microbiologia de agua potable puno peru una

Anlisis microbiolgico de agua potable

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANOFACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

REA DE MICROBIOLOGA

INFORME DE PRCTICAS 01

ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUASMicrobiologa de los Alimentos Presentado por:y y y y y AROCUTIPA CHINO, Edith GUTIERREZ MAMANI, Regina HILASACA CONDORI, Lucy Mariela TAPIA FLORES, Noem VILCA DE LA CRUZ, Edison Alfredo

SEMESTRE : IX DOCENTE : Blga. MSc. Eva Laura Chauca

PUNO-PER 2011

-0-

Anlisis mic

ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUA POTABLE

I.

INTRODUCCIN

El agua cubre tres cuartas partes de la superficiede la Tierra (mares, ros, lagos, etc.) y constituye del 50% al 90% por peso, de todas las plantas y animales; Su gravedad especfica es: 1. Calor especfico: 1, presin atmosfrica normal hierve a 100 C y se congela a 0 C; Alcanza su densidad mxima a los 4 C (un gramo por cm ), en las propiedades del agua se han basado mltiples medidas fsicas, como la graduacin del termmetro, el peso especfico, el calor especifico, etc. El agua es indispensable para la vida, por sus muchas reacciones qumicas en las que entra, de las cuales la ms importante es la hidrlisis de los hidratos de carbono, grasas y protenas, paso esencial en la digestin y asimilacin de alimentos. El agua al igual que el oxigeno, son los elementos esenciales ms importantes para sostener la vida y la salud de todos los seres vivos, por sus propiedades fsicas, qumicas y biolgicas. Tres de las cuatro partes del organismo humano est compuesto por agua, por lo que es vital para el mantenimiento de tejidos, msculos, huesos y para todos los organismos en general, el abastecimiento de aguas limpias y sin contaminantes. La calidad de agua con destino al consumo humano, tiene implicancias importantes, en el aspecto social y econmico que interactan directamente sobre el desarrollo de un pas. Dada la estrecha vinculacin entre los parmetros bsicos de la calidad del agua y la calidad de vida de las comunidades (salud, desarrollo y bienestar), los servicios de agua potable las condiciones de salud y bienestar de la poblacin. La importancia del proceso de control de calidad del agua potable es vital, ya que a partir de los resultados del control se conocen las caractersticas del agua procesada y suministrada a la poblacin y se establecen las acciones necesarias para mejorar la calidad de este elemento, teniendo en cuenta los estndares de calidad sealados por la organizacin mund de la ial salud (OMS) nacionales. La calidad del agua esta determinada por la presencia y la cantidad de contaminantes, factores fsico - qumicos y biolgicos; los seres humanos tienen una gran influencia en todos estos factores, pues ellos depositan res iduos en el agua y aaden toda clase de sustancias y de contaminantes que no estn presente de forma natural. Cuando se utiliza el agua para el consumo humano, la presencia de microorganismos es de vital importancia, ya que esta puede ser uno de los vehculos ms importantes para la transmisin de microorganismos causantes de muchas enfermedades. y saneamiento cumplen una misin fundamental en los procesos de desarrollo y constituyen elementos esenciales para garantizar3

-1-

iolgico de agua potable

Anlisis mic obiolgico de agua potable

II.

OBJETIVOS:

y y

Realizar el anlisis microbiolgico de agua potable Determinar la calidad bacteriolgica del agua potable para consumo humano en la ciudad de Puno, mediante la determinacin de coliformes totales y coliformes fecales.

III.

ANTECEDENTES:

y

DIGESA (2006), al analizar el agua potable de Ayacucho Per, provincia de la mar, distrito de Anco, se determino la calidad microbiolgica con un promedio de 70 coliformes totales/100 ml y 7 coliformes fecales/100 ml calificando el agua potable de dicho distrito, con un dficit de calidad microbiolgica debido a la contaminacin fecal y al dficit de las tuberas. ENERSUR (2004), al estudiar el agua potable de san Hilarin, prximo al poblado de chilca, lima Per, un estudio de la calidad de agua potable, tomndose 10 muestras de dicho poblado, se realizo un anlisis de coliformes totales (CT) y fecales (CF) siendo los resultados de 80 CT/100 ML y 4 CF/100 ml.. FERNANDEZ (2007), al evaluarla calidad qumica y bacteriolgica de agua subterrnea en pozos del municipio de Moa, provincia de Holgun,(cuba),encontrndose como resultados coliformes fecales (CF) y totales (CT) siendo los resultados de 5 CF/100 ml y 90 CT/100 ml respectivamente.

y

y

IV.

