2. Microscopia MICROBIOLOGIA EL MN DELS PROCARIOTES Grandria i morfologia Les cllules procaritiques sn de l'ordre del micrmetre, i els virus del nanmetre.

El tamany de les cllules s bastant variable. Les eucariotes poden fer de 2 a ms grans de 200 m, com la Nanochlorum eukaryotum, que fa de 1 a 2 m de dimetre i s emblant a l'Escherichia coli. Les procariotes tenen un tamany des de 0,1 fins a 10 m. Les espiroquetes sn molt llargues (ms de 500 m de longitud),per tamb molt primes. Sobre els nanobacteris no es sap si sn cllules o no i el seu tamany pot arribar a ser des de 0,05 fins a 0,2 m. PRINCIPALS MORFOLOGIES DELS PROCARIOTES Esfrica: el seu nom s cocs. Depenent de la seva manera d'ajuntar-se poden ser micrococs (en parella), estreptococs, estapilococs (en forma de malla), sarcina i estaflococs (en forma irregular). Bacils: poden estar collocats en cadena. En la forma livio colera sn bacils corvats. Espirins: tenen forma d'espiral. Espiroquetes: tenen forma helicodal molt allargada i fina. Hifes: el seu cicle cellular s ms complexe. Filaments: els bacteris es divideixen per no es separen, tal com ho fan els micellis dels fongs. MICROSCPIA El microscopi s una eina bsica en microbiologia que ens permet observar els microorganismes grcies a la seva capacitat per augmentar la grandria. Les propietats bsiques del microscopi sn: Augment: la capacitat d'augment de les lents s la suma de l'objectiu i l'ocular. Resoluci: observaci de dos punts com unitats diferents, en funci de longitud d'ona i apertura numrica (captaci de llum per la lent). R= 0,5 / A.N. Hi ha diferents tipus de microscopi segons el mecanisme ptic utilitzat per visualitzar la mostra. TIPUS DE MICROSCPIA Microscpia ptica o Microscopi ptic de camp clar o Microscopi de contrast de fase o Microscopi de camp fosc o Microscopi de fluorescncia Microscpia en tres dimensions o Microscpia confocal Microscpia electrnica o Transmissi o Escombratge (scanning)

7

2. Microscopia MICROBIOLOGIA MICROSCPIA PTICA 1. Microscpia de camp clar Observem la grandria, la morfologia, les agrupacions cellulars i les estructures. Tamb es pot fer un recompte del nombre de cllules mitjanant el clcul de la concentraci del nombre total. La majoria dels procariotes no els podem veure perqu no tenen pigment, aleshores tenyim les cllules. Si el que volem s determinar la grandria de la cllula evitem la tinci perqu aquesta vari la cllula. Observacions microscpiques Preparacions in vivo (o fresques) o s simple i utilitzem un portaobjectes i un cubreobjectes. o En pendent. o Aprecia molt millor la grandria. o Limitacions pel baix contrast de la preparaci, noms s possible una bona observaci amb microorganismes pigmentats o amb autofluorescncia. Tincions o Colorants de tipus bsic (crrega positiva): s'uneixen a les parts cellulars amb crrega negativa. Sn tils per tenyir cllules microbianes. Exemple: safranina, fucsina bsica, cristall violeta, blau de metil. o Colorants de tipus cid (crrega negativa): s'uneixen a les parts cellulars amb crrega positiva. Sn tils per detectar teixits infectats amb microorganismes. Exemple: eosina, fucsina cida, roig Congo. o Mordents: No sn colorants, sin intensificadors de la tinci, augmentant l'afinitat del colorant per la cllula o per augmentar el gruix de certes estructures i poder-les visualitzar. Exemple: iode. Obtenci d'una preparaci o Si el microorganisme s molt lbil es pot fixar qumicament, afegint una gota de fixador com glutaraldehid, cid smic, formaldehid, etc. La fixaci es pot fer assecant a l'aire o amb una flama, tenint molt de compte de no cremar la mostra. o Inconvenients de la fixaci: pot distorsionar la grandria, forma, etc. No permet l'observaci de la motilitat. o Per a veure la mostra anem directament a l'objectiu de x100.

