holotype hla™ 96/11 configuraciÓn a y ce c b ce (ref: …hla+96-11+ifu_v1_a_b… · 0086...

0086PreparacióndeADNparaelanálisisde

secuenciaciónenIlluminaMiSeq

HOLOTYPEHLA™96/11CONFIGURACIÓNAYCE

YCONFIGURACIÓNBYCE(REF:H32YREF:H34)INSTRUCCIONESDEUSO

VERSIÓN102/05/2018

Parausodediagnósticoinvitro

V1

OmixonHolotype96/11CONFIGURACIÓN|ConfiguraciónAyCE,yConfiguraciónByCE|Instruccionesdeusov1.ParausodediagnósticoinvitroCopyright©2017,OmixonBiocomputingLtd.Confidencialypropietario

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ContenidoINFORMACIÓNDELFABRICANTE..........................................................................................................................7

SIGNIFICADODELOSSÍMBOLOS...........................................................................................................................7

CONTENIDODELKITHOLOTYPEHLA-96/11CONFIGURACIÓNAYCE(REF:H32)OCONFIGURACIÓNBYCE(REF:H34).............................................................................................................................................................8

CAJADECOMPONENTESDELCEBADOR..............................................................................................................................8CAJADECOMPONENTESDEREACTIVOSDEPREPARACIÓNDELABIBLIOTECA..............................................................................9PLACADEADAPTADORESDE96POCILLOS..........................................................................................................................9LIBRODEEXCEL............................................................................................................................................................9SOFTWARE–OMIXONHLATWIN...................................................................................................................................9

ENVÍOSYALMACENAMIENTO............................................................................................................................10

ADVERTENCIASYPRECAUCIONES.......................................................................................................................10

LIMITACIONESCONOCIDASDELPRODUCTO......................................................................................................................10

INFORMACIÓNDESEGURIDAD...........................................................................................................................11

PARÁMETROSDERENDIMIENTO........................................................................................................................11

ASISTENCIATÉCNICA..........................................................................................................................................11

Soportetelefónico:...........................................................................................................................................11

EQUIPOS,REACTIVOSYSUMINISTROS...............................................................................................................12

RECOMENDACIONESTÉCNICASYDELEQUIPO....................................................................................................................12RECOMENDACIONESDELREACTIVOASOCIADO..................................................................................................................12

CapacidaddelkitreactivodeMiSeq................................................................................................................13SUMINISTROSRECOMENDADOS.....................................................................................................................................13

AVISOLEGAL......................................................................................................................................................14

USOPREVISTO....................................................................................................................................................14

NOTAIMPORTANTEANTESDECOMENZAR........................................................................................................15

AISLAMIENTODEADNGENÓMICORECOMENDADO...........................................................................................................15

PRINCIPIODELMÉTODO.....................................................................................................................................16

RESUMENDEPASOS...........................................................................................................................................17

GLOSARIO/DEFINICIONES...................................................................................................................................18

PASO1–PREPARACIÓNDELAMEZCLAMAESTRADEAMPLIFICACIÓNDEHLA...................................................19

LISTADEREACTIVOS....................................................................................................................................................19PROTOCOLO..............................................................................................................................................................19

Mezclamaestra:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1yDQA1..........................................................20Mezclamaestra:HLA-DRB4.............................................................................................................................20Mezclamaestra:Grupo3deHLA-DQB1..........................................................................................................20

PASO2:AMPLIFICACIÓNHLADECLASEIYII......................................................................................................21


Mezclamaestracargadadepolimerasataq:HLA-A,B,C,DRB1/3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1yDQA1..........22Mezclamaestracargadadepolimerasataq:Grupo3deHLA-DQB1..............................................................22


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AmplificacióndeclaseI(HLA-A,ByC).............................................................................................................22AmplificacióndeclaseII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1yDQB1)..................................23Tamañosesperadosdelosamplicones............................................................................................................23

PASO3:CUANTIFICACIÓNYNORMALIZACIÓNDEAMPLICONES(MEDIANTEELUSODEFLUORÍMETRODEPLACAS).............................................................................................................................................................24


Agrupacióndeamplicones...............................................................................................................................26ExoSAP-ITPurificacióndeRCPExpresa............................................................................................................26

PASO4:PREPARACIÓNDELABIBLIOTECA..........................................................................................................27


Mezclamaestradefragmentación..................................................................................................................28Programadefragmentación............................................................................................................................28Mezclamaestradereparacióndeextremos....................................................................................................29Programadereparacióndeextremos..............................................................................................................29Mezclamaestradeligación.............................................................................................................................30Programadeligación.......................................................................................................................................30Agrupamientoypurificacióndebiblioteca......................................................................................................31

PASO5:SELECCIÓNDELTAMAÑODELABIBLIOTECA.........................................................................................33


PASO6:CUANTIFICACIÓNDEBIBLIOTECACONUNINSTRUMENTODERCPC......................................................34


MezcladelcebadorRCPc.................................................................................................................................34MezclamaestradeRCPc..................................................................................................................................35

PASO7:SECUENCIAMIENTOENELILLUMINAMISEQ..........................................................................................37

LISTADEREACTIVOS....................................................................................................................................................37CapacidaddelkitreactivodeMiSeq................................................................................................................37

PROTOCOLO..............................................................................................................................................................37

PASO8–ANÁLISISDEDATOSDELSECUENCIAMIENTOHLA................................................................................39

PROTOCOLOAUTOMATIZADO........................................................................................................................................39EstablecimientoyconfiguracióndeTI..............................................................................................................39Protocoloporanálisis.......................................................................................................................................39

PROTOCOLOMANUALDELSERVIDOR..............................................................................................................................39EstablecimientoyconfiguracióndeTI..............................................................................................................39Protocoloporanálisis.......................................................................................................................................39

PROTOCOLOMANUALDEESCRITORIO.............................................................................................................................40EstablecimientoyconfiguracióndeTI..............................................................................................................40Protocoloporanálisis.......................................................................................................................................40

FIGURASCOMPLEMENTARIAS............................................................................................................................41

EJEMPLODEPLACAPARAPLACADEAMPLICONES,PLACADEAMPLIFICACIÓN,PLACADEDILUCIÓN,PLACADECUANTIFICACIÓNDEAMPLICONES(PARAUNLOCUSINDIVIDUAL)YPLACADEREACCIÓN.......................................................................................41EJEMPLODEPLACAPARAPLACADECUANTIFICACIÓNDEESTÁNDARES...................................................................................41EJEMPLODEPLACADERCPCPARACUANTIFICACIÓNDEBIBLIOTECAKAPA............................................................................42


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APÉNDICE1:PIPPINPREP...................................................................................................................................43

PROGRAMACIÓNDELPIPPINPREP.................................................................................................................................43EJECUCIÓNDELPIPPINPREP.........................................................................................................................................43

APÉNDICE2:CUANTIFICACIÓNDEAMPLICONESCONUNINSTRUMENTODERCPC.............................................46


APÉNDICE3:CUANTIFICACIÓNDEBIBLIOTECACONUNTINTEFLUORESCENTEINTERCALADODEADNBC...........48



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Antecedentesdeldocumento:notasyactualizacionesimportantes

Versión Fecha Autor Resumendecambios Autorizadopor Fechadeemisión

V1 14/12/2017 TündeVágó Primeraversión EfiMelista 02/05/2018


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Exenciónderesponsabilidad

OmixonhahechotodoloposibleporgarantizarquelasInstruccionesdeUso(IFU,porsussiglaseninglés)seanprecisas.Omixonnoseresponsabilizaporerroresniomisionesquepudieranhaberocurrido. La información de estas IFU está sujeta a cambios sin previo aviso. Omixon no seresponsabilidadporningunaimprecisiónquepudierancontenerestasIFU.

OmixonsereservaelderechoamejorarestasIFUy/olosproductosquesedescribenenestasIFUencualquiermomentosinaviso.

Si encuentra información incorrecta, errónea o incompleta en estemanual, valoraremos suscomentariosysugerencias.Enví[email protected].


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InformacióndelfabricanteNombredelacompañía:OmixonBiocomputingLtd

Direccióndevisita:Fehérváriút50-52/6

Ciudad:Budapest

Códigopostal:H-1117

País:Hungría

Significadodelossímbolos

Númerodepartida/lote

Númerodereferencia/catálogo

Consultelasinstruccionesdeuso

ContienereactivoparanúmerodepruebaN

Fabricantelegal.Losdatosquecontienenestesímbolohacenreferenciaalafechadefabricación

Temperaturadealmacenamientorecomendada

Fechadevencimiento

Dispositivomédicoparadiagnósticoinvitro

ContienecomponentedereemplazoComponentedereemplazo


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ContenidodelkitHolotypeHLA-96/11ConfiguraciónAyCE(REF:H32)oConfiguraciónByCE(REF:H34)

CajadecomponentesdelcebadorLacajadecomponentesdelcebadorproporcionasolucionesespecíficasdelcebador listaparausarparaamplificacióndeRCPdelargoalcance(LongRangePCR)degenesHLAA,B,C,DRB1,DRB3, DRB4, DRB5, DPA, DPB1, DQA1 y DQB1. Además, contiene dos tipos de aditivos RCP(Potenciador1yPotenciador2).

Mezcladelcebador N.ºdereferencia Rxns Volumen/tubo Cantidadde

tubosCódigode

colorHLA-A P012 96 220µL 1 AmarilloHLA-B P022 96 220µL 1 RojoHLA-C P032 96 220µL 1 AnaranjadoHLA-DRB1/3 P042 96 220µL 1 VerdeHLA-DRB4 P072 96 220µL 1 BlancoHLA-DRB5 P112 96 220µL 1 RosaHLA-DPA1 P132 96 220µL 1 NegroHLA-DPB1 P072 96 220µL 1 PúrpuraHLA-DQA1 P082 96 220µL 1 MarrónHLA-DQB1(grupo3) P122 96 220µL 1 AzulPotenciador1 E01 96 1100µL 1 TransparentePotenciador2 E02 96 300µL 1 Transparente


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CajadecomponentesdereactivosdepreparacióndelabibliotecaLacajadecomponentesdepreparacióndelabibliotecacontienelosreactivosparalapreparaciónde la biblioteca (fragmentación, producir los extremos romos y adenilar los extremos de losampliconesyligarlassecuenciasdeadaptadoresindexados)apartirdelosampliconesdeHLA.

