prueba de elisa fundamentos

7/23/2019 Prueba de ELISA Fundamentos

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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL

ECUADORFACULTAD DE CIENCIASMEDICAS

ESCUELA DE MEDICINA

CATEDRA DE BIOLOGIA MOLECULAR

TEMA: ELISA

PERIODO 2015


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ELISA

La palabre proviene del

acrnimo en ingls Enzyme-

Linked ImmunoSorbent

Assay, Ensayo porIn!noa"sor#$%n L$&a'o aEn($as)


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EN 1960 Rosaln !alo" ! #alomon $erson, desarrollaron

el R%&%' (Radioinmnoensao) *e+eccin de 'gs o 'cs marcados con radioisopos La radioac+ividad proporciona na seal -e indica si

n 'g o 'c espec./ico es+ presen+e en la mes+ra% #e bscaron o+ras al+erna+ivas segras para el medio

ambien+e, -e no perdicarn la sald, de menor

cos+o, sencilla prc+ica

E%&%' En2ima inmnoensao se desarrollo

independien+emen+e por #+ra+is 'vrameas 3ierce% 4sa la nin de 'cs a los 'gs para iden+i/icar medir

ss+ancias, por colorime+r.a%

An)*#*'*n)*s


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Los an+.genos son, por de/inicin,

generadores de an+icerpos%

&nclen pro+e.nas, polisacridos

varias molclas pe-eas, -e

es+imlan la prodccin dean+icerpos%

Los an+.genos son, a mendo,

molclas -e se de/inen como (no

propias) o e5+raas, para elorganismo%

a (an+.genos propios) -e ac+7an

como e+i-e+as de iden+i/icacin

An)+&*nos


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#on la respes+a del organismo an+e lapresencia de n agen+e in/eccioso%

Los an+icerpos son molclas pro+eicas

secre+adas por los plasmoci+os, +ienen

na al+.sima a/inidad por ss an+.genos

correspondien+es% 'n+icerpos se carac+eri2an por8 #er *e/ensa na+ral :ener 4+ilidad +erap+ica :ener 4+ilidad *iagns+ica ;arcador de &n/eccin o

E5posicin% *e+eccin de an+.genos

Los an+icerpos +ili2ados en el m+odo

EL' son de origen monoclonal o

policlonal%

An)$#!*rpos


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ELISA Es na +cnica de inmnoensao en cal n 'g o 'c

inmovili2ado se de+ec+a median+e n an+icerpo enla2ado a

na en2ima capa2 de generar n prodc+o de+ec+able al

cambiar de color


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ELISA

#e sa para de+erminar si n an+icerpo

o an+.geno en par+iclar es+ presen+e

en na mes+ra de es+dio%


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ELISA

La in+eraccin an+.geno=

an+icerpo en el labora+orio

pede ser +ili2ada para

de+erminar si n pacien+e +ienena in/eccin o na en/ermedad

a+oinmne%

3ero como preba diagns+ica,

posee diversas limi+aciones -e

conviene conocer8


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LIMITACIONES

1% Resl+ado posi+ivo para an+icerpos no signi/ica -e

necesariamen+e el pacien+e es+a en/ermo

>% &nmnospresin pede dar n /also nega+ivo o pede

es+ar en na vena+ana inmnolgica dar /also

nega+ivo

?% &nespeci/icidad en+re an+.geno = an+icerpo


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VENTANA INMUNOL,GICA

El +iempo -e +ranscrre en+re el momen+o de

la con+aminacin por n virs la prodccin

de an+icerpos s/icien+es para ser de+ec+ados

en la serolog.a es llamado de -*n)ana$n!no.%&$#a% 3or lo +an+o, cando decimos-e n e5amen +iene na ven+ana inmnolgica

de ? meses, eso signi/ica -e el e5amen slo

dar posi+ivo ? meses desps de -e elpacien+e @aa en+rado en con+ac+o con el

de+erminado virs o bac+eria%


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EL'