MARCO TERICO:

4.1. Generalidades del agua: El agua es la fuente de las enfermedades infecciosas ms importante, por tanto, la potabilizacin del agua es la medida de salud pblica ms importante. Los mtodos usados para valorar la calidad microbiolgica del agua son mtodos microbiolgicos perfecta mente estandarizados. Incluso el agua que parece limpia y clara puede estar contaminada con microorganismos patgenos, suponiendo un serio riesgo para la salud. Desafortunadamente no es prctico analizar en el agua la presencia de cada uno de los posible patgenos que pudieran estar s presentes. Sin embargo si es factible saber el nmero total de microorganismos presentes.

-2-


4.2. El agua El agua es un liquido constituido por dos sustancias gaseosas: oxigeno e hidrogeno, un volumen de oxigeno por dos de hidrogeno, su formula qumica es el H2O El agua es el ms importante de los compuestos y uno de los principales constituyentes del mundo en que vivimos y de la materia viva. Casi las tres cuartas partes de nuestra superficie estn cubiertas de agua. Es esencial para toda forma de vida, aproximadamente del 60 Y 70 % del organismo es agua. En forma natural el agua puede presentarse en estados fsicos, sin embargo, debe tenerse en cuenta que en forma natural casi no existe pura, pues casi siempre contiene sustancias minerales y orgnicas disueltas o en suspensin. 4.3. Contaminacin del agua El termino calidad del agua es relativo, referido a la composicin del agua en la medida en que esta es afectada por la concentracin de sustancias producidas por procesos naturales y actividades humanas. Como tal, es un trmino neutral que no puede ser clasificado como bueno o malo sin hacer referencia al uso para el cual es destinada. De acuerdo con lo anterior, tanto los criterios como los estndares y objetivos de calidad de agua variarn dependiendo de si se trata de agua para consumo humano (agua potable), para uso agrcola o industrial, para recreacin, para mantener la calidad ambiental, entre otros Los limites tolerables de las diversas sustancias contenidas en el agua son normadas por la organizacin mundial de la salud (OMS), la organizacin panamericana de la salud (OPS), y por los gobiernos nacionales, pudiendo variar ligeramente de uno a otro. 4.4. Indicadores biolgicos de la contaminacin del agua potable

BACTE IAS La contaminacin fecal ha sido, y sigue siendo, el principal riesgo sanitario en el agua, ya que supone la incorporacin de microorganismos patgenos procedentes de enfermos y portadores, y la transmisin hdrica a la poblacin susceptible. Por ello el control sanitario de riesgos microbiolgicos es tan importante, y constituye una medida sanitaria bsica para mantener un grado de salud adecuado en la poblacin. Para la investigacin del agua se requiere la bsqueda y aplicacin de indicadores biolgicos de contaminacin fecal, aceptndose de forma universal que deberan cumplir los siguientes criterios:

-3-


y y y y y y

Ser un constituyente normal de la flora intestinal de individuos sanos. Estar presente, de forma exclusiva, en las heces de animales homeotrmicos. Estar presente cuando los microorganismos patgenos intestinales lo estn. Presentarse en nmero elevado, facilitando su aislamiento de identificacin. Debe ser incapaz de producirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos. Su tiempo de supervivencia debe ser igual o un poco superior al de las bacterias patgenas (su resistencia a los factores ambientales debe ser igual o un poco superior al de los patgenos de origen fecal) Debe ser fcil de aislar y cuantificar. No debe ser patgeno

y y

No existe ningn microorganismo que cumpla con todos estos requisitos de un indicador ideal, por lo que se toman los quemas de estas caractersticas cumplen teniendo en cuenta estos criterios, los indicadores microbiolgicos de contaminacin fecal clsicos han sido aquellos microorganismos de la flora saprofita del intestino, que se encuentra muy abundantes y en el mayor nmero de individuos de la poblacin.

