DISEÑO DE LA PRUEBA DE ELISA PARA EL DIAGNOSTICO DE FIEBRE TIFOIDEA

Fiebre tifoidea

¿Qué es la fiebre tifoidea?

La fiebre tifoidea es una enfermedad que es causada por una bacteria que es común en muchos paises del mundo. En años recientes, más casos en los U.S. han sido adquiridos durante viajes a otros paises.  La fiebre tifoidea es causada por la Salmonela typhi.   Es una enfermedad enteramente diferente que no debe ser confundida con la enfermedad causada por la Salmonela typhimurium ó Salmonela paratyphi.

¿Cuál es el agente causante de la Fiebre Tifoidea?

  El agente causante es la bacteria llamada Salmonella typhi y las paratyphi, en cuyo caso se habla de paratifoidea. Estas penetran al organismo a través de la vía oral.

¿Quién adquiere la fiebre tifoidea?

Cualquier persona puede adquirir fiebre tifoidea pero esta ocurre más a menudo en gente que llega de areas tropicales ó en viajeros que visitan paises donde la enfermedad es común.

¿Como se transmite la fiebre tifoidea?

La mayoria de gente adquiere fiebre tifoidea comiendo ó bebiendo alimento ó agua que han sido contaminados por gente que tiene la enfermedad, incluyendo aquellos que no tiene síntomas.  Frutas crudas y vegetales, leche y crustaceos son los tipos de alimentos más a menudo asociados con la enfermedad.

¿Cuales son los síntomas de la fiebre tifoidea?

Personas con esta enfermedad pueden experimentar síntomas severos ó leves.  Los síntomas de la fiebre tifoidea pueden incluir fiebre, dolor de

cabeza, molestia general, perdida del apetito y una tos seca.   Los latidos del corazon se hacen lentos y el bazo aumenta de tamaño.  Algunas personas desarrollan manchas rosadas en el tronco del cuerpo.  Estreñimiento ó diarrea pueden ocurrir. Algunas personas no tiene síntomas.

¿Que tan pronto despues de la exposición aparecen los síntomas?

Los síntomas pueden aparecer desde 3 días a 3 meses despues de la exposición, con un promedio usual de 1-3 semanas.

¿Cuanto tiempo puede la persona infectada transmitir la enfermedad?

La enfermedad puede ser transmitida a otras mientras la bacteria permanece en la excreta.   Algunas personas con fiebre tifoidea pueden llevar las bacteria por semanas ó años.  Cerca de 2%-5% se convierten en portadores permanentes.  Los portadores son personas que no estan clinicamente enfermas pero que pueden transmitir la enfermedad a otras.

¿Como se diagnostica? El examen de la excreta en el laboratorio es la forma más común de diagnosticar la fiebre tifoidea.  La bacteria puede también ser identificada en la sangre y otros liquidos corporales.

¿Se necesita excluir a la persona infectada del trabajo ó la escuela? La mayoría de las personas pueden regresar a trabajar ó a la escuela despues de recuperarse de la enfermedad, siempre y cuando se laven cuidadosamente sus manos despues de usar el sanitario. El departamento de salud evaluará cada caso en que la persona con fiebre tifoidea prepara alimentos, es trabajador en area de salud ó en centros de cuidado diario ó atiende guarderias.  No será permitido que las personas regresen a tales lugares hasta que ellas tengan pruebas negativas repetidas para las bacterias y el departamento de salud apruebe su regreso a sus actividades normales.

¿Cual es el tratamiento para la fiebre tifoidea?Antibióticos especificos serán recetados por un médico para tratar la fiebre tifoidea.

¿Como puede prevenirse la fiebre tifoidea?La precaución más importante es el lavado cuidadoso de las manos despues de cada visita al sanitario y antes de preparar y/ó comer alimentos.  Las personas que viven en la misma casa ó tienen contacto directo con una persona con fiebre tifoidea necesitan ser examinadas para determinar si tienen la enfermedad y no pueden trabajar en la preparación de alimentos hasta que ellas tienen pruebas negativas multiples.  Existe una vacuna que proporciona cierta protección para personas que viajan a areas donde la enfermedad es común.  Las personas que viajan a esas areas necesitan tener cuidado sobre los alimentos ó agua que consumen.

MATERIALES Y EQUIPOS:

1. Materiales de vidrio:

Placa petri Tubos de enzayo Probeta de 100 ml Matras Pipetas

2. Equipos Baño maria Incubadora Refrigerador

3. medios de cultivo agar nutritivo caldo nutritivo

4. reactivos formol etanol xilol

5. otros gradilla asa de kolle mechero de bunsen

METODOS:

a) Elaboración de la suspensión madre A partir de las cepas de salmonella se sembró en placas durante 24 horas a

T° 37° C Se cultivo luego en caldo para reactivar el cultivo durante 24 horas a 37° C°

b) Atenuado: Luego se hierve el caldo conteniendo salmonella durante 2 horas para

inactivar el cultivo Se formol con solución fisiológica para conservar los antígenos O de la cepa

Se refrigero el cultivo atenuado para mantener inactivo el cultivo , por ser termo resistente el antigeno O

c) Inoculación Luego de transcurrido 24 horas se inocula al conejo, manteniendo este

régimen cada tres días .Las cantidades de inoculo vario a medida del orden de inoculación, la inoculación fu intravenosa , utilizando la vena marginal de la oreja del conejo . inmovilizando primero el conejo , limpiar el era con alcohol , luego introducir la aguja , aspirando hasta obtener un poco de sangre , para proceder a la inoculación lenta .

