guia de lab oratorio de bioquimica 2011 salud]

GUÍAS DE LABORATORIO DE

BIOQUÍMICA

PARA CARRERAS DEL ÁREA DE LA SALUD

Coordinadora: Mg. ©Karin Figueroa S.

LABORATORIO DE BIOQUIMICA 2011

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CALENDARIO DE ACTIVIDADES

FECHA PRACTICO

Carbohidratos

Aminoácidos

Proteínas

Enzimas

Lípidos (Colesterol) y Glicemia

Extracción de ADN

Controles recuperativos

Examen

Examen de Repetición


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REGLAMENTO INTERNO LABORATORIOS DEPARTAMENTO BIOLOGIA.

1. La Asistencia a Laboratorio es de un 100%. 2. El uso del delantal o cotona blanca es OBLIGATORIO , éste debe usarse abotonado, el pelo

debe llevarse tomado , NO se debe ingerir alimentos ni bebidas en el labor atorio , LOS TELÉFONOS CELULARES SE DEBEN APAGAR.

3. Está prohibido ingresar al laboratorio con chalas o sandalias, se deben utilizar zapatos

cerrados que sirvan de protección

4. Se prohíbe ingresar a laboratorio con falda, o pantalones cortos, SOLO se permitirán el ingreso con pantalones largos.

5. Se exige PUNTUALIDAD, 6. Los estudiantes que lleguen atrasados antes del término del control, podrán ingresar y rendir el

respectivo control de laboratorio (solo se aceptarán dos atrasos en el semestre), los estudiantes que no tengan su delantal NO podrán ingresar al laboratorio, lo cual implica no rendir el control respectivo siendo calificado con nota 1.0 (uno coma cero).

7. NO se aceptará recuperar laboratorios. 8. El uso de la Guía de Laboratorio es OBLIGATORIO , los estudiantes que no tengan su guía

de laboratorio se les calificará con nota 1.0 (uno coma cero). 9. EVALUACIONES:

9.1 En TODOS los laboratorios se realizará un control de entrada, que comprenderá materia del LABORATORIO ANTERIOR Y DEL LABORATORIO A EFECTUARSE . Este control tendrá una duración máxima de diez minutos.

9.2 Para cada tema de laboratorio se deberá realizar un informe (ver anexo elaboración de

informe)

9.3 Al final del semestre se realizará un EXAMEN DE LABORATORIO

9.4 Las ponderaciones de Laboratorio son:

• 40% : Controles de Laboratorio • 30%: Informes • 30% : Examen de Laboratorio

9.5 A LOS ALUMNOS QUE SEAN SORPRENDIDOS COPIANDO EN LOS CONTROLES,

O EN EL EXAMEN, SE LES RETIRARA LA PRUEBA, SIENDO CALIFICADOS CON NOTA 1.0 (uno coma cero).

9.6 Cualqueir información es 9.7 NO SE ELIMINAN NOTAS .


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LABORATORIO Nº 1

CARBOHIDRATOS

INTRODUCCION

Mg. ©Karin Figueroa S. Lic. Patricia Arias

Los hidratos de carbono pertenecen los compuestos poli-funcionales que contienen grupo carbonilo (aldehído o cetónico ) y grupos hidroxilo alcohólicos. Por lo tanto, ellos poseen simultáneamente propiedades de aldehídos o cetonas y de alcoholes polidroxilicos. Los hidratos de carbono comprenden un grupo amplio de compuestos naturales que se dividen en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos, según el numero de átomos de carbono en la molécula, se clasifican en triosas, terrosas, hexosas, heptosas, etc. La formula genérica de los monosacáridos es CnH2nOn. Todos los monosacáridos naturales, teniendo en sus moléculas átomos de carbono asimétricos , son ópticamente activos y giran en el plano de la luz polarizada. Los oligosacáridos y polisacáridos son hidratos de carbono complejos y al ser calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se obtienen monosacáridos. Los polisacáridos forman mediante la hidrólisis un gran número de moléculas de monosacáridos, además poseen una masa molecular muy elevada, son insolubles en agua o forman diluciones coloidales. Los hidratos de carbono están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal. Ellos constituyen los productos finales de la síntesis fotoquímica en plantas verdes. Los animales, no aptos para la acumulación de energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas en las plantas. Los hidratos de carbono participan en la construcción de las estructuras de los organismos vivos, sirven de material para la biosíntesis de los compuestos de otras clases y juegan un papel importante en la bioenergética de la célula. Los hidratos de carbono estan en la composición de los ácidos nucleicos, las glicoproteínas, glicolípidos y en algunas vitaminas y coenzimas. CLASIFICACION DE LOS HIDRATOS DE CARBONO a) Monosacáridos: Son generalmente sólidos bien cristalizados, solubles en agua, de

sabor más o menos dulce. Todos poseen propiedades reductoras, derivadas de grupos carbonilos. - Según su grupo funcional se pueden clasificar en adosas, si contiene un grupo aldehído(-CHO), o cetosa si contiene el grupo cetona (>C=O)


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b) Disacáridos: Formados por dos unidades de azúcares simples siendo lo más importante aquellas derivadas de las hexosas; los que por bloqueo o no de las funciones reductoras se clasifican en:

1. - Disacáridos reductores ej: Maltosa, lactosa. 2. - Disacáridos no reductores ej: Sacarosa. c) Polisacáridos : Son grandes moléculas formados por condensación de unidades de

monosacáridos. Los más comunes son: glicógeno, almidón, dextrinas y celulosa. Cuando se obtienen materiales biológicos de estructuras desconocidas, se emplean usualmente dos tipos de determinaciones para establecer la presencia de hidratos de carbono.

Una de las propiedades de los carbohidratos que se emplean en su determinación es el poder reductor (no todos los azúcares tienen esta propiedad).

El poder reductor de los carbohidratos está condicionado a la presencia de un grupo aldehído libre o un grupo cetónico adyacente a un grupo hidroximetil.

En polisacáridos donde los grupos aldehídos o cetónicos libres se encuentran comprometidos formando enlaces glicosídicos, dan valores negativos con el test reductor. Estos enlaces glicosícos, son estables en medio alcalino pero se hidrolizan en presencia de ácido, liberando monosacáridos que dan reacción reductora positiva.

