UNIVERSIDAD DE ORIENTE NUCLEO BOLIVAR

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLOGICAS

CATEDRA: BIOQUIMICA

PRATICA 2 “SALADO” (SALTING AOT) DE PROTEINAS, SU APLICACIÓN EN LA

SEPARACION Y DETERMINACION DE ALBÚMINA Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA SANGUINEO.

Docente: Elaborado por: Dr. Miguel Basanta Manuel Serrano

Rene Devis

Ciudad Bolívar, Mayo del 2014.

Introducción.

Las proteínas son macromoléculas complejas desde los puntos de vista

físico y funcional, que desempeña múltiples funciones de importancia crucial.

Están sujetas a cambios físicos y funciones que reflejan el siglo de vida de los

organismos en los cuales residen.

Las proteínas son compuestos constituidos por aminoácidos unidos por

enlaces peptídicos. Son moléculas de elevado peso molecular. Según su

composición las proteínas se dividen en: Simples y Conjugadas, se producen por

hidrólisis de aminoácidos y otros componentes orgánicos e inorgánicos. Existen

millones de proteínas en nuestro cuerpo que efectúan funciones específicas, como

la de trasporte de gases catalíticos, de protección, etc.

Estas se pueden clasificar de acuerdo a su solubilidad en Albúminas,

Globulinas, Histonas, Protaminas y Escleroproteínas. En la presente práctica se

utilizan para estudio Albúmina y Globulinas, en cuanto a la Albúmina se puede

acotar que pueden precipitarse de sus soluciones con altas concentraciones de

sales proceso que se denomina salinización.

Para estudiar una proteína es necesario separarla utilizando diferentes

métodos que se basan en las diferentes solubilidades de las proteínas

ocasionadas por el PH (precipitación isoeléctrica), la polaridad (precipitación con

etanol o acetona) o la concentración salina (mediante la adición de sulfato de

amonio). (Harper, 2007)

Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las

proteínas globulares. A baja concentración, las sales incrementan la solubilidad de

muchas proteínas, fenómeno que recibe el nombre de “salting in”. Por otra parte, a

medida que la fuerza iónica aumenta, la solubilidad de una proteína comienza a

disminuir y por lo tanto la proteína puede ser casi completamente precipitada de

su disolución, efecto llamado “salting out”.

Se considera importante describir a la albúmina, por ser ésta la

proteína a separar durante la actividad práctica por el método antes mencionado.

Es un tipo de proteína simple, compuesta de carbono, hidrógeno, oxígeno,

nitrógeno y un pequeño porcentaje de azufre. La albúmina es coagulable por el

calor, los ácidos minerales, el alcohol y el éter, y es soluble en agua y en

disoluciones diluidas de sal. Está presente en tejidos animales tales como la clara

de huevo, la leche y el músculo, además de encontrarse en el plasma sanguíneo.

Resultados

Se presenta una tabla de datos la cual contiene los resultados obtenidos

durante la precipitación de proteínas por medio del método de “Salting Out”,

realizado en la práctica del laboratorio para la cuantificación de las proteínas.

TABLA Nº 1.

Fuente: guía de laboratorio de bioquímica.

1º. Curva de calibración utilizando la lectura de los tubos 3 al 6 en

absorbancia contra mg de proteína contenidos en cada uno de los

mismos.

Para calcular los mg de proteínas en los tubos 3, 4, 5 y 6 se parte del

estándar de proteínas a concentración 8mg/ml, en el que se halla 8mg de

proteínas en 1ml de solución, así el cálculo se realiza mediante una simple regla

de tres utilizando los ml de solución para cada uno de los tubos, presentados en la

tabla anterior. El procedimiento se desarrolla a continuación:

Tubo Nº 3 estándar de proteínas = 0,25 ml

8 mg de proteínas 1 ml

X 0,25 ml

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

Volumen en: ml ml ml ml ml ml ml

Solución X1 proteínas totales 2

Solución X2 albumina 2

Estándar de proteínas 8mg/ml 0,25 0,5 0,75 1

NaCl 0,9% 1,75 1,5 1,25 1 2

Reactivo de biuret 4 4 4 4 4 4 4

mg de proteínas 2mg 4mg 6mg 8mg

X= 8mg proteínas x 0,25ml

1ml

Tubo n° 4: estándar de proteínas = 0,50 ml.

8 mg de proteínas 1 ml

X 0,50 ml

X= 8mg proteínas x 0,50ml

1ml

Tubo n° 5: estándar de proteínas = 0,75 ml.

