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Introducción a la Biología Celular y Molecular

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TP7: Western blot Objetivos

Familiarizarse con la técnica de western blot. Determinar mediante western blot los niveles de plasminógeno y su activación a

plasmina en medios condicionados por células tumorales. Determinar mediante western blot los niveles de actina en cultivos de células

tumorales (B16 y F3II)

Introducción

Aplicación directa vs. transferencia electroforética

La transferencia de proteínas o blotting supone la inmovilización de las proteínas (o ácudos nucléicos) sobre membranas sintéticas, seguido de la detección empleando sistemas especialmente diseñados para la tinción de blots.

El método para proteínas más potente es el denominado Western blot en el que las proteínas son separadas en primer lugar mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (sí, el viejo y conocido SDS-PAGE) y posteriormente se transfieren a una membrana, mediante la aplicación de un campo eléctrico perpendicular al gel. Para proceder a la transferencia se debe poner en íntimo contacto el gel con la membrana (ver figura 1) y luego de colocarlos en una cuba donde se sumergen en el buffer de transferencia se aplica voltaje para crear un campo eléctrico que obligue a las proteínas a pasar del gel a la membrana. Una vez completada esta operación las bandas se revelan por el agregado de un anticuerpo específico.

El nombre Western (oeste, occidental) le fue dado por el investigador W. Neal Burnette (Analytical Biochemistry, 112:195-203, 1981) como un juego de palabras por los nombres

Figura 1: Disposición del cassette para la electrotransferencia


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Southern y Northern de las técnicas que se usan con el mismo fin pero que son aplicadas a los ácidos nucleicos. Luego que Edwin Southern diseñara la técnica que lleva su nombre para detectar ADN, por oposición se denominó Northern a la técnica aplicada al ARN. Finalmente como una broma, la técnica de inmunoblotting (inmunotransferencia) para proteínas fue denominada Western.

Existen otros métodos para transferir o aplicar proteínas sobre una membrana. El más sencillo es aplicarlas directamente en forma de una pequeña gota de una solución concentrada sobre la membrana. La absorción de la gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana, quedando en forma de una mancha o dot (es el caso del dot blot. Existen dispositivos que facilitan la aplicación de las proteínas directamente a la membrana, aplicando una succión que facilita la penetración de la solución, y reciben los nombres de dot blot o slot blot en función de que la proteína quede aplicada en forma de una gota circular o de una línea. En la imagen se muestran dos de estos dispositivos:

Trabajar con las proteínas fijadas sobre una membrana tiene ventajas sobre

el emplearlas dentro del propio gel

? Son más rápidas de teñir y desteñir

? Se detectan cantidades menores de proteínas, ya que se concentran en la superficie y no se diluyen en todo el espesor del gel

? El blot es un registo del gel conveniente y cómodo de manipular

? Las membranas son mucho más fáciles de manipular que el propio gel

Todo procedimiento de 'blotting' consta de 5 etapas

? Inmovilización de proteínas sobre la membrana ya sea mediante transferencia (electroforetica, aspiración, presión) o mediante aplicación directa.

? Saturación de todos los lugares de unión de proteínas de la membrana no ocupados para evitar la unión no específica de anticuerpos, que son proteínas.

? Incubación del 'blot' con anticuerpo primarios contra la/s proteína/s de interés.

Esquema de un dispositivo de 'slot blot' y ejemplo

Dispositivo para 'dot blot' de la empresa BioRad


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? Incubación del 'blot' con anticuerpos secundarios, o reactivos que actúan de ligando del anticuerpo primario unidos a enzimas u otros marcadores.

? Las bandas de proteínas marcadas con enzimas se hacen visibles por incubación con los sustratos apropiados para formar productos coloreados insolubles en el lugar donde se encuentran las bandas de proteína.

