manual de hemostasia y banco de sangre actualizado

Laboratorio No 1Tema:

MORFOLOGIA Y RECUENTO DE PLAQUETAS

Objetivo

Los estudiantes estarán en capacidad de realizar un recuento de plaquetas con los diversos métodos.

Fundamento

Las plaquetas representan fragmentos citoplasmáticos derivados de los megacariocitos. Están rodeadas por la clásica membrana celular de doble capa lipídica que contiene diversos receptores y fosfolípidos funcionalmente importantes. Las plaquetas en circulación no se adhieren unas con otras, ni a la superficie endotelial, pero pueden ser estimuladas a agregarse por varios mediadores, jugando un papel importante en la hemostasia.Para ello forman nudos en la red de fibrina, liberan substancias importantes para acelerar la coagulación y aumentan la retracción del coágulo sanguíneo. En las heridas las plaquetas aceleran la coagulación, y además al aglutinarse obstruyen pequeños vasos, y engendran substancias que los contraen.El recuento de plaquetas se realiza en sangre anticoagulada con EDTA y diluida con oxalato de amonio al 1% o citrato de sodio al 3,8% mediante el uso de la pipeta para dilución de hematíes. En el extendido se sangre periférico, las plaquetas se observan con una tonalidad levemente basófila lo cual permite detallar una zona central granular llamada cronómetro y una zona periférica más clara denominada hialómero.

Materiales y EquiposItem Tipo Descripción

01 MAT Sangre con EDTA

02 MAT Pipeta para la dilución de hematíes03 MAT Agua destilada

04 MAT Cámara de Neubauer

05 MAT Microaspirador

06 MAT Caja de Petri con papel filtro humedecido07 MAT Laminas

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

CLAUDIA XIMENA LOZANO TRUJILLO CLAUDIA MONTEJO

Fecha 30 de Noviembre de 2010 Fecha Fecha

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Unidad de Formación

Versión: 001 Fecha: 30 DE NOV 2010

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Código: UC-BAC-BAN-GL007

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0809 EQU Microscopio

ReactivosÍtem Descripción

01 Solución de Oxalato de amonio al 1% o solución de citrato de sodio al 3,8%02 Solución limpiadora03 Aceite de inmersión

04 Colorante de Wright

ProcedimientoPaso1 METODO INDIRECTO

1. Realizar extendido de Sangre periférica2. Colorear el frotis con Colorante de Wright3. Dejar secar la coloración4. Primero observar en objetivo de 10X para buscar la zona ideal.5. Pasar a objetivo de alto poder 100X, Colocar aceite de inmersión.6. Identificado el sitio donde se observen 100 glóbulos rojos por campo, contar plaquetas en 10 campos microscópicos, y sumar el número total, sacar el promedio dividiendo por diez.7. Luego este resultado lo multiplicamos por una constante que es 21.000 y el resultado se da en milímetro cúbico (mm³). Si el recuento es muy bajo contar en 20 campos.

2 METODO DIRECTO

1. Mezcle cuidadosamente la sangre anticoagulada por inversión, por lo menos 30 veces, con el fin de obtener una muestra homogénea.2. Llene la pipeta con la muestra de sangre hasta la marca 1.0 exactamente; haga uso del microaspirador3. Elimine el exceso de sangre de las paredes externas de la pipeta para no contaminar la solución diluente.

4. Aspire el líquido diluente hasta la marca 101 exactamente.5. Sujete la pipeta entre los dedos índice y pulgar, desprenda el microaspirador y agite la pipeta en forma horizontal durante tres minutos.




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6. Deje reposar la pipeta por 10 minutos si esta trabajando con oxalato de amonio al 1% con el fin de lograr la hemólisis total de los glóbulos rojos.7. En caso de trabajar con Citrato de sodio al 3,8% omita este paso8. Agite nuevamente9. Descarte las primeras 4 gotas, para eliminar el líquido del capilar e inmediatamente llene la cámara en ambos lados.10. Coloque la cámara en ambiente húmedo por 10 minutos. El ambiente húmedo se logra cubriendo la cámara con una caja de petri que llevara adherido un disco de papel filtro humedecido con agua.11. Coloque la cámara en el microscopio. Enfoque con objetivo de 40X y observe el llenado de la cámara, no deben existir agregados plaquetarios.12. Cuidadosamente enfoque el cuadrado central.13. Disminuya la intensidad de la luz y así le será más fácil distinguir y contar las plaquetas.14. Las plaquetas se reconocen como estructuras pequeñas, opacas, redondas o alargadas a veces con prolongaciones, que son medianamente retráctiles.15. El numero esta determinado por el conteo de los 25 cuadrados en que se subdivide elcuadrado central, descartando las plaquetas que tocan las líneas derecha e inferior.

3 CALCULO

El número de plaquetas por mm³ se calcula de acuerdo a:

• Volumen del área contada: 0.1 mm³ ( 1 X 1 X 0.1)• Dilución utilizada: 1:100• Numero de células contadas

Plaquetas por mm³ = Nº de células contadas X 1 X dilución

Plaquetas por mm³ = Nº de células contadas X 10 X 100

Plaquetas por mm³ = Nº de células contadas X 1.000

4 VALORES DE REFERENCIA:

El rango normal para el recuento de plaquetas es de Unidades clásicas:

150.000 – 400.000 / mm³

.5 OBSERVACIONES




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1. Correlacione el número de plaquetas observadas con el recuento obtenido en cámara, usualmente se observan de 8 – 2 0 plaquetas individuales por campo con objetivo de alto poder2. Observe el tamaño de la plaqueta circulante. Frecuentemente se pueden observar en bajo porcentaje, algunas plaquetas con tamaño mayor (macroplaquetas)3. Se debe tener especial cuidado con las soluciones diluentes, estas no deben estar contaminadas pues tanto las partículas como las bacterias pueden simular plaquetas.4. La limpieza de las cámaras y de las pipetas es extremadamente importante en este procedimiento.5. Los líquidos diluentes se deben mantener refrigerados y filtrar antes del uso 6. Si observa agregados en el recuento, el procedimiento debe repetirse.

