patrones indeterminados de western blot en sueros reactivos por anticuerpos contra los virus...
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Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por anticuerpos contra los virus linfotrópicos de
células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica
Western Blot indeterminate patterns in reactive serum by antibodies against T lynphotropic virus I/II (HTLV I/II) in
blood donors in Costa Rica
Ximena Cortés ¹,², Zaida García, Lorena Torres³, Lizeth Taylor¹,²
1. Departamento de Virología. Facultad de Microbiología. Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica. 2. Centro Internacional de Investigación y Adiestramiento Médico (ICMRT). Facultad de Microbiología. Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica. 3. Subárea Laboratorios Clínicos. Área Regulación y Sistematización de Servicios de Salud. Caja Costarricense de Seguro Social. San José, Costa Rica.
Resumen
Los virus linfotrópicos humanos tipo I y II (HTLV I/II) son retrovirus asociados a diferentes patologías. El HTLV I fue el primer retrovirus relacionado con enfermedad y ocasiona principalmente dos tipos de patologías: la leucemia o linfoma de células T del adulto (LTA) y la paraparesia espástica tropical (PET). El HTLV-II se ha asociado a cuadros neurológicos similares. Centroamérica, América del Sur y el Caribe se definen como áreas de alta prevalencia.
Para prevenir la transmisión de la infección de estos retrovirus, se ha implementado el tamizaje de la donación sanguínea en muchos países, incluido Costa Rica. En donadores tamizados la técnica de Western Blot (WB) ha demostrado una actividad incompleta de anticuerpos contra los antígenos virales. Estos patrones se definen como indeterminados. Entre diciembre del 2002 y marzo del 2006 se reportaron los siguientes resultados de WB al evaluar sueros reactivos por ensayo inmunoenzimático: 39 (0,02%) donantes positivos, 254 (0,14%) indeterminados y 113 (0,06%) negativos. Se seleccionaron 42 muestras indeterminadas y 25 positivas para ser analizadas por un sistema comercial (HTLV I/II Blot 2.4); las positivas se clasificaron como: 15 HTLV I, 8 HTLV II y dos muestras indeterminadas. Del grupo de indeterminados se presentaron 4 resultados no concordantes: 1 HTLV II, 1 HTLV y 2 negativos. Se demostró que, en muestras nacionales, patro-nes positivos débiles pueden estar relacionados a WB indeterminados o a reactividad parcial de infección por HTLV II.
El patrón indeterminado más descrito se denomina HGIP (HTLV-gag inde-terminate profile pattern) y es definido como un perfil de proteínas específicas donde se presentan las bandas p19, p26, p28, p32, p36 y p53 sin la presencia de la banda p24 o alguna de las glicoproteínas del gen de la envoltura (gp 46, gp 61/68). En las muestras nacionales se observó que 22 presentaron un patrón similar, sin la p24. Sin embargo, se observaron 6 muestras con patrones diversos que incluyen la p24.
Este primer análisis de muestras nacionales señala la necesidad de realizar un estudio molecular para determinar el estado real de infección por HTLV en donadores nacionales que presenten el perfil indeterminado en la técnica de WB. Esta información permitirá establecer asociaciones con casos verdaderos positivos o con reacciones inespecíficas.
Palabras clave: HTLV I / HTLV II, donantes, Western Blot, patrones indeterminados.
Abstract
Human T lymphotropic virus type I and II (HTLV I/II) are retroviruses associated with different clinical manifestations. HTLV I was the first retrovirus associated to human disease, and it is the etiological agent of two main pathologies: adult`s T-cell leukemia (ATL) and myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). HTLV-II has been related to similar neurological disorders. Central America, South America and the Caribbean are areas of high prevalence.
In many countries, including Costa Rica, blood screening has been implemented to prevent retroviral blood transmission. Applying the Western Blot (WB) technique, screening for HTLV I/II in blood donors has shown incomplete antibody reactivity against viral antigens, which has been classified as an indeterminate pattern. Between december 2002 and march 2006, enzyme immunoassay (ELISA) reactive samples were reported as 39 (0,02%) positive, 254 (0,14%) indeterminate and 113 (0,06%) negative. For further study with the commercial system (HTLV I/II Blot 2.4), there were selected 42 indeterminate samples and 25 positive ones. The results for the positive group were: 15 HTLV-I, 8 HTLV-II and 2 indeterminate. In the indeterminate group we found 4 discordant results: 1 HTLV II, 1 HTLV and 2 negative samples. In this research, using national serum samples, it is weak show positive patterns can be related to indeterminate WB or to partial reactivity of HTLV II infected donors.
The most characteristic indeterminate pattern is the HTLV-I gag indeterminate (HGIP), which has been defined as a protein profile which includes p19, p26, p28, p32, p36 and p53, but excludes p24 or envelope glycoproteins (gp 46, gp 61/68). In the present study, a similar pattern was observed in 22 samples. However, there were 6 samples with patterns that include p24.
This first analysis of indeterminate patterns in national samples demonstrates the importance of molecular studies to establishing the HTLV infection status in national blood donors with this WB profile. This information will enable identify true positives cases and unspecific reactions.
Key words: HTLV I / HTLV II, blood donors, Western Blot, indeterminate patterns.
Introducción
Los virus linfotrópicos humanos tipo I y II (HTLV I/II) son retrovirus asociados a diferentes patologías. El HTLV I fue el primer retrovirus relacionado con enfermedad y ocasiona principalmente dos tipos de patologías: la leucemia o linfoma de células T del adulto (LTA) (ATL, del inglés adult T-cell leucemia) (1, 2) y la paraparesia espástica tropical (PET) (TSP del inglés tropical spastic paraparesis) (3). El HTLV-I además se ha vinculado a cuadros como uveitis, dermatitis, artritis y otros desórdenes autoinmunes
(4). El HTLV-II se ha asociado a cuadros neurológicos similares a los inducidos por el tipo I, pero no se cuenta con la evidencia epidemiológica suficiente para confirmar su papel como agente etiológico (5). La distribución geográfica del HTLV es mundial, y Centroamérica, América del Sur y el Caribe se definen como áreas de alta prevalencia, con conglomerados de personas infectadas (6).
Para prevenir la transmisión de la infección por sangre de estos retrovirus se ha implementado el tamizaje de la donación sanguínea en muchos países y Costa Rica no ha sido la excepción. En todo el mundo, en donadores de sangre tamizados para HTLV I/II se ha demostrado una actividad incompleta de anticuerpos contra los antígenos virales; en la técnica de Western Blot (WB) estos patrones se definen como indeterminados (7-10). En Costa Rica entre diciembre del 2002 y diciembre del 2004 los patrones indeterminados representaron un 0,12% del total de donantes tamizados, y se obtuvo un 0,02% de positivos y un 0,06% de negativos (11).
El patrón indeterminado más común se ha definido como un perfil de proteínas específicas de grupo donde se presentan las bandas p19, p26, p28, p32, p36 y p53, sin la presencia de la banda p24 o alguna de las glicoproteínas correspondientes al gen de la envoltura (gp 46, gp 61/68) (7, 8). Este perfil se ha denominado HGIP (por sus siglas en inglés, HTLV-gag Indeterminate Profile Pattern) y se ha descrito principalmente en zonas tropicales endémicas (8, 12, 13).