Los grupos de microorganismos mas habituales en heces h umanas son B

ei

i

s f e

microorganismos no son exclusivos del intestino humano, sino que forman parte tambin de la flora intestinal de diversos animales de sangre caliente. Esto es importante ya que la contaminacin fecal causada por animales puede entraar riesgos sanitarios, por lo que hay que considerar los microorganismos En mas abundantes y frecuentes en las heces de los fecales,aunque su abundancia animales, sobre todo en los de produccin (vaca, cerdo, oveja, caballo, gallina, pato, y pavo). todos ellos encontramos coliformes y estreptococos relativa es mayor en los estreptococos fecales. Los microorganismos patgenos mas frecuentes transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo: fiebre tifoidea, paratifoidea, disentera (bacilar y amebiana) y clera. Los agentes etiolgicos de esta se encuentran en las materias fecales y la orina de los infectados y cuando son eliminados pueden llegar a un depsito que desemboque en una fuente de agua para beber. 4.4.1. Bacterias Gram negativas Entre las especies que se han aislado de aguas, podemos mencionar a las pertenecientes a los ob te i m, Ente ob

te i

e e, Ae omon s,Vib io, A omob

Al

li enes, Neisse i , o xell y A inetob

te .

-4-

gneros Pse domon s, Fl

coliformes totales y fecales, Es

oli y St epto o

te oides f

ilis,

les.Muchos de estos

te ,


4.4.2 Bacterias Gram Positivas No representan un grupo muy difundido en agua, sin embargo incluye algunos patgenos humanos aislados especialmente de aguas subterrneas. Los cocosms comunes pertenecen aerobios y tolerantes a altas concentraciones salinas que permite diferenciarlos de los! ! 1 " % !! !

a los gnerosMi o o os, St p ylo o! ! "!

estreptococos. Varias especies de los dos primeros son importantes patgenos humanos; aunque no existe certeza acerca de su hbitat original. El genero estreptococos incluye a animales por lo que es un indicador de contaminacin fecal de aguas." !# %

Ente o o

sf e

lis, patgeno humano que habita normalmente en el intestino de hombres y

metabolismo anaerbico y anaerbico respectivamente. A partir de suelos y acuferos aguas subterrneas anaerobias y ltima porcin de tracto intestinal de animales se puede encontrar especies de lost idi m. 4.4.3 Coliformes Mientas que la presencia de unos pocos microorganismos no patgenos en el agua puede ser tolerable, la presencia de organismos indicadores especficos pude indicar que esa agua puede estar contaminada con patgenos. Estos organismos indicadores estn generalmente asociados con el tracto gastrointestinal; su presencia indica contaminacin fecal en la fuente de esa agua. Los microorganismos indicadores ms ampliamente empleados como indicadores son los coliformes. Los coliformes se usan como indicadores de contaminacin en el agua porque se encuentran en gran nmero en el tracto intestinal de humanos y animales. Los coliformes se definen en la bacteriologa del agua como bacterias en for a de varilla, no m esporuladas, gram negativas, aerbicas o aerbicas facultativas que fermentan la lactosa con produccin de gas cuando se incuban a 35C durante 48 h. Dentro de los coliformes se incluyen una gran variedad de microorganismos, siendo la mayora pertenecientes al grupo de las bacterias entricas, por ejemplo, Es2 ) 0 ) '0 0 0 % " & % !#

aerbicos se aslan especies incluidas en el gnero B

ill s; y a partir de suelos, sedimentos,

microorganismo intestinal muy comn, Klebsiell habitual. Sin embargo, Ente ob fermentadoras.)

pne moni e; un patgeno intestinal menos

te

e o enes, un organismo generalmente no asociado con

el intestino, tambin es clasificado dentro de los coliformes debido a sus caractersticas

En general, se asume que la presencia de coliformes en una muestra de agua indica contaminacin fecal y hace que dicha agua no sea apta para el consumo humano.

-5-

' 0 (' ) ('

ei

%

&

%

Las bacterias esporulantes, pertenecientes a los gnerosB

$ #

s y Est epto o os. Los micrococos y estafilococos son

#! #

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ill s y

lost idi m presentan

i

oli, un


4.5 Lmites permisibles de caractersticas microbiolgicas en agua potable Son los lmites de agua ideal, segn OMS, OPS, INDECOPI, SUNASS El contenido de organismos resultante del examen de una muestra simple de agua potable, debe ajustarse a lo establecido. Caracterstica Coliformes totales (UFC/ml) Coliformes fecales (UFC/ml) Recuento total4