Hay tres métodos para transferir proteínas a las membranas

1. Transferencia capilar

2. Transferencia por difusión

3. Transferencia electroforética ('electroblotting')

En el caso de los geles de poliacrilamida el método de elección es la transferencia

electroforética. La transferencia es mucho más efectiva si se realiza aplicando una diferencia de potencial entre el gel y la membrana. Electroblotting

En este método, descrito por Towbin, las proteínas son transferidas desde el gel a

la membrana electroforéticamente. La ventaja de este proceso es su corta duración (de 30 minutos a pocas horas), lo que reduce notablemente el efecto de difusión de las bandas. El procedimiento se inicia apilando sucesivamente sobre una esponja plana papel de filtro empapado en buffer de transferencia, el gel, la membrana en contacto directo con el gel, más papel de filtro y finalmente una esponja plana. Este conjunto se recoge entre dos capas de plástico perforado y se introduce en una cuba en el que se encuentra una solución salina (buffer de transferencia) y dos electrodos planos (diseñados para conseguir un campo uniforme en toda la superficie del gel). Se dispone de forma que el gel quede hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+). La carga neta de las proteínas en el caso de los geles de SDS-PAGE es negativa debida a la carga del SDS.

La electroforesis se realiza a 8-10 V/cm (de separación entre electrodos), que suele corresponder a 0,3 a 2 Ampere de 1 a 4 horas. La velocidad de transferencia es inversamente proporcional al tamaño de la proteína.

El proceso provoca un fuerte calentamiento de la solución por lo que se recomienda refrigerar el sistema y recircular el buffer. Una vez realizada la transferencia la membrana se puede analizar inmediatamente o bien conservarla en frío (2 a 8 ºC) durante meses.

Existen diferentes combinaciones de soluciones de transferencia y de membranas para cada aplicación. En la siguiente tabla se incluyen algunas de las más características

Condiciones de electroblotting más comunes

Gel Buffer de transferencia Membrana

SDS-PAGE (Lammeli) 25 mM Tris, 192 mM glicina, 20% v/v Nitrocelulosa


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O'Farrell 2D metanol, pH 8.3

Papel de intercambio iónico

PVDF

25 mM Tris, 192 mM glicina, pH 8.3 Nitrocelulosa, Nylon, Papel de intercambio iónico, PVDF, papel diazo-modificado

25 mM fosfato sódico, pH 6.5 papel diazo-modificado

SDS-PAGE

O'Farrell 2D

Native PAGE (proteínas acídicas o básicas) 15 mM borato sódico, pH 9.2 papel diazo-modificado

IEF, Native-PAGE (proteínas básicas), geles de urea ácidos

0,7% ácido acético Nitrocelulosa, Nylon, papel diazo-modificad

El grosor del gel es un factor que influye notablemente en la transferencia, siendo

muy ineficiente a partir de geles de 2 mm de espesor, y tanto más eficiente cuanto más fino es el gel, con un límite mínimo de 0,4 mm aproximadamente, debido a los problemas de manipulación.

Es importante incorporar en el gel a transferir un control de la transferencia que habitualmente es la calle donde se ha cargado el marcador de peso molecular que al transferirlo se tiñe sobre la membrana para ver si la transferencia de toda la gama de pesos moleculares ha sido correcta.

Existen algunas variantes a la transferencia electroforética descrita previamente. El sistema más extendido es el 'Semi-Dry blotting' en el que los geles son sometidos a una intensidad de corriente elevada entre dos electrodos planos entre los que se coloca una pila formada por papel, el gel, la membrana y más papel, empapados en el buffer de transferencia. El único líquido que hay es el que empapa los papeles. La ventaja de este sistema es su rapidez, consiguiendo transferencias en pocos minutos.

Membranas

La membrana que se emplea más frecuentemente es la nitrocelulosa, aunque cuando se requieren soportes más robustos, por ejemplo cuando la membrana ha de ser reutilizada diversas veces se recurre al Nylon. Sin embargo las membranas de Nylon se bloquean con más dificultad que las de nitrocelulosa y suelen presentar mayor 'background'. Las membranas de PVDF tienen gran capacidad de unión a proteínas y gran resistencia mecánica pero se humedecen con más dificultad.

Todas las membranas son hidrofóbicas y requieren un tratamiento previo con metanol antes de sumergirlas en soluciones acuosas.

Tinción de proteínas en la membrana

Habitualmente se emplean técnicas de tinción de proteínas sobre las membranas como control de la transferencia. Existen diferentes métodos para teñir todas las proteínas presentes en la membrana, pero los que más interés despiertan son los métodos de tinción de proteínas específicas a partir de mezclas complejas separadas en geles y


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transferidas. Son los métodos de tinción específicos, usualmente basados en métodos inmunoquímicos.