Reactivo N.ºdereferencia Rxns Volumen/

tuboCantidaddetubos

Códigodecolor

Enzimadefragmentación(A) R11 96 278µL 1 AmarilloSoluciónamortiguadoradefragmentación(B)

R21 96 278µL 1 Rojo

Enzimareparadoradeextremos(C) R31 96 162µL 1 VerdeSoluciónamortiguadorareparadoradeextremos(D)

R41 96 324µL 1 Anaranjado

Enzimadeligación(E) R51 96 324µL 1 AzulSoluciónamortiguadoradeligación(F)

R61 96 1800µL 2 Negro

Placadeadaptadoresde96pocillosEl componente de placa de adaptadores indexada de 96 pocillos contiene adaptadores NGSindexados listos para usar (oligonucleótidos de ADN bicatenario) en 5 µL de solución para lageneracióndebibliotecasindividualesdeNGS.Laplacadeadaptadoresindexadade96pocilloscontiene un tipo suficiente de adaptadores indexados para generar 96 bibliotecas NGSindividualesyparaidentificarmuestrasenlosprocesosposteriores.

Versióndelkit Reactivo N.ºde

referencia Rxns Vol/pocillo

N.ºdeplacas

H32 PlacadeadaptadoresA(i1-96) N1 96 5µL 1H34 PlacadeadaptadoresB(i97-192) N2 96 5µL 1

LibrodeExcelSe proporciona un libro de Excel para respaldar el protocolo de Holotype HLA 96/11 con loscálculos,losdiseñosdeplacas,elmantenimientoderegistros,lageneracióndehojasdemuestradeMiSeqymuchomás.Sinotieneunacopia,pó[email protected].

Software–OmixonHLATwinPóngase con contacto con [email protected] obtener los créditos deOmixonHLA TwinnecesariosparalacompradelkitHolotypeHLA96/11.


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Avisoimportante:UselostrescomponentesdelkitOmixonHolotypeHLA96/11yelsoftwareOmixonHLATwinenelmismoflujodetrabajoparaconstituirunflujodetrabajoparaelusodediagnósticoinvitro.Paraconocerlaslimitaciones,consultelaSecciónAdvertenciasyprecaucionesdeusodelproducto.

Los componentes de reemplazo están disponible a pedido especial del usuario. Recuerde queOmixonproporcionaelreemplazodecajasdecomponentes,node losviales individuales.Paraobtenermásinformación,[email protected].

EnvíosyalmacenamientoEnviadoenpaquetesdehielosecoencajasdeenvíodepoliestirenoextruido;debealmacenarsea-20°Calmomentodelallegada.Valideelcontroldetemperaturayelprocesodemonitoreodesuscongeladoresymanténgalosaunatemperaturaregular.Loskitssinabrirsonestableshastalafechadevencimientodelkit(queseindicaenlaetiquetadelkit)cuandoselosalmacenaa-20°C.Después de abrir el producto, se recomienda someter al producto a cuatro (4) ciclos decongelamiento/descongelamientoparagarantizar laestabilidaddelproducto.Loskitsabiertosseránestableshasta3mesescuandoselosalmacenaa-20°C.

AdvertenciasyprecaucionesLimitacionesdeusodelproducto

Paraasegurarelmejorrendimientoposible,utiliceelflujodetrabajodelkitHolotypeHLA24/7yelsoftwareOmixonHLATwinparalatipificacióndeHLAmedianteNGSconlosmateriales,losreactivosylosequiposrecomendadosenlasección“Equiposyreactivos”.ElusuariodebeverificaryvalidarelusodelosmaterialesdiferentesaaquellosidentificadosenlaSección“Equiposyreactivos”.NoreconstituyanidiluyalosreactivosenvolúmenesdiferentesaaquellosquesedescribenenestasIFU.Noutiliceunvolumeninferioraldelosreactivos,diferentealespecificadoenestasIFU.Estasactividadespuedenconduciraerroresderendimiento.OmixonnopuedebrindarsoporteencasodeproblemasderivadosporlafaltadeseguimientodelospasosdelprotocoloquesedescribenenestasIFU.Noutiliceelproductosidetectadañosenloscomponentes(vialesrotos,placa,taponesfaltantes,etc.).

LimitacionesconocidasdelproductoConsulte el documento “Guía de limitaciones conocidas del producto” para determinar lasambigüedades conocidas y las limitaciones conocidas del software respecto del productoHolotypeHLA.EstaguíaseentregaconlasIFU,perotambiénlapodráencontrarenelsitiowebde Omixon en Instrucciones de uso deMyHolotype/Support and Services/HLA Twin o podrá[email protected].


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InformacióndeseguridadLea lassecciones“Informacióndeseguridad”y“Notas importantes”de losreactivoso loskitsespecificadosenlaSección“Equipos,reactivosysuministros”antesdecomenzar.Cuandotrabajaconsustanciasquímicas,usesiempreunambodelaboratorioadecuado,guantesdescartablesygafasprotectoras.Paraobtenermásinformación,consultelashojasdedatosdeseguridad(SDS)apropiadasdisponiblesenelproveedordeproductosespecificado.Paraaccedera lasgeneralidadesde los componentesquímicosde los reactivosdelproducto,consultelasSDSdelkitHolotypeHLA96/11,disponibleapedido.Desecheloscomponentesdelproductocomodesechomédicogeneral.

ParámetrosderendimientoParámetrosprincipalesderendimientoestablecidossegúnlavalidacióndelproducto.

HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1

Sensibilidad 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Especificidad 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775%

Precisión 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724%

Exactitud 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572%

Reproducibilidad 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28%

Repetitividad 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00%

AsistenciatécnicaPararecibirasistenciageneralconesteprotocolo,pó[email protected]

Soportetelefónico:EstadosUnidos|+1(617)500-0790Europa|+36705748001Restodelmundo|+1(617)500-0790


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Equipos,reactivosysuministros

Recomendacionestécnicasydelequipo§ Cicladortérmicoconformatode96pocillos.§ Fluorímetro de placas (o cualquier instrumento capaz de detectar fluorescencia en un

formato de placa de 96 pocillos, para uso con el sistemadeADNbicatenario [ADNbc*]PromegaQuantiFluor).

§ PippinPrep(Catn.ºPIP0001)oBluePippin(Catn.ºBLU0001)deSAGEScience.§ InstrumentodeRCPcconformatodeplacade96o384pocillos.§ FluorímetroQubit(Catn.ºQ33216,ThermoFisherScientific)(opcional).§ IlluminaMiSeq(Catn.ºSY-410-1003)§ Computadorade64bitscon4núcleosy16GBdememoriaRAMcomomínimo.§ Almacenamientodedatosalargoplazo(aproximadamente2TBdedatosporMiSeqporaño).

Recomendacionesdelreactivoasociado§ KitsdeRCPdelargoalcancedeQiagen(Catn.º206401,206402o206403).

§ Cadamuestrarequiere4,4µLdePolimerasataq.§ ElkitdeRCPdelargoalcanceCatn.º206401(20)contiene8µLdePolimerasataq.§ ElkitdeRCPdelargoalcanceCatn.º206402(100)contiene40µLdePolimerasataq.§ ElkitdeRCPdelargoalcanceCatn.º206403(250)contiene100µLdePolimerasataq.

§ ExoSAP-ITdeAffymetrix(Catn.º75001-200,75001-1ML,75001-4X-1MLo75001-10ML).§ Cadamuestraagrupadanecesita4µLdeenzimaExoSAP-IT.§ LaCatn.º75001-200contiene200µLdeenzimaExoSAP-ITExpress.§ LaCatn.º75001-1-MLcontiene1mLdeenzimaExoSAP-ITExpress.§ LaCatn.º75001-4X-1MLcontiene4mLdeenzimaExoSAP-ITExpress.§ LaCatn.º75001-10MLcontiene10mLdeenzimaExoSAP-ITExpress.

§ Kitdecuantificacióndebiblioteca:Illumina/UniversaldeKAPABiosystems(Cat.n.ºKK4824).§ KitdeensayoQubitdsDNABR(Catn.ºQ32850oQ32853)(opcional).

§ LaCatn.ºQ32850contiene100ensayos.§ LaCatn.ºQ32853contiene500ensayos.

§ SistemadeADNbcQuantiFluordePromega(Catn.ºE2670).§ CuentasAgencourtAMPureXPdeBeckmanCoulter(Catn.ºA63880,A63881oA63882).

§ CadaciclodeHolotypeHLAnecesitacomomáximo900µLdecuentasAMPureXP.§ LaCatn.ºA63880contiene5mLdecuentasAMPureXP.§ LaCatn.ºA63881contiene60mLdecuentasAMPureXP.§ LaCatn.ºA63882contiene450mLdecuentasAMPureXP.

§ Casetedegel,1.5%agarosa,libredetinciónconestándarinterno(MarcadorK/R2),paraPippinPrep/BluePippin(Cat.n.ºCDF1510paraPippinPrepyBDF1510paraBluePippin).

§ Etanoldegradomolecular(alcoholanhidro).§ Aguadegradomolecular(librededesoxirribonucleasayribonucleasa).§ Hidróxidodesodio.


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§ 1×soluciónamortiguadoraTE(pH8,0).§ KitreactivodeMiSeqdeIllumina.

CapacidaddelkitreactivodeMiSeq

KitreactivodeMiSeqdeIllumina

TiempoHoras

Muestras96/11

Cicloestándar500(MS-102-2003)

~39 96


~24 72

Ciclomicro300(MS-103-1002)

~19 20

Ciclonano500(MS-103-1003)

~28 8


~17 4

Suministrosrecomendados§ Tubosdemicrocentrífugade1,5mL.§ Tubosdemicrocentrífugadebajaretenciónde1,5mL.§ Tubosdemicrocentrífugadebajaretenciónde2,0mL(serecomiendanlostubosEppendorf

DNALoBindCatn.º022431048).§ Tubosdepareddelgadade0,5mLpara instrumentoQbit (serecomiendan los tubosde

ensayoQubitCatn.ºQ32856).§ Pipetasdevolumenajustable(capacidadde1,0a1000µL).§ Pipetasdevolumenajustablede8canales(capacidadde1,0a100µL).§ Placasde96pocilloscompatiblesconelcicladortérmico.§ Placasóptimasde96pocilloscompatiblesconelfluorímetrodeplacas.§ Placasde96pocilloscompatiblesconelinstrumentodeRCPc.§ Sellosdeplacaparausogeneral.§ Sellosdeplacacompatiblesconloscicladorestérmicos(probadosparaRCPdelargoalcance).§ SellosdeplacasópticascompatiblesconelinstrumentoRCPc(opcionales).§ Piemagnéticocompatibleconlostubosdemicrocentrífugade2mL.§ Bastidoresenfriadoresde96pocillos(2unidades).§ Tuboscónicosde50mL.§ Depósitosde50mL.