Lmite permisible o ideal Ausencia Ausencia 500 UFC/ml

El agua potable no debe contener E. oli o coliformes fecales u organismos termotolerantes en ninguna muestra de 100ml. Los organismos coliformes totales no deben ser detectables en ninguna muestra de 100ml; en sistemas de abastecimiento de localidades con una poblacin mayor de 50000 habitantes; estos organismos debern estar ausentes en el 95% de las muestras tomas en un mismo sitio de la red de distribucin, durante un periodo de 12 meses de un mismo ao. 4.6 Tcnicas de anlisis microbiano en aguas Dos procedimientos se emplean generalmente para detectar la presencia de coliformes en el agua. Estos son: el mtodo del nmero ms probable y el mtodo de la filtracin en membrana (MF). El mtodo MPN emplea medio de cultivo lquido en tubos de ensayo. Las muestras de agua se aaden a los tubos con el medio de cultivo. La aparicin de crecimiento microbiano en los tubos indica contaminacin en el agua que se aadi.

En el anlisis bacteriolgico es importante conocer no solamente que los organismos coliformes estn presentes sino tambin determinar su nmero ms probable por unidad de volumen en el agua. El nmero ms probable de organismos coliformes en una muestra de agua es la densidad ms probable de producir un resultado particular. Las concentraciones de bacterias coliformes totales suelen expresarse como nmero ms probable por 100ml (NMP/100ml). La determinacin del NMP se basa en la aplicacin de la distribucin de poisson para valores extremos encontrados en el anlisis del nmero de resultados positivos y negativos obtenidos en ensayos de diferentes fracciones de la muestra de volmenes iguales y en fracciones que formen series geomtricas.

5

a.

mero ms probable

-6-

3


b. Conteo en placa El ensayo de conteo en placa sobre agar nutriente, con incubacin a 20C, 35C o 37C durante 48 horas, es uno de los ensayos ms antiguos de evaluacin de la pureza del agua. El ensayo es til como prueba de control de rutina de la calidad del agua en los procesos de tratamiento y como un mtodo de estimacin de la calidad sanitaria de la misma. El conteo en placa se realiza mediante el vertido en placa y el esparcido en placa son mtodos utilizados para realizar siembra, identificacin y conteo de bacterias. En el mtodo de vertido, la muestra de agua que va a ser analizada se somete a diluciones sucesiv y una pequea as, muestra de cada dilucin se coloca en una caja para la siembra de bacterias. A parte, el medio de cultivo se calienta hasta que se encuentre en estado lquido y pueda ser vertido en la caja para mezclarse con la muestra de agua diluida, para su posterior incubacin bajo condiciones controladas. Las colonias que aparecen despus de la incubacin son contadas, asumiendo que cada colonia se form a partir de una sola bacteria; el nmero total de bacterias se establece de acuerdo con la dilucin apropiada.

V.

MATERIALES Y MTODOS

5.1 Materiales: a) Material biolgicos Agua potable

y

b) Materiales de vidrio Tubos de ensayo Placas petri Campanas de Durham Pipetas de 0.1 y 10 ml Frasco de vidrio Matraz Probeta Agua destilada

y y y y y y y y

-7-

6


c) Equipos Autoclave Estufa Balanza digital Cocinilla elctrica

y y y y

d) Otros materiales Azas de kohl Mecheros Gradilla metlica Calculadora Plumn indeleble Cmara digital

y y y y y y

e) Medios de cultivo Reactivos Caldo Lactosado simple y doble concentracin Caldo verde brillante Agar recuento EMB (Eosine metil blue) TSI, LIA ,Citrato SIMONS, Indol Reactivo de Kovacs

y y y y y y

5.2 Mtodos empleados y y VI. Nmero ms probable (NMP) Recuento en placa PROCEDIMIENTO: MTODO DEL NMERO MS PROBABLE Para el anlisis microbiolgico de agua potable, consta de cuatro test hasta llegar a la clasificacin, los cuales son los siguientes: a. Test presuntivo b. Test confirmativo c. Test de aislamiento d. Test de identificacin e. Clasificacin

-8-

7

Anlisis microbiolgico de agua potableED CB F A @9 A@98

CO2), capturado en el tubo de

urham.

