepas de S. aureus.

17

6. Presupuesto

tem

Concepto

Unidad Cantidad V/unitario

V/total

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7

1. Materiales de campo Guantes ltex 02 50 100 tapabocas 01 01 2000 Mango bistur 01 01 5000 Hojas de bistur 01 50 500 Bolsas tipo nasco 01 50 500 Contenedor muestras 01 01 5000 Solucin de yodo 01 01 3000 subtotal

5000 2000 5000 25000 25000 5000 3000 70.000

2.1 2.2

2. Materiales de apoyo cultivo bacteriolgico 01 50 20.000 100.000 Prueba sensibilidad 02 100 20.000 200.000 subtotal 300.000

3.1 3.2

3. Papelera Resma tamao carta 01 01 Carpetas de 02 02 presentacin

9.000 600

9.000 600

subtotal 9.600

4.1

Gastos de muestras

envi 01

4. Otros 01

5000

5000 5.000 384.600 38.460 423.060

Subtotal Total Improvistos 10% Total ms improvistos

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7. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Elaboracin de documento Extraccin muestras en caninos Cultivos bacteriolgico Prueba de susceptibilidad Resultado de laboratorio Procesamiento estadstico Interpretacin de resultados Elaboracin de documento final

Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 4 Semana 1 Semana 2 Semana 3 Semana 419

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES DEL PROJECTO RESISTENCIA DE S. AUREUS EN CANINOS

JULIO

AGOS

SEPT

OCT

NOV

DIC

GLOSARIO

Absesos: un absceso es una infeccin e inflamacin del tejido del organismo caracterizado por la hinchazn y la acumulacin de pus. Puede ser externo y visible, sobre la piel, o bien interno. Agar: polisacrido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias especies de algas sidosas de los gneros Gelidium, Euchema y Gracilaria entre otros actuando como pigmento que da un color caracterstico a cada una. Utilizada comnmente en cultivos bacteriolgicos Anillo beta-lactamico: o -lactmico, tambin llamado penam es una estructura lactmico con un anillo heterocclico que consiste en tres tomos de carbono y un tomo de nitrgeno. Antibiticos beta-lactamicos: agente antibitico que contenga un anillo lactmico en su estructura molecular Benzilpenicilnas: antibitico betalactmico, de la familia de las penicilinas, considerado el referente del grupo. Beta-lactamasas: son encimas producida por algunas bacterias y es responsable por la resistencia que stas exhiben ante la accin de antibiticos betalactmicos. Todos estos antibiticos tienen un elemento en comn dentro de su estructura molecular denominado anillo betalactmico, un anillo qumico de cuatro tomos. Las lactamasas rompen el anillo, desactivando las propiedades antimicrobianas de la molcula. Las betalactamasas por lo general son producidas por bacterias Gram positivas en forma secretada. Por lo general, las cepas resistentes a la penicilina se relacionan directamente con el porcentaje de cepas productoras de betalactamasa. Carbapeneminas: carbapenmicos son antibiticos betalactmicos derivados del gnero Streptomyces para el tratamiento emprico de infecciones graves. Catalasa: es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua Cefaminas: son antibiticos semisintticos derivados de la cefamicina C, producida por Streptomyces lactamadurans. Se diferencian de las cefalosporinas por presentar un radical metoxi en posicin 7a, que condiciona la resistencia, las b-lactamasas y la estabilidad metablica. Cefoxitina: antibiticos del grupo de no verdaderas cefalosporinas, son las llamadas cefamicinas que se caracterizan por tener un grupo metoxi en la posicin20

