inmunofenotipificion celular · -lma-m3 : hla-dr(-)-lma-m4 : hla-dr(+) enfermedad inflamatoria...
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INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR
T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.
www.oncoinmun.co.cl
Fenotipo
Genotipo
Fenotipo: Caracterización
Microscopio óptico
Peripheral Blood FilmMagnification x100
Myeloid maturation
myeloblast promyelocyte myelocyte metamyelocyte band neutrophil
MATURATIONMATURATION
Hematopoiesis
PLURIPOTENT
STEM CELL
COMMITTED
PROGENITOR
CELL
RECOGNIZABLE
BONE MARROW
PRECURSOR CELL
MATURE
BLOOD
CELL
myeloblast
monoblast
pronormoblast red cell
neutrophil
monocyte
basophil
platelet
CFU-Baso
CFU-Eos
CFU-GM
BFU-E/CFU-E
eosinophil
pre-T
pre-B
myeloid
progenitor
cell
lymphoid
progenitor
cell
lymphoblast
lymphoblast
T-cell
B-cell
& plasma cell
MIXED
PROGENITOR
CELL
CFU-Meg megakaryocyte
pluripotent
stem cell
Silver stain (GMS) to detect presence of fungal hyphae in tissue x200
Gram’s stain to detect bacteria in tissue (oil immersion x1000)
USE OF HISTOCHEMISTRY TO DETECT INFECTIOUS ORGANISMS
Luxol Fast Blue for myelinFontana-Masson for melanocytes
MORE EXAMPLES OF HISTOCHEMISTRY
Mucin stained and H&E stained colon
Fenotipo: Caracterización
Microscopio electrónico
Antibodies
Polyclonal Monoclonal
Antibodies that are collected from sera of exposed animal
recognize multiple antigenic sites of injected biochemical.
Individual B lymphocyte hybridomais cloned and cultured.
Secreted antibodies are collected from culture media
recognize ONE antigenic site
of injected biochemical
Antibody
Anti−A Anti−BBloodType
A
B
O
Typing Blood:An Example ofAgglutination
AB
Type Bacteria by Agglutination
• E. coli and Salmonella• O antigens = LPS• H antigens = flagella• Example: E. coli O157:H7
Hybridoma
1975 Kohler and Milstein
http://www.immunecentral.com/images/immune_series/i mmune29.gif
Multiple myeloma (human disease)
Bence Jones proteins in urine
Fusions generated by Sendai virus
or PEG
Fluorescein (FITC)
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Re
lat
ive
I
nt
en
sit
y
Wavelength
Protein
Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Propidium Iodide
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Re
lat
ive
I
nt
en
sit
y
DNA
Excitation Emisson300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Fenotipo: Caracterización
Microscopio epifluorescencia
ImmunofluorescenceAntibody binds to slide at site of antigen…..
Adding of a suppressed fluorescent flag or ‘seconda ry antibody’… .
light
Immunofluorescense
www.cdc.gov www.phenopath.com/clinical/ skin.html
Bullous pemphgoid with linear deposits of IgG at dermal-epidermal junction
IFA of Ehrlichia chaffeensisin DH82 cells, 400X
Very good rapid diagnostics
About 25-30% of women who have metastatic breast cancer overexpress HER-2 (EGF) receptor
Determination of HER2-protein overexpression(semiquantitative DAKO Hercep Test™)
Fluorescence in situ hybridisation (FISH)of HER2 amplification
www.roche.com/pages/ facets/9/herc.htm
Fenotipo: Caracterización
Microscopio óptico
Microscopio electrónico
Microscopio epifluorescencia
Anticuerpos
ELISA (Enzyme−Linked ImmunoSorbent Assay)to Detect Antibody
Antigen
Sample
2° AntibodyEnzyme Linked
Detection
Substrate
ELISA to Detect Antigen
1° Antibody
Sample
2° AntibodyEnzyme Linked
Detection
Substrate
FLOW CYTOMETRY
CITOMETRIA DE FLUJO:APLICACIONES
• Hematología• Inmunología• Patología• Transplantes• Farmacología• Biología
• Toxicología• Microbiología• Parasitología• Citogenética• Virología• . . . . . . . . .
CITOMETRIA DE FLUJO:Aplicaciones Clínicas más Frecuentes
• Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias• Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas• Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular• Estudio de macrófagos intestinales (EII). • Estudio de Función Neutrofílica (estallido
respiratorio, fagocitosis, etc.) • Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.)• Cuantificación de moléculas• Estudio de Células Progenitoras (CD34)• Estudios de Función Plaquetaria• Estudios de Resistencia a Drogas• Estudio de Citokinas Intracelulares
Fenotipo: Caracterización
Microscopio óptico
Microscopio electrónico
Microscopio epifluorescencia
Anticuerpos
ELISA
Citometría de Flujo
Southern Blot – DNA
• DNA es extraído desde las células y es
localizado en pocillos haciéndose migrar
como un gel de electrofóresis. El ADN es
transferido a una membrana (nitrocelulosa),
para luego ser teñido.
Southern Blot: Resultados
Western Blot – Protein
• Proteínas extraídas desde células, son dispuestas en pocillos, haciéndose migrar como un gel de electrofóresis. La proteína es transferida desde el gel a una membrana (nitrocelulosa). Finalmente se adicionan anticuerpos contra la proteína, los cuales luego son evidenciados (anticuerpo secundario conjugado, enzima, molécula radioactiva o fluorescente).
Western Blot
Western Blot Results
Northern blot – RNA
• RNA extraído desde células se dispone
en pocillos, haciéndose migrar como un
gel de electrofóresis. El RNA es
transferida desde el gel a una membrana
(nitrocelulosa) para luego ser teñido.
