técnicas: elisa y western blot - wordpress.com · 2018-06-01 · western blot aplicaciones:...
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Técnicas:ELISA y Western Blot
Aspectos prácticos…
Prof. Diana OrtizCátedra Inmunología
Técnica de ELISAFundamento:
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por InmunoadsorciónLigado a Enzimas.
Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a unaenzima y cuantificado por espectofotometría
Ventajas: Es una prueba de altasensibilidad y especificidad. Es cuantitativa. Es relativamenteeconómica. Se pueden procesar hasta96 muestras por placa. Reactivos de granestabilidad.
Limitaciones: Positividad Vs. Infecciónactiva: depende del tipo deanticuerpo evaluado. Amenos que se evalúepresencia de antígenos en lamuestra problema. Dificultad de detección deAcs en pacientes con algunainmunodeficiencia, en períodode ventana o infectados porcepas desconocidas.
Fases:
1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de laplaca (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo)
2. Lavado3. Bloqueo4. Muestra (antígeno o anticuerpo)5. Lavado6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima
(sensibilidad)7. Lavado8. Sustrato de la enzima9. Cuantificación (lector de ELISA)
Técnica de ELISA
Técnica de ELISA
Aspectos a considerar:
Adecuado uso de controles positivos y negativos(control de calidad).
Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzimasustrato).
Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos.
Reactivos en buen estado.
Cuidado de la cadena de frío.
Técnica de ELISA
Evaluación de anticuerpos ELISA
Estuches comerciales:
Detección deanticuerposIgM, IgG, IgE,IgA.
Kit Pyloriset EIA-G(Orion Diagnostic):Títulos ≥ 20 positivos
1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA)
Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween
Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C
Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C
Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween
Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C
Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno
Se detiene la reacción con H2SO4
Valores: UDO > 0,300 positivos
(Ortiz y col., 2000)
2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA)
Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000)
Técnica de ELISA
Elisa estandarizada en laboratorio
Técnica de ELISA
Enzimas más utilizadas: PeroxidasaFosfatasa alcalinaβ-galactosidasa Tetra-metil-benzidina
Interpretación de resultados:
Técnica de ELISA
¿Qué es un valor cut off?
Títulos de anticuerpos
Valores reportados enunidades de Densidad óptica
Algunas Aplicaciones de la ELISA
Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc.
Proteínas
Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos)
Marcadores de drogas
Control de calidad de vacunas
Screening de recién nacido
Investigación clínica
Anticuerpos: Acs antinucleares
Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag postático, carcinoembrionario, etc.
Autoanticuerpos
Técnica de ELISA
Elispot
Mide el número de células productoras de anticuerpos. Elantígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las célulasproductoras de anticuerpos en un medio semisólido y losanticuerpos que se han secretado y unido se detectanmediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como enun ELISA.
Una variante de la ELISA
Western Blot
Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analíticaaltamente específica utilizada para identificar proteínas específicasen una mezcla compleja de proteínas, presente en extractoscelulares o de tejidos.
Etapas:1. Preparación de la muestra
2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel depoliacrilamida)
3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa )
4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso deanticuerpos primarios o secundarios apropiados.
Western BlotTransferencia
Se transfieren las bandas deproteínas o desde el gel haciauna membrana denitrocelulosa (flechas azules).
CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivospor anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre enCosta Rica. Rev. costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 .
Western Blot
Western blot
Aplicaciones:
Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de labiología molecularPermite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas.Estudiar perfil de citocinas.Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra.Factores de crecimientoNiveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc
Diagnóstico:Prueba confirmatoria de VIH
Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmentellamada“enfermedaddelasvacaslocas”
Enfermedad de Lyme.
Fig. 24: Reactividad de sueros (IgG) frente a péptidos sintéticos de H. pylori utilizando MABA.En vertical se muestran las tiras correspondientes a cada paciente: tira 1: conjugado, tiras 2-28 sueros de pacientes. Enhorizontal están los péptidos sintéticos que fueron sensiblizados en el papel de nitrocelulosa, del 2- 4: péptidos de UreB, 5: poolde Ure, 6: pool de flagelina, 7-14: péptidos de VacA, 15: pool de VacA, 16-26: péptidos de Cag, 27: pool de Cag, 1 y 28:Antígeno de H. pylori.
MABA
(Ortiz-Princz D, 2015)
http://www.slideshare.net/amitgajjar85/elisa-14027063
http://es.slideshare.net/perlitayamii/western-blot-28140948
http://es.slideshare.net/tratamiento1/fundamento-y-procedimiento-de-las-pruebas-de-western-blot
https://www.youtube.com/watch?v=GE8JlP0PBEM
https://www.youtube.com/watch?v=_8r5XVmKfOc