Staphylococcus aureus y sus factores de virulencia

MARTÍNEZ IBARRA ALEJANDRA

Universidad Autónoma Metropolitana

Introducción1. Estructura de Staphylococcus aureus2. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune por parte de S. aureus 2.1 Estrategias de evasión del complemento desarrolladas por S. aureus. SpA Sbi SSL-7 CHIPS SCIN Efb Estafiloquinasa3. Organización y regulación de los genes que codifican factores de virulencia. 4. Adherencia bacteriana, colonización e invasividad a tejidos del huésped.5. Islas de patogenicidad bacteriana6. Toxinas bacterianas y su papel en virulencia (Exotoxinas, endotoxinas). Enterotoxinas Exotoxinas Toxina del síndrome de shock tóxico Toxinas exfoliativas Alfa – hemolisina Beta – hemolisina Delta – hemolisina Gama Hemolisina y PV leucocidina7. Biopelículas bacterianas PIA Bap PGA

Introducción

Staphylococcus aureus es un microorganismo anaerobio facultativo, grampositivo, inmóvil, catalasa y coagulasa positivo; de forma esférica, que se agrupa en forma de racimo de uvas. La pared de las células estafilocócicas es resistente a la lisozima y sensible a la lisostafina, la cual rompe los puentes de pentaglicina de Staphylococcus spp. S. aureus es capaz de crecer en un rango de temperatura de 7 a 48°C, aunque su temperatura óptima es de 30 a 37°C, a un pH

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de 4.2 a 9.3, siendo de 7 a 7.5 el pH óptimo y en concentraciones de cloruro de sodio (NaCl) hasta de 15% (Bachert et al., 2002).

S. aureus habita de forma natural en tracto respiratorio alto, piel y cabello de animales de sangre caliente, incluyendo al hombre (Borelli et al., 2006). Una gran fracción de la población humana está colonizada con esta bacteria. Esas cepas colonizadoras de S. aureus causan enfermedad sólo raramente. Sin embargo, S. aureus es una de las causas más frecuentes de infección bacteriana en la gente. Cepas específicas resistentes a antibióticos causan epidemias hospitales, pudiéndose distinguir entre estas, infecciones "nosocomiales" e infecciones adquiridas por comunidad, que son causadas por un grupo mucho más diverso de cepas con propiedades diferentes. S. aureus puede causar una amplia gama de enfermedades en los límites de toxicosis como la intoxicación por alimentos hasta enfermedades invasivas. Las cepas de S. aureus codifican una gran variedad grande de toxinas secretadas, y estas toxinas son responsables de la mayor parte de los síntomas clínicos asociados con las infecciones (Brüssow et al, 2004).

1. Estructura de Staphylococcus aureus

Todos los genomas estafilocócicos tienen un tamaño aproximadamente de 2.8. Mbp con un contenido bajo de G+C. El ADN de S. aureus se encuentra organizado en un cromosoma (Baba et al., 2008)

La pared celular estafilocócica juega un papel importante para el éxito de este organismo, debido a que esta resiste presiones de turgor enormes en todas las a través de todo el ciclo celular (la California 20 a 30 atm), interactúa fuertemente con el ambiente externo célular, particularmente en procesos de infección, y está intimamente implicado en la división celular.

Los componentes de la estructura primaria de la pared celular estafilocócica consisten en peptidoglicano, ácidos lipoteicóicos, proteínas superficiales y recientemente se ha demostrado la existencia de un espacio periplámico (Matías y Beveridge, 2005).

El peptidoglicano es el principal componente de la pared celular de S. aureus. y es el blanco de antibióticos importantes, entre ellos los B-lactámicos, por ejemplo las penicilinas, que ejercen su actividad antimicrobiana interfiriendo con las enzimas (proteínas de unión a penicilinas) específicamente involucradas en la síntesis de peptidoglicano, mientras glicopeptidos, por ejemplo la vancomicina) une con alta afinidad y especificidad a los precursores de peptidoglicano, previniendo así la incorporación a la pared celular bacteriana

Actualemtne existe una necesidad constante de nuevos fármacos antiestafilocócicos debido al desarrollo de cepas antibiótico – resistentes. Un ejemplo de este fármaco es la lisostafina, una enzima secretada por Staphylococcus simulans que rompe específicamente los puentes cruzados de pentaglicina del peptidoglicano de S. aureus, así hidrolizando la pared celular y

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lisando la bacteria. Debido a su especificidad única, la lisostafina podría tener el alto potencial en el tratamiento de infecciones estafilocócicas antibótico-resistentes (Francius et al., 2008).

2. Mecanismos de evasión de la respuesta inmune por parte de S. aureus

El sistema de complemento es la parte de la defensa innata inmune de un hospedero vertebrado, que forma una barrera principal y temprana para la invasión de microbios y patógenos. Sobre la entrada de un invasor, el complemento puntualmente es activado y ataca por opsonización y lisis (target). Además, el sistema de complemento activado induce las reacciones inflamatorias que inician las cuales inician las funciones efectoras celulares adicionales tanto de la respuesta inmune innata como de la adaptable (Zipfel et al.,2007).