8 mg de proteínas 1 ml

X 0,75 ml

X= 8mg proteínas x 0,75ml

1ml

Tubo n° 6: estándar de proteínas = 1 ml.

8 mg de proteínas 1 ml

X 1 ml

X= 8mg proteínas x 1ml

1ml

X = 8 mg de proteínas

X = 6 mg de proteínas

X = 4 mg de proteínas

X = 2 mg de proteínas

Conjuntamente con los resultados obtenidos en el laboratorio, expresados

en la tabla nº 2, y los calculados se procede a realizar la gráfica de la curva de

calibración.

TABLA Nº 2

Fuente: fotocolorímetro utilizado durante la practica en el laboratorio de bioquímica.

*Los valores de mg de proteínas de los tubos X1 y X2 se obtuvieron mediante

extrapolación de la Curva de Calibración.

GRÁFICO N°1: Curva de calibración.

Fuente: fotocolorímetro utilizado durante la practica en el laboratorio de bioquímica

Partiendo de estos resultados se procederá a comparar, por medio de la

relación entre la absorbancia y la concentración de proteínas totales, el valor de la

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 2 4 6 8 10 12 14

Ab

sorv

anci

a

Concentracion de Proteinas

Tubos Absorbancia Mg de proteínas

X1 0,769 11,75*

X2 0,380 5,80*

3 0,139 2

4 0,265 4

5 0,393 6

6 0,460 8

absorbancia de los tubos problemas y así de esta manera determinar la cantidad

de proteínas contenidas en la muestra lo que a su vez nos llevara a conocer la

cantidad total en un ml de suero humano, además de establecer una relación entre

la cantidad de albúmina y globulinas contenidas en la muestra de suero problema.

2º. Cantidad de proteínas totales en la solución X1 en base a la curva de

calibración.

Una vez realizada la extrapolación de los mg de proteína de X1, basándose en

la tabla nº 2, su absorbancia corresponde a 0,769 por lo que 11,75 corresponde a

los mg de proteína en dicho tubo de ensayo.

Primeramente para obtener la cantidad de proteínas totales en el tubo X1, es

necesario calcular dicha cantidad en la muestra inicial de 10 ml compuesta por

0.5ml de plasma o suero y 9,5 ml de NaSO4, de la cual solo se utilizó 2ml de esta

solución. Los cálculos son los siguientes:

2 ml de solución 11,75 mg de proteínas

10 ml de solución X

X = (10 ml de solución) x (11,75 mg de proteínas)

(2 ml de solución)

Posteriormente se tiene que calcular los 0,5 ml que habían sido añadidos

de plasma o suero sanguíneo para poder obtener el porcentaje de proteínas

presentes en su totalidad.

0,5 ml de suero 58,75 mg de proteínas

100 ml de suero X

X = (100 ml de suero) x (58,75 mg de proteínas)

(0,5 ml de suero)

X = 58,75 mg de proteínas

X = 11.750 mg de proteínas

El resultado se expresa en gr/dl por lo que se realiza una conversión de

unidades para la obtención de lo requerido:

,

3º. Cantidad de albumina en la solución X2.

De la misma manera que con la solución X1, se calcula los mg de proteínas

mediante la extrapolación de la misma en la curva de calibración. La absorbancia

de X2 es de 0,380 por lo que el valor de su concentración es de 5,80 mg.

Se calcula la cantidad de albúmina en la muestra inicial de 10 ml de los cuales

se extrajo 4ml de solución.

4 ml de solución 5,80 mg de albúmina

10 ml de solución X

X = (10 ml de solución) x (5,80 mg de albúmina)

(4 ml de solución)

Posteriormente, al añadirse los 0,5ml de plasma, se tiene que:

0,5 ml de suero 14,50 mg de albúmina

100 ml de suero X

X = (100 ml de suero) x (14,50 mg de albúmina)

(0,5 ml de suero)

Se expresa el valor en gr/dl de la siguiente manera:

,

X = 14,50 mg de albúmina

X = 2.900 mg de albúmina

4º. Cantidad de globulinas precipitadas por diferencia.

La cantidad de proteínas totales en el suero equivale a la sumatoria de las

cantidades de albumina y globulinas en la muestra; el primer dato es conocido y la

cantidad de proteínas totales también, por lo que se despeja las globulinas de la

ecuación formada y dará el resultado deseado.

Proteínas totales = albúmina + globulinas.