En el estudio previo, utilizando un sistema de WB implementado en el laboratorio del Centro Internacional de Investigación y Adiestramiento Médico (ICMRT: International Center for Medical Research Training), no se observó una alta frecuencia de este patrón; por el contrario, se obtuvieron patrones con bandeo múltiple que presentaban la proteína 24 y/o alguna banda del gen de la envoltura (11).
En el presente trabajo se pretende obtener mayor información con respecto al patrón de bandas indeterminado observado en muestras nacionales, caracterizar muestras positivas con patrones de bandeo débil y comparar el WB implementado en el laboratorio (in house) con el sistema comercial.
Materiales y métodos
Población de estudio
La población original comprende 174.667 muestras de suero de donantes de sangre de todo el territorio nacional, que asistieron a los bancos de sangre de los laboratorios clínicos de la Caja Costarricense de Seguro Social (CCSS) entre diciembre del 2002 y marzo del 2006. Estas muestras fueron analizadas por diferentes pruebas para detectar agentes infecciosos transmitidos por transfusión sanguínea, para Virus Hepatitis C (VHC), Virus Hepatitis B (VHB), Virus Inmunodeficiencia Humana (VIH), contra el Trypanosoma cruzi (enfermedad de Chagas), contra elTreponema pallidum (sífilis) y anticuerpos tipo IgG contra los virus HTLV I/II. De esta población general se seleccionaron 42 muestras indeterminadas y 25 positivas.
Muestras
Las muestras fueron enviadas y transportadas como se describió de previo (11), y el suero fue almacenado a -20 °C. Cada muestra se descongeló para realizar la técnica de WB "in house" y WB comercial.
Western Blot
El WB "in house" se realizó como se describió anteriormente (11). Por este sistema las muestras fueron procesadas por duplicado. Según criterio del Centro de Control de Enfermedades de Atlanta de Estados Unidos (14), una muestra es negativa si no presenta bandas, positiva si reacciona contra la proteína 24 del gen Gag (p24) y con una o mas proteínas del gen de la envoltura (ENV) gp46 y/o gp 61/68; si no se cumple el criterio anterior se considera una muestra indeterminada.
Para el WB comercial se utilizó el sistema HTLV Blot 2.4, de Genelabs® Diagnostics, siguiendo las especificaciones de la casa comercial. En este sistema una muestra se considera HTLV-I positiva si reacciona con las proteínas centrales (del core) p19 con o sin p24 y con 2 proteínas de la envoltura, que son la recombinante específica para HTLV-I (rgp46-I) y la recombinante específica para HTLV I y HTLV-II, la GD21. Una muestra se considera HTLV-II positiva si reacciona con la proteína central p24 con o sin p19 y las 2 proteínas de la envoltura, la recombinante específica para el tipo II (rgp46-II) y la GD21. Finalmente, si una muestra sólo reacciona con la p19, la p24 y la GD21 se interpretan como positivos para HTLV, sin definir a cual tipo pertenece.
Resultados
Del total de donantes tamizados (174.667) se procesaron las muestras reactivas por ensayo immunoenzimático (EIA); con la prueba confirmatoria de WB se obtuvieron los siguientes resultados: 39 (0,02%) donantes positivos, 254 (0,14%) donantes indeterminados y 113 (0,06%) con resultado negativo.
A todas las muestras con resultado de EIA positivo se les realizó el WB "in house"; de las interpretadas como positivas en este sistema, a 25 que contaban con suficiente suero se les realizó el WB comercial. De estas muestras se clasificaron 15 como HTLV I, 8 como HTLV II y 2 muestras como indeterminadas. Al comparar estos resultados se observó que en el sistema "in house" los bandeos débiles, aún con las bandas de criterio diagnóstico, se relacionaron con un resultado indeterminado.
En las muestras indeterminadas se observó una amplia variedad de patrones con bandas individuales (p15, p19, p24, p28, p46, p53, p68) o patrones de dos bandas que incluyeron: p15 y p28, p19 y p28 o p32, p24 y 15 ó 10, 28, 46 ó 53. Igualmente, se obtuvieron patrones con bandeo múltiple (3 o más) (cuadro 1). De este segundo grupo se seleccionaron 42 muestras que fueron analizadas por el sistema comercial. De dichas muestras 4 no fueron concordantes y se identificaron como 1 HTLV II, 1 HTLV y 2 negativas. Las muestras restantes fueron concordantes con un patrón indeterminado. Una de las muestras indeterminadas por el sistema "in house" se negativizó en la segunda y tercera muestra en el mismo sistema, reduciendo a 3 las muestras no concordantes.
En las muestras procesadas por el sistema comercial se observó que 17 presentaron el perfil de p19, p26, p28 y p36 (figura 1) y 5 más presentaron un patrón similar. Este patrón es semejante al HGIP descrito, que incluye p19, p26, p28, p32, p36 y p53 sin la p24. Sin embargo, también se observaron 6 muestras con patrones diversos que incluyen la banda p24 (cuadro 2).
Discusión
Actualmente no se ha determinado la importancia clínica de patrones de WB indeterminados. El tamizaje de donantes nacionales ha señalado que la prevalencia de patrones indeterminados es mayor a la de muestras positivas y negativas, 0,13% vs 0,02 y 0,06%, respectivamente (11).
Conocer el significado de estos resultados indeterminados es de suma importancia para el seguimiento integral de los casos. Se ha postulado que los pacientes con perfiles indeterminados HGIP no se asocian a infección por este virus; sin embargo, diferentes estudios han demostrado que patrones indeterminados pueden presentar reacciones en cadena de la polimerasa positivas (13, 15) y en algunos casos se han relacionado con la presencia de la banda GD21 (16, 17). En este estudio se detectó una muestra indeterminada que presentó la banda GD21 (figura 1).
Por otra parte, se han propuesto diversas hipótesis para la presencia de WB indeterminados, por ejemplo, presencia de secuencias provirales (16), cargas virales bajas (18), o presencia de HTLV-defectuoso (19). Recientemente se describió el HTLV-3 que presenta homología parcial con los anteriores y podría producir reacciones cruzadas (20). En el presente estudio el sistema comercial detectó una muestra que no se pudo clasificar como HTLV I o II, solamente como HTLV. Este resultado podría estar relacionado con alguna de las causas expuestas anteriormente.
La comparación de las muestras positivas e indeterminadas entre ambos WB mostró una buena concordancia (índice Kappa: 0,8687). Las discrepancias de los resultados indeterminados se podrían explicar como: una muestra negativa asociada a un resultado inespecífico del sistema "in house"; una muestra con reactividad parcial que tampoco fue asignada en forma definitiva por el sistema comercial (HTLV) o bien, clasificada como HTLV-II, que fue detectada por las proteínas recombinantes específicas del sistema comercial.
HTLV II puede presentar patrones no completos de reactividad que no permite clasificarlos por el sistema "in house" (figura 2). Este resultado concuerda con lo reportado en la literatura, donde se señala que individuos infectados por HTLV II pueden presentar reactividad indeterminada en WB o INNO-LIA (21).
