SEMINARIO:  FUNDAMENTO Y PROCEDIMIENTO DE LAS PRUEBAS DE

WESTERN BLOT

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICACÁTEDRA DE ANÁLISIS CLÍNICOS II

INTEGRANTES: Calixto Flores David Quispe Ollero, Elías Oyola Salcedo, Delia Espinoza Minaya,

María Román Solano,

Andrea L. Saldaña Alva, Víctor

M.

INTRODUCCIÓNEXPOSITOR: VICTOR SALDAÑA ALVA

WESTERN BLOT

El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada. Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas.

Las proteínas son transferidas desde el gel a la membrana electroforéticamente.

WESTERN BLOT-METODOS

Secuencia del Western blot

Electroforesis de la muestra con las proteinas

Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa

Coloracion de las proteinas para confirmar transferencia

Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosa

Incubacion con el anticuerpo especifico primario

Lavados del anticuerpo no unido

Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)

Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas

Secuencia del Western blot – Paso 1Paso 1Electroforesis de las muestras de proteínas:

-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S--El SDS aporta cargas negativas-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a su peso molecular

Proteínas ya corriendo en el gel

Fuente de poder

Muestra de proteínas para cargar en el gel

Transferencia de las proteinas a las membranas

Ciertas membranas sintéticas son capaces de unir proteínas de tal forma que pueden servir como soporte para inmunoensayos, tinciones y otros análisis en fase sólida. Las proteínas unidas a dichas membranas mantienen su antigenicidad y son accesibles a sondas.

En primer lugar las proteínas han de separarse en un gel de acrilamida (1D o 2D PAGE), y antes de teñir el gel, dichas proteínas son electrotransferidas desde el gel hasta una membrana adyacente de nitrocelulosa o PVDF, aplicando un campo eléctrico.

La transferencia se puede llevar a cabo en dos tipos de aparatos y por tanto de dos formas diferentes: transferencia húmeda, en aparatos que poseen cámaras que se llenan de tampón y transferencia semiseca, en aparatos que no tienen dichas cámaras y por tanto no necesitan tal cantidad de tampón.

Transferencia de las proteinas a las membranas

Secuencia del Western blotTransferencia a la membrana de nitrocelulosa: Paso- 2-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas

Cassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferencia

El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia

Se quitan las burbujas para asegurarla correcta transferencia

Se detiene la corrida electroforeticaSe desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar

el gel con las proteinas separadas por masa

Paso 3Incubación con anticuerpos específicos y revelado:

Proteína sobre la membrana

Bloqueo de los sitios no ocupados en la membrana con proteína inerte (ej. Albúmina)

Incubar con anticuerpo primario

Incubar con anticuerpo secundario marcado con HRP

Incubar con sustrato especifico

Proteína de interes se ve como una banda oscura

Revelado quimioluminiscente

Paso 4Revelado y análisis:

Existen otras tecnicas de revelado de WB

sustrato enzima H2O2 productocoloreado

quimioLum Obs

luminol HRP si no si muy sensible

3,3´diaminobencidina HRP si marrón no toxico

DAB+niquel HRP si negro no toxico, mas sensible que

DAB

3,3´,5, 5´ tetrametilbencidina

HRP si azul no producto semisoluble

4 cloro naftol HRP si azul-negro no poco sensible

Bromocloroindolil fostato +NBT

FAL no azul no reaccion lenta y

progresiva

Naftol-AS-MX fosfato + Fast red

FAL no rojo no poco sensible

AP/misty purple FAL no purpura no muy estable

HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina

WESTERN BLOT-FUNDAMENTOS

ELECTROFORESIS

Para entender la técnica del Western Blot es necesario comprender que es una electroforesis y en que se basa.

Las proteínas suelen tener carga neta; por lo tanto, si se aplica un campo eléctrico a una solución que contenga una mezcla de proteínas, éstas migrarán a una velocidad que dependerá de su carga neta, forma y peso molecular. Esta técnica es conocida como electroforesis.

Las separaciones electroforéticas se realizan casi siempre en soportes sólidos, generalmente para separar una mezcla de proteínas, el soporte de elección son los geles de poliacrilamida.

Western Blot

La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting o Western blot) es un sistema rápido y muy sensible para la detección y caracterización de proteínas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo. Implica la separación por electroforesis en geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana, de las proteínas de una mezcla compleja (lisado total celular). Los antígenos que se han transferido a la membrana son reconocidos por anticuerpos monoclonales policlonales específicos de ellos.

TIPOS

• Se puede hablar de tipos de western blot según el tipo de detección de las proteínas.