Globulinas = proteínas totales – albúmina.

Globulinas = 11,75 gr/dl – 2,90 gr/dl.

Globulinas = 8,85 gr/dl

5º. Relación albumina/globulina (A/G)

Albúmina/Globulinas = 2,90 gr/dl = 0.328 gr/dl

8,85 gr/dl

Porcentaje de albúmina:

11,75 gr/dl de proteínas totales 100%

2,90 gr/dl de albúmina X

X = (2,90 gr/dl de albúmina) x (100%)

(11,75 gr/dl de proteínas totales)

X = 24,68%

Porcentaje de globulinas:

11,75 gr/dl de proteínas totales 100%

8,85 gr/dl de globulinas X

X = (8,85 gr/dl de globulinas) x (100%)

(11,75 gr/dl de proteínas totales)

Porcentaje de proteínas totales:

Proteínas totales = 75,32% + 24,68%

Proteínas totales = 100%

A continuación se presenta un cuadro comparativo de los valores normales

en relación con los valores obtenidos de proteínas presentes en el suero

sanguíneo o plasma humano.

Proteínas Valores normales

Valores obtenidos Apreciación

Totales 6,0 - 8,4 11,75 Alto

Albúminas 3,5 - 5,5 2,90 Bajo

Globulinas 2,5 - 3,69 8,85 Muy Alto

Albúminas/Globulinas 1,3 – 1,7 0,328 Muy Bajo

X = 75,32%

Discusión de los resultados.

Después de la realización de la práctica de laboratorio y la obtención de los

resultados pudimos lograr el estudio de las proteínas que componen el plasma

sanguíneo, como lo son la albumina y las globulinas.

A altas fuerzas iónicas, la solubilidad de las proteínas disminuye, este

fenómeno es conocido como “salting out”. Este fenómeno se da básicamente por

la competencia que establece la sal Na2SO4 con la proteína por el agua logrando

sacar la capa de solvatación quedando las cargas de las proteínas libres, trayendo

como consecuencia que estas se atraigan y se aglomeran logrando la

precipitación de las globulinas; esto también, es debido a que la sal estaba en una

concentración saturada. Culminada esta etapa se extrajo cierta cantidad de

proteínas para determinar el total que poseía la solución inicial, mientras que se

tomaba otra cantidad para llevar al centrifugado y observar el componente de

albúmina que poseía. En este último se le añadió Éter dietílico como solvente

orgánico para provocar a precipitación de los componentes de la solución.

Notoriamente se observó cómo quedó precipitada las globulinas entre la albumina

que se encontraba por debajo de ella y el éter que estaba por encima.

A través del método colorímetro de Biuret se cuantifica las proteínas totales

y de albumina presentes en la muestra, en el que mientras más oscura la

coloración de la muestra mayor la concentración de proteínas. La centrifugación y

el baño de maría sirven de “catalizadores” de la reacción. El fotocolorímetro

permite cuantificar en función de la longitud de onda la reciprocidad que existe

entre los valores de una misma magnitud fotométrica en relación a dos haces de

radiaciones; arrojó los valores de la absorbancia que se usaron como punto de

partida para realizar la gráfica, que, con valores ya determinados y a partir de una

serie de ecuaciones matemáticas se logró determinar los gr % de albúmina y

proteína y los valores porcentuales de estas y las globulinas.

Se pueden considerar valores correspondientes aproximados de un

Proteinograma para determinar el total normal de albúmina y globulinas. El

proteinograma es un examen que busca hacer una cuantificación aproximada de

los tipos de proteína en la parte líquida (suero) de una muestra de sangre.

Correspondiente a esto los valores regulares son:

Proteínas Valores normales

Valores obtenidos Apreciación

Totales 6,0 - 8,4 11,75 Alto

Albúminas 3,5 - 5,5 2,90 Bajo

Globulinas 2,5 - 3,69 8,85 Muy Alto

Albúminas/Globulinas 1,3 – 1,7 0,328 Muy Bajo

Al considerar estos valores se puede observar que los datos de proteínas

totales, albumina y globulinas obtenidos en el laboratorio se encuentran alterados

por lo que se puede inferir que el individuo en cuestión presenta alguna patología

relacionada con el aumento y la disminución de los valores de proteínas totales en

el plasma.

Luego de decir esto, los resultados obtenidos en el laboratorio observamos

que el porcentaje de albúmina presente en la solución de proteínas totales es de

un 24,68%.

