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INVESTIGACIÓN & DESARROLLO, No. 13, Vol. 1: 56 – 67 (2013)

ISSN 2518-4431

CARACTERIZACIÓN MICROESTRUCTURAL DE MEZCLAS DESHIDRATADAS DE POLISACÁRIDOS-

PROTEÍNAS POR MICROSCOPIA DE FUERZA ATÓMICA

MICROSTRUCTURAL CHARACTERIZATION OF POLYSACCHARIDES – PROTEINS DRY MIXTURES

BY ATOMIC FORCE MICROSCOPY

Carmen Carla Quiroga Ledezma Centro de Investigaciones Agrícolas y Agroindustriales Andinas – CIAAA

Universidad Privada Boliviana

[email protected] (Recibido el 15 enero 2013, aceptado para publicación el 8 julio 2013)

RESUMEN

Las microestructuras de mezclas de amilosa – β-lactoglobulina (AM-βlg) y amilopectina - patatina (AP-PA), formadas a

partir de la deshidratación de soluciones de diferentes concentraciones y diferentes relaciones polisacárido:proteína, se

estudiaron usando Microscopía de Fuerza Atómica (Atomic Force Microscopy – AFM). Los resultados se confirmaron

por Microscopia de Transmisión Electrónica (Transmission Electron Microscopy – TEM). Los compuestos puros

mostraron estructuras lisas, aunque entre los polisacáridos, la amilosa tuvo una estructura más rugosa, y entre las

proteínas la patatina. Las proteínas naturales mostraron diferentes estructuras en comparación con las proteínas tratadas

térmicamente, que mostraron estructuras rugosas, resultado de la agregación de sus moléculas. Los sistemas

polisacáridos-proteínas mostraron estructuras que no sufrieron una segregación de fases a relaciones

polisacárido:proteína igual a 1:1 para la AM:βlg y mayores a 1:1 para AP:PA, y que sufrieron una segregación de fases a

relaciones menores a 1:1 para AM:β-lg e iguales o mayores a 1:1 para AP:PA. Las muestras con segregación de fases

presentaron regiones ricas en polisacárido y regiones ricas en proteína. Después del tratamiento térmico las muestras

que no mostraron una segregación de fases presentaron algún grado de segregación, el grado de segregación de fases

estuvo en función de la concentración de proteína.

ABSTRACT

The microstructure of amylose - -lactoglobulin (AM-lg) mixtures and amylopectin - patatin (AP-PA) mixtures

formed during drying of solutions from different concentrations and different polysaccharide and protein ratios have

been studied using atomic force microscopy (AFM), and the results were confirmed by transmission electron

microscopy (TEM). The pure components displayed even structures, although between the polysaccharides, AM had a

rougher structure, and between the proteins PA did. The native proteins displayed different structures than the heat-

treated proteins which showed uneven structures formed by the aggregation of the protein. The polysaccharide – protein

system displayed non-phase-segregated structures at polysaccharide:protein rations equal to 1:1 for AM:lg and higher

than 1:1 for AP:PA, and phase-segregated structures at polysaccharide:protein rations lower than 1:1 for AM:lg and

equal or higher than 1:1 for AP:PA. The phase-segregated samples showed regions rich in polysaccharide and regions

rich in protein. After heat treatment the non-phase-segregated samples showed some degree of phase segregation, the

degree of phase segregation depended on the protein concentration.

Palabras Clave: Separación de Fases, Segregación de Fases, Películas Deshidratadas, Microscopia de Fuerza Atómica,

-Lactoglobulina, Amilopectina, Patatina

Keywords: Phase Separation, Phase Segregation, Dry Films; Atomic Force Microscopy; Amylose; -Lactoglobulin,

Amylopectin, Patatin.

1. INTRODUCCIÓN

Durante las últimas décadas, los sistemas polisacáridos - proteínas han sido estudiados por los científicos del área de

Ciencia y Tecnología de Alimentos, no sólo porque son los principales componentes presentes en los alimentos, sino

porque también determinan la estructura y por ende las propiedades fisicoquímicas y reológicas de los mismos [1]. El

interés creciente en este tipo de sistemas se debe a que el conocimiento acerca de sus interacciones y su comportamiento

hacen posible manipular y cambiar las propiedades mecánicas y de textura, de acuerdo a los requerimientos de los

desarrolladores de productos, para satisfacer las preferencias de los consumidores. Hasta el momento, los estudios se

han centrado en sistemas de dos componentes y usados como modelos simples para los sistemas de multicomponentes.