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AvisolegalLas IFUy la totalidadde los contenidosdeldispositivoHolotypeHLA96/11 sonpropiedaddeOmixonBiocomputing Limited (“Omixon”) yhan sidodiseñados soloparauso contractualporpartedelclienterespectodelproductoolosproductosquesedescribenenelpresenteyningunaotrafinalidad.Estedocumentoysuscontenidosnosepodránutilizarnidistribuirparaningunaotrafinalidadnitampocosepodráncomunicar,divulgaroreproducirdeningunaotramanerasinprevio consentimiento escrito de Omixon. Omixon no cederá ninguna licencia conforme a supatente,marcaregistrada,derechosdeautoroderechosconformealsistema“commonlaw”niderechossimilaresdetercerosconestedocumento.

OmixonHLATwin(“Software”)otorgaunalicenciaalclienteconformealostérminosycondicionesdeOmixonHLATwinEULA(www.omixon.com/hla-twin-eula/).Siustednoacepta lostérminosycondicionesdelpresente,Omixonnoleotorgarálalicenciadelsoftwareyustednopodráutilizarniinstalardichosoftware.

Elpersonalcalificadoycapacitadodemaneraadecuadadeberáseguirlasinstruccionescontenidasenestedocumentodemaneraestrictayexplícitaparagarantizarelusoseguroyadecuadodelosproductosquesedescribenenelpresente.Deberáleerycomprendertodosloscontenidosdeesteproductoantesdeutilizardicho(s)producto(s).

SINOLEEYSIGUEEXPLÍCITAMENTETODASLASINSTRUCCIONESCONTENIDASENELPRESENTE,LOSPRODUCTOSPODRÍANSUFRIRDAÑOSYLASPERSONASPODRÍANSUFRIRLESIONES,INCLUSOLOSUSUARIOSUOTRASPERSONAS,ADEMÁSDEDAÑOSALOSBIENES.

OMIXON NO ASUME RESPONSABILIDAD ALGUNA DERIVADA DEL USO INADECUADO DE LOSPRODUCTOSQUESEDESCRIBENENELPRESENTE(INCLUSOPIEZASOSOFTWARE)NIDELUSODEDICHOSPRODUCTOSFUERADELALCANCEDELASLICENCIASESCRITASOLOSPERMISOSEXPRESOSOTORGADOSPOROMIXONENRELACIÓNCON LAADQUISICIÓNDEDICHOSPRODUCTOSPORPARTEDELCLIENTE).

PARAUSODEDIAGNÓSTICOINVITRO©2017OmixonBiocomputingLtd.Todoslosderechosreservados.

UsoprevistoElproductoHolotypeHLA96/11–ConfiguraciónAyCE,yConfiguraciónByCE (denominado“HolotypeHLA”)esunacombinacióndereactivosdeensayodediagnósticoinvitroysoftwaredeanálisis dedatos (OmixonHLA Twin™) y tiene como finalidad la identificación y definicióndeantígenos leucocitarios humanos de Clase I y Clase II (HLA) para uso en tipificación de HLA,medianteelusode laplataforma Illumina®MiSeqNextGenerationSequencing.HolotypeHLAproporcionainformacióndehistocompatibilidadhumanadelaClaseIdellocusdeHLA(A,ByC)y laClase II (DPA1,DPB1,DQA1,DQB1,DRB1,DRB3,DRB4yDRB5),medianteADNgenómicohumano.


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El software Omixon HLA Twin™ incluido en el producto Holotype HLA tiene como finalidadinterpretaryemparejarlosdatosdesecuenciacióngeneradosenelsistemaIllumina®MiSeq,quederivaentipificacióndeHLAanivelalélicodeunpaso,altamenteprecisos,conmuybajatasadeambigüedadenelnivel2decampo.

ElproductoHolotypeHLAhasidodiseñadoparausodiagnósticoinvitroporpartedelpersonaldela atenciónmédica profesional, tales como técnicos ymédicos de laboratorio, entrenados entipificación de HLA en laboratorios de diagnóstico acreditados por EFI o ASHI o que puedentrabajarsegúnlasespecificacionesEFIyASHI.

Notaimportanteantesdecomenzar

AislamientodeADNgenómicorecomendadoElADNgenómicohumanosedebeprepararmediantekitsdepreparacióndeADNcomercialmentedisponibles y que generen buenas pruebas para garantizar la uniformidad de la preparación.Independientementedelenfoque,sedebedeterminarexactamentelaconcentraciónylapurezaparaobtenerunrendimientorobustodelensayo.

ElADNdebeestarlibredesustanciascontaminantesquepuedanafectarlaposterioramplificación,preparacióndelabibliotecaypasosdesecuenciación(porejemplo,alcohol,sales,detergentes,formaldehídoyheparina).Lasangrenosedeberecolectarentubosheparinizadosynosedebenutilizar lasmuestras de sangre de los pacientes en tratamiento con heparina, ni lasmuestraslipémicasohemolizadas.

ElADNgenómicopreparadosepuedeusardeinmediatosisepreparaenagualibredenucleasaosealmacenaduranteperíodosprolongadosa-20°Comenos.Recomendamosutilizaraguaparala preparación de ADNg ya que el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en la soluciónamortiguadoradeTEpuedeinhibirlasreaccionesdereaccióndecadenapolimerasa(RCP)delargoalcance. Se deben evitar congelar y descongelar el producto reiteradamente para reducir ladegradación.

Serecomiendautilizarunaconcentraciónde20-30ng/µLdeADNparaproporcionar100-150ngdeADNgenómicoporamplificacióndeRCP.RecomendamosespecialmenteutilizarunmétododecuantificaciónbasadoenlafluorescenciaparadeterminarelADNg.

Serecomiendaespecialmenteutilizaruníndicedeabsorbanciaconvaloresde260nm/280nmy260nm/230nmde1,7–2.

ParalaamplificacióndeHLA-A,HLA-B,HLA-C,HLA-DRB1/DRB3,HLA-DRB4,HLA-DRB5,HLA-DPA1,HLA-DPB1,HLA-DQA1yHLA-DQB1,senecesitan1,0-1,5µgdeADNg.


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PrincipiodelmétodoDurantemuchosaños, lacomunidaddeHLAhaestadotrabajandoenunmétodoquepermitaidentificarconclaridadelampliopolimorfismodelosgenesdeHLAysusproductosgenéticos.Elevento de RCP, en combinación con otras tecnologías (secuenciación de Sanger, SSOP, SSP,Luminex) proporcionaron una fórmula para manejar de manera significativa la detección depolimorfismosdeHLA;noobstante,seobservarondiversaslimitacionesquecontinúaninhibiendonuestra capacidadpara caracterizar los genesHLAdemanera integral. Las tecnologíasque sedesarrollarondurante losúltimosañosdemaneraacumulativamediante ladenominadaNextGeneration Sequencing (NGS), han brindado nuevas oportunidades para permitir la completacaracterizacióndelosgenesHLAdemanerahaploide.LaNGStienedoscaracterísticasdistintivas:1)secuenciaciónclonaldefragmentosdeADNy2)rendimientoextremadamenteelevado.LaNGSproporcionalacapacidadparadividirenfaseslospolimorfismosy,porlotanto,eliminartodaslasambigüedadesyproporciona la tipificacióndeHLAaniveldecampo tresocuatro sinanálisisreflexivo,quepermiteintroducirunasoluciónpotencialmentetotalalproblemadetipificacióndeHLA.ElprotocoloqueaquísedescribeaprovechaestatecnologíaycombinaunaamplificacióndeRCPdelargoalcancedelosgenesHLAconsecuenciaciónenlaplataformaIlluminaMiSeq.Másespecíficamente,losgenesHLAA,B,C,DPA1,DQA1yDQB1seamplificanentodalaextensióndelacodificación,inclusoloselementosdelasregionesnotraducidas5’y3’,mientrasqueDRB1,DRB3yDRB4seamplificandesdeelintrón1alintrón4,yDRB5yDPB1seamplificandesdeelintrón1alaregiónnotraducida3’.Posteriormente, losampliconesseprocesanmedianteunaseriedepasosque:

1. FragmentanlosampliconesauntamañoapropiadoparalasecuenciaciónenlaplataformadeIllumina,

2. extremosromosylosextremosdelosampliconesfragmentados.

3. LigarlassecuenciasdeadaptadoresqueseutilizanentodoelprocesodeMiSeqparacapturar,amplificarysecuenciarelADN.Losadaptadoresincluyenademásuníndicequeesunasecuenciabreve,únicaencadaadaptador,queidentificalosorígenesdelabiblioteca(muestra/locus).

Despuésdeagruparlasbibliotecasindexadasydespuésderealizarlaselecciónycuantificación,lamuestrasecargaenMiSeqparalasecuenciación.Elprocesotomaentre3y5días,segúnlaseleccióndelaceldadeflujoenlaplataformadeIllumina.Acontinuaciónsemuestraelresumendelospasosdelprotocolo:


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Resumendepasos


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Glosario/Definiciones§ Placadeamplicones:nombrealternativoaplacadeamplificación.§ Placadecuantificacióndeamplicones:placade96pocilloscompatibleconelfluorímetro

deplacasdondesecuantificanlosampliconesdiluidos.§ Placadeamplificación:placadeRCPde96pocillosutilizadaparaamplificarloslocusdeHLA.§ Biblioteca final: biblioteca que contiene todas las bibliotecas de muestra lista para

secuenciaciónenunúnicoprocesodeMiSeq.§ Placadereacción:placadondesellevanacabolasreaccionessecuencialesquefragmentan,

reparanlosextremosyliganlosadaptadoresindexadosenlasbibliotecasdemuestra.§ Placadereactivos:placautilizadaparafijarunaalícuotadelosreactivosvariosutilizados

paraprepararlasbibliotecas.§ Biblioteca demuestras: biblioteca preparadamediante la combinación (agrupación) de

todosloslocusdeHLAparaunamuestradada.§ Placadeampliconesagrupados:placaquecontieneunabibliotecademuestras(todoslos

locuscombinados)antesdecolocarlaenlospocillos.§ Placadecuantificacióndeestándares:placade96pocilloscompatibleconelfluorímetrode

placasdondelosestándaresdeADNsecolocanparapermitirlacuantificacióndeamplicones.


