Detección de Staphylococcus aureus en

alimentos

Grupo: 04

Equipo: 1

Integrantes

Objetivos

Realizar adecuadamente la cuantificación de Staphylococcus

aureus en alimentos, mediante la técnica descrita en la Norma

Oficial Mexicana.

Explicar el fundamento de todas las etapas del método de

detección de Staphylococcus aureus en alimentos.

Etiqueta de la Muestra:

Técnica Analítica (son los diagramas de cada una de las integrantes

del equipo, que se integran al reporte).

Resultados

1.- Aislamiento selectivo.

Muestra: Fresas con Crema. Estado físico de la muestra: Solido. Fecha: 28/ 02/ 2013 Hora: 07:00 am Nombre de la persona que tomo la muestra: Gachuz López Gabriela. Temperatura: aproximadamente 20°C Apariencia general de la muestra: Buen color, buen olor, producto fresco, recién elaborado. Apariencia general del lugar: Limpio

No hubo desarrollo de Staphylococcus aureus en las cajas Petri con Agar Baird Parker, para nuestra muestra (Fresas con Crema). Por lo que ya no se prosiguió a la realización del punto 2 y 3. 2. Recuperación de la cepa. 3. Pruebas bioquímicas. Al no encontrar en las cajas Petri colonias típicas de

Staphylococcus aureus, reportamos la sensibilidad de la

metodología empleada (extensión en superficie), que para este

caso es de 100 UFC/g valor estimado para fresas con crema

(muestra sólida).

Al no existir la presencia de S. aureus en el alimento recurrimos a

tomar colonias de las cajas de Agar Baird Parker, dónde se sembró

el control de este microorganismo, para la realización de los otros 2

pasos que consisten en la recuperación de la cepa y las pruebas

bioquímicas que nos ayudarán a confirmar la presencia y

cuantificación de esta especie en un alimento.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

1. Aislamiento selectivo del control.

Se sembró en el agar Baird Parker por agotamiento para obtener colonias aisladas.

Características macroscópicas de Staphylococcus aureus. (Control) Colonias negras circulares, brillantes, convexas, lisas, con

diámetro de 1 a 2mm, muestran zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.

2.-Recuperación de la cepa (control)

VISTA MICROSCOPICA

FECHA DE INOCULACIÓN: 28/ 02/ 2013

MUESTRA: tomada de un tubo que contenía la cepa ya pura

de Staphylococcus aureus para ser el control.

TINCIÓN: Tinción de Gram.

AUMENTO TOTAL: 1000

DESCRIPCIÓN: Gram positivo

MORFOLOGÍA: cocos

AGRUPACIÓN: Estafilococos, tétradas, diplococos.

VISTA MACROSCOPICA

Observaciones: Características coloniales AGAR BAIRD PARKER.

Forma Circular, conexa

Color Negro, brillosas

Elevación Convexa

Textura butirosas

Aspecto/ Caract. Zona circular opaca, halo blanco alrededor de la

Fecha de inoculación: 28/ 02/ 2013

Fecha de observación del crecimiento: 30/ 02/ 2013

Microorganismo: Staphylococcus aureus

Medio de cultivo: Agar Baird Parker

Técnica de inoculación: Estriado en cuadrante radial.

Incubación: 37°C / 24 hrs

colonia.

CUADRO 1. Número de colonias a evaluar de S. aureus

Cuenta total de colonias sospechosas en una caja

representativa

Colonias sospechosas a caracterizar bioquímicamente

51 a 100 UFC 5

Inoculación de colonias aisladas y seleccionadas características de

este microorganismo, según el cuadro anterior BHI

3.- Pruebas bioquímicas del control

3.1.- Prueba de la presencia de la enzima coagulasa

Cuadro 2. Interpretación de las reacciones en la prueba de la coagulasa

Valor Características

2+ (positiva)

Formación de coágulo pequeño organizado

Aparición del coagulo: después de 3 horas. Sólo en los tubos que corresponden a las colonias 1, 3, 4, y 5

3.2.- Prueba de la enzima termonucleasa (control)

Al adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M si existe una coloración rosa brillante

# de Colonia EnzimaTermonucleasa

1 Negativa

2 Negativa

3 Positiva

4 Positiva

5 Positiva

3.3.-Prueba de fermentación de manitol en anaerobiosis control

Manitol + por el vire del indicador rojo de fenol a color amarillo

#de Colonia

Prueba de Manitol

1 Positiva

2 Positiva

3 Positiva

4 Positiva

5 Positiva

3.4.- Prueba de la Catalasa (control)

# de Colonia Enzima Catalasa

1 Negativa

2 Negativa

3 Positiva

4 Positiva

5 Positiva

Cálculos y expresión de resultados del control S. aureus toxigénico

Cómo este es un análisis del control, el cual no provenía de alguna

dilución conocida, se hará un ejemplo de los cálculos considerando

las UFC encontradas en la caja Petri con Agar Baird Parker del

control y las colonias caracterizadas que resultaron positivas para

todas las pruebas bioquímicas (del control).