Cuando se mezclan soluciones de proteína y polisacárido, las macromoléculas pueden: a) segregarse, los dos

componentes macromoleculares están principalmente en diferentes fases; b) asociarse, ambos componentes

macromoleculares están mayoritariamente en la misma simple fase concentrada; o c) permanecer como una solución de

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una simple fase [2], ver la Figura 1. La separación de fases entre el polisacárido y la proteína depende de la

concentración, la temperatura y las condiciones del solvente [3]. La incompatibilidad termodinámica es un fenómeno

bastante general.

Figura 1 – Ilustración de los diferentes tipos de sistemas que los polisacáridos y proteínas forman

después de mezclarlos. (A) Incompatible, sistema de dos fases; (B) Cosoluble, sistema

de una fase; (C) Compuesto, sistema de dos fases.

En trabajos anteriores se estudió el equilibrio de fases del sistema amilopectina – β-lactoglobulina – D2O (agua

deuterada), siendo la amilopectina uno de los principales componentes del almidón y usada ampliamente en la industria

alimentaria. El sistema se segrega en fases a concentraciones macromoleculares altas (ca. 20 %) en dominios ricos en

amilopectina y dominios ricos en β-lactoglobulina, siendo una característica particular la formación de una fase

metaestable cuando se tiene una relación ca. 1:1 de amilopectina y β-lactoglobulina [4]. La microestructura de películas

deshidratadas, formadas a partir de soluciones de amilopectina-β-lactoglobulina, caracterizadas por microscopia de

fuerza atómica, presentan una segregación de fases en casi todas las relaciones amilopectina:β-lactoglobulina. La

característica de las estructuras con segregación de fases es la rugosidad, con dominios de gran tamaño (hasta ca. 10

μm) y con una clara característica espinodal cuando las películas pasan a través de una inversión de fases, i.e. desde

películas donde la fase continua es la amilopectina hasta películas donde la fase continua es la β-lactoglobulina, en el

rango de relaciones amilopectina:β-lactoglobulina de 1:3-1:4 [5]. La característica segregativa de los sistemas

amilopectina - β-lactoglobulina se manifiesta con mayor fuerza cuando las soluciones acuosas son tratadas

térmicamente. La concentración crítica para la separación se reduce y la fase metaestable se pierde. El carácter

espinodal de la separación de fases, a partir de soluciones acuosas, está ausente en ciertos rangos [6].

La amilopectina es un polisacárido ramificado con un peso molecular bastante alto (en el orden de magnitud de 4108 -

5108 Da) a diferencia del otro componente principal del almidón, amilosa, el cual es un polisacárido lineal con un peso

molecular mucho menor (en el orden de magnitud de 1,3105 – 4,810

5 Da) [7-9]; estas diferencias hacen que se

comporten de diferente manera y formen diferentes estructuras con propiedades fisicoquímicas y reológicas diferentes.

Por esta razón, información que se puede obtener acerca del sistema amilosa - β-lactoglobulina ayudará no solamente a

una mejor comprensión de los sistemas almidón-proteínas sino también a un mejor conocimiento sobre la influencia de

cómo las diferencias en su estructura molecular influyen en el sistema.

Otra manera de influir la estructura y las propiedades de un sistema es cambiando alguna característica de la proteína; la

β-lactoglobulina es considerablemente mucho más pequeña que el polisacárido y por tanto su cosolubilidad es alta. La

cosolubilidad puede reducirse y la segregación de fases mejorarse si el tamaño de la molécula de la proteína se

incrementa. Una proteína con una tamaño molecular mayor que la β-lactoglobulina, 18300 Da y 2 nm en diámetro; [10],

es la patatina, una glicoproteína soluble de la papa con un peso molecular de 43000 Da [11] y forma cilíndrica con un

diámetro y largo de 5 y 9,8 nm [12]. Una segunda diferencia entre estas proteínas es que la β-lactoglobulina se agrega y

paulatinamente forma un gel, mientras que la patatina coagula y precipita.