A pesar de que en el sistema comercial el mayor patrón detectado (42,5%) fue semejante al HGIP, en ambos sistemas se detectaron diversidad de patrones inespecíficos y de patrones individuales que deben considerarse en el control y seguimiento de donadores indeterminados.
Los resultados serológicos indeterminados de la prueba confirmatoria de WB no constituyen un problema aislado, ya que son comunes en estos retrovirus, así como en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), especialmente en poblaciones de bajo riesgo. Las causas de estas reacciones son muy diversas y pueden estar asociadas a características propias de determinadas poblaciones y zonas geográficas. Actualmente, en el país no se conoce cuáles factores virales o ambientales podrían estar relacionados.
No obstante, es bien entendido que las reacciones de muestras indeterminadas deben ser rechazadas para uso en el banco de sangre. A consecuencia de esto, el manejo del donante de sangre con un resultado indeterminado es complicado tanto para él mismo como para el personal que da la consejería, debido a que amerita un seguimiento prolongado.
El WB es necesario en el estudio de HTLV I / II; sin embargo, la alta prevalencia de indeterminados en la población nacional resalta la necesidad de un criterio diagnóstico más específico. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) podría ser una herramienta útil para resolver casos indeterminados en un plazo corto.
En la actualidad no se dispone de una cura para la LTM o la M/PTE, por lo que la transmisión de estas enfermedades puede acarrear costos sociales y económicos a largo plazo. Este es el primer análisis de patrones indeterminados de muestras nacionales que señala la necesidad de realizar un estudio molecular para poder determinar el estado real de infección por retrovirus en donadores nacionales que presenten patrones indeterminados, de manera que se establezcan asociaciones con casos verdaderos positivos o con reacciones inespecíficas.
Agradecimiento
Los autores agradecen al Dr. José Luis Salas Oviedo de la Dirección Desarrollo Servicios de Salud, Área de Regulación y Sistematización, Subárea de Laboratorios Clínicos-CCSS y a todos los funcionarios que conforman la Red de Laboratorios Clínicos y Bancos de Sangre. Al Señor Marvin Aguilar (ICMRT) por la asistencia técnica y al Dr. Cesar Vega de la O por la colaboración brindada.
Recibido: 29-03-07 Aceptado: 19-04-07
Referencias
1. Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gadzar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type c retrovirus particles from fresh and cultured lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci1980; 77:7415-7419. [ Links ]
2. Blattner WA, Takatsuki K, Gallo RC. Human T-cell leukemia-lymphoma virus and adult T-cell leukemia. JAMA1983; 250:1074-1080. [ Links ]
3. Gessain A, Barin E, Vernant JC, et al. Antibodies to human T-lymphotropic virus type-1 in patients with tropical spastic paraparesis. Lancet 1985; ii: 407-410. [ Links ]
4. Proietti FA, Carneiro-Proietti AB, Catalan-Soares BC, Murphy EL. Global epidemiology of HTLV-1 infection and associated diseases. Oncogene 2005; 24: 6058-6068. [ Links ]
Diagnóstico
LAS PRUEBAS SOROLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR EL HTLV-YO Y HTLV-II
Las muestras de suero son seleccionadas para el anticuerpo anti-HTLV-I usando 2 pruebas inmunoenzimáticas autorizadas, de diferentes fabricantes, preparados con los antígenos del HTLV-I a partir del "lisado" total del virus y algunas proteínas recombinantes. Estos ensayos varían en la sensibilidad para descubrir los anticuerpos para HTLV-II (4,5). Inicialmente, las muestras reactivas son probadas dos veces para reducir la posibilidad de la reactividad de ser debida a error técnico. Especimenes que son reactivos en cualquiera de las pruebas, las pruebas reproducidas, son consideradas reactivas repetidamente. Especimenes que no reaccionan en alguna de las pruebas repetidas son considerados no reactivos (3).
Mas, recientemente, antígenos recombinantes del HTLV-I, - II y gp21e están incorporados a ELISA, mejorando la especificidad y la sensibilidad. Las pruebas adicionales, como el "immunoblot" (WB) y el análisis por radioinmunoprecipitación, son necesarios para interpretar, con corrección, los especimenes repetidamente reactivos. Las tales pruebas adicionales deben ser capaces de identificar los anticuerpos para proteínas del core (gag) y del sobre (env) HTLV-I/II.
La investigación de anticuerpos por inmunofluorescencia indirecta (IFA) para HTLV-I/II fue realizada en algunos laboratorios. Ninguna de las pruebas adicionales fue autorizada por FDA, pero ellos están disponibles en las instituciones de la investigación, bancos de sangre, algunos laboratorios de salud pública, los laboratorios industriales y como pruebas "internas" en algunos laboratorios de diagnóstico.
Los siguientes criterios, para soropositividad de HTLV-I/II, se adoptaron por un grupo de trabajo del Servicio Norteamericano de salud Pública (USPHS) en 1988 (3): un espécimen que es reactivo repetidamente por ELISA para HTLV-I/II tiene que demostrar inmunoreactividad a la proteína p24 y para un producto de gen env (el gp61/68 y/o de gp46). Ellos son considerados indeterminados. Indeterminados Los "sueros reactivos indeterminados que no satisfacen éstos criterios pero ellos muestran la inmunoreactividad a por lo menos un producto. Pueden ser exigidos "Inmunoblot" y radioinmunoprecipitación y determinar si un espécimen es positivo o indeterminado.
Los especimenes de suero sin inmunoreactividad para cualquier producto del gene HTLV, en las pruebas adicionales más específicas, son considerados falso-positivos. Varios estudios que involucran la amplificación del provirus apoyaron la precisión de éstos criterios de diagnósticos; son considerados infectados los individuos cuyos especímenes satisfacen los criterios para la positividad con HTLV-I o HTLV-II (7,70).
Diagnóstico
PRUEBAS SOROLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA INFECCIÓN POR EL HTLV-I Y HTLV-II
En contraste, personas cuyas muestras son "indeterminadas" raramente están infectadas con cualquier uno de los virus (70,71). En raros casos, personas con reactividad para p19 y para un producto de gene de env (gp61/68 y/o gp46), mas sin reactividad para p24, fueron consideradas infectadas por el HTLV-I/II (72). Un avance importante en las pruebas sorológicas para HTLV fue el desarrollo de una proteína recombinante del env, p21e. Reactividad para p21e (ELISA y WB) fue considerada altamente sensible para infección por el HTLV-I/II, y fue observada en casi 100% de las personas infectadas (73). Sin embargo, la especificidad de la reactividad de p21e fue interrogada (74,75).