7. No se debe reportar el recuento de plaquetas Directo sin confrontarlo con el extendido de sangre periférico coloreado con Wright.8. La diferencia del número de plaquetas entre los cuadrados centrales de la cámara no debe ser mayor de 10 plaquetas.

Consulta

1. Qué valores de referencia tienen las plaquetas?2. Cuál es el valor normal del volumen plaquetario medio?3. Por el método automatizado que errores se pueden tener en el recuento de plaquetas?4. Qué es el dimorfismo plaquetario5. En qué circunstancias fisiológicas y patológicas podemos encontrar trombocitosis y

trombocitopenia?

Bibliografía

BERRIO, M. et-al El hemograma, análisis e interpretación con las tres generaciones. Editorial Universidad de Antioquia. Medellín, Antioquia 2003.

VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

ANEXOS No. Anexo NO APLICA




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Laboratorio No 2Tema: TIEMPO DE SANGRIA

Objetivo

Determinar la función plaquetaria mediante pruebas de tamizaje que requieren una detallada historia clínica, manifestaciones hemorrágicas y evaluación del riesgo hemorrágico.




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Fundamento

La hemostasia primaria se evalúa mejor con el tiempo de sangría, la cual es una medición in vivo de la función de las plaquetas. Existen varios factores que afectan el tiempo de sangría, los cuales incluyen el número de plaquetas, su función y la integridad vascular.En 1910, Duke describió el método de tiempo de sangría como una pequeña incisión en el lóbulo de la oreja (valor normal de 1 a 3 minutos) y relaciono la prolongación de este tipo de hemorragia con trombocitopenia. Más tarde IVY modifico esta prueba para hacerla mas fidedigna y establece una técnica estandarizada que incluye tres aspectos fundamentales

Zona apropiada de la cara volar proximal del antebrazo Presión por encima del antebrazo a 40 mm Hg para conseguir una

presión constante, creando estasis venosa. La venostasia producida por la presión hace que los vasos permanezcan llenos de sangre

Bisturí (simplate) que permita una incisión de 5 mm de longitud y 1 mm de profundidad.

METODO ESTANDARIZADO IVY:

La hemorragia provocada en la piel, al lesionar pequeños vasos, se detiene por la constricción de estos (vasoconstricción) y por la formación del tapón plaquetario en el sitio de la lesión.


01 MAT Algodón

02 MAT Papel de filtro

03 MAT Lancetas desachables (Simplate)

06 EQU Tensiómetro

07 EQU Cronometro


01 AlcoholElaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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ProcedimientoPaso1 Colocar el tensiómetro, en el tercio superior del brazo,

elevándolo a una presión de 40 mm Hg. Esta presión es mantenida durante la prueba

Seleccionar un area de la parte extrema del antebrazo, libre de venas y cicatrices

Limpiar con prepodine esta zona y dejarla secar

2 Realizar una incisión horizontal con el Simplate, que realiza dos incisiones (estandarizadas) de 1 mm de profundidad por 5 mm de longitud. (la dirección de la incisión en el antebrazo tiene un efecto sobre el resultado. Se registran tiempos ligeramente más largos cuando la incisión es horizontal que cuando es vertcal)

3 Poner en marcha el cronometro Cada 30 segundos limpiar la sangre con papel filtro, tener

cuidado de no tocar el sitio de la lesión Detener el cronometro en el momento en que la hemorragia

cese y retirar el tensiómetro.

4 Valores Normales:1 a 9 minutos

5 OBSERVACIONES:

El tiempo de sangría es más corto en niños recién nacidos que en adultos; tiende a ser más prolongado en mujeres y disminuye con la edad

El tiempo de sangría es inversamente proporcional al número de plaquetas, al volumen de las plaquetas y al hematocrito (la anemia aumenta el tiempo de sangría y la eritrocitosis lo disminuye)

Pacientes con recuentos de plaquetas inferiores a 50.000lmm3

no se les debe practicar la prueba Pacientes que estén recibiendo tratamiento a base de acido

acetil salicílico deben esperar mínimo de siete a nueve días de ser suspendido el medicamento para poder realizarle la prueba

6 La prueba de tiempo de sangría es ordenada prequirurgicamente para determinar el riesgo de hemorragia




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perioperatoria y posoperatoria. Sin embargo, esta prueba mide la formación adecuada del tapón plaquetario en el sangrado superficial de la piel y no necesariamente en los órganos internos

Estudios realizados recientemente han demostrado que el tiempo de sangría no es confiable cuando se usa como una prueba de tamizaje para evaluar el riesgo de sangrado excesivo perioperatorio. Un tiempo de sangría anormal puede llevar a posponer innecesariamente una cirugía, a realizar pruebas adicionales, y posiblemente, a un tratamiento inapropiado para normalizar el tiempo de sangría

Se demuestra una vez más, que una prueba única no reemplaza una buena historia clínica ni el estudio integral prequirúrgico, dentro del contexto clínico y de lógica medica. Desde el punto de vista técnico, el tiempo de sangría es muy difícil de controlar a no ser que se utilice un método estandarizado.

Consulta

1. Mencione y explique en qué consisten los diferentes métodos que existen del tiempo de sangría

2. Indique en que patologías se aumenta el tiempo de sangría3. Mencione los medicamentos que alteran el tiempo de sangría

BibliografíaDescripciónBERRIO, M. et-al El hemograma, análisis e interpretación con las tres generaciones. Editorial Universidad de Antioquia. Medellín, Antioquia 2003.

BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993.MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985.LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006




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ANEXOS (Si los hay)No. Anexo Descripción

NO APLICA


TIEMPO DE PROTROMBINA (PT) Y TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA TISULAR (PTT)

Objetivo

Realizar la determinación del tiempo parcial de tromboplatina tisular y el tiempo de protrombina, como medio para valorar la coagulación sanguínea en un paciente.