Numerosos agentes oxidantes como Cu2+, Ag+ y ferricianuro de potasio pueden oxidar a los azúcares reductores. En estas reacciones los carbohidratos sufren una serie de degradaciones oxidativas mientras que la sustancia oxidante es reducida. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS HIDRATOS DE CAR BONO

Usando las diferencias de las propiedades químicas es posible identificar algunos carbohidratos abundantes en la naturaleza a través de ciertos tests muy simples. Una propiedad de los carbohidratos y que se emplea en su determinación es el poder reductor. Esta propiedad está condicionada a la presencia de un carbono anomérico libre, que es aquel más oxidado. Numerosos agentes oxidantes como Cu 2+ (Fehling, Nelson), Ag+ (Tollens) y Ferricianuro (Park-Johnson) pueden oxidar a los azúcares reductores. Todos los Monosacáridos son reductores, como lo son también la mayoría de los Disacáridos, siendo una excepción importante la Sacarosa. Los Polisacáridos son NO reductores por estructura.

Test de Fehling

El complejo ión cúprico-tartrato (reactivo de Fehling) es reducido en ambiente alcalino para formar óxido cuproso (Cu2O), un precipitado pardo-rojizo. Cualquier carbohidrato que dé positivo el test de Fehling se considerará como un azúcar reductor.


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Test de Seliwanoff para Cetosas

Este test está basado en las reacciones de deshidratación (eliminación de H2O), catalizada por ácidos fuertes, en que las Cetosas la acusan con mayor rapidez que las Aldosas. Esta deshidratación conlleva a la formación de Furfurales. Estos Furfurales luego reaccionan con Resorcinol dando lugar a un compuesto coloreado. En consecuencia, las velocidades de desarrollo de color de un azúcar en presencia de HCI y Resorcinol (reactivo de Seliwanoff), permite establecer si un azúcar es Cetosa o Aldosa.

Test de Barfoed

Este test diferencia entre Monosacáridos y Disacáridos reductores. Los iones cúpricos (Cu2+) son reducidos por los azúcares reductores para dar óxido cuproso. En medio ácido los monosacáridos reaccionan más rápido que los disacáridos.

Hidrólisis Acida

Los enlaces glicosídicos son estables en medio alcalino pero se hidrolizan en presencia de ácidos inorgánicos enérgicos, liberando Monosacáridos los que darán reacción reductora positiva al someterlos al test de Fehling.

Test de Iodo para Almidón La fracción molecular de Amilosa del Almidón, tiene estructura helicoidal y es capaz de atrapar moléculas de I2 (o I3

-) para dar un complejo de color azul oscuro. OBJETIVOS

- Caracterizar cualitativamente los carbohidratos de acuerdo a su reactividad en presencia de reactantes específicos.

- Identificar carbohidratos reductores. - Verificar la hidrólisis presentes en distintas muestras

PARTE EXPERIMENTAL En este práctico cada grupo recibe una Muestra Problema que debe ser identificada y que puede ser cualquiera de los siguientes carbohidratos: Glucosa, Fructosa, Lactosa, Sacarosa, Almidón u otros que se indicaran. Para la identificación se debe realizar los siguientes tests a cada muestra patrón y a la muestra problema. Sea metódico y ante alguna duda repita el análisis. 1.- Test de Fehling Tome 1 punta de espátula de muestra (˜ 0.1 g) si ésta es sólida o 1 mL si ésta es líquida y agregue 1 mL de reactivo de Fehling (0,5 mL del A y luego 0,5 mL del B). Se coloca el tubo de ensayo en un baño de agua a ebullición por 5 min.(Use pinzas de madera y coloque en el vaso piedras de ebullición). El test es positivo si se forma un precipitado pardo-rojizo de Oxido Cuproso una vez enfriado.


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2.- Test de Seliwanoff (Resorcinol: 3-hidroxi feno l) Tome 1 punta de espátula de muestra si ésta es sólida o 1 mL si ésta es líquida y agregue 8 mL del reactivo de Seliwanoff, agitar. Colocar el tubo de ensayo en agua en ebullición por 10 a 15 min. Si la muestra contiene Cetosa aparece una coloración rosada. Este reactivo dá un color verdoso cuando en el medio hay pentosas. 3.- Hidrólisis Acida Tome 2 mL de muestra si ésta es líquida o el doble de lo que ha estado utilizando, si ésta es sólida y en este ultimo caso agregue 1 mL de agua destilada al tubo. Acidifique la muestra con 0,5 mL de HCI conc. (¡Cuidado!). Colocar el tubo de ensayo en baño de agua en ebullición por 15 a 20 min. Luego de enfriar neutralice con NaOH 10 % (p/v) midiendo con papel pH. Los carbohidratos superiores no reductores deben liberar azúcares más sencillas reductoras que se confirmarían por el test de Fehling. 4.- Test de Iodo para Almidón Coloque 1 mL de muestra si ésta es líquida o 1 punta de espátula si esta es sólida y agregue 5 gotas de la solución de yodo/etanol (Lugol). La formación de un color azul intenso determina la presencia de Almidón. Tabla de resultado Test GLUCIDO Fehling Seliwanoff Test de iodo Glucosa

Fructosa

Lactosa

Sacarosa

Sacarosa Hidrolizada

Almidon


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LABORATORIO 2

TITULACIÓN DE AMINOACIDOS: Determinación de pK1, pK 2, PI

Mg. ©Karin Figueroa S.

Lic. Patricia Arias INTRODUCCION

Los aminoácidos son moléculas que contienen un grupo básico (amino -NH2) y un grupo ácido (carboxilo -COOH) unidos por un átomo de carbono, el carbono α

Fig. Nº1: Estructura básica de un aminoácido

Los α-aminoácidos difieren entre si por la cadena lateral (grupo -R) unida al carbono-α. Las propiedades de los aminoácidos queda determinada por estructura de la cadena lateral R. Es así como los aminoácidos se clasifican en Grupos R: apolares alifáticos (Glicina (Gly), Alanina (Ala), Valina (Val), Leucina (Leu), Isoleucina (Ile), Prolina (Pro), aromáticos (Fenilalanina (Fen), Tirosina (Tir), Triptófano (Tri), polares sin carga (Serina (Ser), Treonina (Thr), Cisterna (Cys), Metionina (Met), Asparagina (Asn), Glutamina (Gln), polares con carga negativamente (Aspartato (Asp), Glutamato (Glu), polares con carga positivamente (Lisina (Lis), Arginina (Arg), Histidina (His).