QUIROGA


Por tanto, en este trabajo se estudiaron la microestructura de los sistemas: amilosa - β-lactoglobulina y amilopectina –

patatina, en películas formadas a partir de la deshidratación de soluciones. Se pretende que estos sistemas sean usados

como modelos para estructuras formadas en alimentos solidificados. Los principales objetivos fueron: (i) caracterizar

las microestructuras a diferentes concentraciones y relaciones polisacárido-proteína, (ii) identificar las consecuencias de

las diferencias en la estructura molecular cuando se usa un polisacárido lineal en vez de uno ramificado, (iii) encontrar

la diferencia en la estructura cuando se usa una proteína de mayor tamaño, y (iv) describir la influencia del tratamiento

térmico en la estructura de las películas deshidratadas cuando se usa una proteína que tiende a precipitar en vez de una

que tiende a formar un gel. Para este propósito, películas deshidratadas delgadas de polisacáridos y proteínas

solubilizados fueron preparados, la microestructura se evaluó por microscopia de fuerza atómica (Atomic Force

Microscopy – AFM) y los resultados fueron confirmados por microscopia de transmisión electrónica (Transmission

Electron Microscopy – TEM) en el caso de la amilosa - β-lactoglobulina. Se escogió la técnica de AFM porque tiene

una excelente resolución lateral con un potencial de resolución a nivel atómico y molecular, y las muestras no necesitan

ser tratadas antes de realizar la toma de imágenes.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Materiales

La amilopectina (No. A-7780 extraída de maíz ceroso) y la amilosa (No. A-9262 extraída de la papa) fueron comprados

de Sigma-Aldrich. La β-Lactoglobulina fue generosamente provista por Arla Foods (PSDI 2400). La patatina fue

extraída y purificada de acuerdo al método de Bahoc [13], el cual es un método modificado del método desarrollado por

Racusen y Foote [14], de la variedad de papa “Osprey” comprado del mercado local sueco. La patatina purificada dio

un banda fuerte y unas pocas bandas débiles en la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico

(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE).

Todos los cálculos en este trabajo se realizaron en base seca, y todos los valores de concentración se expusieron en

porcentaje, referido al peso.

2.2 Preparación de las muestras

La amilosa (AM) se mezcló con agua destilada y la dispersión fue calentada por 1 h a 140 °C, el mismo procedimiento

de solubilización se aplicó para la amilopectina (AP), pero se calentó a 120 °C. Las soluciones fueron enfriadas a

temperatura ambiente, por 0,5 h la de AM y 1 h la de AP, posteriormente se añadió la proteína, β-lactoglobulina (βlg) o

patatina (PA). La solución final (polisacárido – proteína – agua) se dejó por 2 h a temperatura ambiente y

subsiguientemente se aplicó en hojas de mica recientemente clivadas por inmersión en las soluciones. Finalmente las

muestras se dejaron hasta el día siguiente bajo condiciones ambientales. El contenido final de agua en las películas al

terminar el proceso de secado fue menor al 5 %, el contenido de humedad se determinó por gravimetría i.e. dejando la

película a 105 °C hasta peso constante.

Muestras de amilosa - β-lactoglobulina: El espesor de las películas húmedas estaba entre 100 - 300 µm y el espesor de

las películas deshidratadas entre 5 - 30 µm. Se prepararon muestras a diferentes concentraciones (0,5, 1, 2, 2,5, 3, 5 y 7

% p/p materia seca) y a diferentes relaciones polisacárido-proteína (1:0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 0:1) siguiendo el

procedimiento anteriormente descrito.

Muestras de amilopectina - patatina: El espesor de las películas húmedas estaba entre 150 - 250 µm y el espesor de las

películas deshidratadas entre 0,5 - 10 μm. Las muestras fueron preparadas a diferentes concentraciones (0,5, 1 y 3 % p/p

materia seca) y a diferentes relaciones polisacárido:proteína (1:0, 4:1, 1:1, 1:4, 0:1).

Para ambos sistemas, 2 grupos de muestras fueron preparados, uno de los grupos fue tratado térmicamente antes de la

formación de la película y el otro no. Para las muestras con PA, las mezclas fueron calentadas por 1 h a 90 °C y para las

muestras con βlg las mezclas fueron calentadas a 70 °C, también por 1 h.

Para comparar e identificar los componentes en las mezclas, se prepararon muestras con compuestos puros y sus

estructuras fueron analizadas. La superficie de las películas expuestas al aire durante la fase de formación de la película

fue la que se estudió por AFM.

Para la toma de imágenes con AFM, las muestras no fueron tratadas i.e. las mediciones se realizaron directamente

después del secado. Sin embargo, las muestras que fueron analizadas por TEM fueron sujetas a un tratamiento

específico e.g. fijación, incrustación y teñido químico de acuerdo a procedimientos específicos que se describirán más

adelante.



2.3 Microscopia de Fuerza Atómica (AFM)

Tres tipos de imágenes (topográficas, de contraste de fases y de amplitud) fueron grabadas en el modo de contacto

intermitente o tapping usando un instrumento comercial Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa Barbara, CA). Las

imágenes topográficas fueron usadas para el análisis seccional y las imágenes de contraste de fases y amplitud fueron

usadas para validar las imágenes topográficas y obtener información adicional acerca de la superficie, porque la calidad

de estas imágenes, por lo general, tenían una mejor resolución; por tanto, en este trabajo se presentan principalmente

este tipo de imágenes.