Fundamento

TIEMPO DE PROTROMBINA (PT)

Cuando se añade calcio y un extracto místico al plasma, el facto VII reacciona




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con el factor místico y se forma un producto que convierte el factor X a su forma activa el factor Xa, este a su vez reacciona con el factor V, con el calcio y con los fosfolípidos para formar la protrombina en trombina. Entonces la trombina convierte el fibrinógeno en fibrina. La velocidad de formación de la fibrina depende de los factores V, VII, X, II y I por lo cual, esta prueba es empleada para medir la actividad total de estos factores.RESULTADOS E INTERPRETACION:

El control normal debe dar un Tiempo de Protrombina (PT) en 10.5 y 13.5 segundos que corresponde a un INR de 1.0. El cual esta prolongado cuando existe deficiencia congénita adquirida de los factores V, VII, X o protrombina, cuando el fibrinógeno esta por debajo de 100 mg% y cuando aparecen productos de degradación de fibrinógeno o de fibrina o hay heparina. En la policitemia el PT puede estar prolongado como consecuencia de una desproporción plasma / anticoagulante.EL PT es la prueba mas comúnmente usada para controlar la terapia anticuoagulada oral con antagonistas de la vitamina K para el tratamiento y la prevención tanto de trombosis venosa como de tromboembolismo arterial. La

medicación debe controlarse regularmente con PT para prevenir la sobreanticoagulante y el riesgo del sangrado.La estandarización de la prueba de PT se ha hecho con la introducción de patrones internacionales de tromboplastina y con la definición de una escala internacional de actividad anticoagulante. En 1983 la OMS adopto un sistema de normalización del PT para permitir la estandarizacion internacional del control anticoagulante oral. Los valores de los pacientes se informan en términos de la relación internacional (INR). Este sistema también ha sido recomendado por el Comité Internacional de Trombosis y Hemostasis (ICTH) y por el Comité Internacional para Estandarización de Hematología (ICSH).FARMACODINAMICA DE LAS DROGAS CUMARINICAS:

La síntesis de factores de coagulación vitamina K dependientes (II – VII – IX – X) en el hígado puede ser inhibida por derivados de la 4- hidroxicumarina y la indandiona.2

Normalamente la Vitamnina K cataliza la carboxilación de los residuos de acido glutámico en los factores de coagulación II, VII, IX y X así como en los inhibidores naturales de la coagulación proteína C y proteína S.Los residuos modificados de acido glutámico (acido-gama-carboxi-glutámico) son necesarios para la interacción, mediada por calcio, de estas proteínas con




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fosfolípidos cargados negativamente.

Los antagonistas de la vitamina K bloquean indirectamente la formación de residuos de acidogamacarboxiglutamico, llevando a la liberación en la circulación de proteínas inmodificadas llamadas PIVKA (Proteínas induced by vitamina K absebce / antagonist).Las PIVKA no tienen actividad funcional fisiológicamente importante, pero pueden afectar la determinación del PT efectuada con algunos reactivos de tromboplastina.

RELACION NORMALIZADA INTERNACIONAL (INR):

Para obtener una escala universal de actividad anticuogulante oral la OMS y el ISTH – ICSH han recomendado conjuntamente que el PT debiera convertirse a

INR. Por definición el INR es la relación de PT que se habría obtenido si se hubiera usado la Preparación Internacional de Referencia de la OMS.En la práctica el INR del plasma de un paciente se deriva de la relación de PT y del índice de Sensibilidad Internacional (ISI) de la tromboplastina.

El INR se calcula usando la siguiente fórmula:

INR: (PT PACIENTE) ISI (PT NORMAL)

La OMS ha propuesto que los fabricantes de tromboplastina indiquen la sensibilidad de cada lote de reactivo con el ISI correspondiente y que proporcionen una tabla de conversión en términos de los resultados de PT.Es importante tener en cuenta las variaciones que pueden causar imprecisión del INR, estas incluyen: imprecisión en la calibración del ISI por un método anunciado, estimada en aproximadamente 5%

Variación entre laboratorios en la relación mediada para el PT, estimada en aproximadamente 7% para ISI de 1.0 y de 9% para ISI de 2.0

La variación biológica del INR de un paciente estimada en aproximadamente 8%,. Para tromboplastina con un ISI de 1.0 parece posible limitar la variación total en el INR de un paciente de 11 a 13.5%. Para tromboplastinas con un ISI




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de 2.0 a 2.5 puede observarse una variación más grande de hasta 26%. Por lo tanto no se recomienda utilizar para PT tromboplastinas que tengan un ISI superior a 2.5.Entre las mas importantes variables pre-prueba están, pronta centrifugación, minimización de los efectos de envejecimiento de la muestra, adecuada técnica de congelación y descongelación, presencia de heparina, anticoagulante usado para el plasma, entre otros.

Para efectos prácticos de unificación de resultados, se recomienda informar el resultado de PT así:Resultados en segundos del paciente, control normal en segundos; e INR,

correspondiente al resultado del paciente.Se considera prolongado un PT cuando el INR sea superior a 1.3.

TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA TISULAR

Cuando se añade calcio y cantidad suficiente de fosfolípidos plaquetarios al plasma, se activan todos los factores de la coagulación necesarios para la formación de protombinasa intrinsica, esta activa la protombina y la trombina así formada convierten el fibrinógeno en fibrina.5

VALOR NORMAL: 25 a 35 seg

INTERPRETACION:

El PTT esta prolongado en las deficiencias congénitas o adquridas de uno o mas de los factores XII, XI, X, IX, VIII, V, protombina y fibrinógeno. Esta prolongado si el fibrinógeno es inferior a 100 mg%; cuando aparecen productos de degradación de fibrinógeno o de fibrina. Puede estar prolongado en presencia de anticuerpos antifosfolipido anticoagulante lúpico. En individuos normales que no tienen historia hemorrágica ni alteraciones de los factores de coagulación ocasionalmente se encuentra un PTT ligeramente prolongado.El PTT es la prueba mas comúnmente usada para controlar terapia anticoagulante con heparina. La heparina tiene una vida media de aproximadamente 4 horas, requiere de antitrombina III como cofactor para poder inactivar las proteasas de serina activadas (Factor XIIa, XIa, IXa, Xa y IIa), su efecto anticoagulante es inmediato, dato que se debe tener en cuenta cuando se este monitorizando un paciente heparinizado.