. Se procedi de la siguiente manera: . Preparar el caldo lactosado de simple medir lo

siguiente Caldo de doble . grqp

y y y

Agua destilada

Agua destilada 280mlu t

. uego de preparar el caldo lactosado de doble concentracin; a final aadir rojo de fenol l

como indicador

Caldo lactosado de doble concentracin

Caldo lactosado de doble concentracin + rojo de fenol

w h

.

epetir el mismo procedimiento para el caldo lactosado de simple concentracin

-9-

qp

2. Para caldo doble concentracin 2x) disol er , g del medio enih

sh

Caldo de simple concentracin

ih

y

ml , g

0 ml de agua destilada

c

d

c gd

)

doble concentracin 2 x), pesar

T

P

T

e

c

i gorosamente

ocurre una seleccin de organismos lactosas o siti as con roduccin de gas

P

P

T

T

En estaP

Y`YX

durante

oras resunti a la acti i dad metablica de las bacterias es estimulada

rueba

WVU

conteniendo como medio de culti o caldo lauril tri tosa o caldo lactosado e incubados aT P ba

S

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I

Consist

n

H

olocar

ol

G

a.

i

nes

eterminados de muestra de agua en una serie de tubos C,

H H

v h

f

d


invertido, como se observa en la foto

. Se esterili a en autoclave a 21C durante 15 minutos, porque el caldo lactosado siempre se

esterili a en tubos de ensayo, para evitar la contaminacin en el momento del muestro. . Seguidamente rotular los tubos de ensayo de acuerdo como se ve en la foto

- 10 -

x

tubos de ensayo, ml de caldo lactosado de simple concentracin, provistos de tubito

x y

.

i stribuir a tres tubos de ensayo ml de caldo lactosado de doble concentracin y a seis urham

x

4. Colocar en cada uno de los nueve tubos de ensayo, campanas de

urham


colocados en gradillas y codificados volumen, muestra y dilucin)reali ar la inoculacin de la muestra problema, sin antes agitar el frasco 25 veces. . Inocular 10ml de la muestra original en tres tubos de caldo lactosado de doble

concentracin, 1ml en tres tubos con caldo lactosado de simple concentracin y 0.1ml en los siguientes tres tubos de concentracinsimple.

Inoculacin de agua potable

Orden de los tubos de inoculacin en secuencia descendente de concentracin

10.

espus de incubar 48 horas se observa lo siguiente

- 11 -

. Envolver en papel craff los nueve tubos de ensayo e incubar los tubos por 48 horas a

concentracin y dos series de

tubos con

ml de caldo lactosado de concentracin simple,

8. En la batera preparada en serie de

tubos, conteniendo ml de caldo lactosado de doble

C


Lactosa positivos con formacin de gas y cambio de coloracin como se ve en el crculo rosado

Lactosa negativos, no hay formacin de gas ni cambio de coloracin-2

y adems presentan cambio de coloracin de rojo a amarillo, posiblemente se debe a la fermentacin y acidez producida por las enterobacterias. Los tubos con dilucin 10

-3

concentracin simple de 0.1ml) son negativos porque no se evidencia formacin de gas en las

campanas de durham, ni se observa cambio de coloracin, por lo que se descarta estos tubos. Siendo al final la siguiente formulacin: 3 3

0.

negativos no son considerados.h

Consiste en transferir o pasar un inculo de cada tubo positivo de la prueba presuntiva, a tubos conteniendo caldo lactosado Verde Brillante Bilis CLVBB) o brilla e incubados posteriormente a 37C durante 24 horas. Esta prueba reduce la posibilidad de res ultados falsos positivos que puedan ocurrir por la actividad metablica de bacterias formadoras de esporas. La formacin de gas CO2-fermentacin) dentro de las 24-48 horas constituye una prueba confirmativa de la presencia de coliformes. Los resultados se expresan en trminos de nmero ms probablei j

f

g

fe

.

d

11.

odos los tubos considerados como positivos pasan a la prueba confirmativa. Los tubos

nfi mati

P/100ml).

- 12 -

1ml) son positivos porque se evidencia la formacin de gas CO ) en las campanas de 2

Anli i

Los tubos con dilucin 10

-1

concentracin doble) y 10

concentracin simple de urham


1. Para el test confirmativo se utiliza el caldo verde brillante bilis CVBB)s nm l mq p po

F ndamento:v

edio de enriquecimiento altamente selectivo, en elmedio de cultivo, la peptona

y el extracto de levadura, constituyen la fuente orgnica de nitr geno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los carbohidratos fermentables, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. La selectividad, est dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias gram positivas, de la mayora de los coniformes.w

2.

arcar los tubos de CVBB que corresponda a cada tubo positivo de caldo lactosado de la

prueba positiva.