Para propósitos de notificación y recomendación, l a positividad de m ue stras que indican sorologicamente p21e de b ería n ser confirmadas por pruebas que identifica n rea c tividad para env, como radioi n munoprecipita ción o ensayos basados en proteínas recombinantes (76), o por PCR, hasta información adicional estar disponible. Las pruebas sorológicas adicionales, discutidas anteriormente, son incapaces, así, de diferenciar anticuerpos a HTLV-I de HTLV-II. Fue usada la intensidad relativa de la reactividad para el p19 de proteínas de mordaza y p24 en el "inmunoblot" para diferenciar HTLV-I de HTLV-II (77), mas tal diferenciación puede no ser verdadera (78). Recientemente, fueron desarrollados varios peptídeos sintéticos y proteínas recombinantes para este propósito (8,9,79).
Así, como las pruebas adicionales previamente discutidas, todas estas pruebas son utilizadas solo para pesquisa. Datos preliminares indican que pueden ser altamente específicos para diferenciar los anticuerpos de HTLV-I y HTLV-II (8,9,79). Ni todos los especímenes de sueros HTLV-I/II-positivos pueden ser diferenciados en HTLV-I o HTLV-II, usando estas pruebas. En estos casos, son necesarios métodos mas sofisticados, como amplificación de pro virus o aislamiento de virus, para diferenciar infección por el HTLV-I o por el HTLV-II. Una de las pruebas confirmatorias más utilizadas en el momento es el WB para HTLV-I y II (WB HTLV 2.4, Genelabs, EUA) que utiliza proteínas recombinantes específicas del HTLV-I y HTLV-II y mas una región truncada de la gp21 (GD21), además de proteínas comunes a los dos virus.
Así, el criterio de positividad ocurre cuando el suero reacciona contra la proteína del core (gp19 o p24), GD21, la recombinante específica del HTLV-I (RGP46-I) o la recombinante específica del HTLV-II (RGP46-II). Cualquier otro padrón con bandas es considerado inconclusivo, o cuando no reacciona para la RG46-I o RG46-II, mas hay presencia de la GD21, como HTLV-I/II (Figura 1).
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1 HTLV I / II ELISA 4,0 Instrucciones de uso FOR RESEARCH USE ONLY NO USAR EN PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO FECHA DE REVISIÓN: 09/08
Nota: Los cambios Destacados MBG 0012-ENG-1 23082-192: (192 kit de pruebas) 23082-480: (480 kit de pruebas)
NOMBRE Y USO PREVISTO El MP Diagnostics (MPD) HTLV I / II ELISA 4,0 es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas destinado a la detección de anticuerpos contra las células T humanas tipo virus linfotrópico 1 (HTLV-I) y tipo 2 (HTLV-II) en suero o plasma humano.
Este kit se suministra con fines de investigación solamente. No se pretende para el uso en el diagnóstico o pronóstico de la enfermedad.
INTRODUCCIÓN De células T humanas (virus linfotrópicos HTLVs) son retrovirus patógenos que pueden causar graves enfermedades hematológicas y neurológicas en individuos infectados.
La familia HTLV se compone de dos miembros bien estudiadas: HTLV-I y HTLV-II, así como dos recién descubierto miembros: HTLV-3 y HTLV-4.
HTLV-I es conocido como el agente etiológico de células T del adulto leucemia / linfoma (ATL), HTLV-mielopatía asociada / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP), y el HTLV asociado a uveítis.
HTLV-II infección también se ha asociado con enfermedad de leucemia y neurológicos aunque es menos patogénico que HTLV-I.
Varias líneas de evidencias moleculares sugieren que HTLV-3 posee algunas de las propiedades de HTLV-I Aunque se sabe poco sobre la patogenicidad de HTLV-3.
Los estudios de la distribución geográfica de la infección por HTLV-I revelan que el virus es altamente prevalente en Japón, África, islas del Caribe y América del Sur.
Recientes estudios epidemiológicos en la Estados Unidos y Europa confirmar la presencia de una prevalencia mixta de HTLV-I y HTLV-II entre las diferentes poblaciones de alto riesgo, como los usuarios de drogas por vía intravenosa y transfusión destinatarios.
Los virus se pueden transmitir a través del contacto sexual, y contaminado a través de productos sanguíneos y la madre al niño a través de la lactancia materna.
El MPD HTLV I / II ELISA 4,0 es un inmunoensayo de sándwich directa que utiliza una combinación de proteínas recombinantes y de una proteína de fusión recombinante tri-marcado con peroxidasa de rábano picante. Este formato de ensayo asegura la detección simultánea de varios específico IgA, IgG e IgM contra HTLV-I y HTLV-II.
Además, las pruebas externas han demostrado que MPD HTLV I / II ELISA 4.0 es capaz de detectar anticuerpos contra HTLV-3/STLV-3 (véase la sección "Rendimiento Específico Características ").
El MPD HTLV I / II ELISA 4,0 pretende ser una semi-cualitativa inmunoenzimático ensayo para la detección de anticuerpos para HTLV-I y HTLV-II se ha encontrado en el suero humano o plasma.
QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO
Los pocillos de las tiras de microplacas de poliestireno se recubren con una mezcla de tres diferentes HTLV proteínas recombinantes, que corresponden a los segmentos altamente antigénicas de HTLV-I y HTLV- II virus. El conjugado se basa en una proteína de fusión recombinante tri-, que está marcado con peroxidasa de rábano picante.
El antígeno tri-fusión se genera mediante la clonación de los tres fragmentos de cDNA que codifica para las tres proteínas recombinantes de HTLV en un solo vector.
Suero o plasma humano, diluido en el diluyente que contiene el conjugado, se incuba en estos pocillos recubiertos. HTLV-I/II anticuerpos específicos (IgA, IgG e IgM), si está presente, se unirá tanto a los antígenos inmovilizados en la fase sólida y el antígeno tri-fusión del conjugado.
Después de la incubación, los pocillos es lavado a fondo para eliminar los materiales no unidos una solución de sustrato incoloro que contiene cromógeno 3,3 ', 5,5' - tetrametilbenzidina (TMB) se añadieron a cada pocillo.
La presencia de anticuerpos específicos se indica por la presencia de un color azul después de la incubación, que cambia a amarillo cuando la reacción de color se terminó mediante la adición de ácido sulfúrico.
La intensidad de el producto de color amarillo resultante se mide a 450 nm utilizando un espectrofotómetro y se proporcional a la cantidad de anticuerpos presentes en la muestra.