Según Harper Bioquímica Ilustrada “La albúmina (69 kDa) es la proteína

principal del plasma humano (3,4 a 4,7 g/dL) y constituye aproximadamente 60%

de la proteína plasmática total. Alrededor de 40% de la albúmina está presente en

el plasma y el otro 60% existe en el espacio extracelular.” (pág. 614).

La albúmina presente en la solución estudiada es menor en una diferencia

de ±35% en relación al 60% que debe existir en el plasma humano. Demostrando

que hay una deficiencia de albúmina con respecto a la cantidad de globulina, que

en valores normales es de 38% y en concordancia a la muestra estudiada se tiene

un porcentaje de 75,32% para la globulina. Podemos entender que existe mayor

cantidad de globulina y una deficiencia de albúmina, es decir, los valores no

corresponden a un patrón normal de relación albúmina-globulina.

La importancia de la albúmina en la nutrición se debe a que es una proteína

que puede ser fácilmente metabolizada; una de sus funciones importantes es la de

servir como transportadora de diferentes moléculas en el torrente sanguíneo, tanto

orgánicas como inorgánicas; así como también es la principal responsable de que

se mantenga la presión oncótica, es decir la presión osmótica coloide, y al

disminuir estos valores ocasiona edemas.

Existen patologías o síntomas que llevan una relación con un bajo número

de albúmina. Por ejemplo el plasma de aquellos pacientes que padecen alguna

enfermedad hepática muestra un declive en la relación albúmina-globulinas, es

decir, una relación de albúmina-globulina disminuida, ya que dicha proteína es

sintetizada en el hígado. De igual forma hay una síntesis menguada en forma

relativamente temprana en condiciones de malnutrición proteica como es el

kwashiorkor, que es una enfermedad que se produce en niños por la ausencia de

nutrientes, como las proteínas en la dieta.

Por su parte podemos destacar que los niveles de las globulinas, tomando

en consideración los valores obtenidos en la práctica, están por encima de 3.69

g/dl. Esto suele deberse, fundamentalmente, a un problema de deshidratación;

esta elevación de las Globulinas en general se observa en estados de defensa

contra agentes infecciosos. Las consecuencias de un aumento de las globulinas

en sangre puede ocasionar enfermedades como enfermedad hepática crónica,

además tienen una serie de riesgos como sangrado excesivo, desmayo o

sensación de mareo, hematoma (acumulación de sangre debajo de la piel),

infección, etc.

Conclusión.

Las proteínas se necesitan para la mayoría de las funciones normales del

cuerpo, como el mantenimiento, crecimiento, reproducción, lactación y producción

de pelo. El déficit de proteína en la dieta reduce las reservas en sangre, hígado y

músculos y predisponen a los animales a padecer una variedad de enfermedades

graves o incluso fatales.

Durante el desarrollo de la práctica realizada se procedió aplicar los

principales métodos que se usan en el laboratorio para precipitar y separar

proteínas, así como métodos especiales para cuantificarlas y de esa forma saber

en qué cantidades se encuentran presentes en una solución determinada, en

especial la solución usada en la experiencia de laboratorio, el “plasma o suero

humano” a través del cual se estudiaron sus proteínas más importantes, la

albúmina, las globulinas y la relación que existe entre ellas.

El plasma está constituido por una serie de proteínas, como la

Albúmina y Globulina que desempeñan funciones vitales en el organismo. La

purificación de estas, puede ser lograda mediante la utilización de una serie de

técnicas de separación, tales como el Salting-Out que es la técnica más común de

precipitar proteínas y el método de fotocolorímetro de Biuret con el cual se puede

estimar cuantitativamente las proteínas totales y albúmina presentes en la

muestra.

A través de la separación de las proteínas, por medio de la curva de

calibración se pudo observar que durante el experimento realizado, que se

obtuvieron valores anormales con respecto a los estándares, esto puede ser

debido a la presencia de alguna patología en el organismo, como también a un

error experimental o a alguna falla en la ejecución de la práctica; aun así se

analizaron los resultados en base a los resultados obtenidos siguiendo las

patologías que se pudieran presentar si estos valores fueran los correctos, sin

embargo para estar seguro de ello, se deberá en tal caso, realizar de nuevo todo

el proceso para luego así dar un diagnóstico seguro en caso de que lo amerite.

BIBLIOGRAFÍA.

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Diccionario Mosby Medicina Enfermería y Ciencias de la Salud: quinta adición, 2000 Harcourt