Fig. Nº2: Ejemplos de estructuras de aminoácidos .


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Fig. Nº3: Estructura zwitterión .

Dado que todos los aminoácidos poseen un grupo ácido y un grupo básico presentan propiedades anfóteras. Es decir, son moléculas que puede donar y aceptar protones. En una solución ácida los aminoácidos están completamente protonados (la forma catiónica). Sí la solución es neutra, la mayoría de los aminoácidos existen como iones dipolares, también llamados zwitterión. La carga neta de un ión dipolar es cero (la forma neutra). El pH en el cual predomina la forma con carga neutr a del aminoácido se llama el punto isoeléctrico (pI) . En una solución alcalina se encuentra mayoritariamente la forma con carga negativa, completamente desprotonada (la forma aniónica).

Fig. Nº4: Curva Titulación de Gli cina 0,1 M A 25ºC . Las especies iónicas predominantes en puntos clave de la titulación se muestran encima de la gráfica. Los recuadros sombreados, centrados alrededor de pK1 =2,34 y pK2 = 9,60 indican las regiones de máximo poder tamponante.


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OBJETIVOS • Determinar el pKa1, pKa2 de un aminoácido sin carga • Determinar el pKa1, pKa2, pKR y pI de un aminoácido ácido • Determinar el pKa1, pKa2 , pKR y pI de un aminoácido básico Materiales por grupo Reactivos 1 vaso pp 250 mL Solución de Gli 0,025 Molar pH=2,00 2 vasos pp de 100 mL Solución de Arg 0,025 Molar pH=2,00 1 pipetas aforadas de 25 mL Solución de Asp 0,025 Molar pH=2,00 1 pizeta Solución de NaOH 0,10 Molar 1 agitador magnético 1 barra magnética 1 bureta de 50 mL 1 soporte universal 1 pH-metro 1 pinza 1 doble nuez Parte Experimental 1. Tome una alícuota de 25 mL de solución de glicina 0,025 Molar y viértala en un vaso pp de 100 mL. Incluya la barra magnética y coloque sobre agitador magnético 2. Proceda a medir el pH. Registre este valor. 3. Ambiente una bureta de 50,0 mL con NaOH 0,10 Molar. Ahora llene la bureta con NaOH 0,10 Molar (cuide que no queden burbujas en el vástago de la bureta y únala al soporte universal) 4. Agregue NaOH 0,10 Molar en fracciones de 0,50 mL y mida el pH. (Cuide que la agitación sea constante) 5. Repita el paso 4 hasta llegar a pH 12,0


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LABORATORIO Nº3

PROTEINAS: Extracción y cuantificación de la caseí na de la leche

Mg. ©Karin Figueroa S.

Introducción

La purificación de proteínas es una actividad usual en el trabajo en Bioquímica. La Caseína, la proteína primaria de la leche, es una fosfoproteína que existe en cuatro formas: α, β, γ y δ caseína, cada una con composición aminoacídica diferente. Por lo tanto la caseína es una mezcla heterogénea de componentes proteicos. La caseína puede ser extraída y purificada de la leche por precipitación con sales o por pH. Las proteínas son solubles principalmente por los residuos de aminoácidos polares y cargados que establecen interacciones con el agua. Cualquier agente que rompa estas interacciones proteínas/agua disminuirá la solubilidad de la proteína y precipitara. La sal inorgánica más comúnmente utilizada es el Sulfato de Amonio que en solución se encuentra altamente solvatado reduciendo el agua disponible para interactuar con la proteína. Cada proteína posee una concentración de sal, sobre la cuál la proteína no podrá permanecer en solución y precipitará. El pH también ha sido utilizado efectivamente en la precipitación selectiva de proteínas. Un cambio en el pH de la solución altera el estado iónico de una proteína pudiendo llevarla a un estado de carga neutra (punto isoeléctrico), donde la solubilidad es mínima. Las moléculas de proteína neutras no se repelen eléctricamente y tienden a agregarse precipitando de la solución. La Caseína puede ser separada por precipitación isoeléctrica a pH 4,6. La Lactoalbúmina, junto a otras proteínas, permanece en solución de donde se puede separar por adición de HCl hasta pH 3,0 donde la Lactoalbúmina es insoluble.

Cuantificación de Proteínas en Solución Método de Biuret: cuando aquellas sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos reaccionan con sulfato de cobre alcalino, se forma un complejo de color púrpura. El color resulta de la coordinación de los átomos de nitrógeno peptídicos con los iones Cu++. La intensidad del color depende de la concentración de proteína. Se debe preparar una curva de calibración usando soluciones estándar de proteína. Estas son tratadas con el reactivo de Biuret y se mide la absobancia a la longitud de onda adecuada. La muestra de la proteína desconocida se trata igualmente y su concentración se determina de la curva de calibración.


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OBJETIVOS - Realizar de manera experimental la extracción de la proteína (caseína) - Cuantificar la concentración de proteína por el método de Biuret

PARTE EXPERIMENTAL

a) Separación de la caseína Cada grupo toma 5 ml de leche descremada y la diluyen a 25 ml con H2O destilada. Se agrega lentamente (durante aprox. 5 min) 0,2 ml de HCl al 2%. El pH debe alcanzar a 4,5 (comprobar con pH metro), donde se observa precipitación de la caseína (pH isoeléctrico). Agite por 5 min. Deje decantar en reposo por 15 min. Centrifugue. Descarte el sobrenadante. El residuo se lava dos veces con 10 ml H2O destilada centrifugando cada vez. Lave finalmente con 10 ml etanol dos veces. El sólido centrifugado se redisuelve en 5 ml de NaOH 0,01 M. Si queda sólido en suspensión, volver a centrifugar. La solución resultante se usa para la determinación de proteína disuelta por el método de Biuret.

b) Determinación de proteínas por el método de Biur et Preparar una solución estándar de proteína de conce ntración 10 mg/ml usando una proteína patrón (Albúmina de suero de bovino) BSA. En tubos de ensayo separados preparar cada una de las siguientes soluciones de proteína a partir de la solución standard de la proteína patrón: TUBO Nº ml de soluc. Estándar ml de agua

1 0 5,0 2 0,5 4,5 3 1,0 4,0 4 1,5 3,5 5 2,0 3,0 6 3,0 2,0 7 4,0 1,0 8 5,0 0

En tubos de ensayo separados se toma 1 ml de cada solución de proteína y se agrega, cada tubo, 4 ml de reactivo de Biuret. Se dejan los tubos a temperatura ambiente por 20 minutos y luego se mide la absorbancia a 540 nm de cada solución usando el tubo Nº 1 como blanco. Construir el gráfico Absorbancia v/s concentración (mg/ml) de proteína en papel milimetradoCurva de calibración .