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Paso1–PreparacióndelamezclamaestradeamplificacióndeHLADuración:~2horasEste paso tiene como finalidad preparar mezclas maestras específicamente dellocus paraamplificar cada locus de HLA objetivo de manera individual. Los locus amplificados por esteprotocolo son HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1,HLA-DQA1yHLA-DQB1.

Nota:lasmezclasmaestraspreparadasenestepasocontienentodoslosreactivosparaamplificación,exceptolaPolimerasataq.

ListadereactivosElemento AlmacenamientoSuministradopor

MezcladelcebadorHLA-A -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-B -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-C -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DRB1/DRB3 -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DRB4 -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DRB5 -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DPA1 -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DPB1 -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DQA1 -20°C OmixonMezcladelcebadorHLA-DQB1(grupo3) -20°C OmixonPotenciador1 -20°C OmixonPotenciador2 -20°C OmixonSoluciónamortiguadoradeRCPdelargoalcance(10×) -20°C QiagendNTPs(10mMcadauno) -20°C QiagenH2Odegradomolecular -20°C Qiagen

Protocolo1.1 –Quitardelalmacenamientotodaslasmezclasdelcebador,elPotenciador1y2,losdNTPs

enlasoluciónamortiguadoradeRCPdelargoalcance(10×)ydescongelaratemperaturaambiente.

1.2 – Preparar el potenciador combinado: agregar 132 µL de Potenciador 2 en el tubo delPotenciador 1. Cambiar el nombre del tubo del Potenciador 1 a Potenciador Combinado.GuardarelPotenciador2restanteparautilizarenlareaccióndeRCPdelargoalcancedeDRB4.

1.3 –Prepararlamezclamaestraparacadamezcladelcebadorsegúnlastablasacontinuación:


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Mezclamaestra:HLA-A,B,C,DRB1/DRB3,DRB5,DPA1,DPB1yDQA1

Reactivo Volumen/muestra/locus Volumen/96muestras/locus

Mezcladelcebador 2µL 204µLSoluciónamortiguadoradeRCPdelargoalcance(10×)

2,5µL 255µL

MezcladedNTP(10mMcadauno) 1,25µL 127,5µLH2Odegradomolecular 13,85µL 1412,7µLVolumenTotal 19,6µL 1999,2µL

Mezclamaestra:HLA-DRB4



2,5µL 255µL

MezcladedNTP(10mMcadauno) 1,25µL 127,5µLPotenciador2 0,6µL 61,2µLH2Odegradomolecular 13,25µL 1351,5µLVolumenTotal 19,6µL 1999,2µL

Mezclamaestra:Grupo3deHLA-DQB1



2,5µL 255µL

MezcladedNTP(10mMcadauno) 1,25µL 127,5µLPotenciadorcombinado 5,6µL 571,2µLH2Odegradomolecular 7,85µL 800,7µLVolumenTotal 19,2µL 1958,4µL

1.4 –Coloquecadamezclamaestraenelvortexyagitedurante1segundo.Coloquelasmezclasmaestrassobrehielo.

1.5 –DiluyatodoslosADNgaunaconcentraciónde30ng/µL(elvolumenmínimoes55µL).

Nota:HolotypeHLAincluyesuficientesreactivospara96reaccionesmásunvolumenadicionalparacompensarlapérdidaporpipetayloserroresdeamplificación.


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Paso2:amplificaciónHLAdeclaseIyIIDuración:~8horas,10minutosElPaso2tienecomofinalidadampliarloslocusHLA.SehanoptimizadolasamplificacionesdeHLAClaseIyClaseIImediantedosjuegosseparadosdecondicionesdeRCP.Despuésdecompletarlas reacciones de RCP, la amplificación se verifica mediante electroforesis en gel de agarosa(opcional).

Consejorápido:laelectroforesisdelgeldeagarosa(paso2.5),sibienesrecomendado,noesrequeridoparacompletarelprotocolodeHolotypeHLAdeformaexitosa.Cuandolosampliconesestáncuantificados(Paso3),cualquierconcentraciónporencimade50ng/µLseconsideraunaamplificacióncorrecta.LaelectroforesisengeldeagarosaesunpasodecontroldecalidadimportanteynosedebeomitirsinexperienciasuficienteconelprotocolocompletodeHolotypeHLA.

ListadereactivosElemento Almacenamiento Suministradopor

MezclamaestradeHLA-A -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-B -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-C -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-DRB1/DRB3 -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-DRB4 -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-DRB5 -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-DPA1 -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-DPB1 -20°C Paso1MezclamaestradeHLA-DQA1 -20°C Paso1MezclamaestraHLA-DQB1(grupo3) -20°C Paso1PolimerasaTaq -20°C QiagenADNg 4°C UsuarioH2Odegradomolecular 20°C Usuario

Protocolo2.1 –Retirarlapolimerasataqdelalmacenamiento,agitarlayagregarlaacadamezclamaestra

segúnlastablasacontinuación;paraello,enjuaguebienlaspuntasdelaspipetasytomeconunapipeta:


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Mezclamaestracargadadepolimerasataq:HLA-A,B,C,DRB1/3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1yDQA1

Reactivo Volumen/muestra/locus Volumen/96muestras/locusMezclamaestradelPaso1 19,6µL 1999,2µLPolimerasaTaq 0,4µL 40,8µLTotal 20µL 2040µL

Mezclamaestracargadadepolimerasataq:Grupo3deHLA-DQB1

Reactivo Volumen/muestra/locus Volumen/96muestras/locusMezclamaestradelPaso1 19,2µL 1958,4µLPolimerasaTaq 0,8µL 81,6µLTotal 20µL 2040µL

2.2 –Coloquebrevementeenunvortexyagitetodalapolimerasataqcargadaenlasmezclasmaestras.Determinelaalícuotade20µLdecadamezclamaestracargadaconpolimerasataqenpocillosseparadosde96placasdeRCP.

Nota:LaamplificacióndeClaseIyClaseIIseoptimizanmediantedoscondicionesdeRCPdiferentes;porlotanto,lasmezclasmaestrasdelaClaseIylaClaseIInonecesitanestarenlamismaplaca.

2.3 –Agregue5µLdecadaADNgdiluidoenelpocilloapropiadodelasplacaspreparadasenelpasoanterior.Mezcledentrodelapipeta.Luegoselleconunsellotérmicoeinspeccionevisualmentecadapocillo.Agitetodaslasplacasdeamplificaciónenunacentrífuga.

2.4 –ColoquelasplacasdeamplificaciónencicladorestérmicosyejecutelosprogramasdelaamplificacióndeClaseIyClaseIIsegúnlastablasacontinuación:

AmplificacióndeclaseI(HLA-A,ByC)

Cantidaddeciclos Temperatura Tiempo1 95°C 3minutos 95°C 15segundos35 65°C 30segundos 68°C 5minutos1 68°C 10minutos1 4°C ∞


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AmplificacióndeclaseII(HLA-DRB1/DRB3,DRB4,DRB5,DPA1,DPB1,DQA1yDQB1)

Cantidaddeciclos Temperatura Tiempo1 95°C 3minutos 93°C 15segundos35 60°C 30segundos 68°C 9minutos1 68°C 10minutos1 4°C ∞

Nota:Paraverificareléxitodelaamplificación,procese2µLdecadaamplicónengeldeagarosa2%estándara250durante30minutos.(Opcional)

Tamañosesperadosdelosamplicones

LocusdeHLA Tamañoesperadodelosamplicones(kb)HLA-A,ByC ~3

HLA-DRB1/DRB3 ~4,3HLA-DRB4 ~4,2HLA-DRB5 ~4,2HLA-DPA1 ~5,7HLA-DPB1 ~6,7HLA-DQA1 ~6

HLA-DQB(grupo3) ~6,6

Puntodeparadaseguro.Losampliconessepuedenalmacenara4°Cdurantetodalanocheoa-20°Cdurantemástiempo.


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Paso3:cuantificaciónynormalizacióndeamplicones(medianteelusodefluorímetrodeplacas)Duración:~2horasSe recomienda llevar a cabo la cuantificación y normalización de amplicones para garantizaraportesprecisosalpasodepreparacióndelabiblioteca(opcional).LaconcentracióndeamplicónsemidemedianteelsistemadeADNbcQuantiFluorquecontieneunatintafluorescentedeuniónalADNestándarparallevaracabounacuantificaciónsensibledepequeñascantidadesdeADNbicatenario (ADNbc). Para obtener instrucciones acerca de cómo realizar la cuantificación deamplicónconunequipoRCPq,consulteelApéndice2.

Consejo:siserecomiendalacuantificacióndeamplicones,noesnecesariocompletarcorrectamenteelprotocolodeHolotypeHLA.Paranormalizarlosamplicones,noesnecesario efectuar unamedición precisa de la concentración de amplicones. Encambio,sepuedeusaruncálculoestimadodelasconcentracionesdeampliconesenfuncióndelaexperienciaolaelectroforesisdegeldeagarosa.Nosedebeomitirla cuantificación de amplicones sin tener experiencia uniforme en el protocolocompletodeHolotypeHLA.


PlacadeamplificacióndeclaseI 4°C Paso2PlacadeamplificacióndeclaseII 4°C Paso2ADNLambdaestándar(100ng/µL) 4°C PromegaTintadeADNbcQuantiFluor(200×) 4°C Promega20×soluciónamortiguadoraTE(pH7,5) 4°C PromegaH2Odegradomolecular 20°Ca25°C UsuarioExoSAP-iTExpress -20°C Affymetrix


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Protocolo3.1 –PrepararlosestándaresdelADNmediantediluciónseriadadelADNLambdaestándar(100

ng/µL)queseproporcionaenelkitdeQuantiFluorsegúnlatabladediluciónacontinuación.