Al analizar un sope de la Facultad de Química se encontró que la caja Petri representativa estadísticamente contenía 58 UFC sospechosas de contener a S. aureus . Éstas se localizaban en la caja Petri con agar Baird Parker que corresponde a una dilución

diez a la menos tres (0.001g/mL) y de esta dilución se inoculó 0.1 mL ( =0.0001g de muestra inoculada), extendiendo el inóculo con una varilla de vidrio en forma de “L”, posteriormente se incubó a 35 2 °C durante 48 hrs, obteniendo los resultados antes mencionados (58 UFC). De las colonias características y tomando en cuenta el cuadro número 1, se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioquímicamente. De estas 5 colonias analizadas, solamente 3 resultaron positivas para todas las pruebas bioquímicas realizadas. Se pregunta:

1) ¿Cuántas UFC/g de S. aureus toxigénico, se encuentran en este alimento?

2) ¿Se puede consumir el alimento? El razonamiento de los cálculos es el siguiente: a) Determinar el porcentaje de colonias de S. aureus

toxigénico. Cinco colonias representan el 100 % de UFC muestreadas, tres colonias positivas, a ¿qué porcentaje corresponden? 5UFC--------------------------------------- 100% 3UFC--------------------------------------- x X= 60% Enseguida, de las 58 UFC encontradas en esta dilución (que contiene 0.0001 g de alimento), se dice que 58 UFC están en 0.0001 g de muestra, ¿cuántas UFC habrá en 1.0 g de alimento? 58UFC----------------------------------------- 0.0001 g X ----------------------------------------- 1 g X= 580,000 UFC/g de alimento. De las 580,000 UFC/g de alimento, solamente el 60% de ellas son toxigénicas, entonces ¿cuántas UFC toxigénicas/g de alimento, se encuentran en este alimento?

580,000 UFC/g------------------------------------- 100% X ------------------------------------ 60% X= 348,000 UFC/g El resultado debe expresarse en forma exponencial, tomando en cuenta solamente los 2 primeros dígitos: X= 35x UFC/g Estas 350,000 UFC/g de alimento (35x UFC/g), de acuerdo a Jablonski et. al presentan riesgo para la salud pública, ya que cada 20 min se va duplicando la población de S. aureus toxigénico llegando así en un tiempo corto a

representando números de UFC potencialmente riesgosas que pueden causar intoxicación alimentaria. Por lo que el alimento no se debe de consumir.

Análisis de Resultados

En las cajas Petri con Agar Baird Parker, dónde se inoculo por

extensión en superficpie 0.1 mL de cada dilución, NO se

encontró desarrollo de Staphylococcus aureus, esto lo vemos en

la imagen reportada en resultados, donde podemos ver que no

hay desarrollo, ni características que demuestren la presencia

del microorganismo, los puntos que se ven en la imagen

corresponde a otra especie de estafilococos, se propone que son

Staphylococcus epidermidis porque está especie de

estafilococos también se desarrolla en este medio, las

características de crecimiento corresponden a estas colonias, ya

que eran colonias negras, tamaño irregular, con zona opaca

alrededor de la colonia sin la zona clara alrededor, que es la que

caracteriza a S. aureus y no podría ser algún otro género de

microorganismo debido a que el medio Baird Parker es un medio

de alta especificidad diagnóstica, selectivo y diferencial para el

aislamiento y recuento de estafilococos coagulasa positiva en

alimentos, el cloruro de litio y el telurito potásico suprimen el

crecimiento de microorganismos no deseados inhibiendo el

desarrollo de ellos.

Con esto podemos decir que la única contaminación que

encontramos presente en nuestro alimento analizado (fresas con

crema) son S. epidermidis los cuales se encuentran en la piel

humana, llegando a nuestra muestra por un mal lavado de manos

previo a la preparación de estas o a una contaminación cruzada

durante la elaboración del producto.