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FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ANTICUAGULANTE DE LA HEPARINA IN VIVO

Destrucción plaquetaria y liberación del factor plaquetario 4 Tipo de heparina Proporción de difusión en el espacio extravascular Resistencia del paciente después de una trombosis Medicamentos que interfieren: Antibióticos, nicotina, glucosa 5% en

agua, antihistaminicos.

FACTORES QUE AFECTAN IN VITRO

Tiempo de recolección Liberación del factor plaquetario 4 por recolección o centrifugación

inadecuada Anticoagulante (citrato u oxalato) Dosificación incorrecta Pruebas utilizadas para monitorizar


01 MATPlasma citratado del paciente

02 MAT Tubos de vidrio de 12mm x 7.5 cm

03 MAT Micropipetas graduadas de 100 y 200 microlitros

04 MAT Pipetas volumétricas de 1,2 y 5 ml

05 EQU Cronómetros

06 EQU Baño Maria 370C

ReactivosElaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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Ítem01 Reactivo de Tromboplastina

02 Agua destilada

03 Plasma control normal

04 Cloruro de calcio 0.025 M

05 Reactivo para PTT

ProcedimientoPaso

1 PT

Precalentar a 370C los tubos de ensayo Para la reconstitución y conservación del reactivo deberán

seguirse las instrucciones indicadas por el fabricante Precalentar a 370C 0.2 ml de reactivo por cada prueba. Evitar

la evaporación del reactivo no dejándolo a 370C por un tiempo superior a 60 minutos

Realizar por duplicado cada prueba iniciando con un control normal

Pipetear o.1 ml de plasma en el tubo correspondiente Incubar el plasma 2 – 3 minutos mínimo y máximo 5 minutos Pipetear 0.2 ml de reactivo preincubado y simultáneamente

disparar el cronometro Parar el cronometro en el momento de la formación del coagulo

Consulta1. En que casos se puede alterar el PT2. En que casos se puede alterar el PTT3. En que casos se puede alterar el PT y el PTT

Bibliografía





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BROWN B. Hematology: priciples and procedures 6ª ed. Filadelfia. Lea & Febiger; 1993.MIALE JB. Hematologia medicina de laboratorio 6ª ed. Barcelona: Revertè; 1985.LEE GR. Et al. Wintrobe’s clinical hematology. Filadelfia: Williams & Wilkins; 1999.WILLIAM WJ. Et al. Hematology. 5ª ed. Nueva York. San Luis; 1995.VIVES J.L. Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. Editorial Salvat.

TURGEON, M. Hematología clínica. Teoría y Procedimientos. Editorial El Manual Moderno. 2006

ANEXOS No. Anexo Descripción

NO APLICA




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Laboratorio No 4Tema: HEMOCLASIFICACION DIRECTA E INVERSA

Objetivo

Determinar la clasificación sanguínea en relación con sistema ABO y el sistema RH, efectuando pruebas que identifique el tipo sanguíneo de cada uno de los pacientes.

Fundamento

GRUPOS SANGUINEOS

El grupo sanguíneo es cada uno de los diversos tipos en que se ha clasificado la sangre de las personas en relación con la compatibilidad de los hematíes y suero de otro individuo que la recibe. Estos grupos son cuatro, según la clasificación que hizo Landsteiner, clasificación hoy universal y se denominan: O, A, B, AB. Se caracterizan por las diferentes combinaciones de dos aglutinógenos existentes en los glóbulos rojos y de dos aglutininas contenidas en el suero.FACTOR Rh:

El factor Rh es un aglutinógeno encontrado en 1940 por Landsteiner y Weiner, en los glóbulos rojos en unos primates (Macacus rhesus) y que también existe normalmente en el 85% de los humanos, que por esta causa se denomina Rh positivos.

La sangre de estos transfundida a los Rh negativos (15%), provoca en el suero de estos últimos la formación de anticuerpos, que en sucesivas transfusiones pueden destruir los glóbulos rojos del donante Rh positivo, invalidando así la transfusión y creando efectos adversos. También en el embarazo un feto Rh + puede provocar en la madre Rh – la producción de aglutininas que podrán ser la causa de la enfermedad hemolítica de los recién nacidos.

El factor Rh esta constituido por un complejo de seis antígenos fundamentales, formado por tres




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pares de genes alelos: Cc, Dd, Ee. El antígeno de mayor poder sensibilizante es el D, le siguen en importancia el e y el E.

Un grupo sanguíneo es una forma de agrupar ciertas características de la sangre que dependen de los antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos y en el suero de la sangre.

Las dos clasificaciones más importantes para describir grupos sanguíneos en humanos son los antígenos y el factor Rh. Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden desembocar en hemólisis, anemia, fallo renal, shock y muerte.LOS ANTIGENOS:

Las personas con sangre del tipo A tienen glóbulos rojos que expresan antígenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antígenos B en el suero de su sangre.

Análogamente, las personas con sangre del tipo B tienen la combinación contraria, glóbulos rojos con antígenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre.

Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antígenos (A o B) en la superficie de sus glóbulos rojos, pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antígenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos.