:ambin, debemos +ener en cen+a -e cando

se +ra+a de diagnos+icar na en/ermedad -e

posee n valor predic+ivo posi+ivo bao en nade+erminada poblacin, es necesario volver a

con/irmar el resl+ado posi+ivo median+e o+ro

m+odo de diagns+ico independien+e%


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ELISA

Normalmen+e, se lleva a cabo n western blotdonde sede+ec+a la presencia de varios an+icerpos


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ELISA

El resl+ado del "es+ern se considera posi+ivo candoaparecen al menos A bandas, -e indica -e A an+icerpos

di/eren+es es+n presen+es en el se+o /ren+e a esa in/eccin%

Es en+onces

cando se

diagnos+ica comoposi+ivo a dic@o

pacien+e%


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EL' *isposi+ivos empleados en EL'

L*#)or*s ELISA%

#e san desde +bos decris+al desde los masan+igos @as+a las

ac+ales microplacas de 96pocillos de pls+ico +ra+ado

para amen+ar scapacidad de adsorcin

(en s sper/icie) demolclas, con /ondos depocillo p+icamen+e claros-e permi+an reali2ar las

medidas de densidadp+ica en ins+rmen+os

espec./icos

'c+almen+e disposi+ivos

de maor capacidad B

con ?CD 1A?6 pocillos

B para los

screeningmasivo de los

sis+emas robo+i2ados


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EL'

*isposi+ivos empleados en EL'


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Los lec+ores EL' sonespec+ro/o+me+ros capaces de

reali2ar lec+ras seriadas de cada node los pocillos de la placa EL'%


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' di/erencia de n

espec+ro/o+me+roconvencional, con capacidadde leer +odas las longi+desde onda del l+raviole+a elvisible de manera con+ina,

los lec+ores de EL'disponen de sis+emas de/il+ros -e solo permi+en la

lec+ra de na o pocaslongi+des de onda


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Con)ro.*s

#e +ili2an para asegrar -e la preba es+a /ncionando

correc+amen+e

Control POSITIVO

&nclen na ss+ancia -e se sabe -e reaccionara

posi+ivamen+e, proporcionando as., n pa+rn sobre el cal

basar los resl+ados%

Control NEGATIVO

&nclen ss+ancias -e no deben reaccionar%


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T$pos '* ELISA

Los /)o'os '* ELISA '*p*n'$*n'o '* .aa#)$-$'a' *n($)$#a s* '$-$'*n *n 'os )$pos:

1 Cop*)$)$-os

2 No #op*)$)$-os


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ELISA COMPETITIVO:

El an+icerpo de la mes+ra va

a compe+ir con el congado

por n n7mero limi+ado desi+ios de nin del an+.geno%

abr asencia de color en

na mes+ra posi+iva debido a

-e el ss+ra+o no encon+rar a

la en2ima por-e el congado

@a sido despla2ado por el

an+icerpo presen+e en la

mes+ra

T$pos '* ELISA


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T$pos '* ELISA

ELISA O COMPETITIVO:

#i na mes+ra es posi+iva se /ormar

el compleo an+.geno=an+icerpo al

agregar el congado reaccionar con

el respec+ivo ss+ra+o dando color

*en+ro de los no compe+i+ivos

+enemos8

Los direc+os -e de+ec+an an+.genos

Los indirec+os -e de+ec+an

an+icerpos


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Fas*s '*. ELISA In'$r*#)o F$a#$%nal sopor+e insolble de an+.genos espec./icos para

los an+icerpos obe+o de es+dio% La-a'opara eliminar losan+.genos /iados de/icien+emen+e o no /iados% A'$#$%n del sero problema, de +al /orma -e ss

an+icerpos reaccionarn espec./icamen+e con los an+.genos

/iados al sopor+e% La-a'o para eliminar los an+icerpos

marcados -e no @aan reaccionado%


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Fas*s '*. ELISA In'$r*#)o A'$#$%nde an+i=an+icerpos congados con na en2ima, los cales

reaccionan con los an+icerpos espec./icos aadidos en el pasoan+erior -e se encen+ran /iados a los an+.genos% La-a'o paraeliminar los an+i=an+icerpos marcados -e no @aan reaccionado%