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- Determinación de la concentración de caseína Tomar 1,0 ml de solución de proteína aislada y tratarla de igual forma que las soluciones de proteína patrón. Si la absorbancia no cae en el rango de la curva de calibración, entonces se deben hacer diluciones a la muestra. Informar los mg de caseína por litro de leche. - Determinación de la concentración de una proteína en un muestra problema Tomar 1 ml de la muestra problema y tratarla de igual forma que la solución anterior. Informe la concentración de proteína en mg/ml de muestra.


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LABORATORIO Nº4

ENZIMOLOGIA : Extracción y Caracterización de la F osfatasa

Acida de Aorta de Bovino

INTRODUCCION

Las enzimas son catalizadores biológicos, que aumentan la velocidad de una reacción,

disminuyendo la energía de activación de la misma. Se caracterizan por medio de Km,

constante de Michaelis-Menten y de la Vmáx. velocidad máxima de reacción. La

velocidad de una reacción se puede estimar:

a) midiendo la desaparición de sustrato en el tiempo o

b) midiendo la aparición de producto en el tiempo.

El termino fosfatasa se utiliza para describir a aquellas enzimas que catalizan la hidrólisis

de derivados del ácido ortofosfórico. Dependiendo del tipo de enlace que se hidroliza se

clasifican en:

a) Fosfomonoesterasa (enlace fosfoester)

b) Fosfodiesterasa (enlace fosfodiester)

b) Anhídrido fosfórico hidrolasa (enlace pirofosfato).

Las fosfomonoesterasas se clasifican en específicas (un único sustrato) y no especificas

(reconocen a varios sustratos distintos). Estas últimas, a su vez, dependiendo del pH

óptimo, se clasifican en alcalina o ácida.

Las fosfatasas están presentes en prácticamente todos los órganos animales. Se

encuentran involucradas en el metabolismo de carbohidratos, ácidos nucleicos,

fosfolípidos y en la formación de los huesos.

En este práctico se estudiará una fosfomonoesterasa no especifica que se extraerá de la

aorta de bovino y cuyo pH óptimo está en el rango ácido (fosfatasa ácida).


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Mecanismo de reacción:

Primera etapa: se une el grupo fosfato al grupo OH de un residuo serina del sitio activo

de la fosfomonoesterasa :

O- O-

E - OH + R -O - P = O R -OH + E -O - P = O

- O O-

Enzima Sustrato Intermediario

Segunda etapa: el intermediario se hidroliza regenerando la enzima :

O- O-

H2O + E - O - P = O E - OH + H - P = O

O- O-

En este práctico se usará como sustrato p-nitrofenilfosfato el que al hidrolizarse genera

para-nitrofenol. Este compuesto a pH alcalino presenta un color amarillo el cual puede ser

cuantificado por espectrofotometría a 410 nm. A esta longitud de onda el coeficiente de

extinción molar, εM, es = 17500 M-1 cm-1.

O- O-

E -OH + NO2 - - O - P = O E -O-P = O + NO2 - - O H

O O-

Para determinar la concentración del producto coloreado, se mide la absorbancia a 410

nm, frente a un blanco que contiene todos los reactivos menos el sustrato. Aplicando la

ley de Lambert y Beer, se calcula la concentración molar del producto formado.

Ley de Lambert - Beer : A = ε·c·l, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de

extinción molar, c es la concentración en moles/L y l es el diámetro de la celda.

La velocidad de reacción se obtiene al relacionar la cantidad de producto formado en el

tiempo, mediante la siguiente ecuación:

V = [p-nitrofenol] / ∆t

Donde v es la velocidad de la reacción enzimática, ∆t es el tiempo de incubación.

Para determinar los parámetros característicos de una enzima con comportamiento de

Michaelis Menten, se realiza el estudio del efecto de la concentración de sustrato frente a


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la velocidad de la reacción. En un principio se observa que al aumentar la [S] aumenta la

velocidad de reacción, hasta que llega un momento en que aunque se aumente la [S], la

velocidad se mantiene constante. Esta es la Vmáx y se alcanza cuando la enzima se

satura con sustrato :

v

[ sustrato]

Sin embargo la determinación de Km y Vmáx desde este gráfico no es muy adecuada, ya

que se requiere de gran cantidad de puntos para construir la zona curva. En cambio si se

tratará de una línea recta, esta queda determinada con tres puntos y es más fácil,

extrapolar o interpolar, o calcular una pendiente o una intersección. Es así como

Lineweaver y Burk, linealizaron el comportamiento de Michaelis-Menten obteniendo una

recta que queda representada en el siguiente gráfico:

1/v

1/Vm

-1/Km 1/[S]


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Objetivos

* Cuantificar la velocidad de una reacción enzimática

* Aplicar los conceptos teóricos adquiridos en la caracterización de una enzima.

* Encontrar el pH y la temperatura optima de la fosfatasa ácida de aorta de bovino

* Determinar Km y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino

* Cuantificar la velocidad de la reacción enzimática en presencia de un inhibidor

Materiales por Grupo Reactivos

30 tubos de ensayos solución tampón citrato pH: 3; 4,5;

5,6; 7,5; 9.

3 gradillas solución p-nitrofenilfosfato 30 mM

1 juego de micropipetas P1000, P200,P20 Solución MgCl2 50 mM

puntas azules y amarillas solución de TCA al 30%

3 cubetas solución de NaOH 0,1 M

pipeta vidrio 5 mL+propipeta

cronometro

Material General

espectrofotómetros

4 baños termorregulados ( a 20ºC, 37ºC, 60ºC, 80ºC)

4 placas calefactoras con vaso pp de 250 mL

Hielo

Parafilm

Procedimiento Experimental

A: Preparación de un extracto crudo de la enzima:

La enzima se extrae de aorta de bovino. Esta arteria se encuentra rodeada de una capa

de grasa fácilmente extraíble.