COMPONENTES DEL KIT
Componente Descripción Cantidad prevista
1. HTLV MICROPLACA Doce tiras de 8 pocillos por placa. Cada pocillo de microplaca contiene adsorbido HTLV-I y HTLV-II recombinante proteínas. Contenido: 96 pocillos por placa Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 2 PLACAS 192 pruebas 5 placas 480 pruebas
2. NO REACTIVO DE CONTROL Suero humano normal, no reactivo para anti-HCV, anti-VIH- 1/2, anti HTLV-I/II y HBsAg. Contiene timerosal y de azida sódica como conservante. Contenido: 1,2 ml por vial Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 vial 2 viales
3. CONTROL REACTIVO Suero humano inactivado que contiene un alto título de IgG anticuerpos específicos para HTLV. Contiene timerosal y de azida sódica como conservante. Contenido: 1,2 ml por vial Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 vial 2 viales
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4. DILUYENTE Tamponada con fosfato solución salina que contiene caseína y detergente. Contiene Bronidox TM como conservante. Contenido: 50 ml por botella. Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 botella 2 botellas
5. PLACA DE CONCENTRADO DE LAVADO (20X) Salina tamponada con fosfato con Tween-20. Contiene cloroacetamida como conservante. Contenido: 120 ml por botella. Almacenamiento: 2 o C a 8 o C.. 1 botella 2 botellas
6. CONJUGADO HTLV tri-fusión antígeno marcado con peroxidasa de rábano picante. Contiene 0,02% de timerosal como conservante. Contenido: 160 l por vial Almacenamiento: 2 o C a 8 o C. 1 vial 2 viales
7. SUSTRATO Solución incolora que contiene 3,3 ', 5,5' Tetrametilbencidina (TMB). Contenido: 25 ml por botella Almacenamiento: 2 o C a 8 o C en la oscuridad 1 botella 3 botellas
8. PLACA DE CUBIERTAS Adhesivo fundas para microplaca durante la incubación. 8 piezas 12 piezas
9. INSTRUCCIONES DE USO 1 copia Nota: la solución de parada (H 2 M 2 SO 4 ) No se proporciona en el kit. Para el protocolo de preparación, por favor refiérase a la sección <PREPARACIÓN DE REACTIVOS>.
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
Este equipo es para uso exclusivo en investigación.
1. Evite la contaminación microbiana de los reactivos al abrir y extraer partes alícuotas de la viales o frascos originales.
2. No pipetear con la boca.
3. Maneje las muestras de ensayo, microplacas, controles reactivos y no reactivos como potencialmente agentes infecciosos.
4. Use bata de laboratorio y guantes desechables durante la realización del ensayo. Deseche los guantes en riesgo biológico de residuos-bags. Lávese bien las manos después.
5. Es muy recomendable que este ensayo se realiza en una cabina de riesgo biológico.
6. Mantenga los materiales fuera de la comida y la bebida.
7. En caso de un accidente o de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase consejo médico.
8. Consulte a un médico inmediatamente en caso de que los materiales contaminados son ingeridos o venir en contacto con heridas abiertas u otras en la piel.
9. El ácido sulfúrico puede causar quemaduras. Evitar el contacto. Si entra en contacto con la piel, lávese a fondo con agua.
10. Evitar el contacto del ácido sulfúrico con cualquier agente oxidante o metal.
11. No exponga el sustrato a una luz intensa.
12. Limpie los derrames de materiales potencialmente infecciosos inmediatamente con papel absorbente y limpiar el área contaminada con un agente desinfectante eficaz antes de reanudar el trabajo.
PRECAUCIONES DE ANÁLISIS
1. Utilice sólo muestras de suero o plasma con EDTA, heparina, citrato de sodio, oxalato o K Ácido citrato dextrosa (ACD). Antes del almacenamiento, asegúrese de que coágulos de sangre o células sanguíneas tienen se separó por centrifugación.
2. No utilice sangre completa u otros fluidos corporales
3. Rendimiento óptimo del ensayo debe respetarse estrictamente el procedimiento del ensayo descrito en estas instrucciones de uso. Cualquier modificación del procedimiento puede dar lugar a resultados aberrantes.
4. NO MODIFICAR NI SUSTITUYA LOS REACTIVOS DE MUCHO JUEGO DE UNO A OTRO. Controles, conjugado y las microplacas están ajustados para un rendimiento óptimo. Utilice sólo el reactivos suministrados con el kit.
5. No utilice los componentes del kit después de la fecha de caducidad impresa en la caja del kit.
6. Evite la contaminación microbiana de los reactivos, al abrir y extraer partes alícuotas de la viales o frascos originales. Como esto prematuramente reducirá la vida útil de los kits y dar
resultados erróneos. Utilizar técnicas asépticas incluyendo pipetas o puntas de pipeta desechables cuando dibujo alícuotas de los viales.
7. Para evitar la contaminación cruzada, use una punta de pipeta nueva para cada muestra alícuotas a, y hacer no tocar la parte superior o la parte inferior de las tiras, el borde de los pozos o el líquido en los pocillos con dedos o puntas de pipeta.
8. Se recomienda que los elementos de vidrio utilizados con los reactivos deben ser lavados con 2M ácido clorhídrico y se lavó a fondo con agua destilada o desionizada antes de usarlo.
9. Para obtener los mejores resultados que todos los reactivos y las muestras a temperatura ambiente (25 º C ± 5 º C) antes de utilizar. Inmediatamente después del regreso de uso a 2 º C a 8 º C en almacenamiento.
10. Utilice sólo la calidad de grado reactivo, agua desionizada o destilada para diluir los reactivos.
11. Todos los reactivos deben ser mezclados antes de usar.
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12. Solución de trabajo de conjugado debe estar recién preparado USAR.
13. No exponga los reactivos o realizar una prueba en un área con un alto contenido de sustancias químicas gases desinfectantes (por ejemplo, vapores de hipoclorito) durante el almacenamiento o durante las etapas de incubación. Contacto inhibe la reacción de color. Asimismo, no se exponga los reactivos a la luz intensa.
14. No retire microplacas de la bolsa de almacenamiento hasta inmediatamente antes de su uso. Abierto, las tiras no utilizadas deben conservarse entre 2 º C y 8 º C en la bolsa de almacenamiento con el desecante suministrado.
15. Los controles del kit deben analizarse al mismo tiempo muestras de pacientes para cada ensayo.
16. Se debe tener cuidado de evitar tocar o salpique el borde del pocillo con conjugado. No "Soplar" de la micropipeta. Se recomienda el uso de pipeteo inverso cuando posible.
17. El uso de muestras muy hemolizadas, sueros coagulada incompleta, muestras de plasma que contienen fibrina o muestras con contaminación microbiana puede dar lugar a resultados erróneos.
18. NO USE un baño de agua a incubar microplacas.
19. Durante 37 ° C de incubación, la evaporación debe ser evitado. Cubrir las placas cubiertas con adhesivos proporcionado.
20. Evitar abrir y cerrar repetidamente la puerta de la incubadora durante las etapas de incubación.
21. Asegúrese de que la parte inferior de la placa esté limpio y seco y que no hay burbujas presentes en el superficie del líquido antes de leer la placa. Eliminar cualquier burbuja en el pozo, por ejemplo, por suave tapping.
22. Asegúrese de que el equipo automatizado si se usa es validado antes de su uso.
23. El mantenimiento rutinario del sistema de aspiración / lavado es muy recomendable para evitar prórroga a partir de muestras muy reactivas a las muestras no reactivas.
ALMACENAMIENTO
1. Tienda MPD HTLV I / II ELISA 4.0 kit y sus componentes a 2 º C a 8 º C cuando no esté en uso.
2. Todos los reactivos y las tiras en la condición cerrada o sin abrir, cuando se almacena a 2 ° C a 8 ° C, son estables hasta la fecha de caducidad indicada en el kit. No congele los reactivos.
3. Los cristales se pueden formar cuando la placa Wash Concentrate (20x) se conserva entre 2 º C y 8 º C. Estos cristales debe ser disuelto por calentamiento a 37 ° C antes de su uso.