Las mediciones se realizaron a temperatura ambiente. Para la toma de imágenes se usó un escáner JV con una capacidad

de barrido en el rango de 125 x 125 (ejes x,y) x 25 (eje z) y una punta de material de silicona adherido a un cantiléver

de longitud de 129 μm, con una frecuencia de resonancia entre 282 - 367 kHz y una constante de flexión entre 27 - 62

N/m. Cada muestra se analizó al menos en 5 diferentes lugares, y cada lugar a diferentes amplificaciones (40 μm, 20

μm, 10 μm, 5 μm, 1 μm, 500 nm y 200 nm de tamaño de barrido). La dirección de barrido se cambió a diferentes

ángulos, 0°, 45 ° y 90°, y las líneas de barrido, trazo y retrazo, se analizaron para evitar artefectos. Las imágenes fueron

analizadas usando el programa del microscopio (versión 4.22), las imágenes sólo fueron niveladas.

2.4 Microscopia de Transmisión Electrónica (TEM)

Las soluciones de amilosa y β-lactoglobulina fueron congeladas a -20 °C y liofilizadas por 3 d. Posteriormente, las

muestras fueron fijadas por 3 h con 2 % p/p de glutaraldehído y 0,1 % p/p de rojo de rutenio en 0,15 M de cacodilato

como amortiguador y lavadas 2 veces en el amortiguador por 10 min, seguidamente las muestras fueron fijadas una

segunda vez por 2 h con 1 % p/p de tetraóxido de osmio (OsO4), seguida de un enjuague en la solución amortiguadora

de cacodilato, antes de ser deshidratadas en una serie de soluciones de acetona de diferente grado de concentración.

Finalmente, las muestras fueron incrustadas en una resina de Spurr (versión modifica de una procedimiento descrito por

Langton y Hermansson, [15]).

Secciones delgadas (70 nm en espesor) fueron cortadas y colocadas sobre una película de carbón lacey fijada en una

rejilla de cobre. Las muestras fueron entonces doblemente teñidas con 5 % de acetato de uranil y 0,3 % de citrato de

plomo, para visualizar la fase del polisacárido [16].

Las muestras teñidas fueron transferidas y examinadas en un TEM (Philips CM 120 BioTWIN Cryo) equipado con un

filtro de energía de poscolumna (Gatan GIF 100). Las imágenes fueron grabadas con una cámara CCD (Gatan 791) y

bajo condiciones de baja dosis, utilizando el pico de pérdida cero (ancho de hendedura de 8 eV). La defocalización fue

de aproximadamente 1 µm. Imágenes a diferentes amplificaciones fueron tomadas.

3. RESULTADOS

Para cada sistema, se tomaron fotos de las muestras preparadas, compuestos puros y mezclas, y se analizaron. A simple

vista, las películas delgadas parecían ser bastante homogéneas y regulares, sin embargo, mirando al microscopio se

observó diferentes microestructuras.

3.1 Amilosa pura y β-lactoglobulina pura

Las superficies de los componentes puros fueron bastante diferentes. La película de AM presentó una estructura

granular y rugosa con diferencias de altura de cerca de 70 nm (Figura 2), y el tamaño de los granos estuvieron entre 10 -

30 nm, mientras las películas de βlg natural exhibió una estructura bastante lisa con diferencias en altura de cerca de 3

nm (Figura 3). Cuando la proteína se trató térmicamente, la apariencia de las películas cambiaron considerablemente,

desde estructuras bastante regulares a estructuras irregulares con diferencias en altura de cerca de 50 nm; la proteína fue

agregada en agregados globulares y el tamaño de estos agregados estuvo entre 50-100 nm.

3.2 Mezclas de amilosa y β-lactoglobulina

Las películas formadas a partir de amilosa y β-lactoglobulina mostraron estructuras uniformes y no uniformes.

A proporciones iguales AM:βlg (1:1), las muestras mostraron una estructura aparentemente regular aunque las

diferencias en altura estuvieron entre 70 - 100 nm, Figura 5. A bajas concentraciones las diferencias en altura fueron

menores que a altas concentraciones. Las estructuras parecieron ser estructuras intermedias entre la de los componentes

puros, Figura 2 y Figura 3.