Para establecer una infección, los patógenos tienen que inhibir, controlar y prevenir el reconocimiento del complemento e inhibir la función del efector. Muchos patógenos han desarrollado los medios para controlar la respuesta del complemento del hospedero y para este fin utilizan múltiples estrategias de evasión para interferir e inactivar el poderoso ataque de complemento.Los mecanismos a través de los cuales los patógenos pueden evadir el complemento son: 1) a través de secreción de proteasas, ii) disfraz del complemento y iii) expresión de inhibidores del complemento (Zipfel et al.,2007).

2.1 Estrategias de evasión del complemento desarrolladas por S. aureus.

La estrategia de evasión del complemento de S. aureus consiste en que ésta bacteria expresa múltiples proteínas de superficie celular y secreta proteínas adicionales dirigidas hacia las defensas inmune adaptativas e innatas del hospedero (Zipfel et al.,2007).

SpA (módulo B). Proteína estafilocócica A. Es una proteína de superficie que altera la iniciación de la ruta clásica del complemento. Ésta reconoce el dominio Fc de las Igs con alta afinidad, lo cual resulta en una señalización invertida y bloqueo de los sitios de unión de C1q (y el receptor Fcγ). SpA también puede unirse al receptor gC1qrR/p33 de C1q, el cual es altamente expresado en la superficie de las plaquetas y células endoteliales. Sin embargo este mecanismo podría estar más cercanamente relacionada a la adhesión celular por la asociación al fibrinógeno, que la evasión inmune. SpA puede unirse a factor Willebrand y al receptor 1 del factor de necrosis tumoral (Lambris et al., 2008).

Sbi. Proteína de unión a IgG de S. aureus. es una proteína menos caracterizada que muestra la misma versatilidad fisiológica que SpA (Lambris et al., 2008)..

SSL-7. Superantígeno estafilocócico similar a la proteína 7. Esta proteína rompe la cadena de la respuesta inflamatoria que es llevada a cabo por C5 y sus productos

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de activación. SSl-7 se une a C5 con lata afinidad, resultando en la inhibición de la hemólisis mediada por el complemento. SSL-7 también interactúa con IgA en una manera independiente de C5 (Lambris et al., 2008).

CHIPS Proteína inhibidora de quimiotaxis. Altera las respuestas de monocitos y neutrófilos inhibiendo la señalización de C5a, principalmente a través de la interacción y antagonización de los receptores C5a (Lambris et al., 2008)

SCIN. Inhibidor del complemento estafilocócico. Es una proteína de 10kDa que bloquea las rutas la activación del complemento, clásica, alternativa y de la lectina. SCIN se une específicamente al activador unido a convertasas, pero no a componentes libres. SCIN parece estabilizar las convertasas C3 en un estado no funcional bloqueando eficientemente todas las rutas (Lambris et al., 2008)

Efb. Proteína de unión al fibrinógeno extracelular. Efb fue la primera proteína de unión a C3b identificada en S. aureus, inhibe la opsonofagocitosis a través de los granulocitos. Une fibrinógeno y también el tioester del dominio C3d de C3b (Lambris et al., 2008). Efb inhibe la deposición de C3b sobre superficies sensibilizadas. El sitio de unión del fibrinógeno está contenido en la terminal amino y el sitio de unión de C3d en la terminal carboxilo de la proteína. La unión de Efb a C3 nativa altera la conformación del componente del complemento central y así impide la activación subsecuente de C3 (Zipfel et al.,2007).

Estafiloquinasa. Es una proteína, no es una enzima por sí misma, ésta forma un complejo con el plasminógeno y se convierte en una serina proteasa plasmina activa, cuyo sustrato es C3 e IgG humanas. La plasmina se une a la superficie de S. aureus y remueve IgG, C3b e iC3b de esta superficie, revirtiendo así el efecto de opsonización. La hendidura de la plasmina de IgG en su región de charnela o bisagra también podría atenuar la activación de la vía clásica por C1q. Además de activar la plasmina, la estafiloquinasa suprime directamente las propiedades bactericidas de defensinas – α, lo cual la hace un importante factor de colonización (Lambris et al., 2008)

3. Organización y regulación de los genes que codifican factores de virulencia.

La formación de biopelícula, factor de virulencia importante para la colonización en S. aureus, requiere de diversos loci que codifican el componente polisacárido de la matriz exracelular de la biopelícula, entre esos loci se incluyen sarA, agr, dlt, hla, clp, and ica.

Además de SarA, que es el regulador accesorio estafilocócico, posiblemente también el factor de estrés sigma, σB es importante para la regulación de biopelícula en S. epidermidis, pero menos importante en S. aureus. (Tu Quoc et al., 2007).

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La presencia de PIA polisacárido de adhesión intracelular, es controlada por el operón icaADBC, éste está reprimido por IcaR y TcaR, un regulador del locus asociado a teicoplanina (Tu Quoc et al., 2007).

En aislamientos estáfilocócicos clínicos y de laboratorio, la producción de PIA no siempre se ha correlacionado con la formación de biopelícula, y de hecho, algunos sistemas modelos, el locus ica puede ser suprimido sin afectar considerablemente la formación de la biopelícula in vivo o in vitro. El hallazgo de la producción de biopelícula en ausencia o presencia de ica, ha conducido a la proposición de 2 rutas que regulan la formación de ésta, denominándose ica-independiente e ica-dependiente.