4. La estabilidad del kit después de la primera apertura es de 12 meses. Kit de expiración será el día de expiración fecha, ya sea en el estado cerrado o abierto.
5. Abierto, las tiras no utilizadas microplacas deben almacenar junto con el desecante suministrado a 2 º C a 8 º C en una bolsa cerrada. RECOGIDA, TRANSPORTE Y ALMACENAMIENTO Las muestras de suero o plasma con EDTA, heparina, citrato de sodio, oxalato de K-o ACD puede ser utilizado. Antes del almacenamiento, garantizar que coágulo de sangre o células de la sangre se han separado por centrifugación.
Especímenes frescos se prefieren, los especímenes que se someten a congelación y descongelación repetidas veces no son recomendado. Las muestras deben ser almacenadas de 2 º C a 8 º C si la prueba se va a ejecutar dentro de los 7 días de colección o congelarse a ≤ -20 º C si la prueba es que se retrase por más de 7 días.
Además, hasta 0,1% de azida sódica se puede utilizar para estabilizar las muestras de suero o plasma almacenado a 2 º C a 8 º C. Claro, no se prefieren muestras hemolizadas. Lipémicas, ictéricas o contaminadas (partículas) deben filtrarse (0,45) o centrifugadas antes de la prueba.
Las muestras pueden ser virus inactivado, aunque podría no ser óptima para la ejecución del ensayo como potencial efecto del tratamiento sobre los anticuerpos IgM no se entiende completamente.
Si es necesario, inactivar como sigue:
1. Afloje las tapas de los recipientes de suero.
2. El calor suero a 56 º C durante 30 minutos en un baño de agua.
3. Permita que el suero se enfríe antes de volver a apretar las tapas.
4. El suero puede conservarse congelado hasta el análisis.
MATERIALES ADICIONALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
1. Disposable banco absorbente superior del papel y toallas de papel.
2. Tubos de polipropileno o contenedores.
3. Pipetas graduadas: 5 ml, 10 ml.
4. Multicanal capaz de dispensar 50 l, l 100, y 200 l pipeta.
5. Pipeta capaz de entregar 1-1000 l.
6. Puntas de pipeta desechables.
7. Reservorios de reactivos (cubetas), con una capacidad de 25 ml.
8. El agua desionizada o destilada, grado reactivo calidad.
9. Frascos: 500 ml, 1 litro.
10. Ácido sulfúrico 2 M (como solución de parada), 6 ml se requiere por placa
11. Lavador de microplacas ELISA. Alternativamente, el lavado se puede realizar manualmente mediante el uso de un pipeta multicanal entrega de volúmenes de 0,3 ml y un dispositivo aspirador.
12. A 37 ± 1 º C incubadora.
13. Un doble (A 450 -A 620 ) O individual (A 450 ) Microensayo longitud de onda lector de placas.
14. Desinfectante eficaz.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
1. CONJUGADO DE TRABAJO un conjugado. trabajo debe prepararse inmediatamente antes de su uso. b. Mezclar CONJUGADO y diluyente antes de usar. NO GIRAR el vial conjugado. c. Diluya el conjugado con un factor de dilución de 1:200 con diluyente. Por ejemplo, añadir 10 l conjugado en 2,0 ml de diluyente. d. Utilice sólo recipientes de polipropileno o tubos. e. 6,0 ml de conjugado de trabajo es necesario para una microplaca.
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TABLA DE PREPARACIÓN CONJUGADO Número de pruebas Vol. de Conjugado (l) Vol. de diluyente (ml) 24 15 3,0 48 25 5.0 72 30 6.0 96 40 8.0 2. Lave la placa diluido (1X Lave la placa) un lavado. PLACA diluido (1X Lave la placa) es estable durante 2 semanas a temperatura ambiente.
b. Diluir 1 volumen de lavar la placa 20X con 19 volúmenes de agua destilada (grado reactivo calidad). Mezclar bien. Aproximadamente 200 ml de tampón de lavado se necesita para lavar 1 placa.
3. Solución de parada, 2M H 2 SO 4 (No incluido en el kit, 6ml es necesaria por placa) una. Añadir aproximadamente 11,2 ml de grado analítico lentamente ácido sulfúrico concentrado a 80 ml de agua destilada o desionizada (precaución: no en orden inverso) y luego completar hasta 100 ml con más agua.
PROCEDIMIENTO DE ENSAYO IMPORTANTE:
- Los inmunoensayos de esta naturaleza son sensibles a la temperatura y tiempo dependiente. El cumplimiento estricto del procedimiento de ensayo se asegurará de ensayo óptimo rendimiento. Cualquier modificación del procedimiento recomendado puede conducir a aberrantes resultados.
1. Equilibrar todos los componentes del kit y las muestras de prueba a temperatura ambiente antes de su uso.
2. Preparar CONJUGADO DE TRABAJO como descrito en la PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
3. Retire una microplaca de la bolsa de aluminio. –
4. Mezclar viales de muestras y control a fondo antes de su uso.
5. Llenar un depósito de reactivo con CONJUGADO DE TRABAJO. Utilizando un pipeta multicanal, se añaden 50 l de conjugado de trabajo a todos pocillos. 50 μ l
6. Wells A1 y B1 están "en blanco". NO AGREGAR A LA MUESTRA Estos pozos. Añadir 50 l de diluyente por pocillo a estos pocillos. 50 μ l
7. Añadir 50 l de muestra de ensayo a la bien asignado, a partir de A2 bien. Esto dará una dilución final de la muestra de 1:2. Mix pipeteando arriba y por lo menos una vez. Repita este paso con otras muestras de prueba hasta todo se añade. 50 μ l
8. Añadir 50 l de NO REACTIVO DE CONTROL por pocillo a los pocillos C1, D1 y E1. Mezclar pipeteando arriba y abajo al menos una vez. 50 μ l
9. Añadir 50 l de CONTROL REACTIVO por pocillo a los pocillos F1, G1 y H1. Mezclar pipeteando arriba y abajo al menos una vez. 50 μ l
10. Toque suavemente por todos los lados de la microplaca para asegurar la mezcla adecuada de la muestras y controles. Con cuidado, cubrir la microplaca con una placa Cubrir para evitar la evaporación durante la incubación.
11. Incubar durante 60 ± 2 minutos a 37 ± 1 o C en una incubadora (No utilice un baño de agua durante la incubación). 60 ± 2 min 37 ± 1 o C 12. Retire y deseche la cubierta de la placa y lavar la microplaca con Lave la placa diluido (1X Lave la placa) utilizando uno de los dos métodos recomendados:
A. automático o semi-automático de microplacas Lavadora - Lavado de seis (6) veces con un mínimo de 300 l por pocillo por lavado.
B. Manual de microplacas Lavadora - Aspirar completamente el contenido de todos los pocillos mediante la reducción de la punta del aspirador suavemente a la parte inferior de cada uno también. Tenga cuidado de no rayar el interior de la BIEN LA SUPERFICIE. Llenar toda la placa con al menos 300 l / pocillo, luego aspirar inmediatamente en el mismo orden. Lleve a cabo este ciclo de seis (6) veces. 300 μ l por bien por lavar
13. Secar por inversión de la microplaca y golpeando firmemente sobre absorbente papel. Todos tampón de lavado placa residual debe ser borrado en seco. Color formación puede ser inhibida durante la incubación del sustrato por residual amortiguador placa de lavado.