82. Microscopia MICROBIOLOGIA

TINCIONS Tincions simples S'usa un nic colorant bsic. Per a veure un color, la grandria o la quantitat. Exemple: tinci amb blau de metil. Tincions diferencials S'usen per distingir entre tipus diferents de microorganismes. Ens separen alguna caracterstica. Consta de tinci primria i tinci de contrast. Exemple: tinci de Gram: distingir grampositius (blau) de gramnegatius (vermell). Exemple: tinci de Ziehl Nieelsen: cid alcohol resistent. Distingir Mycobacterium (vermell) de la resta de bacteris (blau). Tincions especials Revelen estructures particulars d'una cllula Exemple: tinci d'endospores (tinci de Wirtz Conklin) Exemple: tinci de cpsules. Tamb n'hi ha que separen flagels, per hi ha mtodes millors que aquet per a fer-ho. TINCI DE GRAM S'utilitza una mostra amb dos tipus de cllules diferents. Les Gram + quedaran de color blau/lila, i les Gram de color vermell. Depn dels elements que formen la paret, noms t sentit en bacteria En els passos 1 i 2 fem una primera tinci (tinci primria) amb cristall violeta i mordent (soluci de iode), on les cllules acaben de color blau/lila. En la decoloraci colloquem l'etanol al portaobjectes, quedant-se un tipus de cllules blau /lila i les altres sense color. A la tinci de contrast tenyim amb safranina i es tenyeixen de vermell les que s'havien decolorat. En la mostra es poden distingir estreptococs, diplococs, bacils i cl3lules de llevat. TINCI DE ZIEHL NIEELSEN Tamb s'anomena cid alcohol resistent. s una tinci diferencial de valor diagnstic. Diferencia Mycobacterium de la resta de microorganismes. Aix s possible perqu aquests tenen uns cids miclics que els ofereixen resistncia a la decoloraci amb

9

2. Microscopia MICROBIOLOGIA alcohol. Si el veiem ho t, tamb pot ser que en tingui poc i no es vegi, ja que sn uns bacteris de creixement lent (poden passar 30 o ms dies perqu comencin a crixer). Primerament fem una tinci primria amb fucsina bsica i ho escalfem a la flama per permetre la penetraci del colorant dins la cllula. Totes les cllules es queden de color vermell. Desprs fem una decoloraci amb una soluci d'cid clorhdric al 3% en etanol 95%, decolorant aix totes les cllules menys els mycobacterium. Fem una tinci de contrast amb blau de metil, veient totes les cllules de color blau menys els mycobacterium que seran vermells. TINCI D'ENDSPORES (Tinci de Wirtz Coklin) s una tinci bacteriana, sn bacteris molt resistents, fins i tot es poden bullir. Aquests bacteris contenen en el seu nucli un component qumic (cid dipicolnic) propi de les endspores bacterianes que s especficament tenyit per verd de malaquita. Es tenyeix la mostra amb verd de malaquita. Escalfem la mostra a la flama per permetre la penetraci del colorant dins l'endospora. La rentem amb aigua per eliminar el colorant lliure. Tenyim amb safranina aquosa per tenyir les cllules vegetatives. Les endspores queden tenyides de blau. TINCI DE CPSULES Els components qumics de la cllula no es tenyeixen, per tant es procedeix a fer una tinci negativa. Les cpsules estan delimitades i envolten la cllula; formades de molt polmers, no hi ha cap colorant que ho tenyeixi, aix que ho tenyim tot. Es tenyeix tota la preparaci amb tinta negra xinesa (o negre sudan o niglocina) i s'asseca. Tenyim amb safranina aquosa, aix queden de color vermell les cllules. Les cpsules sn les zones no tenyides entre la tinta xinesa i les cllules. En la imatge veiem que les cpsules sn molt ms grans que la cllula.

10

2. Microscopia MICROBIOLOGIA 2. Microscpia de contrast de fase Ens permet una observaci clara i amb detall de les cllules sense tenyir. Les cllules apareixen rodejades per un anell llumins, aix que hi ha una millor definici del tamany de les cllules. Podem observar estructures internes com les de la imatge (llevat), fer observaci del moviment o recomptes cellulars. 3. Microscpia de camp fosc Es fa una observaci clara i amb detall de les cllules sense tenyir. Les cllules s'observen com una imatge brillant contra un fons fosc. s la que t major poder de resoluci, aix que permet observar millor estructures i veure'n algunes que no veiem com els flagels. Podem observar estructures externes de la cllula, (tinci de flagels: primer els engrossem i desprs els tenyim), observar el moviment i fer recomptes cellulars. 4. Microscpia de fluorescncia Podem fer una observaci directa sense tincions amb alguns organismes que sn autofuorescents a certes longitud d'ona. S'observa la morfologia, la grandria, les agrupacions cellulars i el moviment. Si no ho sn hi posem fluorocroms com el taronja d'acridina (verd), la rodamina B (vermell) i el isotiocianat de fluoroscena (groc / verd). Si hi ha un organisme patgen marquem l'antics amb fluorocrom. El problema daquest mtode s detectar l'antgen. Immunofluorescncia (anticossos fluorescents). s molt til en diagnosis. Tamb s'utilitza per a l'observaci de la morfologia, la grandria, les agrupacions cellulars i recomptes.

11

2. Microscopia MICROBIOLOGIA

MICROSCPIA EN TRES DIMENSIONS Microscopi confocal: Confocal Scanning Laser Microscopy (CSLM) Serveix per a estudiar les poblacions en els seus ambients. s un microscopi computeritzat que acobla una font lser. Ens forma imatges digitalitzades en tres dimensions. Necessitem un software pel processament de les imatges , s'han de fer tincions amb colorants fluorescents i ens dna imatges amb color falses, ajustant el microscopi. Un bon s d'aquest microscopi s buscar els microorganismes que formen biopellcules. Aquests s'installen i secretes isopolmers acabant fent biopellcules (o bifils). En formen tamb en medis no naturals