Estudio de proteínas musculares por Western blot y técnicas de

genética aplicadas a las enfermedades neuromusculares: PCR,

RFLP y secuenciación

Cádiz, 21-24 Mayo 2013 - XXVI Congreso Nacional de la SEAP-IAP, XXI Congreso Nacional de la

SEC, II Congreso Nacional de la SEPAF

Dra. IRENE VIÉITEZ GONZÁLEZ

Servicio de Anatomía Patológica y Neuropatología – Hospital Meixoeiro

Complejo Hospitalario Universitario de Vigo (CHUVI)

Instituto de Investigación Biomédica de Vigo

Consideraciones generales sobre ácidos

nucleicos y proteínas

FUNDAMENTO CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

• La información genética, contenida en el ADN, se mantiene y es trasferida a su descendencia por su

capacidad de REPLICACIÓN

•El ADN transfiere la información al ARN mediante la TRANSCRIPCIÓN en el núcleo.

•El ARN mensajero se desplaza al citoplasma con la información del ADN y, mediante la

TRADUCCIÓN, sintetiza las proteínas

•Las proteínas son las encargadas de desarrollar las diferentes funciones de las células

Transcripción Traducción

ADN ARN Proteína

Replicación

Núcleo Citoplasma

• Excepciones:

- Retrovirus Transcripción inversa (transcriptasa inversa)

- Virus de ARN Duplicación del ARN (ARN polimerasa)

- Ribozimas: ARN con propiedades autocatalíticas, que son capaces de modificarse y replicarse por si mismos.

- Priones: Proteínas que se autoreplican

- NUCLEÓTIDOS de desoxirribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Timina (T)

- ENLACE FOSFODIÉSTER

- Dirección 5’ 3’

- Estructura en DOBLE HÉLICE y ANTIPARALELA

- COMPLEMENTARIEDAD:

A – T (2 puentes de H2) / G – C (3 puentes de H2)

ADN: Ácido didesoxirribonucleico

Nucleótido

- NUCLEÓTIDOS de ribosa: Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C) y Uracilo (U)

-De cadena sencilla (5’ 3’) : MONOCATENARIO (excepto reovirus)

- Complementariedad con el ADN molde (la Adenina se combina con Uracilo) TRANSCRIPCIÓN

- Tipos de ARN Distintos papeles en la transmisión de la información

ARN Mensajero: sirve de molde para la síntesis de las proteínas y transporta la información

desde el DNA (núcleo) hasta el centro de producción de la síntesis proteica (ribosoma)

ARN Ribosómico: forma parte de los ribosomas que llevan a cabo la traducción

ARN Transferente: sirve para el transporte de los aminoácidos específicos desde las reservas

citosólicas hasta los ribosomas y aseguran su correcto alineamiento

Otros ARNs se emplean en la elaboración del RNA y en la exportación extracelular de

proteínas

ARN: Ácido ribonucleico

RNA de transferencia

(tRNA)

RNA ribosomal

(rRNA)

RNA mensajero

(mRNA)

- Combinación de AMINOÁCIDOS (20 diferentes)

- Compleja organización estructural: Cadena aminoacídica > Estructura cuaternaria (Complejo proteico)

- Funciones muy diversas: Estructurales, Enzimas, Receptores, Hormonas, Anticuerpos…

LAS PROTEÍNAS

Relación entre la secuencia de nucleótidos del ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína

EL CÓDIGO GENÉTICO

Organizado en tripletes o CODONES: cada

tres nucleótidos corresponden a un

aminoácido.

Los codones TAA, TAG y TGA indican la

parada de la síntesis proteica.

DEGENERADO: existe más de un triplete

que codifica por el mismo aminoácido.

ESPECÍFICO: ningún codón codifica más de

un aminoácido

CONTÍNUO: el cuadro de lectura de los

tripletes se realiza sin espacios en sentido 5’-3’

desde el codón de inicio hasta el de parada.

UNIVERSAL: el mismo triplete en diferentes

especies codifica para el mismo aminoácido.

Unidad física y funcional básica de información contenida en el ADN

¿ Qué es un Gen?

