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R eacción en C adena de la P olimerasa (PCR)

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Page 1: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Page 2: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Detección de ácidos nucleicos

Con hibridación

Con amplificación

Southern blot

Northern blot

Western blot

PCR

FISH

Microarray

LCR

NASBA, b-DNA

Page 3: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

• Métodos de amplificación de la diana- PCR (y sus variantes)- NASBA (Nucleic Acid Sequence based amplification)

• Métodos de amplificación de la sonda- Reacción en cadena de la ligasa (LCR)

• Métodos de amplificación de la señal- Branched DNA (b-DNA)

Page 4: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Historia de la PCR

Kary Mullis

Diseñó la técnica de PCR en los años 80

Premio Nobel en Química, 1993

Page 5: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

¿Qué es la PCR?

PCRTécnica molecular específica, rápida,

sensible y versátil

A partir de una molécula de ADN se obtienen millones de copias de un mismo fragmento

¿Cómo es esto posible? ....

Page 6: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Pensemos en la naturaleza...

¿Cómo hace la célula para replicar su genoma?

SE DESNATURALIZA LA DOBLE HEBRA

SE UNE LA

ENZIMA ADNpol

DOBLE CADENA DE ADN

SE SINTETIZAN 2 COPIAS IDÉNTICAS A LA DOBLE CADENA DE ADN

Page 7: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR

Molécula deADN (molde)

dNTPs (A;G;T;C)

ADN polimerasa

termoestable

Cofactor Mg2+

Cebador sentido Cebador Antisentido

¿Cómo podemos lograrlo in vitro?

Page 8: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

¿Qué es un primer?

Secuencia de oligonucleótidos complementaria a secuencia de ADN que se desea amplificar

Fragmento de ADN

SECUENCIA QUE DESEO AMPLIFICAR

PRIMER FW

PRIMER REV

• Permite amplificar un fragmento específico a partir del genoma

Page 9: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

CACGGCCCTGGGAACAATGCAGCTCCGCGTGCGGGCTGAGAGGACCCTGCCCCACCCCAGGTTCCACGCTCA

GTGCCGGGACCCTTGTTACGTCGAGGCGCACGCCCGACTCTCCTGGGACGGGGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT

5´ 3´

5´3´CACGGCCCTGGGAACAATGCA

GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT

3´

3´ 5´

5´

Cebador sentido (Primer Forward )Cebador antisentido (Primer reverse)

GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT3´ 5´

CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´5´

Primers

Page 10: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Características ideales para un primer

• Longitud: entre 18 y 30 nucleótidos• Contenido G+C entre 40-75%• Carecer, en lo posible, de estructuras secundarias y de

complementariedad entre sí• Ambos primers deben tener temperatura de pegado

similar. Cálculo de la temperatura de annealing: [2(AxT ) + 4(CxG)] - 5• Existen programas para diseñar primers y evaluar sus

características

Page 11: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

La ADN polimerasa• Debe ser resistente a altas temperaturas: actúan

~72°C• Existen varias: la más usada es la Taq obtenida de la

bacteria Thermophilus aquaticus (enzima termoestable)

• Actividad exonucleasa 5´ 3´• Enzima se une con alta afinidad al ADN• Necesita de primer o cebador para empezar la

reacción• Necesita de cofactores (Mg2+).

Concentración tiene efecto en especificidad y rendimiento de reacción baja concentración: bajo rendimiento, exceso: amplificaciones inespecíficas

Page 12: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Los desoxinucleótidos (dNTPs)

GRUPO FOSFATO

AZÚCAR

BASE NITROGENADA

• Concentración afecta especificidad y fidelidad de reacción

• Concentraciones altas: disminuye fidelidad de polimerasa y puede inhibir su actividad.

Page 13: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Pasos de la PCR

Desnaturalización

Pegado del primer

Extensión

Repetición de ciclos

Amplificación de fragmento determinado

Page 14: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR
Page 15: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Termocicladores

Page 16: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Tres pasos básicos

Desnaturalización

Apareamiento

Elongación

Primers complementarios

Pasos de la PCR

Page 17: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR

Page 18: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

• Termociclador • Reacción comienza a 94ºC: puentes de H

que mantienen unidos a la doble hebra se rompen ADN molde se desnaturaliza (moléculas simple cadena)

• La temperatura es reducida a 50-60ºC: primers se hibridan en sus posiciones de pegado (annealing).

• Síntesis de ADN (expansión): a 72ºC (temperatura óptima para Taq pol)

• Primeros ciclos: grupo de productos largos se sintetiza a partir de cada cadena de ADN molde. Estos polinucleótidos tienen extremos 5´ idénticos pero extremos 3´ distintos.