Análisis de resultados del control

Mediante una colonia característica del Agar Baird Parker del control pudimos realizar una tinción en la que confirmamos que se tenía la presencia de un microorganismo gram (+), al ser vistas de manera macroscópica pudimos observar las características similares que corresponden a Sthaphylococcus aureus como color negro, brillosas, halo blanco alrededor de la colonia. Se hizo el conteo de las colonias y detectamos 58 UFC en la caja Petri por lo que se prosiguió a caracterizar 5 colonias sospechosas con pruebas bioquímicas, en las cuales sólo 3 de las 5 colonias dieron positivo en todas las pruebas. La prueba de la coagulasa nos es de gran utilidad para detectar a S.aureus, el resultado positivo indica que la muestra contiene al microorganismo, la coagulasa reacciona con la protrombina en la sangre formando un complejo llamado estafilotrombina, permitiendo que la enzima proteasa convierta el fibrinógeno en fibrina esto permite que la sangre coagule. La coagulasa se relaciona con la superficie de S. aureus porque puede cubrir su superficie con fibrina al tener contacto con sangre, está cubierta de fibrina es capaz de resistir la fagocitosis, haciendo de S. aureus un microorganismo de mayor virulencia. La prueba de DNasa se utiliza principalmente para determinar a los estafilococos denominados patógenos potenciales. La desoxirribonucleasa de S. aureus difiere de otras DNasas en que requiere calcio como un catión activador (cofactor), tiene un pH óptimo más alto casi de 9 degradando el DNA ampliamente, presenta termoestabilidad alta resistiendo la ebullición (100°C) durante 15 min, obteniendo nucleasa termoestable, siendo así un indicador de S. aureus en la literatura se presenta como una propiedad constante en este microorganismo, ya que ninguna otra especie de estafilococos la presenta. La prueba del Manitol en anaerobiosis es para detectar a S. aureus ya que fermentan lentamente a los carbohidratos, como el manitol. La prueba resulto positiva en el medio que contenía el indicador rojo de fenol, virando a color amarillo, indicándonos la capacidad de S.

aureus de fermentar el manitol degradándolo hasta ácido sin producción de gas; la prueba se lleva bajo condiciones de anaerobiosos debido a que S. aureus tiene un metabolismo anaerobio facultativo. La prueba de la catalasa nos dio positiva en algunas de las colonias caracterizadas indicándonos así que si contienen la enzima catalasa, la cual le es de gran utilidad a S. aureus para evitar la formación de radicales tóxicos que se forman por el sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas, evadiendo así los mecanismos de defensa en el huésped, subsistiendo y multiplicándose dentro del mismo.

Conclusiones

Las Fresas con crema que analizamos para detectar

Staphylococcus aureus, muestran ser casi seguras al consumo

humano, de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-243-

SSA1-2010, Productos y servicios. Leche, fórmula láctea, producto

lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y

especificaciones sanitarias.

Donde se nos reporta lo siguiente para Staphylococcus aureus en

cremas, un ingrediente principal para la elaboración de nuestro

alimento.

<100 UFC/g o mL Mantequilla, cremas, leche condensada azucarada, leche fermentada o acidificada, dulces a base de leche.

Quesos madurados y quesos procesados

Lo cual cumplió nuestro alimento ya que no encontramos colonias características de S. aureus durante el aislamiento selectivo. Para las fresas que se usan no encontramos reportado la cantidad permitida en UFC/g o mL de Staphylococcus aureus en la NMX-F-

131-1982. ALIMENTOS PARA HUMANOS. FRUTAS Y DERIVADOS.

MERMELADA DE FRESA.

Al no tener desarrollo de este microorganismo desde la primera

etapa del método que consiste en un aislamiento selectivo;

podemos decir que este producto al ser elaborado cumple con las

buenas prácticas de Higiene, reportándolo sólo con la sensibilidad

mínima del método de 100UFC/g valor estimado de fresas con

crema, cumple con las normas antes mencionadas lo que lo hace

un alimento seguro para ser consumido.

Bibliografía

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-115-SSA1-1994, Bienes y servicios. Métodos para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.

NMX-F-131-1982. ALIMENTOS PARA HUMANOS. FRUTAS Y

DERIVADOS. MERMELADA DE FRESA.

NORMA Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-2010, Productos

y servicios. Leche, fórmula láctea, producto

lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y

especificaciones sanitarias.