A causa de estas combinaciones, el tipo O puede ser transfundido sin ningún problema a cualquier persona con cualquier tipo ABO y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo ABO

HERENCIA DEL TIPO ABO:

Los grupos sanguíneos son heredados de los progenitores. Son controlados por un solo gen con tres alelos: O, A, B

El alelo A da tipo A, el B da tipos B y el alelo i da tipos O, siendo A y B dominantes sobre i. Así las personas que heredan dos alelos ii tienen tipo O; AA o Ai dan lugar a tipo A; y BB o Bi dan lugar a tipos B. Las personas AB tienen ambos fenotipos debido a que la relación entre los alelos A y B es de codominancia. Por lo tanto, es prácticamente imposible para unos progenitores AB el tener un hijo con tipo O.HERENCIA DEL FACTOR RH:

El factor Rh es heredado de la misma forma, con la diferencia de que hay dos alelos y el Rh es

dominante. Los alelos son Rh + y Rh –




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FRECUENCIA:

La distribución de los grupos sanguíneos en la población humana no es uniforme. El más común es O+, mientras que el mas infrecuente es AB-. Además, hay variaciones en la distribución en las distintas subpoblaciones humanas.

TIPO 0+ A+ B+ O- A- AB+ B- AB-FRECUENCIA 40% 34% 9% 7% 6% 3% 2% 1%

DETERMINACION DEL GRUPO SANGUINEO ABO

Las pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificación sanguínea relacionada a los diversos grupos sanguíneos, aprovechan las características inmunológicas que expresa cada individuo de acuerdo a su particular codificación genética.

En dichas pruebas se evidencian los antígenos y/o anticuerpos del grupo sanguíneo, de acuerdo a su comportamiento in Vitro. En cuanto al sistema ABO se investigan tanto antígenos o aglutinógenos como los anticuerpos o isoaglutininas naturales.

Loa glóbulos rojos utilizados en estos procedimientos poseen en la membrana los antígenos, además nos facilitan la visualización de la reacción como si fuesen los indicadores del punto final de la hemoaglutinación.La hemoaglutinación se considera la reacción de Ag – Ac de mayor utilidad en el laboratorio de inmunohematología, por lo que se hace indispensable recordar las características y las condiciones que modifican dicha reacción, para poder determinar con claridad los requerimientos óptimos que permitan obtener la mayor constante de equilibrio en cada prueba especifica y en esta forma se asegure la confiabilidad y contribución exitosa de los procedimientos empleados en el estudio de los grupos sanguíneos.

HEMOCLASIFICACION: SISTEMA Rh (Ag D)

En el sistema Rh, existen varios antígenos: D, C, c, E, e; sin embargo, de rutina, solo se determina la presencia del Ag D en los eritrocitos y de acuerdo a su presencia o ausencia se dice que un individuo es Rh D positivo o Rh D negativo

DETERMINACION DEL Ag DEBIL

Consiste en determinar la variante D débil en una muestra previamente tipificada como Rh: D negativo




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La determinación de la variante D débil, solo se realiza a muestras que por el método manual usual han resultado D negativas


01 MAT Glóbulos rojos A, B y OTubos de ensayo

02 MAT Pipetas pasteur03 MAT Muestra de sangre con EDTA

04 MAT Suero del pacienteLaminas del pacientePalillos

05 EQU Centrifuga


01 Solución salina 0.85%

02 Anti A, Anti B, Anti A,B

03 Anti D

04 Albumina Bovina

ProcedimientoPaso1 HEMOCLASIFICACION DIRECTA:

A. Método en tubo:

Marque los tubos con Anti A, Anti B, Antti A,B Lavar los glóbulos rojos del paciente 3 veces consecutivos en solución salina




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y preparar una suspensión final al 3% en dicha solución. Adicionar:

2A B AB

Reactivo anti-A 2 gotas - -Reactivo anti-B - 2 Gotas -

Reactivo anti AB - - 2 GotasGR paciente 1 Gota 1 Gota 1 Gota

3 Mezclar cada tubo y centrifugar 15 – 30 segundos Resuspender suavemente los botones celulares y observar aglutinación

POSITIVO: Aglutinación con cualquier antisuero. Reacciones positivas 3+ o 4+ de aglutinación.

NEGATIVO: La presencia de una suspensión uniforme de GR (O)

4 HEMOCLASIFICACION DIRECTA:

B. Método en lamina:

Marcar tres laminas portaobjeto como A, B y AB Adicionar:

5A B AB

Reactivo anti-A 2 gotas - -Reactivo anti-B - 2 Gotas -

Reactivo anti AB - - 2 GotasGR paciente 1 Gota 1 Gota 1 Gota

6 Mezclar cada preparación con un palillo Rotar manualmente cada lamina Observar aglutinación y registrar los resultados

POSITIVO: La aglutinación fuerte de los glóbulos rojos en presencia de cualquier anticuerpo ABO. Las reacciones positivas muestran 3+ de aglutinación

NEGATIVO: La presencia de una suspensión uniforme (O) de glóbulos rojos.

7 HEMOCLASIFICACION INVERSA:




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PRUEBA INVERSA EN TUBO:

Marcar tres tubos como A, B, O Adicionar:

8 A B OSuero paciente 2 Gotas 2 Gotas 2 Gotas

GR A 1 Gota GR B 1 GotaGR O 1 Gota

9 Incubar de 5 – 15 minutos a temperatura ambiente Mezclar cada tubo y centrifugar por 15 – 30 segundos Al terminar la centrifugación observar el sobrenadante para evidencia la

presencia de hemólisis. Resuspender los botones celulares y observar aglutinación.

10 POSITIVO: Aglutinación y/o hemólisisNEGATIVO: Una suspensión homogénea de eritrocitos.

11 Prueba directa en lamina:

Marcar dos laminas como D y control Adicionar:

12 D ControlSuero Anti-D 2 Gotas -

Albúmina Bovina 22% - 2 GotasSangre 1 Gota 1 Gota

13 Mezclar con palillos cada preparación Rotar manualmente las laminas y observar aglutinación.

POSITIVO: Aglutinación de glóbulos rojosNEGATIVO: Una suspensión uniforme de glóbulos rojos

14 OBSERVACIONES:




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Si la preparación de glóbulos rojos con albúmina al 22% presenta aglutinación, la prueba no se puede interpretar.La desecación en los bordes de la preparación, no se debe confundir con aglutinación.