Clavaminas: Dentro de este grupo, la sustancia ms estudiada es el cido clavulnico producido por Streptomyces clavuligerus . Qumicamente consta de un anillo oxazolidnico unido a otro b-lactmico. Las cadenas laterales surgen del carbono en posicin. Tiene escasa actividad antimicrobiana, pero es un potente inhibidor de algunas b-lactamasas. Se ha demostrado accin sinrgica en combinaciones con ampicilina, amoxicilina, carbenicilina, ticarcilina, penicilina G, cefalotina, cefaloridina y cefazolina. Coagulasa: protena producida por varios microorganismos entre ellos el S. aureus, que permite la conversin del fibringeno en fibrina Diagnostico: anlisis que se realiza para determinar cualquier situacin (enfermedad-) y cules son las tendencias. Disfucion de disco de antibiticos: mtodo de difusin con disco, la bacteria es sembrada en la superficie del medio de cultivo y se difunden disco impregnados con antibiticos para determinar la sensibilidad de la bacteria al antibiotico El anillo betalactmico es parte de la estructura de varias familias de antibiticos, especialmente las penicilinas, cefalosporinas, carbapenems y los monobactmicos, por lo que estos se conocen como antibiticos betalactmicos. El modo de accin de estos antibiticos es la inhibicin de la sntesis de la pared celular de las bacterias, por lo que tiene capacidades letales para las Gram positivas. Las bacterias pueden desarrollar la clsica resistencia a antibiticos betalactmicos por medio de la produccin de una enzima llamada betalactamasa la cual ataca por hidrlisis al anillo -lactmico. Endocarditis: enfermedad que se produce como resultado de la inflamacin del endocardio, es decir, un proceso inflamatorio localizado en el revestimiento interno de las cmaras y vlvulasbien sea nativas o protsicoscardacas. Se caracteriza por la colonizacin o invasin de las vlvulas del corazn formando vegetaciones compuestas por plaquetas, fibrina y microcolonias de microorganismos y, ocasionalmente, clulas inflamatorias. Es responsable de la formacin de los cogulos de sangre. Cuando se produce una herida se desencadena la transformacin del fibringeno en fibrina gracias a la actividad de plaquetas. Fagocitosis: tipo de endocitosis por el cual algunas clulas (neutrfilos y macrfagos) rodean con su membrana citoplasmtica a un antgeno, clula apottica, restos celulares, microorganismos y sustancias de un tamao generalmente mayor a 0.5nm y lo introducen al interior celular. Esto se produce gracias a la emisin de pseudpodos alrededor de la partcula o microorganismo hasta englobarla completamente y formar alrededor de l una vescula, llamada fagosoma, la cual fusionan posteriormente con lisosomas para degradar el antgeno fagocitado.21

Fibirinogeno: protena soluble del plasma sanguneo precursor de la fibrina, su longitud es de 46 nm, su peso 340 kDa. Fibrina: protena fibrilar con la capacidad de formar redes tridimensionales. Esta protena desempea un importante papel en el proceso de coagulacin dadas sus propiedades, tiene la forma de un bastn con tres reas globulares y la propiedad de formar agregados con otras molculas de fibrina formando un cogulo blando. Normalmente se encuentra en la sangre en una forma inactiva, el fibringeno, el cual por la accin de una enzima llamada trombina se transforma en fibrina, que tiene efectos coagulantes. Infeccin: trmino clnico para la colonizacin de un organismo husped por especies exteriores Inhibidores de beta-lactamasas: grupo de medicamentos que actan de manera reversible o irreversible que inhiben a muchas de las enzimas betalactamasas bacterianas. Carecen de actividad antimicrobiana intrnseca, por lo que suelen ser administradas en conjunto con antibiticos betalactmicos, reduciendo la accin que le confiere resistencia a ciertas bacterias en contra de estos antibiticos. Isoxazolilpenicilinas: grupo penicilinas resistentes a las penicilinasas producidas por agentes bacterianos Macromolculas: molculas que tienen una masa molecular elevada, formadas por un gran nmero de tomos. Generalmente se pueden describir como la repeticin de una o unas pocas unidades mnimas o monmeras, formando los polmeros. Manitol: es un edulcorante obtenido de la hidrogenacin del azcar manosa. Pertenece al grupo de edulcorantes denominado polioles o polialcoholes. Meningitis: es una enfermedad, caracterizada por la inflamacin de las meninges, tienden a bloquear los nervios en el cerebro conllevando a inconsciencia y lesin cerebral y de otros rganos que rpidamente progresa a daos irreversibles y muerte Meticilina: antibitico betalactmico de espectro reducido del grupo de las penicilinas. Fue usado anteriormente para el tratamiento de infecciones causadas por bacterias gram positivas productoras de betalactamasa como el Staphylococcus aureus, pero actualmente no es usado clnicamente Monobactamicos: grupo de medicamentos clasificados dentro de los antibitico betalactmico. Descubiertas en 1981, muchas molculas monobactmicas provienen de grmenes que viven en la tierra, aunque pocos tienen actividad antibacteriana de importancia. A diferencia de otros betalactmicos, los22