3. Agitar cada tubo de Caldo lactosado presuntivo positivo y transferir1ml al tubo con CVBB.

4. Incubar los tubos CVBB, durante 24 horas a una temperatura de 37C

u tt l

r

w

qr

al

illante ili ( V

)

- 13 -

k


5. Proceder con la lectura luego de las 24 horas, considerando pruebapositiva confirmativa para coliformes totales a los tubos que presentan a la vez, formacin de gas fermentacin) en el tubito de durham y turbiedad.x

CO 2

Se confirma presencia de coliformes, por la formacin de gas en la campana de durham y presencia de turbiedad.

. Anotar los resultados y calcular el

obtenidos en la prueba confirmativa.

7. odos los tubos confirmados con coniformes totales se llevan a un test de aislamiento.} |

c.

est de aislamiento

Consiste en el aislamiento selectivo de bacterias de la familia Enterobacteriaceae, utilizando un medio selectivo, y tambin sirve para poder diferenciar y observar el crecimiento de colonias entre coniformes totales y fecales. 1. Para el test de aislamiento se utiliza el agar eosina -azul de metileno-lactosa E B) de Levine, Agar eosina-azul de metileno-lactosa (E ,{ x

Fundamento: Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos gram negativos de la familia Enterobacteriaceae. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indi cadores eosina y azul de metileno; estos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias gram positivas. uchas cepas de E ch richia c li y Citr act r presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. {

~

{z

P para coniformes totales a partir de los datos

y

- 14 -


2.

arcar una placa petri en sis partes, que corresponda a cada tubo positivo de coliformes

totales. 3.Agitar cada tubo de confirmado para co liformes totales y con un asa de siembra estril, extraer una asada y sembrar finamente por el mtodo de estras hasta agotamiento.

Extraccin de muestra con asa estril

Siembra por estra simple hasta agotamiento de cada tubo positivo

4. Incubacin: de 24 a 48 horas a 37C.

5. Lectura

El resultado del cultivo en medio selectivo de E B para coliformes fecales es el siguiente:

10-1

10-2

- 15 -


1ra Concentracin 10-1)

E. coli

2da Concentracin 10-2)

i nalmente si hubo un desarrollo caracterstico de colonias que nos permita tipificar las

enterobacterias, que son indicadores de contaminacin fecal. . El agar E B sirve para diferenciar las colonias de b acilos entricos patgenos de os l

organismos capaces de fermentar rpidamente la lactosa, la sacarosa o ambas.

7. Las colonias de E ch richia c li son de dos 2 a3 mm de dimetro, con brillo metlico verdoso a la luz reflejada, con centro oscuro ha negro en la luz transmitida; por lo que se sta puede observar con las mismas caractersticas descritas una estra, por lo que se le considera como positivo a coliformes fecales. 8. Para Confirmar de que bacterias se trata se pasar a un test de identificacin

- 16 -


d. Test de Identificacin Consiste en la incubacin de colonias en medios diferenciales para su identificacin, los medios diferenciales que se utilizarn son: TSI, LIA, Citrato Simona e Indol. 1. Para la identificacin se utiliza medios TSI, LIA, Citrato e indol. TSI Triple Sugar Iron

undamento: Es uno de los medios diferenciales o bioqumicos mejor creados con mltiples

reacciones bioqumicas, una de las caractersticas de este medio es que no tiene inhibidores pero puede llevar indicadores de viraje de pH y los colorantes no deben ser nocivos contra las s y otros, por su alto contenido en nutrientes entre protenas y

bacterias.El TSI se usa para el estudio metablico de Ente ob

te i s, B

Vib io, Est epto o

carbohidratos, aqu se estudia el metabolismo de las cisteina que posee dos molculas de azufre (S), que sern liberados como H2S por accin de la desulfidrasa o cisteinasa de la cistena y con la presencia de las sales ferrosas formarn S2Fe que le dar un precipitado de color negro, en caso de los tres carbohidr atos lactosa, sacarosa y glucosa. La lactosa se metaboliza aerbicamente y se lee los cambios en la parte superficial, la sacarosa en el anillo intermedio y glucosa como es una aldosa se metabo liza va embden meyerhorf en el fondo anaerbicamente; la glucosa se metaboliza al fondo puede llegar a producir solo acidez o tambin gas de CO2 , una pequea burbuja o ruptura del medio indica la presencia de este gas que es significativo para la diferenciacin de especies no productoras de CO2, como S lmonell typ i, y con estas cinco reacciones pueden tenerse muchas combinaciones como ocurre con cada especie y sus variantes. LIA Lisina Iron Agar

undamento: Este medio contiene la lisina un aminocido que puede descarboxilarse o