14. Llenar un depósito de reactivo con el sustrato. El uso de un multicanal pipeta, añadir 100 ml de sustrato a cada pocillo. Aplique una placa Cubierta. 100 μ l
15. Incubar durante 30 ± 2 minutos en la oscuridad a 37 ± 1 o C. 30 ± 2 min 37 ± 1 o C
16. Retire y deseche la cubierta de la placa.
17. Usando una pipeta multicanal, añadir 50 l de ácido sulfúrico 2 M a cada uno pocillo para detener la reacción de color. Toque suavemente para mezclar la placa. 50 μ l
18. Determinar la absorbencia de cada pocillo a 450 nm. Si un filtro dual instrumento se utiliza, la longitud de onda de referencia debe ser 620 nm. La 450/620 nm
NOTA: La absorbancia debe leerse dentro de 10 minutos después de la adición de la 2M H 2 SO 4 Solución de parada.
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CONTROL DE CALIDAD
1. Asegúrese de que cada muestra y control es bien mezclado con el trabajo Conjugar, pipeteando arriba y abajo al menos una vez después de la adición.
2. Cambio del color de CONJUGADO DE TRABAJO indica que el suero o plasma ha sido añadido.
3. El blanco debe ser analizadas por duplicado, mientras que NO REACTIVO DE CONTROL y CONTROL REACTIVO por triplicado en cada placa con cada serie de muestras.
4. Los valores en blanco debe tener una absorbancia de ≤ 0,100.
5. No reactivo valores de control debe tener una absorbancia de ≤ 0,100.
6. Por lo menos 2 de los 3 valores del control reactivo debe tener absorbancia ≥ 0,600. Cualquier valor fuera de este rango no debe ser utilizado para el cálculo de la media Control de reactividad (RCX).
7. Si dos valores del control reactivo se desvían más del 30% de la media, la carrera no es válido y se debe repetir.
8. Para los ensayos no válidos, consulte la guía de problemas.
ENSAYO DE CORTE VALOR
Cada microplaca debe considerarse por separado en el cálculo e interpretación de los resultados de la ensayo, independientemente de la cantidad de placas procesadas simultáneamente. La presencia o ausencia de anticuerpos específicos para HTLV-I/II se determina por la relación absorbancia de las muestras al valor de corte (COV) de la placa.
La CUT-OFF El valor se calcula como (0,25 absorbancia media + NRC):
Valor de corte (COV) = 0.25 + NRCx
CÁLCULO DE LOS RESULTADOS
1. Cálculo de la No-reactiva absorbancia media del control (NRCx) Ejemplo: No. Bueno Absorbancia C1 0,020 D1 0,021 E1 0,022 Total 0,063 Significar = 0.063 / 3 = 0,021 Individuales no reactivo valores de control deben ser ≤ 0,100 unidad. Si uno no reactivo valor de control no cumple con los criterios anteriores, se debe evitar en la medida aberrante. La media de control no reactivo (NRCx) entonces debe ser recalculado usando el permaneciendo los valores individuales del control reactivo. Todo individuo restante no reactivo de control valores deben cumplir con los criterios anteriores o el ensayo no es válido y debe repetirse.
2. Cálculo de la absorbancia media del control Reactivo (RCX) Ejemplo: No. Bueno Absorbancia E1 1,221 F1 1,144 G1 1,298 Total 3,663 Significar 3.663 / 3 = 1.221 Valores individuales del control reactivo debe ser ≥ 0,600 unidad. Si un valor de control reactivo no cumple con los criterios anteriores, debe ser excluido como aberrante. La media de control reactiva (RCX), entonces debe ser recalculado usando el permaneciendo los valores individuales del control reactivo. Todos los restantes control reactivo individuo valores deben cumplir con los criterios anteriores o el ensayo no es válido y debe repetirse.
3. Cálculo de la CUT - valor OFF (COV) CUT - valores Apagado = 0,250 + NRCx Ejemplo: NRCx = 0,021 CUT - valores Apagado = 0,250 + 0,021 = 0,271
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
1. Las muestras con valores de absorbancia menores que el valor CUT - OFF se considera no Reactiva por el MPD HTLV 4.0 I / II ELISA.
2. Las muestras con valores de absorbancia superiores o iguales a la CUT - OFF son de valor consideró inicialmente reactivo por los criterios de la MPD HTLV 4,0 I / II ELISA y debe ser analizado de nuevo por duplicado antes de la interpretación.
3. Los especímenes encontrados reactiva en un nuevo análisis puede ser interpretado como r epeatedly reactiva para anticuerpos frente a HTLV-I/II por los criterios de la MPD HTLV 4,0 I / II ELISA.
4. Inicialmente, las muestras reactivas que no son reactivos en nuevas pruebas se consideran negativas por los criterios de la MPD HTLV 4,0 I / II ELISA.
CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE FUNCIONAMIENTO
Sensibilidad 515 HTLV-I/II positivo, 40 HTLV indeterminado y 11 HTLV-3/STLV-3 muestras positivas fueron Estudió en tres sitios, entre ellos uno de la casa, dos en Francia. Los resultados, resumidos en la Tabla 1, mostró una tasa de detección del 100% para 515 muestras confirmó HTLV-I/II positivos, y casi 72,7% (8/11) para HTLV-3/STLV-3 (homólogo de simio de HTLV-3) muestras positivas.
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Tabla 1: Tasa de detección de anticuerpos contra el HTLV-I y HTLV-II en varios grupos de muestras HTLV MPD HTLV-I/II ELISA 4,0 Tipo de muestra N º de muestras Reactivo Negativo Confirmado positivo para anticuerpos contra HTLV-I/II un HTLV-I 371 371 0 371 HTLV-II 134 134 0 134 HTLV-I/II co-infección 6 6 0 6 HTLV seropositivos 4 4 0 4 Indeterminado HTLV 40 13 27 0 HTLV-3/STLV-3 b 11 8 3 c NA un
Todas las muestras positivas HTLV-I/II se han confirmado con un ELISA alternativo y la mayoría de los las muestras se confirmó además con MPD HTLV Blot 2,4 y / o PCR.
b Todas las 11 muestras positivas por PCR. Seis de las muestras son de mono (STLV-3) fuente. Las otras 5 muestras representaron purga de serie de 2 HTLV-3 individuos infectados: Lobak18 (Perfil tipable en MPD HTLV Blot 2.4) y Pyl43 (probado como indeterminado con MPD HTLV Seque 2,4).
c Estas tres muestras son negativas límite de Pyl43, cuyo HTLV-3 de carga proviral es muy baja según lo determinado por PCR.
Especificidad Un total de 5.306 muestras al azar formando parte de muestras de donantes de sangre (n = 5001), las muestras clínicas (N = 205) y muestras potencialmente interferentes (n = 100) fueron probados. Los resultados, resumidos en Tabla 2, mostró una especificidad de diagnóstico de 99,82% para el donante de sangre al azar, y 100% para los muestras clínicas y muestras potencialmente interferentes.