QUIROGA


. Figura 2 – Imagen AFM de amplitud de AM, 1 % p/p

materia seca, tamaño de barrido de 1 m y rango z de

0.05 V.

Figura 3 – Imagen AFM de amplitud de lg,

1 % p/p materia seca, tamaño de barrido de 1

m y rango z de 0.05 V.

Figura 4 – Imagen AFM de amplitud de lg, 1 %

p/p materia seca, tamaño de barrido de 1 m y

rango z de 0.05 V.

A proporciones bajas AM:βlg (<1:1) i.e. muestras ricas en proteína, las muestras sufrieron una segregación de fases con

regiones ricas en proteína y regiones ricas en polisacárido, las diferencias en altura fueron bastante significativas, a

concentraciones altas las diferencias fueron mayores a 500 nm, Figura 6. A estas concentraciones altas, la proteína se

agregó y organizó en estructuras floculares, donde la topografía fue bastante irregular. Este tipo de apariencia

permaneció hasta las proporcionas más altas investigadas, 1:6 AM:βlg. A bajas concentraciones (0.5 %), se observó una

deshumectación de la superficie de las láminas de mica.

Cuando las muestras fueron calentadas la segregación de fases incrementó. Las muestras tratadas (70 °C por 1 h)

presentaron estructuras irregulares con diferencias en altura de 200 nm aproximadamente, Figura 7.

Figura 5 – Imagen AFM de amplitud de AM y lg,

2 % p/p materia seca, proporción AM:lg 1:1,

tamaño de barrido de 10 m y rango z de 0.5 V.

Figura 6 – Imagen AFM de amplitud de AM y lg,

2,5 % p/p materia seca, proporción AM:lg 1:4,

tamaño de barrido de 10 m y rango z de 1 V.



Figura 7 – Imagen AFM de amplitud de AM y

lg, térmicamente tratada a 70 C por 1 h, 2,5 %

p/p materia seca, proporción AM:lg 1:1,

tamaño de barrido de 10 m y rango z de 0.5 V.

Las micrografías TEM no solamente facilitaron información complementaria respecto a la microestructura de los

sistemas, sino también ayudo a confirmar las micrografías AFM. La estructura de la amilosa pura fue bastante regular,

caracterizada por pequeños agregados en forma de gusanos de cerca de 15 – 20 nm de longitud y cerca de 15 nm de

ancho, los cuales estaban organizados helicoidalmente (Figura 8). Para las mezclas de AM y βlg, las micrografías

mostraron regiones ricas en polisacárido y regiones ricas en proteína. Los dominios ricos en proteína fueron pequeños,

con tamaños cerca a los 100 nm. A concentraciones no muy altas de proteína, ésta estaba dispersa en el polisacárido,

Figura 9 y Figura 10.

Figura 8 – Imagen TEM de AM pura, 1 % p/p

materia seca, la AM fue teñida químicamente.

Figura 9 – Imagen TEM de AM y lg, 3 % p/p

materia seca, proporción AM:lg 1:2, la AM fue

teñida químicamente.

Figura 10 – Imagen TEM de AM y lg, 3 % p/p

materia seca, proporción AM:lg 1:2, la lg fue

teñida químicamente.

QUIROGA


3.3 Amilopectina pura y patatina pura

Se observaron algunas diferencias entre las superficies de los componentes puros. La película de AP fue bastante

regular, con diferencias en altura menores a los 2 - 3 nm. Sin embargo, se vieron pequeñas protuberancias de diámetro

menores a los 20 nm (Figura 10). Las micrografías AFM de la PA pura mostró superficies granulares regulares, el

tamaño de los granos estuvieron en un rango entre 15 - 30 nm y las diferencias en altura entre 2 - 4 nm (Figura 12).

Cuando la proteína fue tratada térmicamente a 90 °C por 1 h, la estructura de la película cambio a una superficie más

rugosa, la película mostró agregados globulares con tamaños entre 30 - 50 nm y las diferencias en altura incrementaron

a 10 nm (Figura 12). Los agregados formados no fueron entidades individuales sino más bien estructuras asociadas con

formas cilíndricas (gusanos).

Figura 11 – Imagen AFM de amplitud de AP, 1

% p/p materia seca, tamaño de barrido de 1 m

y rango z de 0,03 V.

Figura 12 – Imagen AFM de amplitud de PA, 1

% p/p materia seca, tamaño de barrido de 1 m

y rango z de 0,10 V.

Figura 13 – Imagen AFM de amplitud de PA

térmicamente tratada a 90 C por 1 h, 1 % p/p materia

seca, tamaño de barrido de 1 m y rango z de 0,05 V.