15 Prueba directa en tubo: Lavar los glóbulos rojos del paciente tres veces con solución salina y

suspenderlos del 3 – 5% Marcar dos tubos como D y control Adicionar

16 D CONTROLSuero Anti D 2 Gotas -

Albúmina Bovina al 22% - 2 GotasGR paciente 1 Gota 1 Gota

17 Mezclar suavemente y centrifugar durante 15 -30 segundos Resuspender el botón celular y observar aglutinación

POSITIVO: La aglutinación de los glóbulos rojos con anti-DNEGATIVO: Una suspensión uniforme de los glóbulos rojos con anti-D

18 OBSERVACIONES:

Si en el control se observa aglutinación, la prueba no se puede interpretar, hasta realizar mas análisis.

19DETERMINACION DEL Ag DEBIL

Lavar los eritrocitos a tipificar 3 veces con solución salina y suspenderlos al 3 – 5%

Marcar dos tubos con D y ControlAdicionar:

20D CONTROL

Anti – D 2 Gotas -Albúmina Bovina - 2 Gotas




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GR paciente 1 Gota 1 Gota

21 Mezclar e incubar los tubos a 370C durante 15 – 30 minutos, según las

especificaciones del fabricante Centrifugar 15 – 45 seg Resuspender los botones celulares suavemente y observar la presencia de

aglutinación. Si el tubo con anti – D, los eritrocitos están fuertemente aglutinados, pero no en el tubo control, registrar la prueba como D positiva y no realizar la fase siguiente con el suero de Coombs

22 Si las células no son aglutinadas o los resultados son dudosos, lavar los

eritrocitos 3 veces con abundante solución salina. Decantar la SS. Adicionar:

23D CONTROL

Suero de Coombs 1 Gota 1 Gota

24 Mezclar y centrifugar 15 – 30 seg Resuspender suavemente cada botón celular, examinar para aglutinación y

registrar el resultado teniendo en cuenta la escala de intensidad. Si hay aglutinación en el tubo de prueba con anti – D, entonces el resultado es D positivo.

Si el resultado es negativo, adicionar:

25 D CONTROLCélulas control de

Coombs1 Gota 1 Gota

26 Las células control de Coombs son GR O Rh D positivo sensibilizados con anti D

Repetir la centrifugación por 15 – 30 seg. La aglutinación en este punto refleja la presencia de suero antiglobulina libre y confirma que la reacción era realmente Negativa




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27

Consulta

1. Que es el Fenotipo Bombay

2. Realice una tabla de compatibilidad entre los grupos sanguíneos, teniendo en cuenta para cada grupo el Rh (-) y el Rh (+)..

Bibliografía



ANEXOS No. 1

RESULTADOS DEL LABORATORIO

GRUPO NO: _______

INTEGRANTES:

HEMOCLASIFICACCION ABO:

Directa en lamina Directa en tubo Inversa




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ANTI- A ANTI-B ANTI AB

ANTI- A ANTI-B ANTI AB

A B O

Resultado de la muestra analizada:

Grupo:____________

No. 2 Hemoclasificación Rh:

Directa en lamina Directa en tubo Anti – D Control Anti – D Control

Hemoclasificación: Ag D DEBIL

D CONTROLCentrifugacion

inmediataFase Coombs

Celulas control de Coombs

Resultados de la muestra analizada:




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Rh: _________Ag D débil: ____________

ANALISIS:


COOMBS DIRECTO E INDIRECTO

Objetivo Conocer el procedimiento de las pruebas de compatibilidad y adquirir destreza en la

realización del coombs directo e indirecto Interpretar cada uno de los resultados y tomar decisiones en las incompatibilidad de las

pruebas

Fundamento

COOMBS DIRECTO

Se usa para demostrar in vivo la cobertura de los eritrocitos con globulinas. Es útil en la investigación de anemias hemolíticas autoinmunes, hemólisis inducida por drogas, eritroblastosis fetal, reacciones aloinmunes contra eritrocitos recientemente transfundidos.Significado de los resultados anormales:

Un examen de Coombs directo positivo indica anticuerpos contra los glóbulos rojos, los cuales a su vez pueden indicar la presencia de una de las siguientes condiciones

Anemia hemolítica autoinmune sin otra causa subyacente Anemia hemolítica inducida por medicamentos Eritroblastosis fetal




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Mononucleosis infecciosa Infecciones por Micoplasma Sífilis Leucemia linfocítica crónica u otro trastorno linfoproliferativo Lupus eritematoso sistémico u otra condición reumatológica Reaccion a transfusión como la ocasionada por unidades de sangre de compatibilidad

inadecuada Esta prueba también es anormal en algunas personas sin que exista una causa clara,

especialmente en personas de edad avanzada. Hasta el 3% de las personas que están

hospitalizadas sin un trastorno sanguíneo conocido tendrán un resultado anormal en el examen de Coombs directo.

COOMBS INDIRECTO

Detecta anticuerpos hacia los glóbulos rojos en la circulación. Es importante para la determinación de la compatibilidad entre dador y receptor en el caso de transfusiones de sangre. Detecta también la presencia de anticuerpos anti Rh en la madre durante el embarazo. Evalúa la necesidad de administrar inmunoglobulina Rh (Ag D). Ayuda a confirmar el diagnostico de anemia hemolítica.

Significado de los resultados anormales:

Test positivo indica la presencia de anticuerpos circulantes contra los glóbulos rojos En la embarazada con sangre Rh negativo, un test con titulo positivo alto significa que el

feto puede desarrollar la enfermedad hemolítica del recién nacido.

CELULAS CONTROL DE COOMBS

Cuando las pruebas de la antiglobulina, directa e indirecta, dan negativas, es necesario verificar el reactivo antiglobulina. Una manera fácil es, a partir de la prueba negativa, poner la suspensión en contacto con eritrocitos O Rh+, sensibilizados con anti D conocidos como células control de coombs y leer de nuevo.INTERPRETACION:

La lectura con las células control de Coombs deben dar positivas, no mayor de dos cruces.

Es importante recordar que una prueba de la antiglobulina negativa, sin control, puede interpretarse como una prueba negativa, falsa.