El locus regulador del gen accesorio (agr), controla la producción de numerosos factores de virulencia en respuesta a señales de detección de quórum o autoinducción capturadas a través del sistema sensorial de dos componentes AgrAC. La molécula efectora del locus agr es un ARN regulador, llamado RNAIII. Además de sus efectos sobre la expresión del gen de factor de virulencia, la transcripción primaria RNAIII también codifica hemolisina, cuyas propiedades surfactantes, modulan la formación biopelícula. Un estudio reciente con S. aureus también reveló que la interrupción del sistema arlRS, también de dos componentes, demostró promover fuertemente la formación de biopelícula mejorando la adhesión a la superficie y la producción de PIA. De la misma manera, la inactivacion de un sistema alterno de detección mediado por LuxS mostró incrementar la formación de biopelícula in vitro y resultó en el mejoramiento de la virulencia in vivo en un modelo de rata de infección mediada por biopelícula (Tu Quoc et al., 2007).

Diversos determinantes de virulencia están son codificados por bloques de genes contenidos en profagos que se encuentran integrados al genoma, lo cual resulta de gran importancia debido a la adquisición de propiedades de virulencia a través de esta vía. En un estudio de secuenciación y comparación de genomas de diversas cepas de S. aureus se determinaron las locaciones de los principales genes relacionados con virulencia y se encontró que genes que codifican para exotoxinas se encuentran contenidos en el fago vSaα; aquellos que codifican para enterotoxinas en los fagos φNM3, vSa3, φSa3mw, φSa3n, vSa4 y vSaβ, dependiendo de la cepa analizada; genes para la toxina del síndrome del shock tóxico en el fago vSa4; genes para la toxina exfoliativa y la alfa-hemolisina en el fago vSaץ; genes para LukDE leucocidina y diversas exoenzimas en el fago vSaβ, entre otras (Baba et al, 2008).

Otro importante factor de virulencia que posee S. aureus es la resistencia a antibióticos. Las cepas resistentes a muchos antibióticos son denominadas meticilina – resistentes (MRSA), estas causan infecciones fatales tales como neumonía necrosante

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4. Adherencia bacteriana, colonización e invasividad a tejidos del huésped

La mayoría de las bacterias, mas no todas, se adhieren y viven en una asociación cercana con las superficies. Son las adhesinas proteicas las que les confieren la capacidad de resistir a las fuerzas físicas de remoción. Estas adhesinas bacterianas poseen especificidad para superficies, y tienen funciones de indicación de dirección para la bacteria. La expresión de las adhesinas es controlada por varias señales ambientales a través de comunicación cruzada entre adhesinas (Klemm y Schembri, 1999).

El polisacárido de adhesión intracelular basado en la glucosamina (PIA) o pli-Nsucsanilglucosamina (PNSG), es respondable de la adherencia de célula a célula.

SarA regula positivamente los genes fnbA y fnbB. FnbA y FnbB son las proteínas adhesivas importantes para la virulencia, promoviendo la adhesión a superficies bióticas y abióticas (Shanks et al, 2008).

La proteína de unión a la fibronectina tiene dominios de unión a la heparina, y se las proteínas de unión a la fibronectina son requeridas para la formación del biofilm, y son estimuladas por el citrato para este efecto (Shanks et al., 2008). Mutaciones realizadas en la cepa Newman de S. aureus en los genes fnbA y fnbB han producido truncamientos de las proteínas FnbA/FnbB y adhesión reducida a la fibronectina (Grundmeier et al., 2004)

S. aureus produce biopelícula, este es un modo de colonización que facilita la infección. Una biopelícula se define como una comunidad estructurada de células bacterianas encerraadas en una matriz polimérica producida por ellas mismas (Costerton et al., 1999). La adherencia inicial a la superficie de los estafilococos a las superficies abióticas es mediada por múltiples factores. La alteración de la carga negativa de los ácidos teicoicos, por ejemplo, a través de la esterificación de D-alanil reductor, afecta la adhesión primaria y adherencia al poliestireno. Determinantes proteicos tales como la autolisina AtIE, la proteína asociada a la agregación y la proteína asociada a la biopelícula también modulan la adhesión a la superficie (Tu Quoc et al, 2007)

La patogénesis de cepas particulares de S. aureus es atribuida al efecto combinado de factores extracelulares y toxinas, junto con las propiedades invasivas de la cepa como la adhesión, la formación de biopelícula, y la resistencia a la fagocitosis (Cucarela et al., 2001). Mas adelante se describe a detalle el proceso de formación de biopelícula de S. aureus.

5. Islas de patogenicidad bacteriana

Gracias a análisis comparativos del genoma de S. aureus se ha revelado que existen regiones bien conservadas mientras que otros bloques de la secuencia muestran alta variabilidad. Las regiones variables han sido clasificadas

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como profagos, islas de patogenicidad (PAI) o cromosomas en casete estafilocócico (SCCmec) (Baba et al., 2008).

Actualmente, el término isla de patogenicidad se utiliza para describir regiones cromosómicas que contienen genes de virulencia y que están ausentes de cepas no patógenas de la misma especie o de especies cercanamente relacionadas. Las islas de patogenicidad difieren en estructura y función, pero comparten diversas características en común, incluyendo el hecho de que ellas están frecuentemente insertadas en genes de ARNt, que su contenido de G+C difiere del resto del genoma y que ellas codifican restos de elementos móviles (Lavigne y Blanc-Potard, 2008).