Exón: Región del gen que se mantiene en el ARN mensajero tras su maduración (Splicing). Parte

codificante del gen

Intrón: Región del gen que no se mantiene en el ARN mensajero tras el proceso de Splicing. Parte no

codificante del gen.

GEN

Maduración del

ARNm

En organismos diploides es cada una de las dos copias del gen presente en su genoma

¿ Qué es un Alelo?

ALELO DOMINANTE: Alelo que enmascara la expresión fenotípica del otro alelo del mismo locus.

ALELO RECESIVO: Alelo que para expresarse debe estar en ambos locus.

HOMOCIGOTO: Los dos alelos iguales para un locus.

HETEROCIGOTO: Los dos alelos distintos para un locus.

MUTACIÓN: Tipos de mutaciones

MUTACIONES PUNTUALES: Se produce el cambio de un único nucleótido

“Missense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por otro distinto.

“Nonsense”: Variación de un nucleótido que conlleva el cambio de un aminoácido por un codón de parada

(TAG, TAA o TGA).

Cambio en la información genética que puede ser transmitido a la descendencia

MUTACIONES FRAMESHIFT (Cambio en la pauta de lectura): Se produce un cambio total en el

sentido del mensaje genético a partir del sitio de la mutación. Se sintetiza una proteína inactiva, a menudo

truncada.

Se debe a: DELECIONES, INSERCIONES, INDELS, DUPLICACIONES

MUTACIONES IN-FRAME: Si el cambio afecta a un triplete o varios, la proteína solo pierde los

aminoácidos implicados.

MUTACIONES DE SPLICING (de corte y empalme) : Mutaciones que alteran el proceso de maduración

de los ARNm generando transcriptos alterados que codifican por proteínas truncadas.

5’ ACTGCATTTAGC 3’

T A F S

Secuencia normal

5’ ACTGCATCTAGC 3’

T A S S

Secuencia mutada

5’ AGCTGCAGCAAT 3’

S C S N

Secuencia normal Secuencia mutada

5’ AGCTGAAGCAAT 3’

S X

Patrones de Herencia Genética

Herencia Autosómica Dominante Herencia Autosómica Recesiva

Herencia Ligada a X dominante Herencia ligada a X recesiva

ANÁLISIS GENÉTICOS:

Extracción de ácidos nucleicos

PCR y PCR-RFLP

Secuenciación

Extracción ADN: Método de extracción por Fenol-Cloroformo

Lisis de la muestra

Protección del ADN y eliminación

de material proteico y lipídico

Precipitación o concentración

Eliminación de inhibidores

de las reacciones sucesivas

Biopsia músculo Sangre en EDTA Otros tejidos

• Tampón de Lisis de Rojos

• Tampón de lisis de Blancos

• Proteinasa K

• SDS

• Lavados con Fenol

• Lavados con Cloroformo

•Isopropanol

•NaCl, EtOH

•Lavados con EtOH 70%

•Secado

Resuspensión

Cuantificación

• H2O o TE

• Espectrofotometría

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

• Consiste en la replicación de un fragmento de ADN de forma sucesiva Crecimiento exponencial

• Tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar y manipular el fragmento de ADN a análisis

• ADN molde (20ng-1μg)

• Cebadores específicos (Primers)

• Nucleótidos (dNTPs 0.8 mM)

• DNA-Polimerasa

• MgCl2 (1.5-4 mM)

• Tampón

• ddH2O

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

• PCR-MULTIPLEX: Amplificación con varios sets de primers de un ADN molde Productos de

distintos tamaños.