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01 MAT Coombs directo

Muestra de sangre con anticoagulante EDTA Tubos de ensayo Tapones de caucho Gradillas Pipeta pasteur

02 MAT Coombs indirecto

Suero problema Muestra de sangre con anticoagulante EDTA Tubos de ensayo Micropipetas Gradillas Pipetas pasteur

04 MAT Baño Maria a 370C,

06 EQU centrifuga


01 Solución salina al 0.85%

02 Suero de coombs

03 Albúmina bovina

04 Suero anti – D

ProcedimientoPaso Descripción1 PRUEBA DE COOMBS DIRECTO




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Lavar los eritrocitos 3 veces con SS y suspenderlos del 3 – 5% Marcar dos tubos como CD y control Adicionar:

2CD CONTROL

Suero de Coombs 2 Gotas 2 GotasGR paciente 1 Gota -

GR O positivo - 1 Gota

3 También puede realizar su control adicionando dos gotas del GR del paciente y dos gotas de SS

Centrifugar 15 – 45 seg Resuspender los botones celulares suavemente y observar la presencia de

aglutinación Graduar la aglutinación 0, 1+, 2+, 3+, 4+. Si el resultado es negativo, adicionar:

4CD CONTROL

Células control de Coombs

1 Gota 1 Gota

5 Repetir la centrifugación de 15 – 45 seg La aglutinación en este punto refleja la presencia de suero antiglobulina libre

y confirma que la reacción era realmente negativa.

6OBSERVACIONES:

Si se presenta aglutinación en cualquier fase de la prueba en el tubo control, no se puede realizar la lectura.

7 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTO:

Separar el suero del paciente con el que se va a realizar la prueba Lavar los eritrocitos del paciente 3 veces con SS y suspenderlos del 3 – 5% Marcar dos tubos como CI y Control Adicionar:




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8

CI CONTROLGR Paciente 2 Gotas 2 Gotas

Suero del paciente 2 Gotas 2 Gotas

9 Centrifugar 15 – 45 seg Resuspender los botones celulares suavemente y observar la presencia de

aglutinación Si el resultado es negativo, adicionar:

10CI CONTROL

Albúmina Bovina 2 Gotas -Solución salina al 0.85% - 2 Gotas

11 Incubar a 370C por 20 minutos Después de la incubación los glóbulos rojos se lavan tres veces con SS al

0.85% En el ultimo lavado descartar la SS al 0.85% hasta que quede la muestra en

las paredes del tubo Adicionar

12CI CONTROL

Suero de Coombs 2 Gotas -Solución salina al 0.85% - 2 Gotas

13 Centrifugar 15 – 45 seg Resuspender los botones celulares suavemente y observar la presencia de

aglutinación Graduar la aglutinación 0, 1+, 2+, 3+, 4+. Si el resultado es negativo, adicionar:

14 CD CONTROLCélulas control de

Coombs1 Gota 1 Gota




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15 Repetir la centrifugación de 15 – 45 seg La aglutinación en este punto refleja la presencia de suero antiglobulina libre

y confirma que la reacción era realmente negativa.

16 CELULAS CONTROL DE COOMBS:

Lavar tres veces glóbulos rojos O+ Colocar 8 a 10 gotas de suspensión de glóbulos rojos O positivos Colocar la misma cantidad de antisuero anti D al tubo Incubar a 37oC por 30 minutos Lavar de 5 a 6 veces en solución salina 0.85% Resuspender al 3-5% en solución salina 0.85% Probar estos glóbulos rojos con una gota de suero de Coombs y buscar

aglutinación Este control dura 4-5 dias a 4oC

Consulta

1. Una de las fases de la prueba de coombs indirecta requiere albúmina, mencione cuál es la función de los potenciadores y que otros se pueden utilizar.

2. Cuál es la utilidad de las pruebas de coombs, explique3. De acuerdo a las diferentes fases en las que se realizan las pruebas de coombs, indique

que clase de anticuerpos se pueden presentar



ANEXOS Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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No. AnexoNo. Anexo

Prueba de Coombs directa

CD ControlCentrifugación

inmediataFase Coombs



Prueba de Coombs indirecta

CI ControlCentrifugación

inmediataFase albúminaFase Coombs






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Laboratorio No 6Tema: PRUEBAS CRUZADAS

Objetivo

Conocer el procedimiento de las pruebas de compatibilidad y adquirir destreza en la realización del Coombs directo e indirecto

Interpretar cada uno de los resultados y tomar decisiones en las incompatibilidad de las




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pruebas

Fundamento

ANTIGLOBULINA HUMANA O DE COOMBS

La prueba de antiglobulina o de Coombs, es un procedimiento necesario en el trabajo cotidiano de todo Banco de sangre, para demostrar la presencia de anticuerpos incompletos de grupos sanguíneos, de significación clínica, fracciones del complemento o algunos antígenos de los eritrocitos. Los anticuerpos incompletos, usualmente Inmunoglobulina G (IgG), son capaces de unirse a las células rojas, pero no de aglutinarlas cuando están suspendidas en solución salina, por las características de su molécula, el tamaño muy pequeño; sin embargo cuando se agrega otro anticuerpo, anti Ig G, la aglutinación se hace posible. Este anticuerpo Ig G en si, es el suero antiglobulina.

La prueba tiene una utilidad clínica muy amplia; es imprescindible cuando se trata de establecer la naturaleza inmune de diversas situaciones como: una reacción transfusional, la enfermedad hemolítica del recién nacido, una anemia hemolítica relacionada con drogas o con mecanismos autoinmunes. Forma parte de estudios pretransfusionales que deben realizarse tanto al donante como al receptor, como las pruebas de compatibilidad y la detección e identificación de anticuerpos inesperados.El principio de la prueba de la antiglobulina es demostrar anticuerpos incompletos, Inmunoglobulina G, o complemento, mediante el suero antiglobulina, el cual contiene un anticuerpo anti Ig G y / o un anticuerpo anticomplemento.