deaminarse, posee seis carbonos con un COOH en el primer carbono y dos NH en otras 2 posiciones. Si acta una descarboxilasa saca al grupo COOH que es cido y el medio queda alcalinizado, si acta otra enzima que quita los grupos NH2, las deaminasas, el compuesto de seis carbonos se desdobla en dos molculas de CH3-CO-CH3 que formarn el cido pirvico y el medio se acidifica.El medio a su vez posee otros ingredientes como es la presencia de glucosa, otros aminocidos azufrados por lo que a su vez se puede leer H S y acidez de la 2 glucosa, este medio contiene un indicador de pH que es el prpura de bromocresol que de acuerdo al pH variar el neutro es azul claro o ail y al variar a la alcalinidad por descarboxilacin el color azul se intensifica, y cuando hay deaminacin el pH se acidifica y el color amarillo del fondo del tubo se acenta, esta acidez favorece a la reaccin Fe que se torna rojizo en la superficie.

- 17 -

ill s,

lost idi m,


Citrato de Simons (CS) Fundamento: El medio de citrato de simons es un medio pobre en nutrientes, el objetivo es que la bacteria consuma el citrato como fuente de carbono que el acetilocon la coenzima A y oxalacetato ingresen al ciclo de Krebs, la enzima citritasa que es el citrato oxalacetato liasa o citrato desmolasa.La sales de amonio presentes alcaliniza el medio, los cidos forman los bicarbonatos tambin alcaliniza que hace virar al medio de pH 7.0 a 8.0, el color verde del indicador pasa al color azul. Indol Fundamento:La prueba de indol se emplea para detectar la presencia de la enzima triptofanasa presente en las bacterias que degrada el aminocido triptfano al indol. Al aadir al con el indol como el triptfano produciendo compuestos de color rojizo. Para evitar la interferencia de triptfano, el reactivo est disuelto en alcohol isoamlico inmisible en agua. A diferencia del triptfano, el indol es soluble en el alcohol y solo este compuesto reaccionar con el aldehdo produciendo el anillo coloreado caracterstico de esta prueba. 2. Se toma una cepa de bacterias para su inoculacin en medios bioqumicos

medio SI

el reactivo de ovacks que contiene p-dimetilaminobenzaldehido, reacciona tanto

3. La inoculacin en los medios diferenciales se realiza de la siguiente manera:

A)

B)

A)inoculacin profunda y en estrias, B) Doble inoculacin profunda y en estrias C) Inoculacion en estrias D) Inoculacion en fluido en circulos .Incubar a 37oC por 24-48 horas

C)

D)

- 18 -


4. Se realizo la inoculacinde la cepa seleccionada,en medios bioqumicos para determinar la presencia del gnero de bacterias presentes.

1. En SI una picada y estras 2. En IA dos picadas y estras 3. En Citrato de Simons se hace estras 4. Indol una picada

5. A continuacin se lleva a incubacin a 37C por 24 horas, para luego realizar la interpretacin. . Luego de 24 horas se observ lo siguiente:

y En SI hay cambio de coloracin de rojo a amarillo, con produccin de gas y sulfuro de

hidrgeno. que hay deaminacin de la lisina y el pH del medio de acidifica.y En Citrato de Simonshay cambio de coloracin de verde a azul intenso y se hace

y En

IAhay un cambio de coloracin en el fondo del tubo, que se torna amarillo, por lo

evidente de consumo de citrato por la bacteria.y Indol no hay cambio de coloracin y al aadir el reactivo de kovacks no se observa la

formacin del anillo rojo en los primeros segundos, por lo que resulta negativo a indol . Los resultados se vern en el cuadro de interpretacin.

- 19 -


Sirve para el recuento de bacterias aerobias mesfilas viables 1. En tres tubos de ensayo medir ml de agua destilada y realizar la dilucin de agua potable, , al primer tubo colocar 10ml de agua potable, al segundo tubocolocar 1ml del primer tubo, y al tercer tubo aadir 1ml del segundo tubo

ml de agua destilada en cada tubo, pero solo utilizaremos tres para agua potable y tres para agua embotellada

2. Luego tomar un 1ml de cada tubo y colocar a 3 placas petri y aadir agar recuento a cada placa hasta recubrir la placa y dejar que gelifique.

