p1.e5.western blot (inmunoblot)

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Permite la transferencia de proteínas desde ungel donde han sido separadas por por tamaño ocarga mediante electroforesis a una membranamanteniendo una configuración espacial.

Técnica empleada para el análisis individual de

proteínas en mezcla.

Para posteriormente ser detectadas mediante launión de un anticuerpo

Son transferidas a una membrana de nitrocelulosa para

su posterior marcaje con anticuerpos.

Las proteínas se separan mediante

electroforesis en gel

Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una

muestra determinada

• Una vez transferida a la membrana de nitrocelulosa se bloquean los sitios de acción inespecíficos para formar posteriormente un complejo con un anticuerpo específico primario.

• El anticuerpo primario no unido es eliminado y se adiciona un anticuerpo secundario marcado generalmente con HRP (peroxidasadel rábano) o fosfatasa alcalina.

Preparación de la muestra Electroforesis en gel

Transferencia electroforética a una

membrana

Hibridación del Anticuerpo

Detección de las Bandas

• Obtención de la proteína

Eliminar medio de cultivo y

lavar con PBS

Desprender células a un eppendorff

Llevar a sonicador y centrifugar

Obtiene sobrenadante y se deja en hielo

se añade anti proteasaSe añade,

Buffer y SDS

• Obtención de la proteína

• La proteínas se desnaturaliza

con calor, SDS o

mercaptoetanol o ditiotreitol

que rompen los puentes S-S.

• SDS aporta carga negativas

• Las proteínas migran hacia el

cátodo (+) y se distribuyen

según su peso molecular.

Prepara gel Separador

(pH 8.8)

Prepara gel contenedor

(pH 6.8)

Bloqueo de la membrana

(leche PBS-Tween)

Retira solución de bloqueo y lava 3

veces con PBS

Directo: Anticuerpo primario con

enzima

Indirecto: Anticuerpo secundario con

enzima

Incuba con sustrato en agitación

Se enjuaga con agua MQ

Lee Quimioluminiscencia,

Fluorescencia y Colorimetría

Indirecto: Anticuerpo

primario

Lavado 3 veces con PBS tras cada incubación

APLICACIONES Investigación: biología molecular.

*Detección de proteínas o

mutaciones puntualesDiagnóstico:

*Prenatal

* Enfermedades inflamatorias, perfil de

citoquinas en modelos experimentales,

Factores de crecimiento, Secreción de

proteínas

*Prueba de VIH: (estándar de oro) Ac´s

anti-VIH en suero. Membrana con

proteínas de células infectadas + suero

muestra; aparición de bandas indica =

seropositivo.

*Confirma la encefalopatía

espongiforme bovina, "enfermedad de

las vacas locas".

*Enfermedad de Lyme.

*Oncogenes

En veterinaria:

*FIV en gatos.

*Costo elevado.

*Variabilidad reaccional en

las bandas según el ensayo ,

el tipo de muestras, las

condiciones técnicas, hacen

variar la subjetividad de

interpretaciones.

*Problema en las proteínas

de fácil degradación.

*Es tardado (inadecuada

transferencia) bandas

sesgadas, descolorido, o

incluso múltiple.

VENTAJAS

*Alta sensibilidad 0,1

nanogramos de proteína.

*Diagnóstico eficaz

temprano.

*Múltiples muestras y

tipos de estudio.

DESVENTAJAS

VENTAJAS Y DESVENTAJAS