Northern Blot
PCR – Polymerase Chain Reaction
• Secuencias génicas específicas (DNA o
RNA) son replicadas y amplificadas para
una posterior secuenciación u otro
análisis.
Polymerase Chain Reaction
Fenotipo: Caracterización
Microscopio óptico
Microscopio electrónico
Microscopio epifluorescencia
Anticuerpos
ELISA
Citometría de Flujo
Southern blot
Northen blot
Western blot
PCR
Microscopio ópticoMicroscopio electrónicoMicroscopio epifluorescenciaAnticuerposELISACitometría de FlujoSouthern blotNorthen blotWestern blotPCR
Caracterización fenotípica
Caracterización genotípica
Utilidad clínica
Caracterización fenotípica y genotípica
Utilidad clínica
Caracterización fenotípica y genotípica
Utilidad clínica
Infección VIH-SIDA
CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA)
•LLA-B :-BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19.-BII Común : CD10.-BIII Pre B: clg.-BIV Madura : slg
•LLA-T :-TI-proT: CD7-TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8-TIII-Cortical: CD1a-IIV-Madura: CD1a y CD3mb
•LMA : -LMA-M6 : glicoforina A-LMA-M7 : CD61, CD41, CD42b-LMA-M3 : HLA-DR(-)-LMA-M4 : HLA-DR(+)
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Espectro de presentación.
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Alteración de la inmunoregulaciónde mucosa intestinal
Inflamación persistente y/o recurrente
Congestión ulcerativa Granulomatosa
Cáncer
Colon normal
CrohnCrohn
C.U.
ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL
Colitis ulcerosa Enfermedad de Crohn
Estudios celulares de mucosa intestinal (CF):
• Células epiteliales C.P.A.
• Macrófagos Moduladores
• Linfocitos: TCD4 Perpetuación
Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamatio nFALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.
Marcadores de superficie en MI que se encuentran alterados en EII
CD16 Receptor de IgG (Fcγγγγ RIII)
HLA-DR Se expresan en: LBMonocito
Macrófago
Células dendítricas
CD80 y CD86 Interactúan con receptores de CD28 de LT
CD54 Receptor para ICAM-1
Mahida YR et al. Gut.1989;30:826-34
Roggler G. et al. In:Innovative Concept in IBD.Kluwer Acad. Publishers 1999 pps.:111-113
Mucosa
• HLA-DR• CD16
• CD54
• CD25
• CD68• CD80, CD86• CD11b
Normal
20-30%Ausente
7%
Ausente
AusenteAusente
5%
EII
PresentePresente
C.U. 70%Crohn 46%
C.U. PresenteCrohn ausente
PresentePresentePresente
Fenotipo de MI Mediante Inmunohistoquímica
Cambios en células neoplásicas
Transformación
1. Cambios morfológicos
2. Transplantabilidad
3. Disminución de la inhibición por contacto
4. Capacidad proliferativa infinita
5. Tumorgenicidad
Cambios en membrana
1. Comunicación celular
2. Alteraciones en el transporte3. Enzimas de superficie
4. Antígenos de superficie
Cambios bioquímicos
Cambios en el cariotipo
Cambios en células neoplásicas
Comparison of a typical normal (A) and malignant(B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha-fetoprotein
Comparison of a typical normal (A) and malignant(B) cell. CEA, carcinoembryonic antigen, AFP, alpha -fetoprotein
Changes in tumor marker concentration during the course of disease
: www.dpcweb.com/medical/cancer/ cancer_tm_overview_l g.html
MAbs to serum Tumor marker Disease monitoring
Genética del cáncer:Clases de genes implicados en el cáncer
• Oncogenes• Genes supresores • Genes reparadores de DNA
Genes supresores Oncogenes
Genes reparadores de ADN
Genes supresores actúan como frenos
Oncogenes accionan el acelerador
LOH (Loss of Heterozygosity) Pérdida de heterozigocid ad.Pérdida de una copia normal de un gen
(puede dejar sólo una copia “mala”)
Tumor suppressor p53: “guardian of the genome”
(Inactivado en la mayoría de los tumores pormutación y LOH)
(apoptosis)
Tumor suppressor p53
La inestabilidad genómica puede ser identificada por citometrái de flujo.
Num
e ro
de c
é lu l
a s
DNA/Célula
Normal Tetraploide Aneuploide
Diploide
2N 4N 2N 4N 2N
> 6%< 6%
Tetraploidía predispone a la Aneuploidía en EB
Citometría de flujoNormal
Tetraploide
Progresando a aneuploidía8/74 (11%)
11/16 (69%)
N= 90 pacientes
P < 0.0001
Galipeau et al, Proc Nat Acad Sci USA 1996; 93:7081-7084
Intervalo promedio entre tetraplodía y aneuploidía: 17 meses
Caracterización Morfológica celular:
• Conceptos generales de células eucariontes y procar iontes.
• Alcances históricos.
• Microscopia luz, epifluorescencia, electrónica.
• Tinciones y marcadores celulares de estructuras.
Caracterización morfofuncional celular:
• Anticuerpos monoclonales.
• Técnicas ópticas (láser).
• Marcadores proteicos/enzimáticos.
• Expresión génica.
Alcances clínicos:
• Inmunodeficiencias.
• Enfermedades crónicas inflamatorias.
• Pre neoplasias y neoplasias.
INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR
INMUNOFENOTIPIFICION CELULAR
T.M. MSC JUAN LUIS CASTILLO N.Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda.
Laboratorio de Citometría de FlujoHospital del Trabajador, Concepción, Chile.
www.oncoinmun.co.cl