hla tipificación_marcelo pando

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Tipificación de Antígenos de Histocompatibilidad (HLA):

Evaluación de la Compatibilidad entre Donante y Receptor

Marcelo Pando

Julio, 2014


Parte 1:HLA Fundamentos BásicosHLA: Antigenos Leucocitarios Humanos

HLA


HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos

HLA

Presentación antigénica

En la Naturaleza:



HLA


En la Naturaleza:

Embarazo



HLA


En la Naturaleza:

Embarazo

Interaccióncon KIR



HLA


En la Naturaleza:En Medicina:

Embarazo

Interacción con KIR

Trasplantes de organos



HLA



Embarazo



Asociación a enfermedad



HLA



Embarazo




Hipersensibilidad a fármacos



HLA



Embarazo





Selección de pareja!



HLA



Embarazo






DIVERSIDAD!



HLA


En la Naturaleza:

Embarazo





HLA



Embarazo






DIVERSIDAD!


Complejo HLA

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Chromosome_6.svg#filelinks (Wikimedia Commons)

Cromosoma 6• Alrededor de 1900 genes• 170 millones de pares de bases• 4 Mbp en el complejo HLA

HLA 220 genes


Complejo HLA

MHCHLA4 Mb


Complejo HLA

MHCHLA4 Mb

Class I

Class II


HLA Región de clase I

HLA-A HLA-B

HLA-C1.3 Mb

81 Kb


Región de clase II

HLA-DRHLA-DP

398 Kb

47 Kb

HLA-DQ


Desequilibrio de Ligamiento

HLA-B - > C

HLA-DR - > DQ

93% de pacientes con B35 tendrán C*4

60% de pacientes con DR4 tendrán DQ839% de pacientes con DR4 tendrán DQ71% de pacientes con DR4 tendrán DQ4


Serotipos: Antígenos Clásicos de HLAHLA-A HLA-BA1 Bw4 A2 Bw6A3 B5 A9 B7 A10 B703 A11 B8 A19 B12 A23 B13 A24 B14 A2403 B15 A25 B16 A26 B17 A28 B18 A29 B21 A30 B22 A31 B27 A32 B2708 A33 B35 A34 B37 A36 B38A43 B39A66 B3901 A68 B3902 A69 B40 A74 B4005 continue… continue…

HLA-CwCw1 Cw2 Cw3 Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9Cw10

HLA-DR HLA-DQDR1 DQ1 DR103 DQ2 DR2 DQ3 DR3 DQ4 DR4 DQ5DR5 DQ6DR6 DQ7DR7 DQ8DR8 DQ9DR9 DR10 DR11DR12DR13DR14DR1403 DR1404 DR15DR16DR17DR18

DR51 DR52 DR53


Serotipos: Antígenos Clásicos de HLAHLA-A HLA-BA1 Bw4 A2 Bw6A3 B5 A9 B7 A10 B703 A11 B8 A19 B12 A23 B13 A24 B14 A2403 B15 A25 B16 A26 B17 A28 B18 A29 B21 A30 B22 A31 B27 A32 B2708 A33 B35 A34 B37 A36 B38A43 B39A66 B3901 A68 B3902 A69 B40 A74 B4005 continue… continue…

HLA-CwCw1 Cw2 Cw3 Cw4 Cw5 Cw6 Cw7 Cw8 Cw9Cw10

HLA-DR HLA-DQDR1 DQ1 DR103 DQ2 DR2 DQ3 DR3 DQ4 DR4 DQ5DR5 DQ6DR6 DQ7DR7 DQ8DR8 DQ9DR9 DR10 DR11DR12DR13DR14DR1403 DR1404 DR15DR16DR17DR18

DR51 DR52 DR53

630 Alleles


Diversidad de HLA: IMGT/HLA

http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/


Nomenclatura Molecular de HLA


Niveles de Tipificación Molecular

• Baja resolución• A*02, B*35

• Resolución intermedia• A*02:01/02:03/02:07

• Alta resolución• A*02:01


HLA en Trasplantes

• Trasplantes de órganos solidos• Tipificación de serotipos: A1, A2, etc.

O de Baja resolución: A*01, A*02, etc.

• Trasplante de Medula Ósea o Células Madre• Tipificación de alta resolución: hasta el nivel de

secuencia aminoacídica: • A*01:02, A*02:243, etc.