Las islas de patogenicidad de Staphylococcus aureus (SaPIs) son una familia de elementos genéticos que llevan genes que codifican una variedad de toxinas superantígenos. Las SaPIs están establemente integradas en sitios cromosómicos específicos, pero pueden ser movilizadas después de la infección por ciertos bacteriófagos estafilocócicos o por inducción SOS de profagos endógenos por estrés ambiental, incluyendo ciertos antibióticos (Poliakov et al, 2008).

El miembro prototipo de la familia SaPI, SaPI1, contiene genes para la toxina del síndrome de Shock tóxico (TSST-1) así como enterotoxinas Q y K. SaPI1 puede ser movilizado por el bacteriófago 80α, conduciendo a la formación de SaPI1 que transforma las partículas que tienen una morfología similar a aquella del 80 α, pero con capsides que son aproximadamente un tercio del volumen de aquellos del fago ayudante, conmensurado con el tamaño más pequeño del ADN de SaPI1. La integración y la ecisión de SaPIs está ligada al fago, ocurre por la recombinación de un sitio específico entre una secuencia específica att en la isla de patogenicidad y un sitio de att cromosómico correspondiente, que conduce a la generación de repeticiones cortas directas flanqueando al elemento integrado. SaPI1 codifica una integrasa semejante a las integrasas del fago y es suficiente para la integración del sitio específico de la isla patogenicidad, pero no puede promover la ecisión de SaPI1 en ausencia del fago ayudante. Un segundo gen de SaPI1 semejante al del fago codifica una proteína homóloga a la pequeña subunidad de la terminasa del fago, una enzima implicada en la encapsidación del ADN (Poliakov et al, 2008).

Otras islas de patogenicidad encontradas en aislamientos clínicos de cepas de S.aureus son vSaα, vSaβ, vSaץ y νSa4; vSaα, vSaβ, las dos principales islas de patogenicidad de S. aureus están presentes en todas las cepas estafilocócicas secuenciadas hasta ahora, se piensa que estas islas de patogenicidad fueron aquiridas posiblemente a través de transferencia genética horizontal debido a la existencia de genes de recombinación, las integrasas; vSaץ también está presente en todas las cepas secuenciadas de S. aureus y codifica una toxina exfoliativa y exotoxinas; vSa4 se ha encontrado insertada en diversas cepas, entre ellas la N315, en donde se localiza rio abajo en el fago φNM3 y codifica 20 marcos de lectura abiertos incluyendo tres genes superantígenos presentes en esa cepa,

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mientras que en la cepa Newman carece de determinantes de virulencia y codifica solo para una integrasa y tres proteínas. (Baba et al., 2008)

6. Toxinas bacterianas y su papel en virulencia (Exotoxinas, endotoxinas).

Enterotoxinas

Las enterotoxinas de S. aureus se clasifican como citotónicas debido a la afluencia de agua que es pasiva y sigue la secreción activa de iones de cloruro en el lumen intestinal. En general, estas toxinas, ejercen sus efectos por las perturbaciones del sistema de nucleótido cíclico a nivel de la ciclasa.

Conocidas también como toxinas pirógenas estafilocócicas superantígenas (PTSAgs) incluye SEA, SEB, SECn, SED SEG, SEH, SEJ. Como la mayor parte de proteínas secretadas por S. aureus, este tipo de exotoxinas son producidas principalmente en la fase postexponencial de crecimiento (Dinges etal., 2000).

La colonización de S. aureus en los alimentos se ha asociado en gran parte con la forma de gastroenteritis que se manifiesta clínicamente como emesis con o sin diarrea. Esta condición es llamado intoxicación estafilocócica alimentaria y resulta de la ingestión de una o más enterotoxinas estafilocócicas preformadas en los alimentos que han sido contaminados con S. aureus (Dinges et al., 2000).

Cada uno de estas exotoxinas exhibe al menos tres propiedades biológicas: pirogenicidad, superantigenicidad, y la capacidad para aumentar la mortalidad de endotoxina en conejos hasta 100,000 veces más. Las enterotoxinas poseen propiedades adicionales, ya que son potentes agentes eméticos potentes (Dinges et al., 2000)

La propiedad mejor caracterizada de las PTSAgs es la superantigenicidad, la cual se refiere a la capacidad de esas exotoxinas para estimular la proliferación de los linfocitos T sin contemplar la especificidad antigénica de estas células. Otras proteínas de enterotoxinas estafilocócicas (SEG, SEH, y SEI) o genes (sej y sek) también puede ser PTSAgs o codificar PTSAgs debido a que ellas exhiben actividad superantigénica o la homología de secuencia para PTSAgs conocido (Dinges etal., 2000).

Los genes para estas toxinas son llevados por plasmidos, bacteriófagos, o elementos heterólogos genéticos, tales como islas de patogenicidad (Dinges etal., 2000). Por ejemplo, el gen que codifica la enterotoxina estafilocócica A, sea, fue mapeado cerca del sitio de adhesión de el fago temperado PS42-D; los genes sea, se encuentran asociados a una familia de fagos, más que a un solo fago (Brüssow et al., 2004).

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La expresión de los genes que codifican las enterotixinas estafilocócicas es controlada por al menos tres sistemas globales reguladores: el regulador designado accesorio génico (agr), el regulador accesorio estafilocócico génico (sar), y un sistema de represión de catabolitos. Cada toxina es traducida en una proteína precursora que contiene una secuencia de señal aminoterminal, que es hendida durante la exportación de la célula. Son moderadamente estables a la inactivación química, proteólisis y desnaturalización por calentamiento (Dinges et al., 2000).