Directo:• El anticuerpo primario marcado se une al

antígeno de la membrana y reacciona con el sustrato originando una señal detectable. En el método directo de detección, el anticuerpo primario que se utiliza para detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debe ir marcado con una enzima

MÉTODO DIRECTO

Indirecto• El anticuerpo primario sin marcar reacciona

con el antígeno. Luego, un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reacciona con el sustrato. En el método indirecto, se añade primero un anticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de la superficie de la membrana; posteriormente se añade un anticuerpo secundario marcado contra el anticuerpo primario.

MÉTODO INDIRECTO

PROCEDIMIENTO

El procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas:1- Inmovilización de proteínas sobre la membrana, generalmente medianteelectrotransferencia.

Se construye lo que se conoce como sándwich, donde se apilan sucesivamente una esponja plana, papel absorbente, el gel, la membrana sintética, más papel y finalmente otra esponja plana.

2- Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos.

“Bloqueo de la membrana”, para prevenir la unión inespecífica de los anticuerpos a otras proteinasla membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado “background” o falsos positivos.

3- Incubación del 'blot' con anticuerpos primarios contra la/s proteína/s de interés.

Lógicamente, la elección del anticuerpo primario para un Western Blot dependerá del antígeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antígeno en concreto.

4- Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros marcadores.

Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que reconocen a las inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario).

5-Sistema de revelado de las bandas de proteínas marcadas con el complejo de anticuerpos.

Lavado de la membrana.

Como otros Inmunoensayos, el Western Blot consiste en una serie de pasos de incubación con diferentes reactivos (tampones de bloqueo, anticuerpos, etc.) separados por pasos de lavado. Estos lavados son necesarios para eliminar los excesos de reactivos no unidos

APLICACIONES EXPOSITORA: ANDREA L. ROMÁN SOLANO

diagnóstico Se usa principalmente para determinar la

presencia o ausencia de una proteína concreta en una muestra. También nos puede ser útil para determinar los niveles de dicha proteína en esa muestra, o el tamaño de esta proteína, ya que en determinadas enfermedades el problema no es la ausencia total de una molécula sino su reducción o la expresión de una forma truncada de dicha proteína.

- Enfermedades Inflamatorias- Enfermedades Infecto-Contagiosas- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales- Factores de Crecimiento- Proteínas de Secreción- Enfermedades Infecto-Contagiosas- Enfermedades Inflamatorias- Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales- Factores de Crecimiento- Proteínas de Secreción

diagnóstico

Prueba de VIH Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el

Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es muy baja.

Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.

diagnóstico

Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".

Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.

diagnóstico

Actualmente, el Western Blot es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular.

INVESTIGACIÓN

investigación

Con ella se pueden determinar los niveles de una proteína antes y después de un tratamiento, su nivel de fosforilación u otras modificaciones post-traduccionales, etc.

Pierce ha conseguido optimizar los reactivos que se usan en western, eliminar el paso de bloqueo del western tradicional y reducir los tiempos de incubación con los anticuerpos

Fast Western Blot

Haga clic en el icono para agregar una imagen

técnicas relacionadas

La principal razón para transferir y adsorber las proteínas a una membrana para su posterior detección con un anticuerpo es que las proteínas en la membrana se encuentran en la superficie y, por lo tanto, más accesibles a los anticuerpos que si estuvieran imbuidas en un gel de poliacrilamida.

No obstante, en los últimos años se ha desarrollado la posibilidad de realizar la detección de las proteínas dentro del propio gel sin perdida de sensibilidad; esta técnica conocida como “UnBlot® In-Gel Detection” elimina la necesidad de realizar los pasos de transferencia y bloqueo y, además, permite la detección de proteínas que no se transfieren con eficiencia desde el gel a la membrana y evita las perdidas de proteínas durante el propio paso de transferencia.

Una modificación de la técnica de Western Blot es su utilización para la búsqueda de interacciones entre proteínas.

La técnica “Far-Western Blot” utiliza una proteína marcada en lugar de un anticuerpo como sonda en la membrana, la cual reconoce y se une a las proteínas de la membrana a través de interacciones proteína–proteína, por lo que si se genera señal en la membrana, indica la presencia de una proteína que interacciona con la proteína-sonda y, además, que dicha proteína posee el peso molecular correspondiente a la banda donde se observa la señal.

Este método se suele utilizar para buscar interacciones desconocidas entre proteínas o para confirmar posibles interacciones

Detección en el propio gel (“UnBlot® In-Gel Detection”)

Far-Western Blot Detection

Far-Western Blot Detection

técnicas relacionadas