En el laboratorio se procede a retirar la capa de grasa, con la ayuda de una tijera se

extrae la capa externa y se deja solo la capa interna la cual se corta en trozos pequeños


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que se dejan en hielo. Los trozos fríos se homogeneizan junto con una cantidad

adecuada de agua destilada a 0ºC. Se homogeneiza no más de un minuto (evitando el

calentamiento), se enfría si es necesario. La mezcla se filtra usando gasa, el filtrado debe

permanecer frío, este corresponde a la enzima cruda o extracto crudo.

B: Efecto de pH

Para determinar el efecto del pH en la actividad Enzimática se realizarán reacciones en

distintos soluciones tampón citrato de pHs: 3,0; 4,5; 5,6; 7,5 y 9,0

Prepare una serie de tubos según indica la tabla 1. La enzima debe agregarse en último

lugar.

Tabla Nº1

Volumen (mL) B C 1 2 3 4 5

p-nitrofenilfosfato - 1,0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

MgCl2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

2,5 mL buffer pH 0 0 3.0 4.5 5.6 7.5 9.0

H2O 4.5 4.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Enzima 1.0 0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

B: Blanco: No contiene sustrato

C: Control: No contiene enzima y mide la hidrólisis espontánea del sustrato

MgCl 2: La enzima es dependiente del magnesio para su actividad.

Cada tubo debe mezclarse por inversión suavemente e incubar a 37ºC por 30 min.

Terminada la incubación, realice los siguientes pasos para cada tubo:

1. Agregar 1 mL de solución de TCA al 30%, mezclar por inversión y dejar en hielo. El

ácido tricloro acético (TCA) detiene la acción enzimática por desnaturalización ácida de la

enzima.

2. Transferir una alícuota de 1mL a un tubo que contenga 5 ml de NaOH 1,0 M. A pH

básico el producto p-Nitrofenol tiene un máximo de absorción a 410 nm.


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3. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco.

Anote los valores de absorbancia leídos con tres ci fras. Al valor de la absorbancia

de cada tubo experimental debe restarle la absorban cia del tubo C.

4. Una vez realizado los cálculos necesarios grafi que V (velocidad) versus pH. Se

deberá obtener un valor máximo de velocidad que cor responderá al pH óptimo.

Resultados Actividad Efecto pH

Tabla resultados Nº1

Nº tubo a pH Absorbancia

a pH

Concentración

Producto mM

Velocidad de la

reacción

3.0

4.5

5.6

7.5

9.0

C: Efecto de la temperatura en la reacción enzimáti ca

Se estudiará la reacción a las temperaturas 0ºC, 20ºC; 37ºC; 60ºC; 80ºC y 100ºC.

Prepare los siguientes tubos según la tabla 2

Tabla Nº 2

Volumen (mL) B C T

p-nitrofenilfosfato O 1.0 1.0

MgCl2 0.5 0.5 0.5

buffer pH 5,6 2.5 2.5 2.5

H2O 2.0 2.0 2.0

Enzima 1.0 0 1.0

1. Prepare seis veces el tubo C (C1, C2,…C6) y seis veces el tubo T (T1, T2…T6).

Mezcle cada tubo por inversión suavemente e incube 30 min. a las temperaturas

indicadas. Es decir un tubo C y tubo T para cada te mperatura ( Ej. C1 y T1 a 0ºC)


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2. Una vez terminada la incubación se procede para cada tubo en forma idéntica a la

descrita para el efecto del pH (desde el punto 1). Es decir:



enzima.



3. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco. Anote

los valores de absorbancia leídos con tres cifras. Al valor de la absorbancia de cada tubo

(discuta con sus profesores la factibilidad de usar el tubo C como blanco). Una vez

realizados los cálculos correspondientes corregir los valores de cada tubo Ti con el

correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TºC. Determine la temperatura optima

para la enzima

4. Una vez realizado los cálculos necesarios grafi que V (velocidad) versus

temperatura. Se deberá obtener un valor máximo de v elocidad que corresponderá a

la temperatura óptima.

Resultados Actividad Efecto Temperatura

Tabla resultados Nº2

Nº tubo a T ºC Absorbancia

a Tº

Concentración

Producto mM

Velocidad de la

reacción

0

20

37

60

80

100

Una vez realizados los cálculos correspondientes corregir los valores de cada tubo Ti con

el correspondiente Ci, grafique V (velocidad) versus TºC. Determine la temperatura optima

para la enzima.


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D: Efecto de la concentración de sustrato.

Determinación de Km y Vmáx de la fosfatasa ácida de aorta de bovino.

Prepare los siguientes tubos, según la tabla 3:

Tabla Nº3

Volumen (mL) Blanco 1 2 3 4

p-nitrofenilfosfato - 0,5 1,0 1,5 2,0

MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

buffer pH 5,6 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

agua 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

Enzima 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Para cada tubo mezcle por inversión suavemente e incube a 37ºC, por 30 Minutos (este

será el ∆t y debe ser medido con precisión).

1. Una vez terminada la incubación se procede para cada tubo en forma idéntica a la

descrita para el efecto del pH (desde el punto 1). Es decir :



enzima.



4. Lea en el Espectrofotómetro cada tubo a 410 nm, usando el tubo B como blanco.

Anote los valores de absorbancia leídos con tres ci fras. Al valor de la absorbancia

de cada tubo.

5. Una vez realizado los cálculos necesarios grafique V (velocidad) versus temperatura.

Se deberá obtener un valor máximo de velocidad que corresponderá a la temperatura

óptima.


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6. Con los valores de absorbancia calcule la [p-nitrofenol]. Con este valor y el tiempo de

incubación calcule la velocidad de la reacción.

7. Conociendo la concentración inicial de sustrato, calcule la concentración de este en

cada tubo. Grafique según Lineweaver- Burk. Determine el valor de Km y Vmáx.

8. Para calcular la concentración de sustrato recuerde que V1 x C1 = V2 x C2

Resultados Curva de Saturación Tabla Nº3

Concentración

Sustrato

Absorbancia

A 410nm

Concentración

Producto mM

Velocidad de

reacción

1 / [ S ]

1 / v

E: Efecto de un inhibidor en la cinética de una rea cción enzimática .

