PRÁCTICA N° 1:

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué métodos conoce para determinar la actividad enzimática?

Habitualmente se utiliza 4 métodos:

1) Medida de la velocidad inicial. Cuando una enzima se mezcla con un

gran exceso de sustrato (a concentración saturante), el complejo

intermedio enzima-sustrato se genera en una rápida fase inicial transitoria.

Después, la reacción llega a una cinética constante durante la cual el

complejo enzima-sustrato se mantiene prácticamente en cantidades

invariables en el tiempo y la velocidad de reacción es constante.

2) Medida del progreso de la curva. En estos experimentos los parámetros

cinéticos se determinan a partir de expresiones de las concentraciones de

las diferentes especies como funciones del tiempo. La concentración del

sustrato o del producto se mide en momentos posteriores a la rápida fase

inicial y durante un tiempo lo suficientemente largo que permita a la

reacción acercarse al equilibrio

3) Medida de la fase transitoria. En estos experimentos se observa el

comportamiento de la reacción durante la rápida fase inicial transitoria en la

que el complejo molecular intermedio llega a un periodo cinético constante.

4) Experimentos en la fase de equilibrio. En estos experimentos se perturba

una mezcla de enzima, sustrato y producto que ha alcanzado el equilibrio

químico, por ejemplo cambiando la temperatura, la presión o el pH, y se

estudia cómo regresa la mezcla al equilibrio

También se puede demostrar la actividad enzimática de dos maneras:

Sustrato residual: se verifica que el sustrato no trasformado residual después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas de pH y temperatura.

Productos formados: los productos liberados después de un tiempo determinado de incubación en condiciones específicas.

2. Explique la acción bioquímica de cada uno de los componentes en los pasos seguidos para determinar la actividad enzimática.

Etapa A:

Se utilizó los siguientes componentes:

1) Solución de almidón PH6.0 al1%: El almidón es el principal polisacárido de

reserva de la mayoría de los vegetales y es una fuente de calorías para el ser humano, está compuesto por la amilosa y la aminopectina.

2) Solución de cloruro de sodio 0.1M: El cloruro de sodio es un compuesto químico

responsable del fluido extracelular de muchos organismos (la concentración de glucosa normal en los humanos).

3) Agua destilada: El agua destilada carece de minerales y de

cualquier tipo de microorganismo, con lo que al trabajar con ella se evita que las sustancias que pudiera poseer intervengan en los resultados del experimento.

De esta forma todas las muestras son exactamente iguales hasta ese momento.

4) Enzima al 1% (amilasa salival): Utilizamos la amilasa ya que va a degradar al

almidón, dejándolo como pedazos de dextrina, glucosas o triosas.

Etapa B:

Componentes:

1) Ácido clorhídrico 0.05N: La aplicación del ácido clorhídrico es en la

regeneración de resinas de intercambio iónico. El intercambio catiónico suele utilizarse para eliminar cationes como Na+ y Ca2+ de disoluciones acuosas, produciendo una sustancia desmineralizada.

Le da color a la sustancia (lo pinta). 2) Solución yodada:

Se utiliza esta solución como indicador para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas, formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por presentar distintos colores según las ramificaciones que presente la molécula de polisacárido.

Etapa C:

Componentes:

1) Solución cúprico alcalina: Es un reactivo químico usado para medir los

niveles de aminas y aminoácidos. El ion cúprico (otorgado por el sulfato cúprico) es capaz de reducirse por efecto del grupo Aldehído del azúcar (CHO) a su forma de Cu+. Este nuevo ion se observa como un precipitado rojo ladrillo correspondiente al óxido cuproso.

2) Solución fosfomolibdica:

Se utiliza para reducir la sustancia, la nueva sustancia se visualiza de color azul oscuro.

3) Agua destilada: Sirve para evitar que la sustancia contenga microorganismos que

puedan afectar su composición.

3. Elabore una gráfica de la acción de una enzima sobre su sustrato, con la energía de activación y el estado de transición.