Después de transcurrido el tiempo de dosis de la inoculación , por l9o menos 6 veces , realizar el diagnostico con la prueba de ELISA para determinar la producción de antigenos contra la Salmonella typhi.

d) Diagnostico con la prueba de ELISA Para realizar el diagnostico de la infección por salmonella , se emplea

pruebas para un diagnostico preliminar El suero y el plasma son los elementos mas comunes usados para la

detección de anticuerpos. Deben guardarse congelados en caso de que la prueba no tenga que realizarse de inmediato luego de la recolección.

Los reactivos usados para esta prueba se incluye a los paquetes de las pruebas comerciales , ya sean fijados a fase sólida o empaquetados separadamente

DIAGRAMA DE FLUJO

1. Elaboración de la solución madre :

SEMBRAR INCUBAR A 37° POR 24 h

atenuar con formol al atenuar el cultivo a 100°C por 0.25% por dos horas en baño maria

Inocular la solución atenuada al conejo :inoculación Dosis en ml fecha

1era 0.25 15/01/052da 0.5 18/01/053era 1.0 21/01/05

4ta 1.5 25/01/055ta 2.0 28/01/056ta 3.0 31/01/05

Procedimiento para la técnica de Elisa:

1. adherir 100 ul de antígeno de Salmonella tiphy diluido en buffer carbonato a una concentración de 1ug por ml a los posos de la placa de micro titilación que serán empleados en la prueba , excepto en los posos .

2. cubrir la placa y dejar en el refrigerador a 4° C durante toda la noche 3. lavar los posos de la placa con buffer de lavado para remover el exceso de

antigeno , se coloca 200 ul de buffer de lavado en cada poso esperar 5 minutos y luego estimular el contenido de los posos invirtiendo rápidamente la placa. Repetir por tres beses el lanado , después de lo cual invertir la placa sobre papel secante dando golpes suabes hasta dejar sin restos de buffer de lavado.

4. adicionar a los posos 100 ul de solución bloqueadora. Cubrir la placa para evitar la evaporación con cinta adhesiva y luego incubar durante una hora a 37° C

5. lavar los posos al igual que el paso 36. siguiendo el esquema de distribución de los sueros en la placa , añadir a los posos

100 ul de dilución del suero a evaluar y los sueros controle, luego cubrir la placa e incubar durante una hora a 37°C.

7. lavar los posos al igual que el paso 3.8. añadir en 50 ul del conjugado anti-Ighumana-peroxidasa dilución 1/5000 tween a

cada pso cubrir la placa y luego incubar por una hora a 37°C .9. lavar los posos al igual que el paso numero 3.10. agregar 50 ul de sustrato OPD-H2 S2 a cada poso e incubar en oscuridad a

temperatura ambiente , esperar de 10 a 30 minutos hasta observar una coloración amarilla en los controles positivos .

11. detener la reacción con 25ul de ácido sulfúrico 2M

DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PRUEBA DE ELISA

fijar a cada uno de los posillos los LAVAR CON BUFFER agregar solución Ag e incubar a 4°C por 24 h DE LAVADO bloqueadora e incubar A 37°C por una hora

incorporar a tres posillos la solución problema (P) LAVAR CON BUFFER agua destilada (B) , en un posillo el DE LAVADO control negativo (-)y en un posilloel control positivo (+),e incubar a 37°C por una hora

P P P B B B - +

LAVAR CON B BUFFER DE LAVADOIncorporar la solución conjugada (50 ul) a cada posillo e incubar a 37°C por una hora

LAVAR CON BUFFER DE LAVADOIncorporar el sustrato (50ul) e incubar en la oscuridadA medio ambiente por 10 a 30 minutos hasta observarUna coloración amarilla en los controles positivos y detener la reacción con ácido sulfúrico (25ul) 2 M

RESULTADOS:Mediante la prueba de ELISA INDIRECTA, se obtuvó la presencia de un color amarilla que nos indica la presencia de anticuerpos contra Salmonella typhy que fue inoculada en la endovenosa, utilizando la vena marginal dela oreja del conejo.

DISCUSIÓN.

. El tiempo de la reacción con el sustrato buffer sustrato se prolongo 15 – 30 minutos de lo normal se debe a su caducmiento del sustrato.. Realizar los procedimientos adecuados y respetar los tiempos de incubación, ya que las lecturas de menor o mayor incubación puede dar resultados falsamente positivos o negativos.

CONCLUSIÓN:

. Para el diagnostico serológico de Salmonela typhy, se empleara el método de ELISA indirecta para detectar anticuerpo en el organismos.. Se determinó la efectividad de la prueba de ELISA por infección por Salmonella typhy obteniéndose anticuerpos en contra del microorganismos, causante de la fiebre tifoidea o intestinal.

BIBLIOGRAFÍA

ABBAS A. 1995. INMUNOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. INTERAMERICANA Mc. Graw Hill. MADRID. ESPAÑA.

TIZARD. IAN. INMUNOLOGIA VETERINARIA. Mc. Graw Hill. INTERAMERICANA. HEALTHCARE GRUPO. MEXICO.