guia practicas medios cultivos1

Universidad Alas Peruanas – Arequipa

Dr. Ricardo J. Juárez Zevallos Patólogo Clínico

PRACTICA N°02 MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías: Físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el pH y la presión osmótica; entre los requerimientos químicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento. Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas.

Requerimientos para el desarrollo bacteriano: Las bacterias pueden ser divididas en autótrofas y heterótrofos. Las primeras comprenden las bacterias del suelo y el agua que obtienen carbono y nitrógeno de la atmósfera y de la materia inorgánica simple. Las bacterias heterótrofas requieren compuestos orgánicos más complejos como

fuente de carbono y nitrógeno, así como proteínas o sus derivados, también requieren carbohidratos y grasas. Este último grupo de organismos es el más importante en bacteriología médica.

- Proteínas: Se suministran generalmente como peptonas que se encuentran disponibles en el comercio, preparadas por digestión parcial de carne con enzimas pépticas, consisten en polipéptidos, dipéptido y aminoácidos.



- Carbohidratos: Suministran carbono para las síntesis, y además su fermentación libera energía utilizable en el metabolismo.

- Factores accesorios de crecimiento: Son también requeridos por algunas bacterias. Entre ellos están las vitaminas del complejo B (tiamina, ácido nicotínico, piridoxina, botina). Estas sustancias son necesarias y las bacterias no las pueden sintetizar. Otros factores necesarios para algunas bacterias son obtenidos de nutrimentos más complejos, como el suero, la sangre la yema del huevo, etc.

- Sales minerales: Elementos como potasio, sodio, calcio, etc. También son requeridos por algunas bacterias en su desarrollo.

- Atmósfera: Microorganismos aerobios obligados, anaerobios obligados, anaerobios facultativos, etc.

- Presión osmótica: Las células pueden encogerse y ser destruidas (plasmólisis) en soluciones hipertónicas, inversamente, se rompen (plasmoptisis) por entrada de agua, en las soluciones hipotónicas.

- Temperatura: Para la mayoría de bacterias patógenas del hombre la temperatura óptima de crecimiento es de 37°C.

- Luz: La mayoría de las bacterias desarrollan en ausencia de luz porque esta puede ser letal.

- Reacción: La mayoría de las bacterias crece mejor en un medio ligeramente alcalino (pH 7,2- 7,6).

II. OBJETIVOS.

- Preparar medios de cultivo líquidos y sólidos. - Determinar el uso de esos medios para aislar e identificar a los microorganismos.

III. MATERIALES.

- Placas Petri. - Tubos de Ensayo. - Mecheros de Bunsen. - Autoclave. - Matraces. - Pinzas de madera. - Baño maría. - Trípodes - Rejillas de asbesto. - Medios de cultivo a prepararse.



IV. TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existe una gran variedad de medios para el cultivo de los microorganismos en el laboratorio, la mayoría de ellos pueden adquirirse ya elaborados, necesitando algunos sólo la adición de agua o la esterilización. Los medios de cultivo pueden clasificarse:

a) POR SU CONSISTENCIA:

1. Medios Líquidos o Caldos: Son aquellos que contienen, disueltos en agua, los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos.

2. Medios Sólidos: Contienen nutrientes disueltos en agua pero se les añade un agente solidificante. El Agar es un polisacárido complejo que se obtiene de algas rodofíceas de origen marino cuyas propiedades son de gran utilidad en la preparación de medios de cultivo sólidos: No es degradado enzimáticamente por los microorganismos (a excepción de algunos microorganismos de ambientes marinos), funde aproximadamente a 100°C y permanece en estado líquido mientras la temperatura no descienda por debajo de 45-50°C. Además, una vez solidificado se puede incubar a temperaturas elevadas sin que se licúe. Generalmente el Agar se añade, para solidificar un medio líquido, en una concentración del 1,5%. Los medios con Agar se envasan en tubo o en placa de Petri.

3. Medios Semisólidos: Son similares a los medios sólidos, pero la concentración del agente solidificante es menor, generalmente del 0,4% con lo que, una vez solidificados mantienen una consistencia gelatinosa. Se utilizan, por ejemplo, para determinar la movilidad de los microorganismos.

b) POR SU ORIGEN

1. Medios complejos: Contienen todos los nutrientes necesarios para el crecimiento de muchos tipos de microorganismos, pero no se conocen todos los componentes que forman parte de ellos, ni las concentraciones exactas de cada uno de ellos. Muchos de sus componentes proceden de la degradación parcial de tejidos o productos animales, de plantas o de microorganismos que son fuente de aminoácidos, azúcares, lípidos, vitaminas y minerales. Ejemplos de dichos componentes son las peptonas o triptonas (proteínas animales digeridas enzimáticamente), el extracto de carne y el extracto de levadura. Como ya se ha mencionado, en estos medios suelen encontrarse azúcares pero en muchos casos los medios complejos son suplementados con glucosa. Un ejemplo de medio nutritivo complejo es el caldo nutritivo, que contiene peptona y extracto de carne.