La velocidad de una reacción química es proporcional al número de moléculas por unidad de tiempo con energía suficiente para alcanzar el estado de transición. Este estado de transición posee una energía superior a la de los reactivos y a la de los productos constituyendo entre ellos una barrera energética que debe superarse para que la reacción tenga lugar. La diferencia entre la energía de los reactivos y la del

estado de transición recibe el nombre de energía libre de activación.

4. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimático

y defínalos.

1. Hidrolasas: Catalizan reacciones de hidrólisis. Rompen las biomoléculas con moléculas de agua. A este tipo pertenecen las enzimas digestivas.

2. Isomerasas: Catalizan las reacciones en las cuales un isómero se transforma en otro, es decir, reacciones de isomerización.

3. LigasaS: Catalizan la unión de moléculas.4. Liasas: Catalizan las reacciones de adición de enlaces o eliminación, para

producir dobles enlaces.e5. Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de óxido-reducción. Facilitan la

transferencia de electrones de una molécula a otra. Ejemplo; la glucosa, oxidasa cataliza la oxidación de glucosa a ácido glucónico.

6. Tansferasas: Catalizan la transferencia de un grupo de una sustancia a otra. Ejemplo: la transmetilasa es una enzima que cataliza la transferencia de un grupo metilo de una molécula a otra.

7. Conzimas: Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas no proteicas que transportan grupos químicos entre enzimas. A veces se denominan cosustratos.

8. La enzima: Son proteínas complejas que producen cambios químicos específicos en algunas sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas. Como por ejemplo: las enzimas pueden convertir los almidones y azucares en sustancias que el cuerpo pueda utilizar.

9.  Sustrato: Es cualquier compuesto químico. Que subyase a otro y sobre el cual está en condiciones de ejercer algún tipo de influencia. 

10.  HOLOENZIMA: Estructura formada por la apoenzima y la coenzima11. APOENZIMA: Enzima propiamente dicha de:

- naturaleza proteica  - peso molecular elevado  - no dializable y termolábil 

12.GRUPO PROSTÉTICO: Parte adherida más o menos laxa a la apoenzima. Los grupos prostéticos o las coenzimas actúan cediendo y recibiendo parte de los productos de la reacción alternativamente. Ejemplo: Los hidrógenos en las reacciones de óxido-reducción

13.PROENZIMAS o ZIMÓGENOS: Enzimas sintetizadas como precursores no funcionales. Suelen activarse por la eliminación de un fragmento peptídico de su molécula         Ejemplo: Pepsinógeno gástrico   Pepsina (al perder 44 aminoácidos)

14. ISOENZIMAS     Formas moleculares (estructuralmente distintas) de una enzima.  Responsables de catalizar la reacción enzimática

15. ACTIVADORES, INHIBIDORES y MODULADORES     Modifican la velocidad de las reacciones enzimáticas

16.  ACTIVADORES: Iones que aceleran la velocidad de una reacción Son cationes: Mg2+,Mn2+, Ca2+,K+   En ocasiones se unen a la apoenzima, pero más común es su  combinación con el sustrato o la coenzima

17.     INHIBIDORES: Sustancias que disminuyen la velocidad de las reacciones  catalizadas por las enzimas

18.     MODULADORES: Moléculas que actúan sobre enzimas oligoméricas con características de cooperatividad funcional. Influyen sobre la velocidad de las reacciones enzimáticas:

19.  NAD+ y NADP+: Coenzimas que contienen la vitamina nicotinamida a la cual se une una ribosa, 2 o 3 radicales, otra ribosa y una adenina. - NAD interviene en reacciones degradativas donde se libera energía de los                     sustratos atacados. Ejemplo: lactato, etanol - NADPH participa en sistemas enzimáticos encargados de la biosíntesis de diversos metabolitos. Ejemplo: ácidos grasos, el colesterol y otros

20.  FMN y FAD: Son las formas activas de la riboflavina .La riboflavina o vitamina B2, es una sustancia de color anaranjado formada por un alcohol derivado de la ribosa, el ribitol y un radical ácido, la flavina. Son grupos prostéticos.