A'$#$%n de n sbs+ra+o sobre el -e sea capa2 de ac+ar laen2ima marcadora% #e pede parar la reaccin si se desea%

L*#)!ravisal o colorim+rica del prodc+o /inal coloreado


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Leenda

'n+.geno

'n+icerpo

3rimario

'n+icerpoLigado a En2ima

#s+ra+o

Pr!*"a ELISA In'$r*#)a


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:ipos de ensaos

(EL' #'N*&F)


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Ap.$#a#$on*s '*. ELISA

D*)*##$%n '* an)+&*nos o an)$#!*rpos:

Girs

ongos3arsi+os

$ac+erias%

D*)*##$%n '* a!)oan)$#!*rpos:

&g< (Hac+or rema+oideo)

*N'

3ro+e.na del n7cleo


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Ap.$#a#$on*s '*. ELISA

M*'$#$%n '* 3oronas:

Pro&*s)*rona4 *s)r%&*nos4 #or)$so.4

$ns!.$na4 )*s)os)*rona4 &ona'o)rop$na#or$%n$#a !ana4 TS3

D*)*##$%n '* an)+&*nos )!ora.*s:

An)+&*no pros))$#oA.6a76*)opro)*+naAn)+&*no '*. o-ar$o

An)+&*no #ar#$no*"r$onar$o


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Ipor)an#$a

En es+dios serolgicos, @ema+olgicos,

endocrinolgicos, oncolgicos, en los

+ransplan+es, la medicina /orense la

an+ropolog.a%

Los resl+ados apor+an elemen+os

diagns+icos, in/ormacin de na en/ermedad coadvan en la plani/icacin del +ra+amien+o


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Fonsideraciones

Fora#$%n '* !na o s #apas '*$n!no#op.*os

Es el ensao de compe+icin del an+.geno% En es+a e+apa es mimpor+an+e con+rolar los /ac+ores +iempo +empera+ra deincbacin para evi+ar la aparicin de /alsos nega+ivos%

En el caso del +iempo, si es in/erior a 1A min+os, no ocrrir lain+eraccin an+.geno=an+icerpo el color no ser eviden+e al /inal del

ensao, dando n /also nega+ivo%

3or s par+e, si la +empera+ra de incbacin es m baa, la /ormacin

del compleo an+.geno=an+icerpo +ampoco se comple+ar en el +iempoes+ablecido,

;ien+ras -e si la +empera+ra es m al+a, las pro+e.nas (an+.geno an+icerpo) se desna+rali2an , por +an+o, disminen s capacidad

para in+eraccionar, dando igalmen+e /alsos nega+ivos%


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Fonsideraciones

R*-*.a'o '* .a r*a##$%n *n($)$#a

*esps de n lavado paraeliminar +odas las molclasmarcadas no /iadas en /orma deinmnocompleos, se aade elss+ra+o en2im+ico en solcin% #edea reaccionar se lee ladensidad p+ica median+eespec+ro/o+ome+r.a%


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L*#)or ELISA


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Con!&a'o: En($aLa en2ima escogida como marcador debe8

4nirse /cilmen+e a an+.genos an+icerpos,

Encon+rarse en es+ado pro a n precio ra2onable

:ener n sbs+ra+o cromognico o /lorognico convenien+e de /cil

preparacin%

Las en2imas ms

+ili2adas son /os/a+asalcalina, pero5idasa de

rbano I=galac+osidas


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ELISA DE CUARTA GENERACI,N

&den+i/icar an+icerpos con+ra el G& mspreco2men+e, sino +ambin inves+iga el an+.geno

3>D, na pro+e.na e5is+en+e en el virs G&%

El EL' DJ generacin es, por lo +an+o, n e5amen

doble -e bsca an+icerpos al propio virs%

Gen+ana inmnolgica de D semanas (en algnos

casos en @as+a > semanas)%

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