3.4 Mezclas de amilopectina y patatina

Las películas formadas a partir de amilopectina y patatina mostraron estructuras uniformes y no uniformes que sufrieron

segregación de fases.

Las muestras ricas en polisacáridos, con relaciones AP:PA > 1:1, mostraron estructuras regulares a concentraciones

bajas y altas, con diferencias en altura de cerca de 5 nm (Figura 13). La apariencia de la microestructura de las muestras

recordó a la muestra de AP pura (Figura 11).

Cuando la relación AP:PA fue de 1:1 las muestras mostraron dominios ricos en polisacárido y dominios ricos en

proteína. Los dominios de proteína correspondieron a la fase discontinua y el polisacárido a la fase continua. La forma

de los dominios de PA fue esférica, de diversos tamaños comprendidos entre 10 - 150 nm, más o menos, y diferencias

en altura de cerca de 40 nm (Figura 16). A bajas concentraciones los dominios fueron menores que a altas

concentraciones.

A relaciones AP:PA <1:1, muestras ricas en proteína, las estructuras fueron bastante regulares y diferentes de las

estructuras de los componentes puros, Figura 11 y Figura 12, formados principalmente por agregados de proteínas



floculados con pequeñas regiones bastante lisas correspondientes al polisacárido. El tamaño de los agregados fue

bastante regular, en el rango entre 30 - 150 nm y diferencias en altura de 40 nm, Figura 17. A un incremento de la

concentración, las muestras se volvieron más rugosas.

Figura 14 – Imagen AFM de amplitud de AP y

PA, 1 % p/p materia seca, proporción AP:PA 4:1,

tamaño de barrido de 1 m y rango z de 0,10 V.

Figura 15 – Imagen AFM de amplitud de AP y PA

tratada térmicamente a 90 C por 1 h, 1 % p/p

materia seca, proporción AP:PA 4:1, tamaño de

barrido de 1 m y rango z de 0,10 V.


PA, 1 % p/p materia seca, proporción AP:PA 1:1,


Figura 17 – Imagen AFM de amplitud de AP y PA

tratada térmicamente a 90 C por 1 h, 1 % p/p

materia seca, proporción AP.PA 1:1, tamaño de

barrido de 1 m y rango z de 0,10 V.


PA, 1 % p/p material seca, proporción AP:PA 1:4,


Cuando se aplicó tratamiento térmico a las soluciones de AP-PA, calentando a 90 °C por 1 h, la estructura de las

muestras cambió i.e. se volvieron irregulares (Figura 14 y Figura 15), incluso a proporciones de 4:1 de AP:PA. Sin

embargo, el tamaño de los dominios separados estuvo en el rango de 150 nm. Las muestras que sufrieron una

QUIROGA


segregación de fases, como 1:1 AP:PA mostraron un crecimiento en el tamaño de los dominios de las proteínas, Figura

16 y Figura 17.

4. DISCUSION

Todas las muestras de almidón – proteína, cuando la proteína no fue tratada térmicamente, antes de la aplicación en las

láminas de mica, eran soluciones de una sola fase para ambos sistemas AM-βlg y AP:PA. Pero durante la formación de

la película el sistema empezó a segregarse debido a los cambios en la composición del sistema i.e. hubo un incremento

en la concentración macromolecular de la muestra en función al tiempo. Las diferencias en rugosidad revelaron que las

muestras sufrieron diferentes estados de aspereza, con tamaños de dominio que fueron desde los nanómetros hasta los

micrómetros [5].

4.1 Polisacáridos y proteínas puros.

El mayor grado de rugosidad de la película de amilosa respecto al de la amilopectina también fue reportado por Rindlav

[17]. La aspereza de la AM se debió a la segregación de AM; a concentraciones menores al 1 % la AM tiende a

segregarse en entidades de forma cilíndrica y precipitar. El tamaño de los agregados encontrados en este trabajo está en

concordancia con lo que se publicó en la literatura, entre 10 y 20 nm [18], [19]. Aunque también la AP tiende a

asociarse, la velocidad de asociación de la AP es mucho menor que la de la AM [20] y mucho más lenta que la

formación de la película, por tanto, la estructura permanece bastante regular.

Aunque, la película de AP mostró algunas protuberancias pequeñas, las diferencias en altura fueron mínimas,

traduciéndose en una superficie bastante regular; estas protuberancias también fueron observadas por otros autores e

interpretadas como impurezas [17], [21] o como conglomerados individuales de los lados de la cadena de la

amilopectina [22].