- Detección rápida de deleciones en un gen (Distrofina, 1988)

Análisis de una PCR: Electroforesis de Agarosa

• Técnica para separar fragmentos de ADN mediante la aplicación de un campo eléctrico

• El ADN tiene carga negativa por lo que se dirigirá al polo positivo

• Separación de los fragmentos de ADN en función del peso molecular

• Visualización por unión ADN – Bromuro de Etidio

• También permite cuantificar y/o aislar el producto de PCR

1 2 3

PCR SIMPLE PCR MULTIPLEX

RFLP: Restriction fragment length polymorphism

• Estudio de una mutación conocida

• Identificación de mutaciones en el fragmento amplificado utilizando enzimas de restricción (ER)

y analizando los productos en gel de agarosa

• Las ER cortan la cadena de ADN en sitios específicos dando un patrón de bandas característico

• La presencia de una mutación modifica este patrón de bandas

M N HT HM

576 bp

364 bp

212 bp

5’GCGACCTCTTCAACCTCTCGGCGCCCCTGGCCCGGCCGGT

GGGCACCAGCCTCTTTCTGCAGACCGCCCTTCGCGGCTGGGC

GGTGCAGCTGCTGGACTTGACCTTCGCCGCGGCGCGCCAGCC

CCCGCTGGCCACGGCCCACGCGCGCTGGAAGGCTGAGCGCGA

GGGACGCGCTCGGCGGGCGGCGCTGCTCCGCGCGCTGGGCAT

CCGCCTAGTGAGCTGGGAAGGCGGGCGGCTGGAGTGGTTCGG

CTGCAACAAGGAGACCACGCGCTGCTTCGGAACCGTGGTGGG

CGACACGCCCGCCTACCTCTACGAGGAGCGCTGGACGCCCCC

CTGCTGCCTGCGCGCGCTGCGCGAACCGCCCGCTATGTGGTG

GGCGTGCTGGAGGCTGCGGGCGTGCGCTACTGGCTCGAGGGC

GGCTCACTGCTGGGGGCCGCCCGCCACGGGGACATCATCCCA

TGGGACTACGACGTGGACCTGGGCATCTACTTGGAGGACGTG

GGCAACTGCGAGCAGCTGCGGGGGGCAGAGGCCGGCTCGGTG

GTGGATGAGCGCGGCTTCGTATGGGAGAAGGC 3’

Bfa I Fragmento amplificado: 576bp

Sustitución de C > A

212bp

364bp

SECUENCIACIÓN DEL ADN

La secuenciación permite realizar un análisis en profundidad del ADN y desvelar la

información básica presente en el fragmento a estudio

La secuenciación automática:

• Método de Sanger DIDEXOSINUCLEÓTIDOS

• Pasos de la reacción de Secuencia:

I. Purificación del producto PCR Exosap ®

II. Amplificación con un solo primer, ADN

polimerasa, dNTPs + ddNTPs (Big Dye®)

III. Desnaturalización de los fragmentos

IV. Separación por electroforesis capilar

V. Lectura de la secuencia

REACCIÓN DE SECUENCIA

96° 1’

96° 10’’

50° 5’’

60° 4’

4° ∞

25 ciclos

SECUENCIACIÓN DEL DNA

Heterocigoto

CÓDIGO DE COLOR:

ADENINA

TIMINA

GUANINA

CITOSINA

ALELO 1 C

ALELO 2 T

ALELO 1 T

ALELO 2 T

ALELO 1 C

ALELO 2 C

Normal

Homocigoto

SECUENCIACIÓN DEL DNA

ANÁLISIS DE PROTEÍNAS:

Western Blot

WESTERN BLOT

Técnica analítica para detectar proteínas específicas en extractos celulares o de tejido

Obtención y preparación de la muestra

Separación por electroforesis

Trasferencia de proteínas

Immunoblot

Revelado

Análisis de Resultados

Obtención y preparación de la muestra

Etapas:

• Toma de la muestra (músculo – 20µg)

• Lisis (Solución PIK + Inhibidores)

• Homogenización

• Sonicación

• Separación de las fracciones de interés (Centrifugación)

• Desnaturalización para SDS-Page (Adicción del tampón de Leemli

y ebullición)

• Separación de las proteínas aplicando un campo eléctrico

• Gel de Poliacrilamida Rápido y Versátil (Acrilamida/Bisacrilamida)

• Gel Desnaturalizante (SDS- Page): Pérdida de la estructura 3D

• Tampón de Electroforesis Mantener pH constante

• Discontinua

Gel Concentrador: < %Acrilm+Bisacrilm

pH 6.8 (+ácido)