Se utilizará H2PO4- ( producto de la reacción) como inhibidor de la reacción catalizada por

la fosfatasa ácida. Para ello se repite la experiencia anterior “Efecto de la concentración

de sustrato” en presencia del inhibidor.

Volumen (mL) Blanco 1 2 3 4

p-nitrofenilfosfato - 0,5 1,0 1,5 2,0

MgCl2 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

buffer pH 5,6 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Agua destilada 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

NaH2PO4 10 mM 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Enzima 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

1. Selle los tubos con parafilm, incube a 37 ºC por 30 minutos. Proceda de la misma

forma anterior para detener la reacción enzimática y medir la formación de

producto.


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Resultados Cinética de Inhibición

Tabla Nº3

Concentración

Sustrato

Absorbancia

A 410nm

Concentración

Producto mM

Velocidad de

Reacción en

presencia de

NaH2PO4

1 / [ S ]

1 / v

1. En gráfico velocidad versus concentración trace los resultados de velocidad en

presencia del inhibidor

2. En gráfico de Lineweaver- Burk trace los resultados de velocidad en presencia del

inhibidor

3. Determine el tipo de inhibición.

Resultados

1. Construir la gráfica del efecto del pH.

2. Construir la gráfica del efecto de la temperatura

3. Construir la gráfica de según Lineweaver- Burk. Determine el valor de Km y Vmáx.

4. Determine el tipo de inhibición.


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LABORATORIO Nº5

GLICEMIA Y COLESTEROL

A. GLICEMIA

INTRODUCCIÓN La glucosa es la principal fuente de energía en el ser humano. Sin embargo, dependiendo de los requerimientos energéticos del individuo el metabolismo de la glucosa puede resultar en: a) producción de energía, al catabolizarse hasta CO2 y H2O a través de la glicólisis , b) almacenamiento de energía, generando glicógeno en el hígado o triglicéridos en el tejido adiposo, c) utilización de la glucosa, convirtiéndola en amino ácidos o conjugándola con proteínas.

A pesar de las considerables fluctuaciones en la ingesta de carbohidratos (principal fuente de glucosa) y en su demanda, la concentración de glucosa en la sangre (glicemia) de los individuos sanos se mantiene en un rango estrecho (70 – 105 mg/dl en el adulto en ayuno). La estricta regulación de la concentración sanguínea de glucosa depende de la acción de varias hormonas. La insulina estimula la captación de glucosa y promueve su conversión a glicógeno (glicogénesis) o triglicéridos, y además inhibe la producción de glucosa endógena. Por otra parte hormonas contrarreguladoras como glucagón, epinefrina, cortisol y hormona de crecimiento, aumentan la liberación y producción endógena de glucosa (glicogenolisis, gluconeogénesis) .

Por lo tanto, alteraciones en la producción, secreción, y/o actividad biológica de estas hormonas resultan en cambios de los niveles sanguíneos de glucosa. Por esto la determinación de la concentración de glucosa en la sangre es fundamental en el diagnóstico y monitoreo de desórdenes del metabolismo de carbohidratos como por ejemplo diabetes mellitus, diabetes gestacional, hipoglicemia neonatal, hipoglicemia idiopática, carcinoma de islotes pancreáticos, etc. Existen numerosos procedimientos analíticos para cuantificar la concentración de la glucosa en la sangre, siendo rutinariamente utilizados los métodos enzimáticos , dada su alta especificidad y sensibilidad. En este trabajo práctico se utilizará el método de la glucosa oxidasa (GOD), acoplado a una reacción colorimétrica catalizada por la enzima peroxidasa (POD).


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Las reacciones involucradas en el ensayo enzimático son las siguientes: Glucosa (muestra) + O2 + H2O

GOD

gluconolactona + H2O2

2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol

POD

4 H2O + 4-(p-benzoquinonamonoimino)fenazona El último producto generado en esta serie de reacciones es coloreado, por lo tanto puede absorber la luz visible y en consecuencia puede cuantificarse espectrofotométricamente (ver anexo de espectrofotometría). Dado que la producción de 4-(p-benzoquinonamonoimino)fenazona es directamente proporcional a la concentración de glucosa, se puede construir una curva de calibración generada a partir de soluciones de concentración conocida (estándar) de glucosa y las mediciones de absorbancia del producto final del ensayo enzimático. Para conocer la concentración de glucosa de una muestra desconocida, realizamos el ensayo y medimos la absorbancia del producto. Este valor de absorbancia puede ser interpolado en la curva de calibración para conocer la concentración de glucosa. OBJETIVOS

- Cuantificar la concentración de glucosa de una muestra problema - Evaluar las diferentes concentraciones de glucosa sobre el efecto que puede

implicar en el organismo. TAREAS PREVIAS - Cálculos para preparar estándares de glucosa mediante dilución seriada de la solución stock.


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PARTE EXPERIMENTAL Materiales 1 micropipeta p20 1 micropipeta p1000 puntas para p20 puntas para p1000 15 tubos eppendorfs 1 microplaca lector de microplaca rotulador 1,5 ml suero fisiológico 1 ml glucosa 400 mg/dl (solución stock) 3 ml reactivo R1 0,1 ml plasma A (muestra) 0,1 ml plasma B (muestra) Procedimiento experimental 1. Preparación de estándares de glucosa - rotular 5 tubos eppendorfs para preparar las soluciones estándares de glucosa - preparar 500 µl de los estándares de glucosa (400, 200, 100, 50 y 25 mg/dl), haciendo

diluciones seriadas en suero fisiológico a partir de la solución stock de glucosa. 2. Obtención de plasma sanguíneo (ya fue hecho, Ud. recibirá el plasma) - rotular 1 tubo eppendorf para colectar el plasma sanguíneo - centrifugar 2 min a 800 x g (1500 rpm) la muestra de sangre heparinizada para

separar el plasma de los elementos figurados - aspirar con la micropipeta el plasma, sin distorsionar el pellet celular - recuperar el plasma en tubo eppendorf limpio rotulado 3. Ensayo enzimático y medición de absorbancia - rotular 8 tubos eppendorfs para preparar las mezclas de reacción - preparar las mezclas de reacción, agregando a cada tubo los volúmenes de reactivos

indicados en la siguiente tabla 1 . Es recomendable, para sincronizar lo más que se pueda las reacciones, agregar el reactivo R1 a todos los tubos y luego comenzar a agregar los 3 µl de muestra a los tubos correspondientes. Luego de haber agregado la última muestra agitar todos los tubos simultáneamente.