Las propiedades antigénicas de las enterotoxinas estafilocócicas no han sido útiles en la identificación de variantes importantes, pues dichas diferencias moleculares son indistinguibles a pesar de la diferencia en residuos de aminoácidos. Estructuralmente las enterotoxinas están conformadas como proteínas plegadas comunes; la forma completa de las moléculas de las enterotoxinas es elipsoide, y contienen dos dominios desiguales: un dominio A, y un dominio B, más pequeños que el A. Su estructura secundaria consiste en una mezcla de hélices α y hojas β (Dinges et al., 2000).

El dominio B contiene residuos cerca pero no incluyen la terminación amino de la proteína madura. En otras proteínas, la estructura del dominio B se asocia a la unión de carbohidratos o a otras proteínas, en en caso de las enterotoxinas este dominio no muestra en su actividad ninguna de esas dos funciones. Posee una región β-barril interna hidrofóbica y una superficie externa por residuos hidrofílicos. Al final del dominio B se localiza un puente disulfido característico de lasenterotoxinas, en oposición a la hélice α en forma de gorra. EL dominio A contiene una terminación carboxilo y un hacimiento β motif. Los dominios A y B se encuentran separados por un surco largo que forma una cavidad marcado por hélices α (Dinges et al., 2000).

La estructura de las enterotixinas se caracteriza además por (i) una terminal amino muy grande que se pliega por encima del dominio A, (ii) una segunda hélice α en el surco largo que separa al dominio, (iii) una “asa” de cisteina en el dominio la B, y (iv) una hélice α en la base del dominio la B. Estas características estructurales extras de las enterotoxinas están posiblemente relacionadas con su capacidad para inducir intoxicación alimentaria estafilocócica y con su resistencia al rompimiento en el tracto gastrointestinal (Dinges et al., 2000).

Las enterotoxinas poseen sitios específicos de unión a los receptores de los linfocitos t (TCR) y al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). La unión de SEA, SEB, y el SEC al TCR ocurre a través de la cavidad formada en el surco en la molécula de esas enterotoxinas. Esta cavidad parece actuar recíprocamente con las tres asas de Vb (CDR1, CDR2, y HV4) (Dinges et al., 2000).

Exotoxinas

Toxina del síndrome de shock tóxico. Esta toxina es codificada por el gen tstH (donde la H se refiere al aislamiento humano), que está presente en el cromosoma

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bacteriano dentro de una isla de patogenicidad estafilocócica de 15.2 kilobytes. TSST-1 es traducida como una proteína precursora con 234 aminoácidos y secretada después de la ruptura de una secuencia de señal de 40 aminoácidos localizada en su terminal amino. La proteína madura es una cadena sencila polipeptídica con un peso molecular de 22,000 y un punto isoeléctrico de 7.2. La toxina es generalmente resistente al calor y a la proteólisis; TSST-1 puede ser hervido por más de 1 h sin la pérdida perceptible de actividad biológica, y no es hendida después de la exposición prolongada a la tripsina. Antigénicamente TSST-1 es distinta de otro PTSAGS y no tiene la homología de secuencia significativa primaria a otras proteínas conocidas, incluyendo otras PTSAGs (Dinges et al., 2000)

TSST-1 está compuesta de dos dominios adyacentes. El Dominio A (1 a 17 y 90 a 194 residuos) contiene una hélice-α central larga (125 a 140 residuos), rodeada por una hoja β de cinco cadenas. Una hélice corta amino-terminal próxima al final de esta hélice central en el dominio A. El Dominio B (18 a 89 residuos) está compuesto de un motif tipo barril de cinco cadenas-β. Los residuos del lado trasero de la hélice α son requeridos para la actividad superantigénica de TSST-1 Esta toxina es codificada por el gen hla (Dinges et al., 2000).

Toxinas exfoliativas. Estas son proteínas extracelulares responsable del síndrome de la piel escaldada, asociadas a algunas infecciones por S. aureus (Brüssow et al., 2004).

Existen dos toxinas exfoliativas serológicamente diferentes, estos serotipos son ETA y ETB, ambos serotipos pueden causar enfermedad en la gente y son producidos por una proporción pequeña pero significativa de cepas S. aureus. Aunque ellas se diferencien en algunas propiedades fisicoquímicas, ambas toxinas producen los efectos de dermatológicos descritos en ratones neonatales. Las toxinas tienen especificidad de especie, afectando a la gente, monos, ratones, y hámsteres, pero no ratas, conejos, perros, erizos, ratones campestres, conejillos de Indias, pollos, o ranas (Landhani et al, 1999).

Ambas toxinas han tienen una homología de secuencia del 40 %. ETA y ETB consisten en 242 y 246 aminoácidos, respectivamente, con masas moleculares de 26,950 y 27,274 kDa. El gen para ETA es cromosómico, mientras que para ETB es plasmídico; ETA es termo estable y conserva su actividad exfoliante aún después del calentamiento a 60°C durante 30 minutos. Las toxinas son elaboradas durante la fase postexponencial de crecimiento bacteriano y excretadas de estafilococos colonizadores antes de la absorción en la circulación general. Las toxinas alcanzan el zona granulosa de la epidermis por difusión a través capilares dérmicos. No existe ninguna unión significativa de las toxinas a cualquier otro órgano de cuerpo que no sea la piel. Estas toxinas tiene alta afinidad a gránulos de queratohialina ,ETB tiene particularmente alta afinidad por la por la profilagrina y la filagrina, que son estractos epidérmicos. ETA y ETB han

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mostrado unión a un glicolípido parecido a GM4, extraído de la piel ratones lactantes (Landhani et al, 1999).