Page 19: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

• Ciclos desnaturalización – hibridación (annealing) - expansión: productos largos actúan como molde para la síntesis de ADN dando productos cortos con extremos 5’ y 3’ determinados por los sitios de pegado de los primers.

• Ciclos subsecuentes: productos cortos se acumulan (exponencialmente) hasta que uno de los componentes se agota.

Page 20: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

1. DesnaturalizaciónRotura de puentes de H que unen desoxinucleótidos (temperatura depende de contenido de GC)

95ºC

2. AnnealingPegado de primers a secuencia targetTemperatura depende de primers: muy alta poco/nada de producto, muy baja productos inespecíficos

3’ 5’5’ 3’ADN Targetforward

reverse

40-60ºC

Page 21: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

3. ExtensiónIncorporación de los dNTPs al extremos 3´ libre

72ºC

TAQ

dNTPs libres

Incorpora 100 nt por segundo

Extensión final 5 min: asegura que productos de amplificación estén completamente terminados

Producto

• Longitud determinada por distancia que separa sitios de pegado de primers

• Productos largos amplifican con < eficiencia (existen enzimas más eficientes para estos)

• Productos cortos pueden confundirse con dímeros de primers en un gel.

Page 22: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR

Verificación del producto de PCR en gel de agarosa

Productos de PCRMarcador de tamaño molecular

Page 23: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR
Page 24: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

¿Por qué el número de ciclos no puede ser mayor a 40?

Efecto plateau

• Degradación de reactivos• Inactivación de la enzima• Agotamiento de reactivos

Page 25: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Controles de la PCR

La PCR siempre debe contar con un control positivo y uno negativo. Estos controles son necesarios para:• Comprobar que no exista contaminación en la mix de reacción

(control negativo) • Corroborar que si no existe el producto deseado, no es por un

desperfecto en la reacción (control positivo).

CONTROL NEGATIVO: se utiliza agua como molde CONTROL POSITIVO: se utiliza como molde ADN que se sabe

tiene el sitio de pegado de primers.

Page 26: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Falsos positivos y negativos de la PCR

• Causas de falsos positivos - CONTAMINACIÓN!!- Amplificación inespecífica

• Causas de falsos negativos- Inhibidores de la PCR en la muestra (ej. grupo hemo, heparina)

- Extracción del ADN defectuosa- Mutación en el sitio de hibridación del cebador- Baja concentración o calidad del templado- Concentración incorrecta de Mg2+ o primers

Page 27: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

• RT-PCR• PCR anidada (Nested PCR)• Booster PCR• PCR asimétrica• PCR Multiplex• PCR Reversa• SISPA-PCR• PCR competitiva• PCR en tiempo real (Real Time PCR)

Variantes de la PCR

Page 28: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

RT-PCR

Técnica usada para amplificar una secuencia de ácido ribonucleico (ARN).

ADN ARNTRANSCRIPCIÓN

RETROTRANSCRIPCIÓN

Page 29: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Pasos de la RT-PCR

ARNm

ARNm (rosa) + ADNc (azul)

Primer cadena de ADN

Síntesis de segunda cadena de ADN

PCR

RT

DEGRADACIÓN ARN

- ADN complementario es producido a partir de ARNm + dNTPs + enzima ADN polimerasa (retrotranscriptasa) + primer de ADN = oligo(dT) (5´TTTTTT3´) que se hibrida con cola poly(A) del ARNm generando ADNc.

- Luego que se completa la reacción de retrotranscripción, se realiza PCR para generar segunda cadena de ADN.

Page 30: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR anidada (Nested PCR)

Más sensible y específica. Ideal para muestras con poca

cantidad de templado.

Page 31: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Booster PCR

1° PCR

2° PCR con el mismo set de cebadores

Dos amplificaciones sucesivas con idéntico set de primers.

Más sensible.

Page 32: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR asimétrica

Útil para generar sondas

Page 33: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR múltiple (Multiplex)

Amplifica múltiples productos incluidos en el mismo templado

Page 34: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

PCR reversa

Secuencia conocida

Corte con enzima de restricción

Fragmento cortado

PCR con un par de

cebadores

Sólo se conoce una secuencia de ADN para la hibridación de los 2 cebadores.

Ligació

n

Page 35: Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Detección de ácidos nucleicos Con hibridación Con amplificación Southern blot Northern blot Western blot PCR

Sequence Independent Single Primer Amplification

(SISPA) PCR

Sirve para amplificar fragmentos de ADN de secuencia desconocida.

Utiliza primers adaptadores.


Western Blot

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Pcr,Pcr Multiplex Exposicion

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