Etiquetaeneltubo

ADNdeentrada VolumendeADN(µL)

Volumen1xTE(µL)

Concentraciónfinal(ng/µL)

Estándar1 ADNLambda 7,5µL 492,5µL 1,5ng/µLEstándar2 Estándar1 250µL 250µL 0,75ng/µLEstándar3 Estándar2 250µL 250µL 0,38ng/µLEstándar4 Estándar3 250µL 250µL 0,19ng/µLEstándar5 Estándar4 250µL 250µL 0,09ng/µLEstándar6 Estándar5 250µL 250µL 0,05ng/µLEnblanco Enblanco 0µL 250µL 0ng/µL

3.2 – Prepare las placas de cuantificaciónde amplicones (vea las figuras complementarias).Dividaenalícuotas99µLdesoluciónamortiguadoraTE1xenlospocillosdeunaplacaópticade96pocillosparaelnúmerototaldeampliconesquedebecuantificarse.

3.3 –Agregue1µLdeampliconesdesdelospocilloscorrespondientedelasplacasdeampliconesalospocillosindividualesdelasplacasdecuantificacióndeamplicones.Mezcledentrodelapipeta.

3.4 –PrepareunasolucióndetrabajodetinteQuantiFluor1×conlasiguientefórmula:0,5µLdetinteQuantiFluor(200X)+99,5µLdesoluciónamortiguadoraTE1×.Preparesuficientesolución de trabajo de tinte QuantiFluor 1× de tal forma que cada muestra (total demuestrasenlasplacasdeamplicones)yelestándar(14entotal)recibanunaalícuotade100µL.

3.5 – Prepare una placa de cuantificación de estándares y placas de cuantificación deamplicones.Dividaenalícuotas100µLde lasolucióndetrabajodetinteQuantiFluor1×a los pocillos de la placa óptica de 96 pocillos que será la placa de cuantificación deestándaresyalasplacasdecuantificacióndeampliconesdelPaso3.2.

3.6 –Conlosestándarespreparadosarriba,agregue100µLdecadaestándar,porduplicado,enlospocillosindividualesdelaplacadecuantificacióndeestándares(14pocillosentotal).Mezcledentrodelapipeta.

3.7 –Agitebienenvórticeparamezclarycentrifugue.

3.8 –Proceselaplacadecuantificacióndeestándaresenelfluorímetrodeplacaseguidodelasplacasdecuantificacióndeamplicones.

3.9 –CalculelaconcentracióndeADNenlasplacasdecuantificacióndeampliconescondatosRFUgeneradosporelfluorímetrodeplaca.ConsultelapestañaDilution(Dilución)enellibrodeejerciciossuministradoparaobtenerasistenciaconloscálculos.


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3.10 – Diluya ADN en las placas de amplicones con H2O de grado molecular para que laconcentraciónfinaldeADNseadeaproximadamente67ng/µL.

§ SilaconcentracióndeADNesde150ng/µLomayor:agregue25µLdeH2O§ SilaconcentracióndeADNesde100a150ng/µL:agregue10µLdeH2O§ SilaconcentracióndeADNesdemenosde100ng/µL:noagregueH2O

Agrupacióndeamplicones3.11 –Agrupetodosloslocusdecadamuestraenunasolaplacadeagrupacióndeamplicones.

Combinelosvolúmenesindicadosparacadalocuscomoseindicaenlasiguientetablaparaobtenerunvolumenfinalde35µL:

LocusdeHLA VolumenagrupadoA 3,5µLB 3,5µLC 3,5µL

DRB1/DRB3 3,5µLDRB4 3,5µLDRB5 3,5µLDPA1 3,5µLDPB1 3,5µLDQA1 3,5µL

DQB1grupo3 3,5µL

3.12 –Agregue4µLdeExoSAP-iTExpressencadabibliotecademuestras.Enjuaguelaspuntasdelaspipetaspormediodepipeteado.Sellelaplacaconunsellotérmicoycentrifugue.

3.13 –Coloquelaplacadeampliconesagrupadosenuncicladortérmicoyejecuteelsiguienteprograma:

ExoSAP-ITPurificacióndeRCPExpresa

Cantidaddeciclos Temperatura Tiempo1 37°C 4minutos1 80°C 1minuto1 4°C ∞

Puntodeparadaseguro.Losampliconessepuedenalmacenara4°Cdurantetodalanocheoa-20°Cdurantemástiempo.


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Paso4:PreparacióndelabibliotecaDuración:~3horasDuranteestepaso,losampliconesagrupadossepreparanparasecuenciarlosenelIlluminaMiSeq.Los amplicones se fragmentan enzimáticamente, los extremos se reparan y se adenilan, y losadaptadoresindexadosseliganalosextremos.LasbibliotecasluegoseagrupanseguidasdeunsolopasodelimpiezayconcentraciónqueserealizaconesferasAMPureXP.

Nota:Omixonrecomiendavolúmenesmayoresquelonecesariopara96muestras,porquemuchasdelasenzimasysolucionesamortiguadorassonviscosas,loquegeneraunexcesodepipeteado.


Placadeampliconesagrupados 4°C Paso3Enzimadefragmentación(A) -20°C OmixonSoluciónamortiguadoradefragmentación(B) -20°C OmixonEnzimareparadoradeextremos(C) -20°C OmixonSoluciónamortiguadorareparadoradeextremos(D) -20°C OmixonEnzimadeligación(E) -20°C OmixonSoluciónamortiguadoradeligación(F) -20°C OmixonPlacadeadaptadores -20°C OmixonEsferasAMPureXP 4°C BeckmanCoulter80%Etanol(preparadofresco) 20°Ca25°C UsuarioH2Odegradomolecular 20°Ca25°C Usuario

Protocolo4.1 –Enciendaelcicladortérmico.Verifiquequelatapacalefaccionadatometemperatura.

Nota:Asegúresedeagitarenvórticelaenzimadefragmentación(A)porcompletoantesdeusarla.

4.2 –Preparelamezclamaestradefragmentacióndeacuerdoconlasiguientetabla:


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Mezclamaestradefragmentación

Reactivo Volumenporbiblioteca(µL)

Volúmenesrecomendadospara96bibliotecas(µL)

Códigodecolor

Enzimadefragmentación(A) 2µL 220,8µL AmarilloSoluciónamortiguadoradefragmentación(B)

2µL 220,8µL Rojo

VolumenTotal 4µL 441,6µL

4.3 –Prepareunaplacadereactivos:coloqueunanuevaplacade96pocillosdeRCPenunestanteenfriadordeRCPydividaenalícuotasunacantidadigualdelamezclamaestradefragmentaciónencadapocillodeunasolacolumna.

Nota:LareaccióndefragmentaciónsehadiseñadoparabrindarADNdeuntamañoidealparasecuenciarloenelIlluminaMiSeq.Esimportantemantenerlosreactivosfríoshastaque la reacción comienceen el ciclador térmicopara evitar la fragmentaciónexcesiva.Serecomiendausarpipetasdevariaspuntasparaminimizarlasoportunidadesdefragmentaciónexcesiva.

4.4 –Centrifuguelaplacadeampliconescombinadospor10segundos,ycolóquelasobrehieloounbloquefrío.

4.5 –Prepareunaplacade reacción: coloqueunaplaca frescade96pocillosdeRCPenunbloquefríodeRCP.

4.6 –Agregue4µLdemezclamaestradefragmentacióndelaplacadereactivosenlospocillosde la placa de reacción en forma correspondiente con las muestras de la placa deampliconescombinados.Serecomiendausarunapipetadevariaspuntas.

4.7 – Transfiera 16 µL de amplicón desde la placa de amplicones agrupados al pocillocorrespondientedelaplacadereacciónconunapipetadevariaspuntas.Mezcledentrodelapipeta.

4.8 –Cubralaplacadereacciónconunsellotérmicoycentrifuguedurante10segundos.

4.9 –Incubelaplacadereacciónenuncicladortérmicoconelsiguienteprograma:

Programadefragmentación

Cantidaddeciclos Temperatura Tiempo1 37°C 10minutos1 70°C 15minutos1 4°C ∞

Puntodeparadaseguro.Lasbibliotecaspuedenalmacenarsea4°Cdurantelanocheoa-20°Cpormástiempo.


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4.10 –Preparelamezclamaestradereparacióndeextremosdeacuerdoconlasiguientetabla:

Mezclamaestradereparacióndeextremos

Reactivo Volumenporbiblioteca(µL)


Códigodecolor

H2Odegradomolecular 1,25µL 139,2µL Enzimareparadoradeextremos(C)

1,25µL 139,2µL Verde

Soluciónamortiguadorareparadoradeextremos(D)

2,5µL 278,4µL Anaranjado

VolumenTotal 5µL µL

4.11 –Dividaenalícuotasunacantidadigualdemezclamaestradereparacióndeextremosenunasolacolumnasinusardelaplacadereactivos.

4.12 – Centrifugue la placa de reacción (que contiene las muestras fragmentadas) durante10segundos.Agregue5µLdemezclamaestradereparacióndeextremosdesdelaplacadereactivosencadapocillodelaplacadereacción.Serecomiendausarunapipetadevariaspuntas.Mezcledentrodelapipeta.


4.14 –Incubelaplacadereacciónenuncicladortérmicoconelsiguienteprograma:

Programadereparacióndeextremos



4.15 –Retirelaplacadeadaptadoresindexadosdelalmacenamientoydescongeleatemperaturaambientedespuésdequeelprogramadereparacióndeextremoscomienceenelcicladortérmico.Cuando laplacadeadaptadores lleguea la temperaturaambiente, centrifuguedurante3minutosa3000rpm.

4.16 –Quiteconcuidadoelsellodelaplacadeadaptadores.Nosacudalaplacadeadaptadoresunavezqueseretiróelselloparaevitarlacontaminacióncruzada.

4.17 –Transfieratodoelvolumendecadapocillodesdelaplacadereacción(25µL)alpocillocorrespondientedelaplacadeadaptadores.


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Nota:SiNOsevaausartodalaplacadeadaptadores,puedeusarsesolamenteelnúmerodeadaptadoresnecesarios.Corteelsellodelaplacaentrelospocillosquesevanausarylospocillosqueseconservarán.Quiteconcuidadoelsellodelaplacadeadaptadores,dejandoelsellocolocadosobrelasplacasqueseconservarán.

a. Transfiera25µLdesdecadamuestradereparacióndeextremosdelaplacadereacciónaunpocillodelaplacadeadaptadores,mezclandobienconunapipeta.

b. Transfieralamuestracompletadesdelaplacadeadaptadoresalpocillooriginaldelaplacadereacción.

c. Vuelvaasellarlaplacadeadaptadoresyvuelvaaponerlaen-20°C.Uselaplacade reacciónen lugarde laplacadeadaptadorespara lospasos restantesdelmanual.