Las toxinas exfoliativas poseen la actividad superantigénica, es decir pueden activar un gran número de clones de Células T simultáneamente. Los antgenos convencionales requieren de la digestión a través de células presentadoras de antígenos (APCs) seguido de la presentación superficial de un pequeño fragmento de péptido formando un complejo con una proteína del MHC para activar una pequeña proporción (menos del 0.1 %) de células de T que llevan receptores de Célula t específicos. En contraste, los superantígenos pueden evitar este proceso de tratamiento intracelular y pueden unirse directamente a la molécula del MHC sobre la superficie del APC fuera del surco de unión del antígeno. Este complejo puede entonces unirse con región variable Vβ de la cadena β del receptor de las Células T, provocando la activación de células polyclonales CD4+ y Células T CD8+ , que es característico de los superantígenos (Landhani et al, 1999).

Alfa – hemolisina. Un alto porcentaje de cepas de S. aureus elabora esta toxina, y es tóxica para una amplia gama de células de mamíferos. Es en particular activa contra eritrocitos de conejo, y es también dermonecrótica y neurotóxica. Niveles de toxina alfa tan bajos como 1 mg son mortales cuando es inyectada en conejos intravenosamente (Dinges et al., 2000).

Los 26 primeros residuos del polipéptido traducido comprenden una secuencia de señal que es hendida durante la secreción. La proteína madura contiene 293 residuos y tiene un peso molecular de 33,000 y un punto isoléctrico de aproximadamente 8.5. No hay ninguna cisteina en la proteína madura, que está compuesta principalmente de hojas β (65 %), estructuras helicoidales α en mucho menor porcentaje (el 10 %) de la estructura secundaria. Esta toxina está bajo el control del gen regulador accesorio (agr) y por lo tanto es elaborada durante la fase exponencial tardía de crecimiento en un cultivo en lote, o en grupo (Dinges et al., 2000).

Los monómeros de alfa-hemolisina son secretada por S. aureus y se integran en la membrana de una célula blanco, donde ellos forman heptámeros cilíndricos. Esta forma de oligomérica es capaz de lisar células eucariontes. La característica de esta toxina alfa es su capacidad a de lisar eritrocitos, particularmente, los eritrocitos de conejo, que son al menos 100 veces más susceptibles a la hemólisis por la toxina alfa que otros mamíferos y 1,000 veces más que eritrocitos los humanos (Dinges et al., 2000)..

Una vez que el heptámero cilíndrico se ha formado en la membrana de célula, un poro de 1 a 2 nm es formado gradualmente. El monómero de la toxina inicialemnte se une y se incorpora en la membrana de la célula blanco., la unión puede ocurrir de dos formas. Cuando la toxina alfa está presente en concentraciones bajas, un receptor específico une la proteína. No se conoce la identidad de este receptor de superficie de célula, sin embargo, en

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concentraciones más altas, la alfa-hemolisina no expresamente se adhiere a la membrana de célula. El monómero, es capaz de penetrar la bicapa liídica. La difusión de los monómeros a través de la bicapa lipídica causa la formación subsecuente de un poro heptamérico. Se ha sugerido que los cambios conformacionales ocurridos en la toxina después de la oligomerización son necesarios para la activación del poro (Dinges et al., 2000).

Beta – hemolisina. Esta toxina es sumamente hemolítica para la oveja, pero no eritrocitos de conejo. No es dermonecrótica en conejillos de Indias, y no es mortal en ratones. Esta toxina mejora su actividad a través de la incubación por debajo 10°C después del tratamiento en 37°C, conduciendo a la denominación la hemolisina " frío- caliente"

La beta-hemolisina es secretada en medio de cultivo como una exotoxina, tiene un peso molecular de 35,000. Es codificada por r el gen hlb, cromosómicamente está localizado en el Fragmento ClaI de 4 kb y codifica un polipéptido de 330 aminoácidos con un peso predicho molecular de 39,000. Los 34 primeros residuos del polipéptido comprenden una secuencia señal, hendida en la secreción, resultando una proteína madura con peso molecular de aproximadamente 35,000, su punto isoeléctrico es por encima del pH 9. La beta-hemolysin es producida en gran cantidad cepas de S. aureus particularmente aislamientos animales (Dinges et al., 2000).

Delta – hemolisina. Es un péptido de 26 aminoácidos capaz de causar el daño de la membrana en una variedad de células de mamíferos.La toxina de aislamientos humanos de S. aureus contiene nueve diferencias de aminoácidos en comparación con la delta-hemolisina extraida de aislamientos caninos, los pesos moleculares de éstas son de aproximadamente 3,000. Estas hemolisinas diferentes conservan propiedades de carga, y ambas son hemolíticamente activas, aunque serológicamente son parcialmente idénticas. Esta proteína es elaborada en el 97 % de cepas de S. aureus, y una proteína inmunológicamente relacionada es elaborada por cepas de Staphylococcus haemolyticus (Dinges et al., 2000).

El gen hld codifica una transcripción de 514nucleótidos que produce la delta-hemolisina. La delta-hemolisina es controlado por agr, y la expresión más alta en caldo de cultivo es observada en la fase tardía logarítmica (postexponencial) (Dinges et al., 2000).

