Practica 6Inmunoelectrotranferencia

Rocio Sarahy Carrillo LlanosSharon Carolina Carvajal CruzNorma Sánchez UrreaGiselle Sarahi Tapia Ante

Electroforesis• La electroforesis es una técnica para la separación de

moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica

Electroforesis• El soporte más utilizado para analizar las

mezclas entre proteínas u otras sustancias, es el gel; el cual suele estar constituido por agar, u otras sustancias, como la poliacrilamida.

Electroforesis

• Alta sensibilidad, resolución y versatilidad• Metodo de separación de: -Acidos nuclicos -Proteínas• Separa mezclas complejas• Permite determinar:-El peso molecular de una proteína-El punto isolectrico• Migracion de solutos en un campo eléctrico• Se mueven las partículas en base a:-Su carga neta-Peso molecular -Estructura tridimensional

Inmunoelectrotransferencia

• Esta técnica también es conocida como Inmunoblotting o Western blot.

• Es posible la identificación de una proteína específica en un mezcla compleja de proteínas.

• En la Western blotting, una mezcla de proteínas se separa por medios electroforéticos en un

• gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE)• un gel en placa con infusión de dodecilsulfato sódico (SDS)• un agente de disociación

Las bandas de proteínas se transfieren a una membrana de nitrocelulosa mediante electroforesis, y las bandas individuales de proteína se identifican al inundar la membrana de nitrocelulosa con anticuerpo policlonal o monoclonal radiomarcado o unido a enzimas específico para la proteína de interés.

La técnica de Western blotting también puede identificar unanticuerpo específico en una mezcla. En este caso los antígenos conocidos de peso molecular bien definido se separan mediante SDS-PAGE y transfieren a nitrocelulosa. Las bandas separadas de antígenos conocidos se prueban luego con la muestra que se sospecha contiene anticuerpo específico para uno o más deestos antígenos.

Tipos de electroforesis.

Componentes:• Fuente de iluminación

• Dos electrodos: ánodo (-) cátodo (+)

• Cubeta

• Tampón de electroforesis

• Soporte electroforético (gel).

Electroforesis horizontal.

Electroforesis vertical.

Electrodos de platino.

Electroforesis horizontal.

• ADN o ARN.• Bidireccional.• Medios de

separación: gel de agarosa.

Sembrar muestra con micropipeta.

Fuente de corriente conectada

Electroforesis vertical: moléculas de ADN como proteínas.

PAGE continua

El buffer para preparar el gel y el que esta en los contenedores tiene la misma composición.

PAGE discontinuaSe utiliza para mejorar la resolución (bandas mas compactas). La composición del gel y el buffer es diferente.

MAYOR PORO

MENOR PORO

Electroforesis vertical.

Electroforesis continua (un solo tipo de gel)

Electroforesis discontinua (2 tramos de gel de composición ligeramente diferente).

SDS-PAGE = SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis

Las muestras se tratan con SDS para ser desnaturalizadas (tanto el gel como el buffer de corrimiento contienen SDS). Se utiliza B-mercaptoetanol para romper enlaces disulfuro, separando la proteína en subunidades y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS. En esta electroforesis, las proteínas corren en función de su masa molecular y carga pero no de su forma.

Geles de poliacrilamida

La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel.

Ventaja de los geles de poliacrilamida es que son:

• Químicamente inertes

• Transparentes

• Estables en un amplio rango de pHs, temperatura y

fuerza iónica.

Componentes de un gel de acrilamida :

• MONÓMERO, Acrilamida es la molécula que es polimerizada para dar largas cadenas las cual al ser entrecruzadas constituyen el gel soporte.

• ENTRECRUZADOR O PUENTE N, N,Metilenbis acrilamida

• Esta molécula entrecruza químicamente las cadenas lineales de acrilamida, originando la malla consistente y porosa.

• El polímero que se forma es:

• GENERADOR DE RADICALES LIBRES, Persulfato de amonio (iniciador).

En soluciones acuosas forma radicales libres, los cuales reaccionan con los monómeros de acrilamida, preservándose en forma de radicales que pueden polimerizarse.

• CATALIZADOR, TEMED ((N,N,N,N'-tetrametilnediamina).

Existe en forma de radicales libres por lo cual contribuye a la reacción de polimerización acelerándola.

• La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato y TEMED

• La porosidad del gel se determina por la cantidad de monómero presente así como del agente entrecruzante.

En función del estado de las proteínas a lo largo del proceso electroforético éstas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes.

• una electroforesis nativa es la que somete a las proteínas a migración sin desnaturalización.

• una electroforesis desnaturalizante, es la que somete a las proteínas a migración asegurando la completa desnaturalización.

El agente desnaturalizante más empleado es el Dodecil Sulfato de Sodio o SDS, un detergente

• Se pueden uniformar las cargas de una proteína añadiendo SDS, entonces se moverán en el gel solo debido a su peso molecular.

DETERMINACIÓN DE LOS PM INMUNOLOGÍA

MOVILIDAD RELATIVA

• El Rf es una medida convencional de la movilidad de la proteína relativa al frente de migración y se define como la distancia desde el inicio del gel separador hasta el centro de cada banda dividida  entre la distancia a la que ha  migrado.

• El frente del gel se determina por la posición de un compuesto de referencia de movilidad máxima, como puede ser el colorante azul de bromofenol

• DEPENDE: de la carga y tamaño de partícula

CUANTIFICACIÓN DE BANDAS

DETERMINACIÓN DE PM

• El peso molecular (PM) de las proteínas puede determinarse en electroforesis al comparar las movilidades electroforéticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Existen patrones (mezclas de proteínas de peso molecular conocido y que se tiñen uniformemente) de varios rangos de peso molecular, se debe aplicar el que abarque el peso molecular esperado para la proteína que se quiere determinar. Estos patrones deben ser tratados de manera similar a la muestra

SDS (dodecil-sulfato sódico)

• El SDS es un detergente con capacidad desnaturalizante que al unirse a las cadenas polipeptídicas les otorga carga neta negativa. Gracias a esta propiedad la carga neta de las proteínas no es una variante a considerar, dejando solo como variante la masa molecular.

• Se puede entonces determinar el peso molecular aparente de cualquier proteína por comparación con un patrón de proteínas de pesos moleculares conocidos. Las movilidades de las proteínas en los geles de SDS-PAGE son funciones lineales del logaritmo de su peso molecular.