El suero antglobulina se prepara a partir de colonias diferentes de conejos inmunizados con

globulinas humanas. Los animales se inyectan con Ig G o betaglobulinas, altamente purificadas, las cuales actúan como inmunogenos y provocan una respuesta de anticuerpos contra esas globulinas humanas: anticuerpos anti Ig G o anticuerpos contra el complemento.

La prueba de la antiglobulina se hace mediante dos formas, la prueba directa y la prueba indirecta; son métodos similares, pero se diferencian en la reacción de sensibilización de las células rojas, es decir la unión entre antígeno y su correspondiente anticuerpo. En la prueba directa se demuestra esa sensibilización in vivo, en la prueba indirecta in Vitro.

PRUEBA DE COMPATIBILIDAD

Cuando a un paciente se le va a realizar una transfusión de cualquier componente que contenga glóbulos rojos, se debe clasificar para los sistemas ABO y Rh (Ag D) y buscar el componente del




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mismo grupo ABO y Rh (Ag D). Además debe realizarse pruebas de compatibilidad, entre el suero o plasma del receptor y los eritrocitos del donante


01 MAT Muestra de sangre con anticoagulante EDTA Pipetas pasteur

02 MAT Tubos de ensayo

03 MAT Micropipetas

04 MAT Gradillas

05 EQU Baño Maria a 370C

06 EQU Centrífuga


01 Suero problema

02 Albúmina Bovina

03 Suero de Coombs

04 Solución salina al 0.85%

ProcedimientoPaso Descripción1 La práctica consiste en buscar 1 unidad de sangre compatible.

Recolectar una muestra de sangre del receptor en tubo seco para obtener suero y en tubo con EDTA para lavar glóbulos rojos

Separar el suero del receptor Lavar los eritrocitos del receptor tres veces con solución salina y

resuspenderlos del 3-5%

2 Disponer de los tubos pilotos la bolsa proveniente del donante Lavar los glóbulos rojos provenientes de los pilotos del donante tres veces




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con solución salina y resuspenderlos del 3-5% El procedimiento que se describe a continuación se debe realizar para cada

una de las unidades a transfundir Marcar dos tubos uno con el numero de la bolsa y el otro como autocontrol Adicionar:

3 FASE SALINA:

PRUEBA CRUZADA AUTOCONTROLSuero receptor 2 Gotas 2 Gotas

GR donante 1 Gota -GR receptor - 1 Gota

4 Centrifugar 30 – 45 seg Observar la presencia de hemólisis en el sobrenadante. Resuspender los

botones para observar aglutinación; si existe graduarla según la escala La presencia de hemólisis o aglutinación, constituye una prueba cruzada

incompatible, una suspensión homogénea de eritrocitos se considera como una prueba cruzada compatible en la Fase Salina o inmediata.

5 FASE ALBUMINA:

PRUEBA CRUZADA AUTOCONTROLAlbúmina bovina 2 Gotas 2 Gotas

6 Incubar 15-30 minutos a 370C Centrifugar 30 – 45 seg Observar la presencia de hemólisis en el sobrenadante. Resuspender los

botones para observar aglutinación; si existe graduarla según la escala La presencia de hemólisis o aglutinación, constituye una prueba cruzada

incompatible, una suspensión homogénea de eritrocitos se considera como una prueba cruzada compatible en la Fase de Albúmina

Lavar tres veces con SS y decantar bien el sobrenadante en el ultimo lavado

7FASE DE COOMBS:

PRUEBA CRUZADA AUTOCONTROLSuero de Coombs 2 Gotas 2 Gotas

8 Centrifugar 30 – 45 seg




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Resuspender los botones para observar aglutinación. Si existe, graduarla según la escala

La presencia de hemólisis o aglutinación, constituye una prueba cruzada incompatible, una suspensión homogénea de eritrocitos se considera como una prueba cruzada compatible en la Fase de Coombs

Si el resultado es negativo, adicionar:

9PRUEBA CRUZADA AUTOCONTROL


1 Gota 1 Gota

10 Centrifugar 30 – 45 seg Observar aglutinación y registrar los resultados La presencia de hemólisis o aglutinación, confirma que la prueba era

realmente negativa en la fase de Coombs y que se ha trabajado correctamente. (Este es un control interno que no se informa).

11 OBSERVACIONES:

En algunos centros se emplean medios diferentes a la albúmina para disminuir el potencial Z; entre ellos están la solución salina de baja fuerza iónica (LISS), el Polietilenglicol (PEG) y el Polibreno de baja intensidad (LIP). Para cada uno existen protocolos que se deben seguir cuidadosamente

El autocontrol debe permanecer negativo siempre Se deben registrar los resultados para cada unidad. Si la prueba es

incompatible la unidad no se debe trasfundir, se debe buscar otra unidad de sangre y realizar las pruebas cruzadas correspondientes.

Consulta

1. Qué es un Banco de Sangre

2. Qué tipos de Banco de Sangre existen

3. Qué es un donante y cuáles son los criterios para proteger al donante

4. Qué es el receptor y cuáles son los criterios para proteger al receptor




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5. Defina: Flebotomía terapéutica. Donación autóloga. Hemafėresis. Receptor especifico. Donación dirigida. Donación Voluntaria

6. Cuáles son las pruebas físicas y de laboratorio que se realizan antes de la donación

7. Cuáles son las condiciones que se deben tener en cuenta para que la flebotomía sea un éxito.

8. Cuáles son los criterios de autoexclusión de un paciente

9. Cuáles son los parámetros postdonación

10. Enumere algunas reacciones adversas a la donación

11. Cuáles son los componentes que conforma la sangre total

12. Cuáles son las pruebas de laboratorio que se le realiza a cada unidad de sangre.



ANEXOS No. 1 Descripción

Prueba Cruzada:Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:



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Prueba Cruzada AutocontrolFase Salina

Fase AlbúminaFase de Coombs


Interpretación: ______________________________________________________




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manual de hemostasia y banco de sangre actualizado

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