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- incubar 30 min. a temperatura ambiente - transferir 150 µl de cada reacción a un pozo de la microplaca, registrando la

localización de cada muestra - medir la absorbancia a 505 nm (A505) en lector de microplaca Tabla 1

ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA

La cantidad de luz monocrómática absorbida por las moléculas de una solución se relaciona directamente con: la distancia que debe recorrer el haz de luz para atravesar la solución, la estructura de las moléculas en solución capaces de absorber energía a la longitud de onda determinada (λ) y la concentración de la/s molécula/s absorbente/s. Estas variables se integran en la ley de Beer-Lambert, que puede ser expresada de la siguiente manera, si consideramos sólo una especie molecular en la solución capaz de absorber energía a esa longitud de onda:

lcI

IoA ××=

= εlog

Donde: A : absorbancia ΙΙΙΙo: intensidad de la luz incidente ΙΙΙΙ: intensidad de la luz transmitida εεεε: coeficiente de extinción molar (L mol-1 cm-1) c: concentración de la molécula absorbente (mol L-1) I: largo de la celda por la que pasa de luz (cm)

La absorbancia es un valor empírico, determinado en un espectrofotómetro y es

además un valor adimensional (sin unidades). El coeficiente de extinción molar es específico de cada molécula, y depende de la

naturaleza química de la molécula estudiada, el solvente en el que se encuentra, la

Tubo Reactivo R1 Muestra 0 (blanco) 300 µl 3 µl suero fisiológico 25 300 µl 3 µl glucosa 25 mg/dl 50 300 µl 3 µl glucosa 50 mg/dl 100 300 µl 3 µl glucosa 100 mg/dl 200 300 µl 3 µl glucosa 200 mg/dl 400 300 µl 3 µl glucosa 400 mg/dl Muestra A 300 µl 3 µl plasma A Muestra B 300 µl 3 µl plasma B


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longitud de onda de la luz incidente, del pH y de sí la especie absorbente se encuentra en equilibrio con otras especies, por ejemplo cambiando el estado de protonación.

El largo de la celda depende del diseño de la celda y del espectrofotómetro

utilizado. De esta forma si medimos la absorbancia de soluciones con diferentes

concentraciones de la molécula absorbente, en las mismas condiciones experimentales (ε y l constantes), la absorbancia sólo dependerá de la concentración de esta molécula. Por lo tanto la relación entre absorbancia y concentración puede ser representada por la siguiente ecuación:

cKA ×= en donde los términos ε y l han sido reunidos en una única constante K. Esta ecuación puede ser representada por una recta en un plano de ejes cartesianos, donde A es la variable dependiente (y), c la variable independiente (x) y K la pendiente.


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B. LIPIDOS: Determinación de colesterol

Mg. ©Karin Figueroa S. INTRODUCCION. El colesterol y los ésteres del colesterol son liberados desde las lipoproteínas por detergentes. La enzima colesterol esterasa hidroliza los esteres de colesterol formándose H2O2 en la siguiente reacción enzimática de oxidación de colesterol por la colesterol oxidasa según la siguiente ecuación: Colesterol esterasa Ester de colesterol + H2O colesterol + ácidos. Grasos Colesterol oxidasa Colesterol + O2 colesterol-4-en-ona+H2O2 Peroxidasa H2O2 + 4AP+ fenol quinonimina + H2O La cantidad de quinonimina de color rojo formada es proporcional a la concentración de colesterol Reactivos : - Kit de Determinación de colesterol - Muestra se suero Procedimiento BLANCO ESTANDAR MUESTRA

Standard

-

20 µl

-

Muestra

-

-

20 µl

Reactivo de

trabajo

2ml

2ml

2ml

1. Mezclar e incubar a 37ºC por 5 minutos o 10 minutos entre 15º y 25ºC 2. Medir la Absorbancia del estándar y la muestra , ajuntando el espectofotrometro

con el blanco del reactivo a 505 nm. El color es estable por 30 minutos.


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Cálculos: Concentración de colesterol = Abs. de la muestra * concentración del estandar Abs. del estándar mg/dlx 0.0258= mmol/l Concentración del estándar : 200mg/dl Linealidad del método: El método es lineal hasta una concentración de 600mg/dl (15.4 mmol/l). Si la concentración de colesterol es mayor de 600mg/dl en el suero o plasma, diluir la muestra en solución salina y repetir la determinación, multiplicando el resultado por el factor de dilución. Valores de referencia Los siguientes limites son recomendados para el reconocimeinto de una hipercolesterolemia Sospechoso: 220mg/dl (5.7 mmo/l) De riesgo: 260 mg/dl (6.7 mmol/l) Objetivos: - Conocer el método de cuantificación de colesterol - Relacionar los conocimientos teóricos con la aplicación práctica y clínica


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LABORATORIO 6

EXTRACCIÓN DE DNA Lic. Patricia Arias

Introducción

El ácido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado ADN, constituye el principal componente del material genético de la inmensa mayoría de los organismos, junto con el ARN, siendo el componente químico primario de los cromosomas y el material con el que los genes están codificados.

Se trata de una molécula de gran peso molecular (macromolécula) que está constituida por tres sustancias distintas: ácido fosfórico, un monosacárido aldehídico del tipo pentosa (la desoxirribosa), y una base nitrogenada cíclica que puede ser púrica (adenina o guanina) o pirimidínica (timina, citosina o uracilo). La unión de la base nitrogenada (citosina, adenina, guanina o timina) con la pentosa (desoxirribosa) forma un nucleósido; éste, uniéndose al ácido fosfórico, nos da un nucleótido; la unión de los nucleótidos entre sí en enlace diester nos da el polinucleótido, en este caso el ácido desoxirribonucleico.

Fig. Nº1: Estructura Bases Nitrogenadas.

La función principal del ADN es mantener a través de un sistema de claves (código genético) la información necesaria para que las células hijas sean idénticas a las progenitoras (información genética). Este proceso se almacena en la secuencia de las


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bases (aparentemente aleatoria), que tiene una disposición que es copiada al ARNm (traducción) para que en el ribosoma sintetice determinada proteína. Este proceso es también denominado "dogma central de la biología molecular". Por medio de los mecanismos de recombinación y mutaciones se obtienen las variaciones necesarias para adaptaciones y evoluciones.