Las películas de las proteínas nativas puras mostraron una estructura bastante similar aunque la superficie de la

muestras de PA fueron un poco más rugosas que las de βlg. La rugosidad de las muestras se debió a la asociación de las

moléculas de proteína y la formación de agregados de varios monómeros. Sin embargo, después del tratamiento térmico

las muestras fueron bastante diferentes a las nativas, el tamaño de los dominios de proteína incrementaron y las

películas de βlg fueron más rugosas, con agregados mucho más grandes que las de PA. Una razón para tener una

estructura de PA más compacta pudo deberse a que la muestra fue calentada por encima de su temperatura de

desnaturalización, el cual está en el rango de 40 - 65 °C [12], etapa en la cual las moléculas se desdoblan y se agregan.

Por el contrario, la βlg fue tratada térmicamente por debajo de su temperatura de desnaturalización (78 °C [10]), y

aunque la asociación y agregación por debajo de la temperatura de desnaturalización se ha reportado en la literatura

[23], se cree que el proceso de desnaturalización fue incompleto a pesar de haber sido calentada por 1 h.

Cuando la proteína comienza a desnaturalizarse, primero se forman agregados primarios a partir de los monómeros, y

estos agregados empiezan a asociarse en agregados con mayor peso molecular.

4.2 Mezclas de amilosa y β-lactoglobulina

Para el estudio del comportamiento de fases de la AM - βlg, el contenido de AM en las mezclas no excedió el 1 % en

AM porque a mayores concentraciones de AM se formaron geles y fue difícil la aplicación de las soluciones de manera

uniforme sobre las láminas de mica. Además, la gelación pudo interferir con la segregación de fases; se ha reportado

que la concentración crítica está entre 1-1.5 % [24], [19].

La segregación de fases durante la formación de la película en los sistemas AM - βlg se comparó con la caracterización

previamente realizada para el sistema AP - βlg [5]. A contenidos de AM alto y βlg bajo, la superficie de las muestras

fueron regulares, i.e. no hubo una clara evidencia de una segregación de fases. Otra diferencia entre la segregación de la

AP - βlg y AM - βlg fue que las películas con segregación de fases parecieron permanecer con la AM como fase

continua hasta concentraciones muy altas de proteína. En el sistema AP - βlg las películas segregadas cambiaron de una

fase continua de AP a una fase continua de βlg por debajo de la relación 1:3 de AP:βlg. Cerca de la región de la fase de

inversión el sistema AP - βlg mostró la característica de una descomposición espinodal. La causa pudo ser debido a que

el poder de solubilización de la matriz de AM es mayor que la de la matriz de AP. Aunque, los estudios de la fase de

equilibrio del sistema AP – βlg - D2O [4] mostró que la AP también tiene un gran poder de solubilización, ya que una

fase metaestable uniforme puede ser formada hasta por debajo de aproximadamente una proporción de 1:1 de AP:βlg.

Por otro lado, el retardo en la segregación de fases entre la AM y βlg pudo deberse a la alta viscosidad de la AM,

haciendo que la asociación entre las moléculas de proteína tome un mayor tiempo o sea omitida completamente.

También, pudo ser que el tiempo requerido para la asociación de la proteína fuera mayor que el tiempo requerido para la



formación de la película y que el tamaño de los agregados de la βlg formada fuera aún muy pequeño para inducir una

segregación de fases rápida.

Cuando las soluciones fueron tratadas térmicamente, antes de la formación de la película, la tendencia a la segregación

de fases incrementó. Las estructuras regulares se volvieron irregulares cuando fueron tratados térmicamente a 70 °C. A

esa temperatura, se esperó que se formen agregados de 100 monómeros de βlg [25], e incluso que algunos de ellos se

asocien en estructuras con mayor peso molecular a lo largo del tiempo, fenómeno este dependiente de la concentración

de la proteína. A contenidos de βlg alta la muestra se segregó en fases i.e. en regiones ricas en polisacárido y regiones

ricas en proteína. Las regiones ricas en βlg mostraron una estructura granular.

4.3 Mezclas de amilopectina y patatina

Muestras ricas en AP, con relaciones de AP:PA mayores a 1:1, mostraron estructuras sin segregación de fases. La

cosolubilidad de la AP y PA pareció ser alta, lo cual podría ser debido a la gran diferencia en tamaño ente ellos. Aunque

el tamaño molecular de la PA es más grande que la βlg, aún sigue siendo mucho más pequeña en comparación con el

polisacárido, el tipo de estructura encontrada a estas proporciones y concentraciones en este trabajo estuvo de acuerdo

con las estructuras encontradas en películas formadas a partir de soluciones de AP y βlg [5]. La segregación de fases en

estas muestras fue inducida por el tratamiento térmico; a baja concentración de proteína la PA formó agregados

parecidos a entidades individuales y a altas concentraciones los agregados se asociaron en estructuras mucho más

grandes.