21.PIROFOSFATO DE TIAMINA: (Carboxilasa) Forma activa de la vitamina B1 o timina y actúa como coenzima de diversos sistemas enzimáticos.

22.FOSFATO DE PIRIDOXAL y FOSFATO DE PIRIDOXAMINA PIRIDOXINA: forma alcohólica de la PIRIDINA, también denominada PIRIDOXOL - Forma química y nombres genéricos de la vitamina B6: PIRIDOXINA - PIRIDOXAL o PIRIDOXAMINA Formas activas de la piridoxamina y que participan como coenzimas en diversas reacciones, especialemente en el metabolismo de los aminoácidos.

23.COENZIMA A: Contiene al ácido pantoténico (vitamina) Además de ser un nucleótido de adenina, ribosa y fosfato, contienen mercaptoetilamina con su característico grupo funcional -SH. Participa en gran número de reacciones, en especial con los radicales acilos -acetilo-, que en unión con esta coenzima, forma la acetil coenzima A que es clave en el metabolismo y para el ciclo de Krebs.

24.BIOCITINA: Es un péptido que forma parte de una proteína pequeña llamada "proteína acarreadora de carboxilbiotina", la cual es carboxilada y así puede carboxilar a otras sustancias.

25.LIPOIL-LISINA:Forma activa de la vitamina conocida como "ácido lipoico".26.   ÁCIDO FÓLICO- Puede formar parte de diversas estructuras parecidas

todas con un radical de pteridina unido al del ácido para-aminobenzoico para formar el radical del ácido pteroico.

5. ¿Cuál es la importancia clínica de la medición de la actividad enzimática? De ejemplo.

Las enzimas son importantes porque son altamente específicas en su actividad y todas las células metabólicas contienen algunas o muchos de esos componentes esenciales. Ciertos tejidos contienen enzimas características que sólo penetran en la sangre cuando se destruyen o lesionan las células en las cuales están contenidas. La presencia en la sangre de cantidades significativas de estas enzimas específicas indica el sitio probable de daño tisular.Por ejemplo * Amilasa Descompone el almidón en sus azúcares constitutivos. De actividad extracelular. Segregándose por las glándulas salivales y el páncreas a la saliva y al líquido pancreático.Los aumentos de la amilasa sérica indican generalmente enfermedad pancreática.En la pancreatitis aguda su nivel puede alcanzar 600 unidades, en el transcurso de las 4 h de comienzo de la enfermedad sus niveles pueden elevarse hasta 2000 unidades. Descendiendo sus valores en el transcurso de 48 a 72 h, incluso persistiendo la inflamación.La pancreatitis crónica produce elevaciones menos marcada, más bien variables, y el carcinoma del páncreas no afecta por lo general dicha enzima.Su elevación puede acompañar también al dolor abdominal agudo en ciertos casos de úlcera péptica perforada, empiema de la vesícula, obstrucción intestinal, embarazo ectópico roto o peritonitis de cualquier causa. También en enfermedad de la glándula parótida.La amilasa se excreta por la orina, y si el nivel sérico ya ha disminuido, el nivel urinario puede ser de utilidad diagnóstica.

6. ¿Qué factores pueden afectar la actividad enzimática?

Concentración del sustrato.- A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción.

Concentración de la enzima.- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite.

Temperatura.- Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad.

pH.- El pH óptimo de la actividad enzimática es 7, excepto las enzimas del estómago cuyo pH óptimo es ácido.

Presencia de cofactores.- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima.

PRÁCTICA N° 2:

DISTRIBUCIÓN INTRACELULAR DE LAS ENZIMAS DE ÓXIDO REDUCCIÓN

CUESTIONARIO:

1. ¿Qué es el 2,6 diclorofenolindofenol y cómo actúa en la cadena respirtoria.