4.18 –Preparelamezclamaestradeligación.Preparesuficientemezclamaestradeligaciónparacadamuestra.

Mezclamaestradeligación

Reactivo Volumen(µL)


Códigodecolor

Enzimadeligación(E) 2,5µL 252,5µL AzulSoluciónamortiguadoradeligación(F)

30µL 3030µL Negro

VolumenTotal 32,5 3282,5µL

4.19 –Dividaenalícuotaslamezclamaestradeligaciónen3columnassinusardelaplacadereactivos.Serecomiendausarunapipetadevariaspuntas.

4.20 –Agregue32,5µLdemezclamaestradeligaciónencadapocillodelaplacadereacción.Serecomiendausarunapipetadevariaspuntas.Mezcledentrodelapipeta.


4.22 –Incubelaplacadereacciónenelcicladortérmicoconelsiguienteprograma:

Programadeligación




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Agrupamientoypurificacióndebiblioteca4.23 –PermitaquelasesferasAMPureXPlleguenatemperaturaambiente.Asegúresedeque

seanhomogéneas(singrumosnigránulos).Prepare5mLde80%etanol(4mLEtOH+1mLH2O)reciénhecho.

4.24 –Para crear laBiblioteca, combineunaalícuotade cadaamplicónagrupado,ahoraunaBibliotecademuestrasespecífica,enunúnicotubodemicrocentrífugadebajaretenciónde2,0mL.

I. Para 16muestras omás: calcule la cantidad de cada Biblioteca demuestras paraagruparlascomounaúnicaBibliotecaconunvolumentotalde900µL.Divida900µLentreelnúmerodebibliotecasdemuestras.EsteelvolumendealícuotaquedebetomarsedecadabibliotecademuestrasypipetearseenlaBiblioteca.

II. Paramenosde16muestras:transfiera60µLdecadabibliotecademuestrasaunaBiblioteca.

4.25 –Agregue900µLdeesferasAMPureXPaltubodelaBiblioteca.Agitebienconelvórticeycentrifuguebrevemente.Nopermitaquelasesferasseseparen.Incubelabibliotecapor10minutosatemperaturaambiente.

Nota:Sihaymenosde900µLdebibliotecaen laagrupaciónfinal,agregueunacantidad equivalente de esferas AMPure XP. Debe haber una relación 1:1 deagrupaciónfinalydeesferasAMPureXP.

4.26 –Coloqueeltubodebibliotecaenunsoportemagnéticoeincubedurante10minutos.

4.27 –Coneltuboenelsoportemagnético,retireydescarteconcuidadoelsobrenadantedeltubodelabiblioteca,sintocarlasesferas.

4.28 –Coneltuboenelsoportemagnético,agregueaproximadamentede1,5a2mLdeetanol80%preparado frescoal tubode labiblioteca.El volumenagregadodeetanoldebe sersuficienteparaquecubralasesferas.

Nota:Apliqueeletanolalcostadodeltubosinesferas.

4.29 –Incubeeltubodelabibliotecaatemperaturaambientedurante30segundos;después,retireydescarteconcuidadoelsobrenadante.

4.30 –Repitalospasos4.28y4.29.

4.31 – Centrifugue rápidamente el tubo de la biblioteca y vuelva a colocarlo en el soportemagnéticoconlatapaabierta.Retireeletanoresidualconunapipeta.Notoquelasesferas.


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Nota:Asegúresedequeelgránulodelaesferanocontienealcoholresidual.Estopuederequerirquesegireeltuboenelsoportemagnéticoparaquitareletanolsinperturbarelgránulodelaesfera.

4.32 – Permita que las esferas se sequen con el aire durante 5 a 8 minutos en el soportemagnéticohastaelquegránulodelaesferaquedeseco.

4.33 –Quiteeltubodelabibliotecadelsoportemagnéticoyeluyalabibliotecacon31µLdeagua de gradomolecular. No deje que la punta de la pipeta toque las esferas, porquequedaránpegadasaella.

4.34 – Agite en vórtice la biblioteca para volver a poner las esferas completamente ensuspensión. Centrifuguebrevemente si quedan algunas gotitas en las paredes laterales.Asegúresedequelasesferasquedenensuspensión.

4.35 –Incubelabibliotecaatemperaturaambientedurante2minutos.

4.36 –Coloqueeltubodelabibliotecasobreelsoportemagnéticodurante2minutos.

4.37 – Recolecte la biblioteca: manteniendo el tubo final de la Biblioteca en el soportemagnético,recolecte31µLdelsobrenadanteenunnuevotubodemicrocentrífugadebajaretenciónde1,5mL.

Puntodeparada seguro. Lasbibliotecaspuedenalmacenarsea -20 °Cporperíodosextensosdetiempo.


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Paso5:SeleccióndeltamañodelabibliotecaDuración:~1horaElpaso5hacequelabibliotecaavancedesdeelpaso4yrealizalaseleccióndeltamañoconelPippin Prep. El Pippin Prep puede seleccionar automáticamente un rango de tamaños defragmentosdeADNyeluirlosenunacámaraderecolección.Nota:puedeusarseBluePippinenlugardePippinPrep.ConsulteelApéndice1paraverlasInstruccionesdeusodelPippinPrep.


Casettecongeldeagarosa1,5%,sintinte 20°Ca25°C SageScienceSolucióndecargadePippin/mezclamarcadora(etiquetadaK)

4°C SageScience

Bibliotecaagrupada 4°C Paso4

Nota:SeusaelMarcadorKconelPippinPrep.ElBluePippinusaelMarcadorR2.

Protocolo5.1 –HagaquelasolucióndecargadeMarcadorklleguealatemperaturaambiente.

5.2 –Combine31µLdelgrupocon10µLdelasolucióndecargadeMarcadork.

5.3 –Mezcleagitandoelvortexycentrifugue.

5.4 –ConfigureelPippinPrepparaquerecojafragmentosdeADNdeentre650y1300bps.Carguelamuestrade40µLenelpuertodemuestrasyprocese.Eltiempodeprocesamientodurade45a50minutos.

5.5 –Recolectetodoelcontenido(aproximadamente40µL)delpuertodeelucióndelPippinPrepytransfiéraloaunnuevotubodemicrocentrífugadebajaretenciónde1,5mL.Estaeslabibliotecadetamañoseleccionado.

Puntodeparada seguro. Lasbibliotecaspuedenalmacenarsea -20 °Cporperíodosextensosdetiempo.


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Paso6:CuantificacióndebibliotecaconuninstrumentodeRCPcDuración:~1horay15minutosEsnecesariocuantificarlabibliotecaseleccionadaportamañoafindeusarenformaóptimaelresultadodelsecuenciador IlluminaMiSeq.Laconcentraciónde labibliotecaseleccionadaportamañopuedemedirseconprecisiónpormediodeRCPc.Demaneraopcional,ustedpuedeusarelkitQubitdsDNABRyunamáquinaQubitparamedirlaconcentracióndelabiblioteca.Paraesteprotocolo,consulteelApéndice3.


10xPremezcladelcebadorIllumina -20°C KAPABiosystems2xMezclamaestraKAPASYBRFASTdeRCPc -20°C KAPABiosystemsEst.1(20,00pM) -20°C KAPABiosystemsEst.2(2,00pM) -20°C KAPABiosystemsEst.3(0,20pM) -20°C KAPABiosystemsEst.4(0,02pM) -20°C KAPABiosystemsEstándaresdeADNdeIllumina -20°C KAPABiosystemsH2Odegradomolecular 20°Ca25°C Usuario1×soluciónamortiguadoraTE(pH8,0). 20°Ca25°C UsuarioBibliotecadetamañoseleccionado 4°C Paso5

Protocolo1 –PreparelamezcladelcebadordeRCPcconlapremezcladelcebador10×Illuminaylas2×

mezclasmaestrasKAPASYBRFASTdeRCPc:

Nota: Los reactivos del kit KAPA SYBR FASTdeRCPc (mezclamaestra deRCPc,premezcladelcebadorysolucionesROX)secombinanduranteelprimerusodelkit.Estasolucióncombinadaesestableporalmenos30ciclosdecongelamiento/descongelamiento. Siga la documentación de KAPA para determinar si serecomiendaROXparasuinstrumentodeRCPc.

MezcladelcebadorRCPc

Reactivo Volumen(mL)10xPremezcladelcebadorIllumina 1mL2xMezclamaestraKAPASYBRFASTdeRCPc 5mLVolumenTotal 6mL


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2 –PreparelamezclamaestradeRCPc.

MezclamaestradeRCPc

Reactivo Volumen(µL)MezcladelcebadorRCPc 228µLH2Odegradomolecular 76µLVolumenTotal 304µL

3 –Prepareunadiluciónseriadadelabibliotecadetamañoseleccionado.

a. Prepareunadilución1:1000agregando1µLdebibliotecadetamañoseleccionadoa999µLdesoluciónamortiguadoraTE1×(pH8,0),yenjuaguemuybienlapuntadelapipeta.Agiteconelvortexycentrifugue.

b. Prepare una dilución 1:2000 agregando 100 µL de la dilución 1:1000 a 100 µL desoluciónamortiguadoraTE1×(pH8,0).Agiteconelvortexycentrifugue.

4 –PrepareunaplacadecuantificacióndeRCPcenunaplacaRCPfrescacompatibleconsusistemadeRCPc.

5 –Dividaenalícuotas16µLdelamezclamaestradeRCPcportriplicadoparalosestándares1a4,ladilución1:1000yladilución1:2000(vealasfigurascomplementarias).

6 –Dividaenalícuotas4µLdelosestándares1a4,ladilución1:1000yladilución1:2000entrelospocilloscorrespondientes.

7 –SellelaplacadecuantificacióndeRCPcycentrifúgueladurante10segundos.

Nota:EvitegenerarburbujasenlospocillosdelaplacadecuantificacióndeRCPc.Centrifuguesegúnseanecesarioparaeliminarlasburbujas.

8 Configurelostriplicados1:1000y1:2000comomuestrasobjetivo,ydefinalosestándares(puntos:4,concentracióndeinicio:20pM,dilución:1:10).EjecuteelsiguienteprogramaenlamáquinadeRCPcparadeterminarlaconcentracióndeADNdelaBibliotecadetamañoseleccionado:

Cantidaddeciclos Temperatura Tiempo1 95°C 5minutos25

(sincurvadefusión)95°C 30segundos60°C 90segundos(adquisicióndedatos)

9 – Para convertir el resultado de RCPc de una concentración pM a una nM, ingrese losresultados“mediadecantidad”delosreplicadosdelasdosbibliotecasenlapestañadellibrodeejerciciosdeOmixonllamada“Cuantificacióndebiblioteca”.