El núcleo dirige las actividades de la célula y en él tienen lugar procesos tan importantes como la autoduplicación del ADN o replicación, antes de comenzar la división celular, y la trascripción o producción de los distintos tipos de ARN, que servirán para la síntesis de proteínas. Las cadenas de polipeptídicas codificadas por el ADN pueden ser estructurales como las proteínas de los músculos, cartílagos, pelo, etc., bien funcionales como las de la hemoglobina o las innumerables enzimas del organismo. La función principal de la herencia es la especificación de las proteínas, siendo el ADN una especie de plano o receta para nuestras proteínas.

El primer paso en la purificación del DNA consiste en homogeneizar las células y lisar los núcleos de los cuales se extrae el DNA. El medio de extracción de ordinario contiene un detergente, como el SDS, que sirve para lisar (romper) los núcleos y liberar el DNA, hecho que aumenta notablemente la viscosidad de la solución. El detergente inhibe también cualquier actividad nucleasa en la preparación.

El objetivo de los pasos de purificación es separar el DNA de materiales contaminantes, como RNA y proteínas.

OBJETIVOS - Conocer los procedimientos básicos de purificación y extracción de DNA - Conocer las diferentes funciones que tienen cada reactivo para realizar la extracción - Lograr la visualización de DNA Materiales Hojas de acelga Sal Agua fría Detergente líquido Licuadora Jugo de lechosa (papaya) o piña (ananá) Vasos precipitados limpios Colador o filtros Alcohol frío Palillos Cuchara Parte Experimental


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En este práctico cada grupo contara con medio vaso de hojas de acelga al que se debe agregar una punta de espátula de sal y 250 ml de agua destilada fría, licuar a alta velocidad por 15 minutos. Las cuchillas de la licuadora separar las células de los tejidos que forman parte de la hoja. - Cuele el contenido del vaso de la licuadora a un vaso limpio. Añada 2 cucharadas soperas de detergente líquido (solubiliza membranas). Mezcle todo y deje reposar 10 minutos. - Vierta esta mezcla en pequeños recipientes de vidrio limpios. - Añada a cada recipiente unas gotas de jugo de lechosa (enzima) y mezcla muy suavemente para no formar espuma. Deje reposar 2 minutos. - Incline cada recipiente y añade lentamente desde su borde el alcohol frío hasta que veas una capa sobre el contenido. El DNA se elevará desde la mezcla hasta la capa de alcohol. Con un palillo puedes manipular el DNA. Información para la realización del informe Para el informe deberá averiguar lo siguiente:

1) Que función cumple el detergente 2) Que función cumple el alcohol 3) Que función cumple el jugo de lechosa

Esta información debe ser incluida en la parte de discusión.


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ANEXOS Formato de Entrega de Informes:

• Papel tamaño carta.

• Letra Arial 10. • Márgenes 2 cm por cada lado.

• Los títulos y subtítulos deben ir en negrita. • Escritura a espacio simple. • El número total de hojas no debe sobrepasar las 15, incluyendo portada e índice.

El informe debe incluir:

1) Tapa: - Titulo. (nombre de la guía) - Integrantes. (Nombre y apellidos)

- Nombre docente: - Fecha de realización del práctico

2) Índice. - Especificar la página en la que se encuentra cada uno de los

capítulos del informe.

3) Introducción:

- Indicar el marco teórico del estudio realizado. - Especificar los objetivos generales y específicos del trabajo

realizado.

4) Materiales y Métodos:

- Presentar las actividades realizadas y los medios empleados en su desarrollo incluyendo fotos, gráficos, esquemas, láminas, etc. Citar la bibliografía consultada en el caso de ser necesario.

5) Resultados y Discusiones:

- En esta parte se mostrar en forma de tablas todos los resultados de las mediciones realizadas.

- Posteriormente realizar una discusión de los diferentes

resultados que se obtengan, comparándolos con fundamento

teórico de lo observado en el laboratorio. - Ej. Si entre dos muestras problemas observó un cambio de

color cual es el principio químico que lo hizo cambiar y mostrar ese tipo de reacción para lo cual debe utilizar bibliografía.

6) Conclusiones y recomendaciones:

- Presentar las conclusiones obtenidas y posibles recomendaciones que el alumno pueda aportar.


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7) Bibliografía:

Al final de cada informe se deberá detallar la bibliografía consultada en base al siguiente modelo.

• Libros.

APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE DEL AUTOR 1; APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE AUTOR 2; APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE AUTOR 3; ETC. Año de publicación. Título de la publicación. Editorial. Cuidad y país

de publicación. __ Pág. (páginas del texto).

Ej: Matissek, R., Schnepel, F. N. y Steiner, G. 1998. Análisis de los alimentos. Ed. Acribia. Zaragoza, España.: pp. 1 y 229-232.

• Revistas u otra publicación periódica:

APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE DEL AUTOR 1; APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE AUTOR 2; APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE AUTOR 3; ETC. Año de publicación. Título de la publicación. EN REVISTA: Editorial.

pp.: __ - __ (páginas citadas).

Ej: Mazziatelli, M., and A. Shubert. 1990. Effect of several VAM

endophytes and artificial sustrate on vitropropagated Vitis berlandisi x rupestri 1103. En revista: Agric. Ecosyst. Environ.

29:279-283.

• Webibliografía: APELLIDO E INICIAL DEL NOMBRE DEL AUTOR. Disponible en: Página web.

SORIA A., Elia M., REYES E., Carlos, OCCEGUERA A., Zenaida et al. MICORRIZACIÓN DE PLANTAS MICROPROPAGADAS DE CAÑA DE AZÚCAR (Sacharum officinarum). Agric. Téc. [online]. oct. 2001, vol.61, no.4 [citado 02 Septiembre 2007], p.436-443. Disponible en la Web: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0365-

28072001000400005&lng=es&nrm=iso>. ISSN 0365-2807. NOTA: No se aceptaran como bibliografía o fuente de información.

www.rincondelvago.com www.wikipedia.com www.yahoo.com www.altavista.com

Ni otro tipo de web de dudosa fuente

Si se sorprenden informes en donde la información escrita es copiados y pegados textual desde las páginas web sin haber analizado u ordenado las ideas este informe será evaluado con nota 1.0

guia de lab oratorio de bioquimica 2011 salud]

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