2, 6-Dichlorophenol indofenol (DCPIP, también DPIP) es un compuesto químico utilizado como un colorante redox. Cuando oxidado, DCPIP es azul con una máxima absorción en 600 nm; Cuando se reduce, DCPIP es incoloro. DCPIP puede utilizarse para medir la tasa de fotosíntesis. Es parte de la familia de los reactivos de la colina. Cuando se expone a la luz en un sistema de fotosíntesis, el tinte es deionizarse por reducción química. DCPIP tiene una afinidad más alta para los electrones de la ferredoxina y la cadena de transporte de electrones fotosintética puede reducir DCPIP como sustituto de NADP +, que es normalmente el portador final de electrones en la fotosíntesis. DCPIP se reduce y llega a ser descolorido, el aumento resultante en la transmitancia de luz puede ser medido usando un espectrofotómetro. La reducción del DCPIP DCPIP también puede utilizarse como un indicador para la vitamina C. si está presente, vitamina C, que es un buen agente reductor, el tinte azul, que se vuelve rosado en condiciones ácidas, se reduce a un compuesto incoloro por ácido ascórbico

La sustitución se basara en el siguiente mecanismo de reacción:

La oxidación del succinato , catalizada por la succinato deshinogenasa , genera electrones que producen el compuesto Metosulfato de fenazina (PMS) que posteriormente reducirá al2,6 diclorofenol indofenol (DCPIP) .La función del cianuro de potasio (KCN) es bloquearla enzima terminal de la cadena respiratoria asegurando la transferencia de electrones hacia la reducción del DCPIP, mientras la función de PMS es la de ser un acarreadores electrones , los cuales llegaran al aspecto final de estos que es el DCPIP.

Al ser interrumpida la cadena respiratoria por el KCN, los complejos quedan reducidos hasta perder su color, el 2,6-DCPIP es el primero en tornarse incoloro, quedando la succion de color amarillo debido al Metosulfato de fenazina, que posteriormente , al ser reducido completamente también se torna incoloro.

Para la determinación se colocaran los reactivos de tubo de ensaye, teniendo en cuenta que el ultimo en ser adicionado será la será la suspensión celular, posteriormente se agita y se mide el porcentaje de transmitancia a una longitud de onda de 600nm ya que a esta longitud se lee el color verde. El color verde se origina por la combinación de color amarillo del Metosulfato de fetazina y el azul del 2,6 diclorofenol indofenol se vuelve incoloro.

2. ¿Que es el p-fenilendiamina y como actúa en la cadena respiratoria?

P-fenilendiamina (p-fenilendiamina), y Mingwuersi D, es la más simple diamina aromática, existe una amplia gama de aplicaciones, intermedio para la preparación de colorantes, polímeros, colorantes también pueden ser usados para producir piel, antioxidantes para el caucho y el revelador de fotos, p-fenilendiamina o de otra prueba comúnmente utilizada de reactivos sensibles a hierro y cobre. P-fenilendiamina intermedio de tinte es extremadamente importante, principalmente para Kevlar, tintes, colorantes de azufre, colorantes ácidos.

3. Grafique usted en una cadena de óxido-reducción biológica acción de los indicadores redox 2,6 diclorofenolindofenol y p-fenilendiamina.

Una reacción redox es aquella en la que uno de los compuestos se reduce y el otro se oxida, de ahí su nombre. El reactivo que se oxida esta perdiendo electrones que luego cogerá el que se reduce. Y el que se reduce esta ganado los electrones que el otro ha soltado. Antiguamente lo que se creía que el que se oxidaba ganaba oxígeno, en realidad esto era bastante cierto, solo que era incompleto, pues el perder electrones el que se oxida se une con el oxígeno para tener los electrones necesarios ejemplo:

Fe + O2  Fe2O3

2PbO  2Pb + O2

4. ¿Qué es el homogeneizado de hígado y cómo se obtienen las fracciones celulares por centrifugación diferencial?

5. ¿En qué fracción celular se encuentra la cadena respiratoria?

6. Esquema de centrifugación diferencial:

BIBLIOGRAFIA

Susan R. Feldman. Sodium chloride. Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology. John Wiley & Sons, Inc. Published online 2005.

Saurina J, Hernández-Cassou S (1994). «Determination of amino acids by ion-pair liquid chromatography with post-column derivatization using 1,2-naphthoquinone-4-sulfonate». Journal of chromatography. A 676 (2): 311–9