10 –Conlosvolúmenesquefiguranenellibrodeejercicios,diluya10µLdelabibliotecadetamañoseleccionadoaunaconcentraciónde2nMconH2Oestérilenunnuevotubodemicrocentrífugadebajaretenciónde1,5mL.Almacenelabibliotecadetamañoseleccionadorestantea-20°C.


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Puntodeparada seguro. Lasbibliotecaspuedenalmacenarsea -20 °Cporperíodosextensosdetiempo.Enelcasodeunalmacenamientoa largoplazo,serecomiendaenfáticamenterecuantificarlabibliotecaantesdeprocesarlaenelMiSeq.


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Paso7:SecuenciamientoenelIlluminaMiSeqDuración:~24a40horasEl IlluminaMiSeqesun instrumentoNGSautomatizadoquepuedesecuenciar labibliotecadetamañoseleccionadoquesepreparóenlospasosanteriores.Eldesmultiplexadodelasmuestrasindizadasserealizaenformaautomáticaluegodehaberfinalizadoelprocesodesecuenciamiento.

Consejo rápido:puedeusarunpicodePhiXdel1%comouncontrol adicionalparamonitorear lareaccióndelsecuenciamiento.Consulte ladocumentaciónde IlluminasobreelcontroldePhiXparaobtenermásinformación.


Cartuchodereactivo -20°C IlluminaHT1 -20°C IlluminaPR2 4°C IlluminaCélulaflujoMiSeq 4°C IlluminaBibliotecaen2nM 4°C Paso6NaOH1No2N 20°Ca25°C UsuarioH2Odegradomolecular 20°Ca25°C Usuario

CapacidaddelkitreactivodeMiSeq

KitreactivodeMiSeqdeIllumina

TiempoHoras

Muestras96/7


~39 96


~24 96

Ciclomicro300(MS-103-1002)

~19 28


~28 12


~17 6

Protocolo7.1 –PrepareelMiSeqdeacuerdoconlosprotocolosestándaresdeIllumina.


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7.2 –PrepareunaBibliotecadesnaturalizadade1nM:Combine10µLde0,2NNaOHreciénpreparadoy10µLdelabibliotecaseleccionadadetamañodiluidode2nMenunnuevotubodemicrocentrífugadebaja retenciónde1,5mL.Agiteconel vortexy centrifugue.Incubeestabibliotecadesnaturalizadade1nMatemperaturaambientedurante5minutos.

7.3 –Prepareunabibliotecadesnaturalizadade20pM:Agregue980µLdeHT1enfriadoalos20µLdelabibliotecadesnaturalizadade1nM.Agiteconelvortexycentrifugue.

7.4 –Prepareunabibliotecadesnaturalizadade9pM:Agregue550µLdeHT1enfriadoy450µLde la biblioteca desnaturalizada de 20 pMa un nuevo tubodemicrocentrífuga de bajaretenciónde1,5mL.Agiteconelvortexycentrifugue.

7.5 –Transfiera600µLdelabibliotecadesnaturalizadade9pMeneldepósitodemuestrasdecargadecartuchodereactivoMiSeq.

Consejorápido:esrecomendableusarellibrodeejerciciossuministradoparacrearlaHojademuestraquerequiereelMiSeq.


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Paso8–AnálisisdedatosdelsecuenciamientoHLAElIlluminaMiSeqprocesarálabibliotecaagrupadade9pMygenerarádatosdesecuenciamientocomo archivos fastq. Consulte el manual HLA Twin para obtener asistencia con la instalacióncorrectadelHLATwinyconseguirinformaciónsobrecómointerpretarelanálisisdegenotipificacióndesusdatosdesecuenciamiento.ParaimplementarelProtocoloautomatizadoyporproblemasrelacionadosconlainstalaciónoelanálisisdelosdatos,comuní[email protected].

Protocoloautomatizado

EstablecimientoyconfiguracióndeTI1. InstaleHLATwinServerenelservidor.

§ InstaleHLATwinClientenunacomputadoracliente;puedenconectarsevariosHLATwinClientsalservidor.

§ Comuníquese con Soporte de Omixon ([email protected]) para instalaciones deinstalaciónpersonalizadasparalaAutomatización.

Protocoloporanálisis1. AbraHLATwinClienteiniciesesión.

2. Losdatosyasehanprocesadooseestánprocesando.ReviselosresultadosconelsistemaTrafficLightdelHLATwin.

3. Exporte los resultados de la genotipificación y/o las secuencias de consenso según searequerido.

Protocolomanualdelservidor

EstablecimientoyconfiguracióndeTI§ InstaleHLATwinServerenelservidor.§ InstaleHLATwinClientenunacomputadoracliente.

Protocoloporanálisis§ AbraHLATwinClienteiniciesesión.§ SeleccionelosdatosdeMiSeqenformatofastqofastq.gzeinicielaejecucióndelatipificación

deHolotypeHLA.§ Unavezque la tipificacióndeHolotypeHLAestá terminada, revise los resultadosconel

sistemaTrafficLightdeHLATwin.§ Exporte los resultados de la genotipificación y/o las secuencias de consenso según sea

requerido.


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Protocolomanualdeescritorio

EstablecimientoyconfiguracióndeTI§ InstaleHLATwinDesktop.

Protocoloporanálisis6 AbraHLATwineiniciesesión.

7 SeleccionelosdatosdeMiSeqenformatofastqofastq.gzeinicielaejecucióndelatipificacióndeHolotypeHLA.

8 Unavezque la tipificacióndeHolotypeHLAestá terminada, revise los resultadosconelsistemaTrafficLightdeHLATwin.

9 Exporte los resultados de la genotipificación y/o las secuencias de consenso según searequerido.


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Figurascomplementarias

Ejemplo de placa para Placa de amplicones, Placa de amplificación,Placadedilución,Placadecuantificacióndeamplicones(paraunlocusindividual)yPlacadereacción

EjemplodeplacaparaPlacadecuantificacióndeestándares


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EjemplodeplacadeRCPcparaCuantificacióndebibliotecaKAPA


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Apéndice1:PippinPrep

ProgramacióndelPippinPrep1. HagaclicenlapestañaProtocolEditor(Editordeprotocolo)yhagaclicenelbotón“New”

(Nuevo).

2. HagacliceneliconodelacarpetaalladodelcampoCassetteyseleccione“1.5%DFMarkerK”(MarcadorK1,5%DF)paraPippinPrepo“1.5%DFMarkerR2”(MarcadorR21,5%DF)paraBluePippin.

3. Enlavíaqueustedestáprogramando:

a. Resalteelcampo“Range”(Rango).b. Configurela“RefLane”(Víadereferencia)paraquecoincidaconelnúmerodevíaen

elcualestátrabajando.c. Configureelcampo“Start*”(Inicio*)en650.d. Configureelcampo“End*”(Fin*)en1300.

4. EnelcampoReferenceLane(Víadereferencia),seleccionelavíaenlacualestátrabajando.

5. Hagaclicenelbotón“SaveAs”(Guardarcomo)ypóngaleunnombreasuprograma.

EjecucióndelPippinPrep1. EnciendaelPippinPreppresionandoelbotóndeencendidoqueestáenlapartetraseradel

aparato.

2. InspeccionevisualmenteelPippinPrep.Asegúresedequelas5lucesLEDestánencendidasyqueelinteriordelaparatoestálimpioyseco.

3. HagaclicenellogotipodeSageSciencequeestáenlaparteinferiorderechadelapantalla.Esto le permitirá ingresar una contraseña. La contraseña predeterminada de fábrica es“pips”.

4. HagaclicenlapestañaFactorySetup(Configuracióndefábrica)yasegúresedequeelvalordebaseaumbralestápuestoen0,02.

5. ColoqueeldispositivodecalibracióndentrodelPippinPrepyasegúresedequelabandaoscuraestábocaabajoyencimadelaslucesLED.

6. EnlapestañaMain(Principal),hagaclicenelbotón“Calibration”(Calibración).

7. En la ventana “Calibration” (Calibración), asegúrese de que el campo “Target I pHmA”(Objetivo IpHmA)estápuestoen0,80 (0,60paraBluePippin)y luegoaprieteelbotón“Calibration”(Calibración).

8. VayaalapestañaProtocols(Protocolos).Hagaclicenelbotón“Load”(Carga)yseleccioneelprogramaparaHolotypeHLAylavíaespecíficaqueusaráusted.Asegúresedelosiguiente:

a. Lavíacorrectaestáencendida.b. Elindicadordeseleccióndeespectroanchoestáactivo.


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c. Lavíadereferenciaeslamismalíneaqueseprocesará.

9. VayaalapestañaMain(Principal).Asegúresedelosiguiente:

a. Elprogramaquecargóeselqueestáseleccionado.b. La vía de referencia apropiada está seleccionada y es también la vía en la que se

procesarálamuestra.

10. Inspeccioneelcasete.Antesdesacarlacintaquesellalospocillos,reviseparaversihayburbujasdetrásdelpuertodeelución.Sihayalgunaburbujadetrásdelpuertodeelución,golpeeyhagagirarelcaseteconsuavidadentresusmanosparasacarlas.

11. Coloqueelcasete,conlacintatodavíapuestasobrelospocillos,dentrodelPippinPrep.

12. Despeguelacintaconcuidadoyasegúresedesacarladesdelapartelimpiadelcasete(vía5)hacialaparteusadadelcasete(vía1).Tengacuidadodenosalpicarlíquidocuandoseretiralacinta,paraprevenirlacontaminación.

13. Quitetodoelvolumende lasoluciónamortiguadoradelpuertodeeluciónde lavíaqueusaráyagregue40µLdesoluciónamortiguadoradeelectroforesisfrescaenesepuertodeelución.

14. Coloqueunatiradelgadadecintasobrelospuertosdeelución.

15. Cualquier depósito que esté menos de 3/4 lleno debe completarse con soluciónamortiguadoradeelectroforesis.¡Nollenelospocillosenexceso!Elbordedelasoluciónamortiguadoradebe llegar justoalplástico,ynomásalto,para impedirquesearrastrecuandosedeslizalatapa.Apliquesoluciónamortiguadoradesdelospocilloslimpios(Vía5)alospocillosusados(Vía1).