A relaciones polisacárido:proteína cerca de 1:1, el sistema exhibió una segregación de fases con dominios ricos en

proteína inmersos en la matriz continua del polisacárido; una vez más este tipo de estructuras son muy parecidas a las

reportadas en la literatura [5]. Sin embargo, ninguna fase de inversión fue observada en las películas de AP:PA incluso a

relaciones por debajo 1:4. Otra diferencia fue el tamaño de los dominios, en el sistema AP:βlg los dominios alcanzaron

tamaños razonablemente grandes cuando se estaba muy próximo a la relación de la fase de inversión mientras que en el

sistema AP:PA el tamaño de los dominios permaneció en el rango del submicrón.

Después del tratamiento térmico la PA perdió solubilidad y precipitó. Obviamente este proceso incrementó la fase de

segregación. Muestras con proteínas nativas con estructuras regulares fueron transformadas en muestras segregadas; a

bajas concentraciones de proteína la PA formó agregados individuales y a altas concentraciones los agregados se

asociaron en estructuras más grandes. A relaciones AP:PA menores a 1:1 la proteína no solamente formó agregados sino

que también se asoció en estructuras más grandes, mostrando dominios ricos en βlg y dominios ricos en AP de formas

irregulares.

En las muestras que no fueron tratadas térmicamente pareció ser que el polisacárido controló el sistema, en cambio en

las muestras tratadas térmicamente la proteína controló el sistema. En el sistema almidón-proteína la fase de

segregación podría acentuarse ya que ambos polisacáridos se segregan también, Kalichevsky y Ring [26].

En alimentos reales, la estructura es obviamente más compleja. La proteína y el almidón son casi siempre calentados

juntos. La relación almidón:proteína es usualmente a favor del almidón, aunque la mayoría del almidón podría

permanecer en los gránulos hinchados, pareciendo dominios de almidón puro y la relación entre el almidón solubilizado

libre en la solución y la proteína podría bien estar cerca a lo que ha sido estudiado en este trabajo. La amilopectina es el

componente dominante en casi todos los tipos de alimentos ricos en almidón, pero como la amilosa es liberada

primeramente durante el proceso de gelatinización del almidón, podría asumirse que juega un papel importante en la

estructura formada en la fase de solución. Además, basados en la observación realizados en este trabajo y otras

publicaciones anteriores [5], [6] la segregación de fases podría aparecer en la formulación de alimentos complejos

deshidratados y jugar un rol importante en la humidificación, reactividad química, así como en las propiedades

mecánicas.

5. CONCLUSIONES

La microestructura de las películas deshidratadas a partir de soluciones acuosas de polisacárido - proteína: amilosa - β-

lactoglobulina y amilopectina - patatina, muestran dos tipos de microestructuras; estructuras regulares, uniformes sin

segregación de fases y estructuras irregulares con segregación de fases.

Las estructuras sin segregación de fases se forman a relaciones polisacárido:proteína igual a 1:1 para AM:βl y mayores

a 1:1 para la AP:PA. Sin embargo, estas muestras sufren una segregación de fases cuando las soluciones son tratadas

térmicamente. El grado de segregación de fases después del tratamiento térmico depende de la temperatura de

calentamiento y de la concentración de la proteína. Por otro lado, las estructuras con segregación de fases son formadas

a relaciones polisacárido:proteína menores a 1:1 para AM:βlg e igual a o mayores a 1:1 para la AP:PA; las muestras

QUIROGA


muestran dominios ricos en polisacárido y dominios ricos en proteína. La segregación de fases toma lugar durante la

formación de la película debido a los cambios en la composición de la muestra.

6. AGRADECIMIENTOS

Un agradecimiento especial a Hanadi Makie por su colaboración en la extracción y purificación de la patatina. El

soporte financiero se obtuvo de la Agencia Sueca para el Desarrollo Internacional (Sida/SAREC).

Este trabajo es parte del trabajo doctoral “Segregación de Fases y Cambios Microestructurales en Sistemas Almidón –

Proteína” realizado bajo la supervisión del Profesor Björn Bergenståhl del Departamento de Tecnología de Alimentos de

la Universidad de Lund en Suecia, en colaboración con el Centro de Alimentos y Productos Naturales de la Universidad

Mayor de San Simón en Bolivia.

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