Gel Separador: > %Acrilm+Bisacrilm

pH 8.8

Las proteínas se

separan solamente

en función de su

PESO

MOLECULAR

WESTERN BLOT: Separación por electroforesis

WESTERN BLOT: Transferencia de proteínas

• Gel Poliacrilamida Membrana de Nitrocelulosa o PVDF

• Accesibilidad de las proteínas a su detección con Anticuerpos

• Electrotransferencia:

- Sandwich: Filtro – Gel – Membrana – Filtro

- Tampón de Transferencia

- Corriente eléctrica: Cátodo (+) Ánodo (-)

Gel

Poliacrilamida

Membrana

Nitrocelulosa

Anticuerpo primario

Anticuerpo secundario

Bloqueo

Detección

Leche en polvo o BSA

en tampón TTBS

Monoclonoal o Policlonal

Dilución 1:200-1:2000

Tiempo de incubación

Reconoce la inmunoglobulina de la

especie en el que se ha producido el

primario. Son conjugados con un

sistema de revelación (HRP o AP)

Reacción de un sustrato (ej. luminol)

catalizada por la Horseraddish peroxidase

con emisión de luz.

WESTERN BLOT: Inmunoblot

•Se compara la altura de la banda obtenida con un marcador de pesos moleculares para confirmar que

hemos detectado el producto de interés.

•Cuando es necesario valorar la cantidad de proteína para comparar la expresión en diferentes tejidos o

pacientes es necesario realizar una comparación con una proteína endógena cuya expresión no varia en

las diferentes muestras (GAPDH, IgG, Actina).

WESTERN BLOT: Análisis de Resultados

Aplicación al estudio de

Enfermedades Neuromusculares

ENFERMEDADES NEUROMUSCULARES

DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Historia clínica

Datos paraclínicos Biopsia muscular

Laboratorio Miopatología

Disección – Orientación

Congelación M/E

Inmunogold

Histoquímica

Inmunohistoquímica

Microscopía Confocal

Extracción de DNA

PCR multiplex

PCR-RFLP

Secuenciación

Otras

Banco de DNA

Cortes criostato

DIAGNÓSTICO Consejo genético

Wb

Bioquímica

+

Sangre

Banco de

Tejidos

DISTROFINOPATÍAS

Distrofina: Nexo de unión entre citoesqueleto y matriz extracelular

1987: Gen DMD localizado en Xp21 => 79 exones

Herencia ligada a X recesiva: Mujeres portadoras y hombres afectos

Estudio de exones de zona caliente del gen

PCR multiplex detecta más del 95% de las

deleciones en DMD

PCR MULTIPLEX

WESTERN BLOT

1 2 3 4 5 6 7 8

427 kDa

Expresión de la Distrofina

Fenotipos:

Distrofia muscular de Duchenne

Distrofia muscular de Becker

PCR I

Exón 45

PCR II

Exón 47

Exón 48

Exón 44

1 2 1 2

DMD DMB DMB

DISTROFIAS DE CINTURAS

LGMD1C: Caveolinopatía

Caveolina 3 (21kDa): Proteína integral de membrana para la

formación de caveolas en el músculo

Gen CAV3 (3p25) => 2 exones

Herencia AD: Heterocigoto Afecto

A45T (exón 2)

Control Heterocigoto Control Heterocigoto

R26Q (exón 1)

SECUENCIACIÓN

LGMD2C: Gamma-sarcoglicanopatía

Gen SGCG (13q12) => 8 exones

Gamma-sarcoglicano: 35kDa

Etnia Gitana: Elevada prevalencia mutación C283Y (mutación fundacional)

Población Mediterránea: Elevada prevalencia mutación del521T

C283Y → Rsa I

PCR-RFLP SECUENCIACIÓN

del521T (exón 6)

Control

Homocigoto Heterocigoto

GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle

• Glucogenosis más frecuente

• Miofosforilasa: Degradación del glucógeno

• PYGM (11q13) 20 exones

• Herencia AR

• Gran heterogeneidad alélica

3Indels

2Duplicaciones

2Grandes Deleciones

15Pequeñas Deleciones

1Pequeñas Inserciones

9Splicing

69Missense/nonsense

Nº TotalMUTACIÓN

3Indels

2Duplicaciones

2Grandes Deleciones

15Pequeñas Deleciones

1Pequeñas Inserciones

9Splicing

69Missense/nonsense

Nº TotalMUTACIÓN

“ nonsense” R50X ( exón 1)