Detección de proteínas totales

Colorantes

Los colorantes que permiten teñir las proteínas en los geles de poliacrilamida no son utilizables en los filtros pues se unen irreversiblemente a éstos. Para teñir las proteínas en los filtros se emplean: Ponceau S, Tinta china o Negro Amido.

Ponceau S se emplea en forma de solución acuosa. La tinción es rápida pero no es permanente y puede desaparecer en el procesamiento posterior. Como la tinción desaparece es compatible con casi todos los procedimientos de detección con anticuerpos.

El método de tinción de filtros con tinta china es reproducible, sensible y permanente, y no interfiere con los procedimientos de inmunodetección, pero puede tapar la tinción colorimétrica del proceso inmunoquímico. La tinción se basa en la adherencia preferente de las partículas coloidales de carbón de la tinta sobre las proteínas inmovilizadas. La destinción se hace en PBS.

El negro amido es menos sensible que la tinta china. Las bandas aparecen negras sobre un fondo azul claro. Después de la tinción se destiñe con una solución de metanol/ácido acético. Este método de tinción es incompatible con la inmunodetección posterior.

Tinción mediante biotina-estreptoavidina

Este método de tinción se basa en la afinidad de la estreptoavidina por la biotina. Los grupos amino primarios y secundarios de las proteínas unidas a la nitrocelulosa se pueden biotinilar empleando un derivado N-hidroxido succinimida de la biotina que contiene un brazo espaciador hidrofóbico. Un lavado posterior elimina el exceso de biotina y después se bloquea la membrana con una solución de leche en polvo. Las proteínas biotiniladas pueden ser detectadas empleando un complejo preformado de estreptoavidina-enzima y el sistema de detección de la actividad enzimática.

Tinción mediante oro coloidal

Existen productos comerciales como AuroDye-R de Amersham que actúa como colorante para proteínas sobre filtros. Se trata de una solución coloidal estabilizada de oro a pH 3. A este pH las partículas de oro están cargadas negativamente y se unen específicamente a las proteínas. No se puede usar sobre membranas de Nylon pues se une no específicamente a las cargas de la membrana. El color obtenido es rojo oscuro. Existen sistemas de amplificación de señal. Este método tiene una sensibilidad similar al de la tinción con plata de los geles.

Detección específica de proteínas membranas


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En la técnica de Western blot se emplea comúnmente el sistema de inmunodetección indirecta que se representa en la figura. En este método se emplea un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés. Un segundo anticuerpo, marcado con un enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero, se emplea para localizar donde se formaron los complejos antígeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario se puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una señal detectable (por ejemplo una señal sobre una película radiográfica o una mancha de color en el filtro). En ocasiones se emplean en lugar del anticuerpo secundario proteína A o proteína G.

Bloqueo de la membrana

Una etapa común a todos los procedimientos de inmunodetección es el bloqueo, para prevenir la unión no específica del sistema de detección a la membrana, con el riesgo asociado de tener un elevado background o falsos positivos.

Se han descrito numerosas soluciones bloqueantes que han resultado efectivas. El factor esencial a tener en cuenta es elegir un sistema de bloqueo compatible con el sistema de detección empleado. Por ejemplo, las soluciones de bloqueo que contienen leche descremada contienen una gran cantidad de carbohidratos complejos, y por ello deben descartarse cuando se van a emplear anticuerpos que reconocen determinantes en carbohidratos, o por ejemplo se ha de evitar el uso de suero completo si en la detección se emplea proteína A o proteína G.

Las dos soluciones de bloqueo que son compatibles con casi cualquier sistema de detección son las soluciones de leche descremada y las soluciones de albúmina sérica bovina (BSA). También se recomienda el bloqueo en Tween-20 si hay demasiado background. Sin embargo es conveniente usar con cuidado los detergentes no iónicos como Tween-20 pues pueden solubilizar las proteínas transferidas a la membrana.

En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de bloqueo comunmente empleadas :

En la tabla siguiente se recogen algunas de las soluciones de bloqueo más comunmente empleadas :

Soluciones de bloqueo más comunes en 'Western blotting' Agente bloqueante Características

Leche en polvo 5% de leche descremada en PBS /TBS. Muy económico. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antígenos.

Leche / Tween-20 Económico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS - 01% Tween-20. Con poco 'background'. Se deteriora con rapidez. Es posible que tape algunos antígenos.