antibiticos monobactmicos tienen solo un solo anillo betalactmico en vez de tener dos. Nafcilina: antibitico betalactmico,1 de espectro reducido del grupo de las penicilinas,2 por lo que se indica en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias Gram positivas, en particular las especies de estafilococos que suelen ser resistentes a otras penicilinas Neumona: o pulmona es una enfermedad del sistema respiratorio infecciosa e inflamatoria que consiste en la infeccin de los espacios alveolares de los pulmones. Oxacefeminas: qumicamente, el ncleo es semejante a las cefamicinas, salvo que el azufre del anillo dihidrotiaznico ha sido sustituido por oxgeno. El nico representante de este grupo es el moxalactam, que tiene una gran actividad frente a bacterias gramnegativas, resistentes a otros b-lactmicos. Su espectro y actividad es semejante al de la cefotaxima, pero es ms eficaz frente a Bacteroides del grupo fragilis. Oxacilina: antibitico betalactmico, de espectro reducido del grupo de las penicilinas, por lo que se indica en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias Gram positivas, en particular las especies de estafilococos que suelen ser resistentes a otras penicilinas. Penicilinasas. Tambin llamada beta-lactamasas Peptidoglicanos: o murena es un copolmero formado por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el cido N-acetilmurmico unidos mediante enlaces -1,4. La cadena es recta y no ramificada. Constituye la estructura bsica de la pared celular de las bacterias y de las Prochlorophyta. Piodermis: pioderma de superficie o superficial es una colonizacin bacteriana nicamente de la superficie de la epidermis Pluripeptona: es una mezcla en partes iguales de peptona de carne y peptona de casena) es la fuente de nutrientes; fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano para el desarrollo de microorganismos. Proceso dermatolgico: alteracin de la funcin dermatolgica por agentes externos Protenas ligadoras de penicilina: son receptores enzimticos que reciben el nombre Protenas Fijadoras de Penicilinas (PBP-Penicillin Binding Proteins) y son carboxipeptidasas, transpetidasas y endopeptidasas, implicadas en la fase final de la formacin de la pared celular23

Protombina: factor II de coagulacin) es una protena plasmtica producida por el hgado y forma parte de la cascada de la coagulacin. Prueba de suceptibilidad: prueba microbiolgica en la que se detecta la sensibilidad de un agente patgeno a un antimicrobiano Resistencia antibitica: es la capacidad de un microorganismo para resistir los efectos de un antibitico Septicemia: se le llama sepsias al sndrome de respuesta inflamatoria sistmica (SRIS) provocado por una infeccin (no necesariamente grave). Esta respuesta del organismo se desarrolla como respuesta a grmenes patgenos pero no se debe a la presencia de los microorganismos en s, sino a la accin del sistema inmune liberando sustancias proinflamatorias que ponen en marcha el SRIS. Transpeptidas: enzima bacteriana cuya funcin es realizar enlaces cruzados en la formacin de las cadenas que constituyen al peptidoglicano en la pared celular de muchas bacterias. Esta enzima es tambin conocida como una carboxipeptidasa D-Alanina-D-Alanina tipo serina por tener dos residuos de Alanina en el carbono terminal.

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BIBLIOGRAFIA

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LISTA DE TABLAS

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Tabla 1. Patrones de estndar del halo de inhibicin para S.aureus

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