Arginina > Stop (CGATGA)

Mutación más frecuente

“missense” W798R (exón 20)

Triptófano > Arginina (TGGCGG)

Mutación privada de España

(2ª mutación más frecuente) “ missense” G205S ( exón 5)

Glicina > Serina (GGCAGC)

2ª mutación más frecuente

en la población general

MUTACIONES MÁS FRECUENTES

R50X, W798R y G205S

78% alelos mutantes en pacientes

españoles

1: Marcador peso molecular 4: Caso Homozigoto

2: Producto PCR sin digerir 5: Caso Heterozigoto

3: Caso Normal

PCR-RFLP: Análisis de las mutaciones R50X, W798R y G205S

TGG > CGG

Trp > Arg CGA > TGA

Arg > Stop

GGC > AGC

Gly > Ser

Nonsense R50X

Exón 1

Missense W798R

Exón 20

Missense G205S

Exón 5

GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle

Inserción en el Exón 8

Inserción T entre nucleótidos 892-893

Alteración pauta de lectura

Codón de parada prematuro

35 aminoácidos después

SECUENCIACIÓN

Secuencia normal: 5’ GAGTATTTCGTGGT… 3’

Secuencia mutada: 5’ GAGTTATTTCGTGG… 3’

Tyr Phe Val

Leu Phe Arg

GLUCOGENOSIS II: Enfermedad de Pompe

Maltasa ácida (105kDa): Degradación glucógeno lisosomal

Gen GAA (17q25) 20 exones

Herencia autosómica recesiva

Diagnóstico Prenatal:

CONCLUSIONES

• CONFIRMACIÓN Y EXACTITUD EN EL DIAGNÓSTICO

• MÉTODO DIAGNÓSTICO NO INVASIVO

•DETECCIÓN PRECOZ DE LA ENFERMEDAD

•DETECCIÓN DE HETEROCIGOTOS Y FAMILIARES AFECTOS

•CONSEJO GENÉTICO:

- Prevención de futuros casos

- Diagnóstico prenatal o preimplantacional

•CONOCIMIENTO DEL DEFECTO MOLECULAR:

- PRONÓSTICO (correlación genotipo – fenotipo)

- POSIBLES TERAPIAS GÉNICAS

Muchas Gracias por su atención

Grupo de Neurociencias NC-CHUVI Instituto de Investigación Biomédica de Vigo (IBIV)

Investigadores:

• Saida Ortolano

• Susana Teijeira • Irene Viéitez • Beatriz San Millán • Carlos Spuch

Personal de apoyo:

• Olga Souto

• Soraya Barrera • TaniaVázquez-Santos

Coordinadora: Carmen Navarro

DIAGRAMA GENERAL DE ESTUDIO GENÉTICO

Muestra biológica

DNA

Producto de

PCR

RESULTADO

Reacción Secuencia Digestión (ER)

Extracción DNA

PCR

(Polymerase chain reaction)

Análisis por RFLP

(Restriction fragment length

polymorphism)

Análisis por

Secuenciación

DISTROFIAS DE CINTURAS

ENFERMEDAD LOCUS (OMIM) PROTEÍNA MW (kDa) LOCALIZACIÓN

LGMD1A 5q31 Miotilina 57 Sarcómero

LGMD1B 1q21 Laminina A/C 74/65 Membrana Nuclear

LGMD1C 3p25 Caveolina 3 17 Transmembrana

LGMD1D 7q Desmina 53 Citoplasma

LGMD1E 6q23 DNAJB6 37 Citoplasma/Disco Z

LGMD1F 7q32.1 TPNO-3 104 Membrana Nuclear

LGMD1G 4q21 (Starling et al. Europ J Hum Genet 2004; 12: 1033-1040)