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Tween-20 0.1% Tween-20, 0.02% azida sódica en PBS/TBS. Económico. Permite la tinción después de la inmunodetección. Puede quedar un 'background' residual.

BSA 3% BSA, 0,02% azida sódica en PBS. Bueno. Relativamente económico.

Suero de caballo 10% suero de caballo, 0,02% azida sódica en PBS. Sin 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con algunos anticuerpos anti-inmunoglobulinas.

Elección del sistema de anticuerpos

El tipo de anticuerpos empleado en la detección de las proteínas transferidos a la

membrana no es determinante. Existen anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser altamente específicos y en general, son más sensibles que los monoclonales. Sin embargo los anticuerpos monoclonales, a diferencia de los policlonales, mantienen siempre sus propiedades de reconocimiento independientemente del lote.

Una vez elegido el anticuerpo a emplear se deben realizar controles en el experimento, como por ejemplo la inclusión de un experimento completo idéntico con sueros pre-inmune (suero negativo) , y sin el anticuerpo primario (sólo el secundario empleado en la detección, para verificar que la técnica no presente pegado inespecífico o cruzado con otras moléculas).

Secundarios / proteína A/ proteína G Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos obtenidos

inoculando en la especie productoras inmunoglobulinas de la especie a detectar (anticuerpos anti-especie). También se emplean los fragmentos Fab2, producidos mediante digestión con pepsina de los anticuerpos puros, y que, al carecer de región Fc no interfieren con algunos componentes de los tejidos que pueden estar presentes en las muestras biológicas complejas, reduciendo el 'background'.

Tanto la proteína A como la proteína G son proteínas que aisladas de la pared celular de bacterias y que tienen la capacidad de unirse a la región Fc de los anticuerpos. Ambas pueden ser marcadas con facilidad con enzimas y otros marcadores. La proteína G tiene una capacidad de reconocimiento más amplia que la proteína A. Elección del sistema de revelado

Existen tres grandes grupos de marcadores o sistemas de revelado empleados en Western blotting:

? Enzimas, que catalizan una reacción en la que se forma un precipitado coloreado, o en la que se emite luz.

? Radioquímicos, que emiten radiaciones ionizantes ? Oro coloidal, que acumulado localmente produce un color rojizo, y que puede

actuar como catalizador para la deposición de plata, con lo que se incrementa la señal.

Enzimas Los dos enzimas más empleados para marcar proteína A o G o anticuerpos son la

peroxidasa de rábano y la fosfatasa alcalina.


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Peroxidasa de rábano (HRP)

La peroxidasa de rábano (HRP) se emplea con gran frecuencia. Se dispone de sustratos que forman un precipitado coloreado así como de sustratos quimioluminiscentes.

La utilización de sustratos colorimétricos se basan en la formación de un

producto coloreado insoluble que precipita sobre la membrana en el lugar de acción del enzima. Este tipo de reacciones es irreversible, ya que una vez formado el precipitado, no puede reutilizarse la membrana.

Se han descrito tres sustratos para la HRP: ? 3,3' diaminobenzidina (DAB)

En presencia de peróxido de oxígeno ls polimerización oxidativa y el ciclado de la DAB por acción de la HRP produce la aparición de un precipitado marron. Se puede intensificar la reacción añadiendo iones de Cobalto o de Niquel, que provocan un cambio de color del precipitado de marrón a gris -negro. La reacción es muy rápida y es fácil que se desarrolle en exceso provocando un elevado 'background' en el filtro. DAB es una molécula de acción carcinogénica y es necesario tomar precauciones para su manipulación. ? 3,3',5,5' tetrametilbenzidina (TMB)

Es un sustrato alternativo para la DAB, más sensible antes de la amplificación con metales. Se forma un precipitado azul. Sin embargo su uso es reducido pues el precipitado es semisoluble en agua y desaparece con facilidad en algunas condiciones. Actualmente se dispone de nuevas formulaciones del sustrato que producen productos más estables. ? 4-cloro-1-naftol En presencia de HRP y de peróxido de hidrógeno el cloronaftol produce un precipitado azul-negro. La reacción es fácilmente controlable, aunque es relativamente insensible cuando se compara con DAB o TMB.