La delta-hemolisina es producida en el 97 % de las cepas de S. aureus. También es supuesto que del 50 a 70 % deestafilococos coagulasa-negativos produce esta toxina. La delta-hemolisina es capaz de lisar eritrocitos y otras células de mamíferos, así como estructuras subcelulares tales como la envoltura membranal, organelos, esferoblastos y protoplastos. Esta toxina también posee actividad dermonecrótica, y resulta mortal en altas concentraciones. La presencia de fosfolípidos inhibe la actividad de la delta-hemolisina (Dinges et al., 2000).

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El mecanismo de acción de la delta-hemolisina. Una hélice es formada por la toxina delta con dominios hidrófobos e hidrófilos sobre lados de enfrente. Basado en esta información, se ha propuesto que la delta-hemolisina actúe como un surfactante para romper o alterar la membrana celular (Dinges et al., 2000).

Gama Hemolisina y PV leucocidina. Estas dos toxinas producidas por S. aureus están formadas por dos componentes. Cada una de estas toxinas es hecha como dos proteínas no asociadas secretadas, los componentes son llamados S y F (para lenta - y proteínas de rápida - extracción en una columna de intercambio iónico). La gama-hemolisina es elaborada por prácticamente todas las cepas de de S. aureus, mientras PV leukocidina es elaborada sólo por un 2 a 3 % de las cepas. Las toxinas afectan a los neutrófilos y a los macrófagos, y la gama-hemolisina es además capaz a lisar muchas variedades de eritrocitos de mamíferos (Dinges et al., 2000).

Los componentes de estas proteínas provienen de dos loci distintos dentro del genoma de S. aureus, y las dos toninas resultan. En cepas que contienen ambas citotoxinas, tres componentes S (HlgA, HlgC, y LukS-PV) y dos componentes F (HlgB y LukFPV) están disponibles. Un nivel alto de identidad de secuencia está presente entre estos productos génicos (Dinges et al., 2000).

.Los genes para la gama-hemolisina son transcritos de un loci simple,

localizado en el fragmento cromosómico digerido ScaI de 4.5 kb. Los extractos de un clon que contiene este fragmento fueron hemolíticos y leucotóxicos. Los marcos de lectura abiertos, en orden , son llamados hlgA, hlgC, y hlgB, y ellos corresponden a genes de gama-hemolisina previamente identificados. hlgC y hlgB son transcritos en un simple ARNm, mientras hlgA es expresado separadamente.

Las tres proteínas codificadas son traducidas todas con una secuencia sencilla, que es hendida para formar la proteína subunitaria madura secretada. Los productos maduros tienen pesos moleculares de 32,000 para HlgA, 32,500 para HlgC, y 34,000 para HlgB; sus puntos isoléctricos están estimados en 9.4, 9.0, y 9.1, respectivamente (Dinges et al., 2000).

Los genes que codifican la PV-leucocidina son lukS-PV y lukFPV. Un fragmento cromosómico EcoRV de 6.5 kb. de S. aureus contiene el locus luk-PV completo, consistiendo en dos marcos de lectura separados. La proteína extraída de un clon fue leucotóxica, pero no exhibío ninguna actividad hemolítica. El gene lukS-PV codifica un polipéptido de 312 aminoácidos, incluyendo una secuencia señal de 28 residuos que es hendida para producir la proteína madura con un peso molecular de 32,000. La proteína LukS-PV tiene un punto isoeléctrico de 9.0. La proteína LukF-PV es una 325-proteína de aminoácido que de modo similar contiene un péptido de señal de 24 residuos. La proteína madura tiene una punto isoeléctrico de 9 y un peso molecular de 34,000 (Dinges et al., 2000).

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Hay seis formas posibles de Gamma-hemolisina/PV-leucocidina, debido a la presencia de tres unidades potenciales S y dos F, todas las combinaciones son capaces de lisar eficientemente leucocitos (Dinges et al., 2000).

Las respuestas inflamatorias debido a las doxinas de dos componentes han sido observadas, incluyendo la capacidad de la PV-leucocidina para inducir secreción granular en leucocitos polimorfonucleares y la liberación de mediadores inflamatorios. Se ha documentado que la gama-hemolisina es menos capaz de inducir una respuesta de leucocitos polimorfonucleares que la PV-leucocidina, en cuyo caso, la subunidad de S es más importante que la subunidad F debido a que se ha supuesto que el componente S es el responsable para la unión inicial a la membrana (Dinges et al., 2000).

7. Biopelículas bacterianas

Las células de una biopeícula y las células planctónicas presentan grandes diferencias en los perfiles de expresión de proteína y, en particular, significativo incremento en las proteínas en biopelículas asociados con la adhesión de la célula, la biosíntesis de peptidoglicano, y el metabolismo del formato y piruvato (Tu Quoc et al., 2007).