DISTROFIAS DE CINTURAS

ENFERMEDAD LOCUS (OMIM) PROTEÍNA MW (kDa) LOCALIZACIÓN

LGMD2A 15q15 Calpaina 3 94 Citoplasma

LGMD2B 2p13 Disferlina 230 Membrana

LGMD2C 13q12 - sarcoglicano 35 Transmembrana

LGMD2D 17q11-q12 -sarcoglicano 50 Transmembrana

LGMD2E 4q12 -sarcoglicano 43 Transmembrana

LGMD2F 5q33-34 -sarcoglicano 35 Transmembrana

LGMD2G 17q11-q12 Teletonina 19 Sarcomérica

LGMD2H 9q31 TRIM32 72 Citoplasma

LGMD2I 19q13 FKRP 60 Aparato de Golgi

LGMD2J 2q 24-31 Titina 4200 Sarcomérica

LGMD2K 9q34 POMT1 (Balci et al. Neuromusc Disord 2005; 15: 271-275)

LGMD2B: Disferlinopatía

Disferlina (230kDa): Mantiene la integridad del sarcolema

Gen DYSF (2p13) => 55 exones

Cierta correlación Genotipo – Fenotipo:

1 2 3 4

230 kDa

WESTERN BLOT

Fenotipos:

LGMD2B

Miopatía distal de Miyoshi

DMAT

GLUCOGENOSIS V: Enfermedad de McArdle

11 mutaciones

M1V

M1L

L5RfsX20

L5Vfs

V16Ffs

E26Afs

L36R

H37QfsX33

R50X Y53X

A55GfsX21

Q73Hfs

L116P

E125X

L132WfsX163

N134Kfs

G136D

R139W

R194W

G205S G205D

R270X E337R

E349K

L354P

W362X

R428C

G449R

S450L

A452Rfs

G455R

V456M

P454_L464

D511Tfs

D534Vfs

R590H

F599Lfs

R602W

R602Q

K609K

A660D

D662A

Q666E

A670V

N685Y

G686R

G686R

A687P

T692Kfs

A704V

G705Rfs

F710del

R715W

C784X

Q785X

I83F

Y85X

R94Q

R94W

N102Dfs

L153R

L153P

G157V

G159R

R161C

G174D

P230R

V239del

S246P

L292P

Y298Lfsx35

A364V

A365E

W366X

T379M

E383K

A384D

E386Afs

W388Sfs

L397P

G486D

T488N

T488I

R490W

R490Q

R490Afs

R491C

W492X

V494Sfs

E541X

K543T

K543X

R570W

R570Q

Y574X

K575E

R576X

Q577R

L587P

R650EfsX8

R650X

E655K

Y733X

K754Nfs

Q755X

R771Q

E796Vfs

W798R T808P

S809FfsX6

D815A

W826S

c.855 +1G>C c.1092 +1G>A

c.1239 +1G>A

c.1768 +1G>A

c.1970-2177del

c.2380 -1G>A

Hotspots in exons 1, 14 y 17

(32% mutations) 12 mutaciones

14 mutaciones

c.681 -2A>G

c.1000 -1G>T

c.1769 -1G>A

23 nuevas mutaciones

Deleción 5 nucleótidos

Alteración pauta de lectura

Codón de parada prematuro (PTC)

21 aminoácidos después

Deleción T14

Alteración pauta de lectura

Codón de parada prematuro (PTC) 20

aminoácidos después

SECUENCIACIÓN

PYGM

GLUCOGENOSIS IIb: Enfermedad de Danon

• LAMP2 Xq24

• Herencia dominante ligada a X

• 9 exones

• Splicing alternativo exón 9:

- Isoforma LAMP2a

- Isoforma LAMP2b Músculo estriado y cerebro

MUTACIÓN Nº Total

Sustituciones nucleotídicas

(Missense/Nonsense) 10

Pequeñas Inserciones 3

Pequeñas Deleciones 9

Grandes Deleciones 5

Splicing 10

Small Indel 1

Q359PfsX13 (c.1074InsC)

Secuencia Normal Secuencia Mutada

Viéitez I et al. Human Genetics 2008.