La reacción quimioluminiscente ocurre cuando la energía de una reacción química se emite en forma de luz. Se emplea la peroxidasa de rábano (HRP) para catalizar la oxidación del luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. Inmediatamente después de la oxidación el luminol se encuentra en un estado excitado del que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm, con un máximo de emis ión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción y una emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas. Si esta


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reacción se produce sobre una membrana, y ésta se pone en contacto con una película de autorradiografía, queda impresionada. Este sistema tiene la ventaja de que permite eliminar el sistema de anticuerpos secundarios (striping) y volver a analizar la membrana con otros anticuerpos (reprobing); es decir, s reversible. Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina tiene una acción similar a la peroxidasa de rábano. Se han descrito asimismo sustratos colorimétricos y sustratos quimioluminiscentes.

Los sustratos colorimétricos de la fosfatasa alcalina son : ? Bromocloroindolil fosfato / nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT).

Forma un precipitado azúl-púrpura- Es el resultado de la desfosforilación y posterior oxidación de BCIP a indigo, acoplada a la reacción de NBT a diformazon. La reacción es progresiva lo que facilita el control de la misma ajustando el tiempo de desarrollo. ? Naftol-AS-MX fosfato / Fast red (NAMP/FR) y naftol-AS-BI-fosfato / Fast Red TR

(NABP/FR) Las dos parejas de productos conforman dos sustratos que se transforman en un

precipitado insoluble de color rojo. Este sistema es menos sensible que el anterior (BCIP/NBT) pero el color obtenido tiene un mejor contraste con la membrana. ? AP mistly purple / AP liquid purple.

Son productos comerciales (Amersahm, composición exacta no conocida) con propiedades de sustrato específicas para la fosfatasa alcalina. Se forma un precipitado intensamente púrpura que no desaparece con el tiempo.

El sustrato quimioluminiscente de la fosfatasa alcalina es el 3-(2'spiroadamantane) -4-methoxy-4-(3'phosporyloxy)-phenyl-1,2-dioxetane.

Después de la desfosforilación el producto se acumula como un intermediario inestable que se descompone en adamantane y methymetha-oxybenzoato que pasa de un estado inestable, excitado, a otro estable, relajado, emitiendo luz.

Sistemas radioquímicos de revelado

Para poder detectar las proteínas mediante el uso de isótopos radiactivos es necesario que éstas incorporen este tipo de isótopos. Existen diferentes estrategias para conseguirlo. La elección de una u otra dependerá del objetivo perseguido. Veamos algunos ejemplos :


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? Si el objetivo es detectar las proteínas sintetizadas en un período de tiempo en un sistema celular, el método de elección es el denominado marcaje metabólico, que consiste en la adición al medio de cultivo de las células de aminoácidos marcados (en general se emplean los aminoácidos azufrados cisteína y metionina con el isótopo S35, emisor de radiación beta débil). Las células incorporarán este aminoácido a todas las proteínas que sinteticen durante el período de exposición al trazador.

? Si el objetivo es detectar una proteína

en concreto, el método de elección será inmunoquímico con un sistema de revelado que emplee reactivos radiactivos: anticuerpos secundarios unidos a I-125 o proteína A o G -I125. El proceso de marcaje de una proteína con I-125 se basa en la reacción de Bolton y Hunter que tienes en la figura. De una manera similar se pueden incorporar otros marcajes como el S35.

El revelado se realiza mediante exposición de la membrana ante película autorradiográfica. En este caso, a diferencia de la autorradiografía y fluorografía de los geles de acrilamida no es necesario tratar la membrana con fluoróforos pues la totalidad del marcaje se localiza en la cara más externa de la membrana.

La ventaja de disponer de copias duraderas (película) del experimento es además de la conservación, la posibilidad de realizar densitometrías que permiten obtener valores cuantitativos de la señal obtenida. La densitometría se basa en la medición la densidad de la banda, la que será proporcional a la cantidad de emisión, que a la vez será proporcional a la cantidad de la muestra. Para ello es ideal el sistema de slot blot. En la figura se han recogido algunos ejemplos.


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Tinción mediante oro coloidal Es posible detectar las proteínas fijadas sobre la

membrana empleando anticuerpos que directamente o indirectamente (anticuerpos secundarios o proteína A o G) estén unidos a oro coloidal.