Sacar 1ml de cada tubo y colocar a cada placa

ilucin de agua potable en las tres placas petri

Aadir agar recuento a cada placa petri

Luego de agregar agar recuento, dejar que gelifique

- 20 -

M

E

ECUE

E P ACAS

ilucin de agua potable


3. Seguidamente llevar a incubacin a 37C por 48 horas.

4. De las placas incubadas realizar el conteo de cada placa, para su posterior interpretacin Para el recuento de las placas se dividen estas en cuatro cuadrantes para su mejor conteo, y si es amplio de rango de colonias desarrolladas se dividen en 8 cuadrantes.

y

VII.

RESULTADOS

a. Los resultados para recuento de bacterias mes filos viables en agua pota ble son los siguientes: Recuento Total: agua potable Recuento total 10-1 10-2 10-3 totales N de colonias * nmero de total cuadrante * Dilucin 155 (4) * 10 6200 125 (4) * 100 46 (4) * 1000 50000 184000 240200

Recuento total = 240200 / 3 = 80066 m.o./1 ml = 8 x 104UFC /ml de muestra Recuento de mesfilos: 8 x 104UFC /ml de muestra

- 21 -


b. Los resultados por el mtodo del nmero ms probable para coliformes totales y fecales son los siguientes:Numero Ms Probable Para Coliformes Totales en agua potable NMP para coliformes totales Diluciones Test Presuntivo Test Confirmativo Test de aislamiento 10-1

10

-2

3 3 0

3 3 1

NMP para coliformes totales se hace uso del test presuntivo y confirmativo Segn la tabla del nmero ms probable, usando tres tubos sembrados cada uno con 10, 1 y 0.1 ml de muestra da como resultado: 240 NMP, el cual se multiplica 100 y se divide entre 10, siendo el resultado 2400 2 x 10 3 NMP/100ml.

NMP para coliformes fecales se hace uso del test de aislamiento Segn la tabla del nmero ms probable, usando tres tubos sembrados cada uno con 10, 1 y 0.1 ml de muestra da como resultado: 3 NMP el cual se multiplica 100 y se divide entre 10, siendo el resultado 30 NMP/100ml. Indicadores de contaminacin para agua potable Coliformes totales Coliformes fecales NMP/100ml 2 x 10 NMP/100ml 30 NMP/100ml3

c. Test de aislamiento, donde se identific la especie con la ayuda de interpretacin de los medios bioqumicos. TEST DE IDENTI ICACINBACTERIANA PARA AGUA POTABLE Con las pruebas bioqumicas se determina que se trata de una especie de coniformes totales, te f e ndii.

siendo la especie aislada Cit ob

Pruebas Bioqumicas

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10 0 0 0

-3


ESPECIE

TSI P.B. Gas SH2 Glu. Lac. Sac. Reac. A/A + + + + + K/A

LIA Lis. +

Citrobacter freundii

VIII.

CONCLUSIONES

y

De acuerdo a los lmites permisibles establecidos por la OMS, OPS, INDECOPI y SUNASS la calidad microbiolgica del agua potable no es apta para el consumo humano, puesto que sobrepasa los lmites permisibles. En el recuento de bacterias mesfilas el lmite mximo no debe ser mayor a 500 UFC/ml, siendo el resultado so brepasado en 8 x 10 4 UFC/ml. En el nmero ms probable, segn los lmites permisibles, la presencia de coniformes totales y fecales debera ser cero, pero esto no se observa as, siendo positivo a coliformes totales en 2 x 10 3 NMP/100ml y en coliformes fecales 30 NMP/100ml, evidencindose de esta manera la contaminacin del agua potable.

y

y

y

La especie aislada e identificada fue Cit ob de coliforme total.

te f e ndii , un indicador

y

Los resultados observados posiblemente se deba a la contaminacin que se pudo haber sufrido en el proceso de la muestra, aunque tambin se puede deber a la real contaminacin del a gua potable, a causa de la contaminacin de bahia interior de Puno del lago Titicaca.

IX.

BIBLIOGRAFIA

AGURTO,

T.

(2009)

MICROBIOLOGA

BIOQUMICA

ENTEROBACTERIACEAE. 1ra. Edicin. Editorial Unin. Per. Pg. 314. MADIGAN, M. (2009) BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS DE BROCK. 10 Edicin. Editorial Pearson. Pg. 1085. BROOKS, G. (1992) MICROBIOLOGA MDICA DE JAWETS14va. Edicin. Editorial Manual Moderno SA de C. V. Pg. 186.

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CS

INDOL

+

-

BACTERIANA


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microbiologia de agua potable puno peru una

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