Moléculas de HLA

• HLA de Clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C

• HLA de Clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP

α1 α2

α3β2m

β1α1

α2 β2

DRA1 DRB1 -> DR1-18

DRB3, 4, 5 -> DR51, DR52, DR53

DQA1 DQB1 -> DQ1-9

DPA1 DPB1 -> DPs


HLA de Clase I HLA de Clase II

Cadena Alfa

HLA-AHLA-BHLA-C

Cadena Alfa

DRA1DQA1DPA1

Cadena Beta

DRB1DRB3DRB4DRB5

DQB1DPB1

Cadena Beta 2 microglobulina

Moléculas de HLA: estructura y función


HLA de Clase I

HLA de Clase II

Linfocitos T CD8 Linfocitos T CD4

NK

Moléculas de HLA: estructura y función


Estructura de HLA de Clase I


Estructura de HLA de Clase II


Epitopes de HLA AA Pos 10 20 30 40 50 A*01 GSHSMRYFFT SVSRPGRGEP RFIAVGYVDD TQFVRFDSDA ASQKMEPRAP A*02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---R------ AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A AA Pos. 210 220 230 240 250 A*01 LRCWALGFYP AEITLTWQRD GEDQTQDTEL VETRPAGDGT FQKWAAVVVP A*02 ------S--- ---------- ---------- ---------- ---------- AA Pos. 310 320 330 340 A*01 AVVAAVMWRR KSSDRKGGSY TQAASSDSAQ GSDVSLTACK V A*02 ---------- ---------- S--------- ---------- -

α1 α2

α3β2m


Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150 A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A


Genética del HLA: Genes HLA Clase I

Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 and 8

α1 α2

α3β2m

ADN

ARNm

Proteína

Exon 2 Exon 3 Exon 4


Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exones 4, 5 & 6

Genética del HLA: Genes HLA Clase II

Cadenas alfa

DRA1DQA1DPA1

Cadenas beta

DRB1DRB3DRB4DRB5

DQB1DPB1

ADN

ARNm

Proteína

Exon 2 Exon 3

α2

α1 β1

β2


Resumen Parte 1: HLA Fundamentos Básicos

• Gran diversidad: génica, alélica y haplotípica.

• Inmunidad contra las diferencias entre lo propio y lo ajeno.

• La posición de la diferencias en la molécula de HLA es importante en la generación de alo-anticuerpos.


Resumen Parte 1: HLA Fundamentos Básicos

• Tipos de resolución en la tipificación de HLA es importante para cada tipo de trasplante.

• Exones 2, 3 y 4 son los tipificados en las moléculas de HLA Clase I.

• Exones 2 y 3 son los tipificados en las moléculas HLA Clase II.


Parte 2: Tipificación de Antígenos de HLA

Metodologías:

Serología: usa células y detecta los antígenos HLA en la superficie celular.

Molecular: Usa ADN y detecta los dos alelos de un gen.


Tipificación de Antígenos de HLA:

ADN:

Proteína:


Tipificación de Antígenos de HLA: Serología

NEGATIVO POSITIVO

Suero contra HLA-B57

HLA-B57

HLA-A1


Tipificación de Antígenos de HLA: Molecular


Exon 2 Exon 3HLA de Clase II

PCR

HLA de Clase I


Tipificación por Primers Específicos de Secuencia (SSP)

HLA-DR1

Paciente LMPositivo para HLA-DR1

Control interno

Positivo

Paciente JMNegativo para HLA-DR1

Control interno

Negativo



HLA-ABDR TRAY



HLA-ABDR TRAY

HLA-A1, A3HLA-B35, B57HLA-DR7, DR4


Tipificación con Sondas de ADN: SSOP

ADN:



ADN:



Sonda 1 Sonda 2

Isótopo Radioactivo



Sonda 2Sonda 1

LUMINEX

Sonda 1 Sonda 2

Isótopo Radioactivo


Cada perla tiene una fluorescencia verde y naranja

Tipificación con LUMINEX SSOP


Cada grupo de perlas tiene una sonda diferente


Red intensity

Gre

en in

tens

ity


Cada perla tiene una fluorescencia verde y naranja


Red intensity

Gre

en in

tens

ity

A3 B57


Cada perla tiene una sonda diferente

Red intensity

Gre

en in

tens

ity



Cada perla tiene una sonda diferente

Red intensity

Gre

en in

tens

ity


HLA-A1, A3HLA-B35, B57HLA-C*4, C7


Secuenciación de HLA



Secuenciación de HLA: Ambiguedades


Resultados ambiguos de la tipificación

Allele 1 Allele 2

DQB1*03:01 DQB1*03:02

DQB1*03:03 DQB1*03:04

DQB1*03:04 DQB1*03:91Q

DQB1*03:113 DQB1*03:14



Allele 1 Allele 2

DQB1*03:01 DQB1*03:02

DQB1*03:03 DQB1*03:04

DQB1*03:04 DQB1*03:91Q

DQB1*03:113 DQB1*03:14

1 2 3 4 5 6 7 8

16

24

31

PC



Allele 1 Allele 2

DQB1*03:01 DQB1*03:02

DQB1*03:03 DQB1*03:04

DQB1*03:04 DQB1*03:91Q

DQB1*03:113 DQB1*03:14

1 2 3 4 5 6 7 8

16

24

31

10

PC



Allele 1 Allele 2

DQB1*03:01 DQB1*03:02

DQB1*03:03 DQB1*03:04

DQB1*03:04 DQB1*03:91Q

DQB1*03:113 DQB1*03:14

1 2 3 4 5 6 7 8

16

24

31

PC

9



Allele 1 Allele 2

DQB1*03:01 DQB1*03:02

DQB1*03:03 DQB1*03:04

DQB1*03:04 DQB1*03:91Q

DQB1*03:113 DQB1*03:14

PC

1 2 3 4 5 6 7 8

16

24

31

PC


Ventajas y Desventajas


Resumen Parte 2

• Las distintas técnicas de tipificación obtienen informacion diferente que se puede complementar.

• Serología detecta la molécula de HLA en la superficie celular.

• Las técnicas moleculares usan ADN y asumimos la expresión correcta.

• La tipificación de alta resolución nos da el nivel de tipificación mas alto pero limitado a la región que se secuencia.


1er Caso:• Paciente con PRA de 100%• Anticuerpos detectados:• Contra Clase I:

• A:2 29 30 31 33 74 • B:27 44 46 47 50 5102 56 62 71 73 13 18 35 37 38

49 51 52 53 57 58 59 63 64 65 75 77 78 • C:15 4 A:23 24 25 32 68 69 17 18 2 5 6

• Contra Clase II: • DR:11 8 9 04:02 103 12 13 16 7 • DR:01:01(DR51) • DQA1:02:01 • DQ:4 5 6


1er Caso:

• Paciente con PRA de 100%

• Probabilidad de encontrar un donante de 1 en 270

• Donante potencial con 0 mismatches para ABDRDQ

• Crossmatch prospectivo positivo para celulas T y B

HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQPaciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08


1er Caso:


• Anticuerpos contra donante probables:

• DQA1*02:01 (MFI 4409-4813)

• DRB1*04:02 (MFI 14759)

• DRB1*04:04 (MFI 1605)

• Otros DR4 = Negativos


1er Caso:

• Es DQA1*02:01 un DSA?



1er Caso:


• Evaluemos el desequilibrio de ligamiento:

DQ2 DQB1*02 --- DQA1*02:01 solo en DR7

El haplotipo de DR17 es:

DR17 DQA1*05:01 DQB1*02:01

DR17 DQA1*01:02 DQB1*06:02



1er Caso:

• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?

• El desequilibrio de ligamiento no nos ayuda a resolver este caso:

DRB1*04:01 DQB1*03:02 (DQ8)

DRB1*04:02 DQB1*03:02 (DQ8)

DRB1*04:04 DQB1*03:02 (DQ8)



1er Caso:• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?

• Tipificación por SSP de alta resolución HLA-DR:


1er Caso:


• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)

• FXM:


Celulas T Celulas B

103 MCS 85 MCSPositivo Positvo

Cutoff 57 MCS 78 MCS

Donante


1er Caso:



• FXM:


Celulas T Celulas B



Donante

• Auto FXM:

Celulas T Celulas B



Paciente


1er Caso:



• FXM:


Celulas T Celulas B



Donante

• Auto FXM:

Celulas T Celulas B



Paciente

•El Paciente tiene auto anticuerpos•Un DSA de bajo MFI que no explica el Flow XM•Es un muy buen donante para este paciente


2do Caso: Anticuerpo Alelo Específico


2do Caso: Anticuerpo Alelo Específico

DRB3*02


Resultados del Luminex:

MFI Allele FrequencyDRB3*01 1,200 21.0%DRB3*02 24,000 65.3%DRB3*03 2,500 13.7%

•El alelo DR52 (DRB3*02) es muy frecuente y debería ser tipificado


Y despues de la tristeza de no haber ganado.


Hay que felicitar al equipo por lo jugado!!!


Y guardar la esperanza para el proximo Mundial!


Gracias!

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