Debido a las características del oro coloidal la interacción antígeno anticuerpo se observa como una señal rosácea de intensidad proporcional a la cantidad de antígeno presente. La señal es tenue y tiende a desaparecer. Por ello se han diseñado sistemas de intensificación de señal que en general se basan en la precipitación de plata metálica en torno al oro coloidal. La reacción de amplificación con plata se basa en la reducción de iones de plata a plata metálica por acción del oro, que actúa como catalizador. Se forma un precipitado marrón oscuro, estable, que incrementa la sensibilidad 10 veces.

La tinción que se obtiene es permanente y casi sin background. El proceso de intensificación de la señal del oro con plata es progresivo y puede ser monitorizado hasta obtener la señal deseada.

Ejemplo de la técnica Western Blot.

En la figura 2 se muestra un ejemplo de esta técnica, donde puede observarse el perfil proteico (2.A) de dos muestras de células tumorales tratadas con un inhibidor de una proteína (Akt) que interviene en una vía de señalización importante para la sobrevida celular y que fueron reveladas con Coomassie Blue. En la figura 2.B se muestran los mismos extractos celulares pero luego de la corrida electroforética las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF y se realizó un western blot incubando con una solución de anticuerpos policlonales contra Akt activado. La banda que se observa en 2.B corresponde a la proteína Akt. Se puede apreciar el efecto del inhibidor sobre estas células por la disminución del tamaño de la banda en la calle del Tratado si se la compara con la muestra Control.

A B

Control Tratado Control Tratado

Figura 2: Comparación entre la visualización de una mezcla de un extracto crudo de proteínas de células tumorales y el reconocimiento de los niveles de una proteína particular del mismo extracto proteico.


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http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/westernblot.htm

Procedimiento:

PARTE I.

Luego de la corrida electroforética, se debe proceder de la siguiente manera:

1. En un tupper colocar el transfer buffer 1x frío con metanol y colocar el cassette, las esponjas y el papel de filtro.

2. Retirar el gel entre los vidrios con cuidado y realizar un lavado con TBS. Reservar hasta el armado del cassette.

3. Activar la membrana con metanol (hasta cubrir) e incubar durante 15 segundos. Realizar 5 lavados rápidos con agua destilada. Colocar en el tupper preparado para armar el cassette de transferencia.

4. Armar el cassette siguiendo el orden: tapa negra, esponja, papel de filtro, membrana, gel, papel de filtro, esponja, tapa transparente. Controlar que no queden burbujas entre los elementos colocados ya que el aire impide la transferencia.

5. Cerrar el cassette y colocarlo en la cuba con más transfer buffer y el refrigerante.

6. Correr a 37 mA durante 30 minutos en agitación. 7. Teñir las membranas con rojo ponceau por 5 minutos. 8. Lavar el colorante con H2Od hasta ver las bandas. Analizar la calidad de la

transferencia visualmente y anotar las observaciones. 9. Una vez que se realizó la transferencia, marcar con lápiz de manera de

identificar el orden de siembra. 10. Dejar en solución de bloqueo (5% de leche en polvo) a 4°C hasta la próxima

clase donde se continúe con la parte II.

PARTE II

1. Realizar 2 lavados de 30 segundos con TBS. 2. Dejarlo en TBS hasta armar las bolsitas. 3. Colocar las membranas en las bolsitas con 2 ml del anticuerpo

correspondiente y sellar evitando que queden burbujas en las bolsitas. 4. Incubar durante 45 minutos a 37°C en agitación. 5. Realizar 3 lavados de 3 minutos con TBS-T. 6. Preparar el segundo anticuerpo que se encuentra unido a peroxidasa con

TBS-T para un volumen final de 3ml por membrana. 7. Incubar las membranas con el segundo anticuerpo durante 20 minutos a

37°C con agitación.


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REVELADO POR LUMINISCENCIA

Para revelar mediante este método se deben preparar dos soluciones en tubos diferentes correctamente rotulados.

Solución 1:

-100 ul de Luminol -44 ul de ácido p-cumárico -1 ml de Tris- HCl 1M pH 8.5 -H2O a 10 ml

Solución 2 :

-6.1 ul de H2O2 -1ml de Tris-HCl 1M pH 8.5 -H2O10 ml En oscuridad:

Unir ambas soluciones y colocar la membrana asegurando que el líquido cubra perfectamente toda la membrana. Incubar durante 3 minutos.

Retirar la membrana y colocarla dentro del casete. Colocar la placa fotográfica y revelar.

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