Numerosos factores exógenos afectan la formación biopelícula en los estafilococos, y aquellos disparadores exógenos incluyen la salinidad y la glucosa, la limitación de oxígeno, la depleción de hierro, heparina, y varios estreses como el calor y el etanol. El estrés del ciclo del ádido tricarboxílico también ha mostrado inducir la producción de PIA y la promoción de biopélicula, sugiriendo que señales endógenas metabólicas también puedan ser sentidas que regulan la formación biopelícula (Tu Quoc et al., 2007)

El gen mgrA, también llamado rat o norR codifica la proteína de MgrA, una porteina de unión de DNA que actúa como un importante regulador de la actividad autolítica. La disrupción de mgrA resulta en una formación de biopelícula alterada posiblemete como consecuencia de propiedades de la superficie alteradas o cambios en la expresión de los genes (Tu Quoc et al., 2007)

El proceso de formación de Biopelícula en S. aureus implica: (i)la adhesión de células bacterianas a una superficie (adhesión temprana) y (ii) acumulación dependiente de crecimiento de bacteria en clusters de células multilaminados (adherencia intercelular). Diferentes proteínas incluyendo aquellas de la familia de los componentes microbianos superficiales que reconocen moléculas adhesivas de la matriz (MSCRAMMs), están implicadas en la adherencia de S aureus. Expresamente, MSCRAMMs puede mediar la adherencia de S. aureus a diferentes tipos de células y superficies abioticas una vez que los componentes adhesivos del plasma del hospedero han cubierto la superficie objetivo (Cucarela et al., 2001).

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PIA (antígeno polisacárido de adhesión intracelular), glucalix, juega un papel importante en la formación de la biopelícula estafilocócica. El cluster icaABCD, un operon presente en Staphylococcus epidermidis y S. aureus, participa en la fase de adherencia intercelular de formación biopelícula a través de la codificación de proteínas implicadas en la síntesis del polisacárido poly-N-succinil β-1-6 glucosamina (PIA-PNSG) de la matriz de la biopelícula (Cucarela et al., 2001).

In vitro la adhesión y la formación biofilm sobre superficies celulares de mamíferos e inertes está asociado con (i) producción exopolisacárido ; (ii) fenotipo de morfología de colonia rugosa en agar rojo Congo (CRA); (iii) resistencia más alta a fagocitosis; (iv) sensibilidad más baja a antibióticos cuando hay formación de biopelículas (v) capacidad más alta para adherirse a superficies diferentes y biomateriales utilizados en cirugía ortopédica, causando osteomielitis; y (vi) capacidad más alta para colonizar la glándula ovina mamaria, causando mastitis (Cucarela et al., 2001).

Bap es una proteína de superficie directamente implicada en la formación biopelícula sobre superficies abióticas en ausencia de componentes de plasma de hospedero. El rasgo más notable de Bap es la presencia de una región de repetición extensa, en la cual las repeticiones son idénticas aún en el nivel de nucleótido. Aunque la función biológica de las repeticiones no haya sido establecida, se especula que esta región podría servir para proyectar la parte amino-terminal de la proteína de la superficie de célula y promover la interacción con superficies abióticas, componentes de la célula del hospedero, u otra bacteria. Bap promueve la adhesión primaria así como el segundo paso de formación biopelícula, donde la adherencia intercelular juega un papel importante (Cucarela et al., 2001).

PGA, polosacárido B-1-6-N-acetil-D-glucosamina, es un polímero involucrado en la adhesión por estafilococos; adhesión a superficies abióticas, adhesión intracelular y formación de biopelícula. PGA es un factor de virulencia en un modelo catéter en Staphylococcus aureus y S. epidermis (Van Houdt y Michiels, 2005).

Los genes CodY, bfd1, y bfd4 se han sido vinculados a la regulación guanosina-dependiente, lo que indica la posible participación de señales de una molécula pequeña las señales de sensores metabólicos de una pequeña molécula, que modulan la biopelícula. En el Bacilo subtilis, CodY es un represor transcripcional pleiotrópico de proteína de unión a GTP, que regula genes en la fase de crecimiento postexponencial. El gen bfd1 codifica una proteína hipotética que contiene un motif GGDEF que es una señal asociada con la actividad diguanlilato ciclasa. El ácido diguanílico cíclico es un regulador global bacteriano de motilidad, adherencia, y la formación biofilm. De modo interesante, dos estudios divulgaron que la adición de ácido cíclico diguanílico atenúa la formación de biopelícula por S. aureus tanto in vitro como in vivo.

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El producto del gen bfd4 es una enzima que comparte un 33% de identidad con la GTPasa codificada por yjeQ (engQ) en E. coli; en donde se ha observado que la disrupción de yjeQ reduce la severidad de la virulencia en un modelo de infección murino (Tu Quoc et al., 2007).

SrrAB, también llamado SrhSR, constituye una típica histidina kinasa par señalizador de dos componentes. SrrA, reprime la producción de factor de virulencia a través de la modulación de los niveles de RNAIII, efector principal del locus agr, en condiciones de tensión de oxígeno baja. Se ha especulado que mutantes srrA son incapaces de desarrollar biofipelícula debido a un defecto vinculado a la sensibilidad al oxígeno (Tu Quoc et al., 2007).

La disrupcción de los genes atpF y fmtA ha resultado en la formación defectuosa de biopelícula. La disrupción de atpF afecta la formación de biopelícula posiblemente debido a la alteración en la síntesis de ATP o en el potencial de membrana, mientras que la disrupción de fmtA está asociada con alteraciones en la estructura de la pared celular. fmtA modula los niveles de resistencia a fármacos en cepas de S. aureus metilcilina resistentes, lo que indica un vínculo entre biofilm y S. aureus metilcilina resistentes, principales problemas a confrontar en el manejo clínico de infecciones estafilocócicas (Tu Quoc et al., 2007).

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