16. Asegúresedequecadaunodelospocillosdecarga(pocillosconagarosa)estánllenosconla soluciónamortiguadoradeelectroforesis. La soluciónamortiguadoradebeestar justoencimadelaagarosa,yversecompletamenteplana.

17. CierredespacioelPippinPrepytengacuidadodequenadadelasoluciónamortiguadoratoquelatapamientrascierraeldispositivo.

18. Lleveacabolapruebadecontinuidad.Cuandolossensoressesecanligeramente,escomúnquelapruebadecontinuidadfalleunavez.Silapruebadecontinuidadfalla,hagalapruebaunavezmás.Unavezquesecompletelapruebadecontinuidad,abralentamenteelPippin.AsegúresedequelatapadelPippinPrepnoarrastrelíquidoporelcasete.

19. AgiteconelvortexlasolucióndecargadeMarcadorKbrevementeycentrifugue.Agregue10µLdesolucióndecargadeMarcadorKasusaproximadamente30µLdebiblioteca.

20. Agiteconelvortexsubibliotecabrevementeycentrifugue.

21. Extraiga40µLdesoluciónamortiguadoradelpocillodemuestraqueestaráusando.

22. Agregueaproximadamente40µLde subibliotecacargadaconMarcadorKalpocillodemuestraqueestaráusando.

23. Marquelavíaqueestáusandoconlasinicialesdeltécnicoylafecha.


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24. Cierre el Pippin Prep y haga clic en el botón “Start” (Inicio). Asegúrese de que la víaapropiadaestáencendida.Lamuestradebeprocesarseporunos45minutos.

25. Unavezquesecompletóelprocesamiento,abraelPippinPrepconcuidado.Espereparaversilatapaarrastraalgodelíquidoporelcasete.

26. Quitelatapaqueestásobrelospuertosdeelución,concuidadodenotocarnadadelíquido.

27. Transfieratodoelvolumendesdeelpuertodeeluciónaunnuevotubodebajaretenciónde1,5mL.

28. Cubratodoslospocillosabiertoscondospiezasdecintaselladoradeplacas.Recuerdedejarunapestañaenel lado limpio.Estoharáqueseamásfácilquitar lacintadesde lapartelimpiaalausada.

29. Coloqueelcaseteselladoensubolsaypóngaloaunlado.

30. TomeelcasetedelavadoylléneloconaguaMiliQ.CierreconsuavidadlatapadelPippinPrep,concuidadodenoderramarnadadellíquidoporelcasetedelavado.

32. DejeelPippinPrepcerradoporunoscuantossegundos.

33. AbraelPippinPrep,concuidadodenollevarnadadelíquidoporelcasetedelavado.

34. Quiteelcasetedelavado,vacíelodeaguaydejequeseseque.

35. LimpietodaelaguaquetengaelPippinPrepyciérrelosuavemente.

36. Seleccioneelbotón“ShutDown”(Apagar)delmenúdelPippinPrep.


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Apéndice2:CuantificacióndeampliconesconuninstrumentodeRCPcDuración:2horas


20×soluciónamortiguadoraTE(pH7,5) 4°C PromegaADNLambdaestándar(100ng/µL) 4°C PromegaTinte200×QuantiFluordeADNbc 4°C PromegaH2Oestéril 20°Ca25°C UsuarioPlaca(s)deamplificacióndeclaseI 4°C Paso2Placa(s)deamplificacióndeclaseII 4°C Paso2

Protocolo2. Cree una dilución serial con tubos demicrocentrífuga de 1,5mL y el estándar de ADN

QuantiFluorLambda(100ng/µL).Sigalasiguientetabladediluciones:

Etiquetaeneltubo ADNdeentrada

VolumendeADN(µL)

Volumen1xTE(µL)

Concentraciónfinal(ng/µL)

Estándar1 ADNLambda 7,5µL 492,5µL 1,5ng/µLEstándar2 Estándar1 250µL 250µL 0,75ng/µLEstándar3 Estándar2 250µL 250µL 0,38ng/µLEstándar4 Estándar3 250µL 250µL 0,19ng/µLEstándar5 Estándar4 250µL 250µL 0,09ng/µLEstándar6 Estándar5 250µL 250µL 0,05ng/µLEstándar7,enblanco Enblanco 0µL 250µL 0ng/µL

3. Preparelasplacasdecuantificacióndeamplicones(vealasfigurascomplementarias).Dividaenalícuotas49,5µLdesoluciónamortiguadoraTE1xenlospocillosdeunaplacaópticade96pocillosparaelnúmerototaldeampliconesquedebecuantificarse.

4. Agregue 0,5 µL de amplicones desde los pocillos correspondientes de las placas deampliconesapocillos individualesde lasplacasdecuantificacióndeamplicones.Mezcledentrodelapipeta.

5. Prepareunasolucióndetrabajodetinte1×QuantiFluorconlasiguientefórmula:0,25µLtinte QuantiFluor (200X) + 49,75 µL solución amortiguadora TE 1×. Prepare suficientesolucióndetrabajodetinteQuantiFluor1×deformaquecadamuestra(totaldemuestrasenlasplacasdeamplicones)yelestándar(14entotal)recibanunaalícuotade50µL.


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6. Prepareunaplacadecuantificacióndeestándaresyplacasdecuantificacióndeamplicones.Dividaenalícuotas50µLdesolucióndetrabajodetinteQuantiFluor1×enlospocillosdelasplacasópticasde96pocillosconelformatodelaplacadecuantificacióndeestándaresylasplacasdecuantificacióndeamplicones(consultelasfigurascomplementarias).

7. Conlosestándarespreparadosarriba,agregue50µLdecadaestándar,porduplicado,alospocillosindividualesdelaplacadecuantificacióndeestándares(14pocillosentotal).

8. Agiteenvórticeparamezclarbienycentrifugue.

9. Coloque cadaplacade cuantificaciónen lamáquinadeRCPc, una a la vez, y ejecute elsiguienteprograma:

Cantidaddeciclos Temperatura Tiempo1 25°C 10segundos

225°C 15segundos25°C 30segundos(adquisicióndedatos)

10. CalculelaconcentracióndeADNdelasplacasdecuantificacióndeampliconesconlosdatosRFUenbrutogeneradosporelinstrumentodeRCPc.

11. DiluyaelADNdelasplacasdeampliconesconH2OestérilparaquelaconcentraciónfinaldeADNseadeaproximadamente67ng/µL.

§ SilaconcentracióndeADNesde150ng/µLomayor:agregue25µLdeH2O§ SilaconcentracióndeADNesde100a150ng/µL:agregue10µLdeH2O§ SilaconcentracióndeADNesmenorque100ng/µL,agregue0µLdeH2O.


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Apéndice3:CuantificacióndebibliotecaconuntintefluorescenteintercaladodeADNbcDuración:~15minutosLaconcentracióndelabibliotecadetamañoseleccionadopuedemedirseenformaprecisaconun tinte fluorescente ADNbc intercalado, como SYBR verde o un equivalente. Los kits y losinstrumentoscomercialmentedisponiblesparaestefinincluyenperonoselimitanallectorQubitdeThermoFisher(usaelkitdeensayodeADNbcQubitdeampliorango),ellectorQuantusdePromega(usael tintefluorescentedeADNbcQuantifluor)yotros.AquísedescribeelmétodoQubit,yaqueeselinstrumentodeusomáscomún.Siseusanotroinstrumentoyotrokit,sigalasinstruccionesestándardelfabricante.

Nota:EstemétodofluorimétricoparaelADNbcconstituyeunamanerarápidaperoprecisadedeterminarlaconcentracióndelabibliotecadetamañoseleccionadofinal.MidetodoelADNbcpresenteenlabiblioteca.


KitdeensayoQubitdsDNABR temperaturaambiente ThermoFisherEstándaresQubitdsDNABR 4°C ThermoFisherBibliotecadetamañoseleccionado 4°C Paso5

Protocolo6.1 –HagaquelosestándaresdeQubitlleguenalatemperaturaambiente.Preparetubosde

ensayodeQubit(500µL,paredesfinas)parasubibliotecaporduplicado,ylosdosestándares.Agiteenvórticeycentrifuguelosestándaresylabiblioteca.

6.2 –Agregue995µLdesoluciónamortiguadoray5µLdetinteauntubodecentrífugade1,5mL.Agiteconelvortexycentrifugue.

6.3 – Transfiera 190 µL desde la mezcla de reactivos a los tubos de Qubit para los dosestándares.Transfiera198µLdesdelamezcladereactivosalosdostubosdeQubitparalosduplicadosdelabiblioteca.

6.4 –Agregue10µLdesdeelestándar1altubodeQubitcorrespondienteyagiteenvórticedurante2segundos.Repitaparaelestándar2.

6.5 –Agregue2µLdesdelabibliotecaa losdostubosdeQubitcorrespondientesyagiteenvórticedurante2segundos.

6.6 –IncubelostubosdeQubitatemperaturaambientedurante2minutos.

6.7 –EnciendalamáquinadeQubityelijaBRprotocol(ProtocoloBR).


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6.8 –PongaeltubodeQubitestándar1ypresioneGO(Empezar).Repitaparaelestándar2.

6.9 –PongaeltubodebibliotecaenQubitypresioneGO(Empezar).Repitaparaelreplicado.

6.10 – Para convertir el resultado de Qubit de ng/µL a una concentración nM, ingrese laconcentración media de los dos replicados de la biblioteca en la pestaña del libro deejerciciosdeOmixonllamada“LibraryQuantitation”(Cuantificacióndebiblioteca).

6.11 – Con los resultados de lamedición delQubit, diluya 10µL de la Biblioteca de tamañoseleccionado a una concentración de 2 nM con H2O estéril en un nuevo tubo demicrocentrífuga de baja retención de 1,5 mL. Almacene la biblioteca de tamañoseleccionadorestantea-20°C.

Puntodeparadaseguro.Lasbibliotecaspuedenalmacenarsea-20°Cporperíodosextensosdetiempo.Enelcasodeunalmacenamientoalargoplazo,serecomiendaenfáticamenterecuantificarlabibliotecaantesdeprocesarlaenelMiSeq.

holotype hla™ 96/11 configuraciÓn a y ce c b ce (ref: …hla+96-11+ifu_v1_a_b… · 0086...

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