Tabla 2: Especificidad diagnóstica de ELISA MPD HTLV-I/II 4,0 en varios grupos de muestras MPD HTLV I / II ELISA 4,0 Muestra Grupo N º de muestras No- Reactivo Repetidamente Reactivo Confirmado Falso Positivo un Donante de sangre 5001 4990 11 9 (0,18%) Paciente hospitalizado 205 204 1 0 Embarazo clínico 50 50 0 0 VHC 10 10 0 0 VIH 20 17 3 0 H.pylori 10 10 0 0 Factor Reumatoide 10 10 0 0 Total 5306 5291 15 9 (0,18%) un Todas las muestras repetidamente reactivas se confirmaron posteriormente con MPD HTLV Blot 2.4 para descartar las muestras verdaderas positivas e indeterminadas.
Reproducibilidad La precisión del ensayo del MPD HTLV 4.0 I / II ELISA se evaluó en casa con tres calibradores de suero, incluyendo un control reactivo (RC), una muestra de HTLV-I positivo y un HTLV-II muestra positiva. Dentro de plazo: tres lotes de componentes de ELISA se analizaron en un 30 repeticiones por suero calibrador en 3 ocasiones. El coeficiente de variación (CV) para los 3 calibradores en carrera diferente varió entre 6,5% y 13,6% (Tabla 3). Entre plazo: Un total de 90 observaciones se registraron para evaluar precisión entre distintas series. Estas observaciones representan 3 carreras con 3 lotes de componentes ELISA con cada suero calibrador. El coeficiente de variación para los 3 calibradores variaron entre 8,2% y 15,7% (Tabla 3). Total precisión: tres lotes de componentes de ELISA se analizaron como 4 repeticiones por suero calibrador en cada ocasión. Esto se repite 36 veces durante un período de 40 días por 4 operadores.
La precisión global se evaluó con 430 puntos de datos normalizadas (OD / COV) obtenidos con 3 calibradores de suero. El coeficiente de variación es de 15,9%. Tabla 3 Ensayo de reproducibilidad de MPD HTLV-I/II ELISA 4,0 Muestras Ensayo Componentes N º de Replica Significar OD / COV Dentro de la corrida Precisión (CV,%) Entre plazo Precisión (CV,%) # 1 30 5,455 8,5 # 2 30 5,890 9.0 Reactivo Controle # 3 30 6,053 8.0 9,5 # 1 30 5,380 6,5 # 2 30 5,355 10,9 HTLV-I Positivo # 3 30 5,310 6,7 8,2 HTLV-II Positivo # 1 30 10,530 9,1 15,7
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GUÍA DE PROBLEMAS
Problema Posibles causas Solución 1. Ensayo no es válido debido a la fuera de especificación absorbancia valor de blanco o NRC (> 0,100)
• La temperatura de incubación fuera de rango
• Incorrecto volumen de dispensación
• Tiempo de incubación más largo que el especificado
• Dilución incorrecta de Trabajo Conjugado
• La contaminación cruzada de los controles
• Control y conjugado de trabajo no está bien mixto
• Componente mezclado de diferentes kits
• Un lavado insuficiente
• Compruebe la preparación de reactivos, , Aseguran los reactivos se mezclan bien antes de utilizar
• Revise el control de signos de contaminación
• No utilice los componentes de muy diferente de los kits
• Verificar la calibración y programa de mantenimiento de pipeta, pipeta multicanal, incubadora, Lavador de microplacas y lector
2. Ensayo no es válido debido a la fuera de especificación absorbancia valor de RC (<0,600), o general débil o completamente sin color desarrollo
• La temperatura de incubación fuera de rango
• Incorrecto volumen de dispensación
• El tiempo de incubación es insuficiente
• Dilución incorrecta de Trabajo Conjugado
• Control y conjugado de trabajo no está bien mixto
• Los controles y las muestras de la prueba no equilibraron a temperatura ambiente antes ensayo
• Deterioro de la actividad enzimática de conjugado
• Deterioro de la microplaca
• Filtro lectura incorrecta o interferencia de camino óptico.
• Componente mezclado de diferentes kits
• El lavado excesivo
• Compruebe la preparación de reactivos, asegurar los reactivos son bien mezclado antes de utilizar
• No girar vial conjugado antes utilizar
• Revise el control de signos de contaminación
• Verifique la fecha de caducidad del kit y su componentes
• No utilice los componentes de muy diferente de los kits
• Equilibrar reactivos a la habitación temperatura antes de su uso
• Verificar la calibración y programa de mantenimiento de pipeta, pipeta multicanal, incubadora, Lavador de microplacas y lector 3. Ensayo válido pero en general color desarrollo es demasiado fuerte con demasiadas reactiva inicial especímenes
• La temperatura de incubación fuera de rango
• Incorrecto volumen de dispensación
• Tiempo de incubación más largo que el especificado
• Oxidación del sustrato debido a la inadecuada almacenamiento o uso del canal sucio
• Preparación incorrecta de tampón de lavado 1x
• Deterioro de Lavado 1X Plate
• Un lavado insuficiente o ineficaz
• Compruebe la preparación de reactivos, asegurar los reactivos son bien mezclado antes de utilizar
• Revise el control de signos de contaminación
• Verifique la fecha de caducidad del kit y su componentes
• No utilice los componentes de muy diferente de los kits
• Equilibrar reactivos a la habitación temperatura antes de su uso
• Utilice recipientes limpios y valles
• Compruebe la calidad de agua destilada o agua desionizada utilizada para la dilución
• Verificar la calibración y programa de mantenimiento de pipeta, pipeta multicanal, incubadora, Lavador de microplacas y lector
• Compruebe que 1X Wash Plate es dentro de 2 semanas después de la vida útil preparación
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
La desviación de los procedimientos recomendados puede dar lugar a resultados aberrantes.
LIMITADA EXPRESA RENUNCIA DE GARANTÍA
El fabricante no hace ninguna garantía expresa excepto que el kit funciona como un Investigación ensayo
Sólo para uso dentro de las especificaciones y limitaciones descritas en el producto Manual de instrucciones cuando se utiliza de acuerdo con las instrucciones contenidas en el mismo.
La fabricante se exime de cualquier garantía expresa o implícita, incluyendo expresado tal o garantía implícita respecto a la comerciabilidad, idoneidad para el uso o utilidad implícita para cualquier otro propósitos. El fabricante está limitada al reemplazo del producto o reembolso del el precio de compra del producto.
El fabricante no será responsable ante el comprador o terceros partes por cualquier daño, perjuicio o comoquiera que las pérdidas económicas causadas por el producto en el uso o en la aplicación de la misma.
PROBLEMAS TÉCNICOS / QUEJAS
¿Debería haber un problema técnico / queja, por favor haga lo siguiente:
1. Anote el número de lote del kit y la fecha de caducidad.
2. Conserve los kits y los resultados que se obtuvieron.
3. Póngase en contacto con la más cercana oficina de MP Biomedicals o con su distribuidor local.
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