2. Medios definidos: Son aquellos que contienen los distintos nutrientes en forma de productos químicos puros (pero no extrapuros) y en concentraciones conocidas. Así, un medio definido que permita el desarrollo de un microorganismo heterótrofo y "poco exigente", como E. col i , debería contener sales inorgánicas y fuentes de carbono y nitrógeno: MgSO4, KPO4H2, Na2PO4H, glucosa y NH4Cl. Otros elementos esenciales, como hierro, manganeso y cobre, se encuentran generalmente presentes como contaminantes de los productos químicos antes citados, en cantidades suficientes para el crecimiento.



3. Medios semisintéticos: Es una mezcla de los anteriores. Llevan algunas sustancias químicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de naturaleza y composición indefinidas

c) POR SU COMPOSICIÓN: Muchos medios de cultivo utilizados en el laboratorio son medios generales en los que se pueden desarrollar una gran variedad de microorganismos con distintos requerimientos nutricionales. Sin embargo, en algunas ocasiones, es necesario aislar a partir de una muestra un microorganismo que se encuentre en un bajo número y que pueda ser enmascarado por otros microorganismos presentes en un número más elevado. En esos casos es recomendable utilizar medios de cultivo que ayuden a separar y diferenciar dichos microorganismos o que, de forma selectiva, favorezcan el crecimiento de alguno de ellos. Estos medios pueden ser:

1. Medios Enriquecidos: Son los medios comunes , a los que se añaden ciertos productos, a manera de suplemento nutritivo (sangre, suero, glucosa, hemoglobina, etc) que permiten el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibidores del crecimiento, en bacterias exigentes. Ejemplo agar sangre, etc.

2. Medios de Enriquecimiento: Son medios líquidos que por su composición química favorecen o permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcialmente la de otras. Ejemplo el medio Muller-Kauffman que permite el crecimiento de Salmonella e inhibe el de numerosas coliformes.

3. Medios Selectivos: Son aquellos que permiten el crecimiento de un tipo determinado de microorganismos, inhibiendo el desarrollo de los demás. Algunos de estos medios contienen un agente selectivo como antibióticos, productos químicos, colorantes, etc. Entre los agentes selectivos podemos citar el cloruro sódico, que en concentración elevada inhibe la mayoría de los microorganismos excepto los microorganismos halotolerantes, como son los estafilococos, o la azida de sodio, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas al fijarse al hierro de la porfirina del sistema citocromo, permitiendo seleccionar los estreptococos, que carecen de este sistema, así como otros Gram positivos

De la misma manera, la bilis y sales biliares convierten los medios de cultivo a los que se añaden en selectivos para Salmonella ya que, además de inhibir a los microorganismos Gram positivos, en concentraciones elevadas inhiben también a bacterias Gram negativas fermentadoras de lactosa. Los colorantes, como el verde brillante, inhiben selectivamente las bacterias Gram positivas, siendo también inhibidor para la mayoría de las bacterias intestinales excepto para Salmonella.

Este colorante es la base del medio Agar Verde Brillante, utilizado para el aislamiento de Salmonella a partir de muestras fecales. Los medios selectivos pueden serlo también por su pH, así el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias.



4. Medios Diferenciales: Son aquellos diseñados para distinguir unos microorganismos de otros, a partir de una población mixta, por la apariencia distinta que toman sus colonias. Estos medios de cultivo ponen de manifiesto propiedades que un determinado tipo de microorganismo posee. Por ejemplo, los medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de color que se origina cuando éste es metabolizado, como en el caso del medio CLED.

Los medios diferenciales pueden ser además selectivos, si se añaden agentes que inhiben el crecimiento de determinados microorganismos. En este caso va a ser posible distinguir diferentes tipos microbianos dentro del limitado grupo de microorganismos que pueden crecer. Así, el medio EMB de Levine es selectivo para las bacterias Gram negativas por contener dos colorantes, eosina y azul de metileno, que inhiben el crecimiento de bacterias Gram positivas. Es también un medio diferencial, porque distingue las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. La formación de ácidos a partir de lactosa hace que ambos colorantes precipiten en la superficie de las colonias, que aparecen de color morado. En ciertas ocasiones, como ocurre en el caso de E. col i , las colonias presentan además un brillo metálico. El Agar Mac Conkey es otro ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas; la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio.



V. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo sólo necesario la adición de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio líquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada.

A continuación el caldo se envasa en los recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizándolos. La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y añadir Agar al 1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos especiales, ya que el Agar es insoluble en agua. Por ello, una vez añadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100°C, para permitir que el Agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan.



Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas. Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservación de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4°C para retrasar su deshidratación.

VI. CUESTIONARIO

1. ¿Qué usted entiende por medio de cultivo?

2. Cuáles son los objetivos de la nutrición microbiana?

3. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a su composición?

4. ¿Qué es un medio artificial?

5. ¿Cómo se clasifican los medios de cultivo atendiendo a los objetivos de su empleo?

6. ¿Qué información aportan los medios diferenciales?

7. ¿Cómo se denomina el producto que se añade a los medios de cultivo para sodificarlos?

8. ¿Cuáles son los compuestos nutritivos básicos?

9. ¿Qué compuestos podemos incorporar al medio de cultivo que le sirva a la bacteria como fuente de nitrógeno?

10. ¿Qué compuesto nutritivo aporta el carbono que le sirve a la bacteria para obtener energía?

11. Explique como usted realiza la pesada de un medio de cultivo deshidratado.

12. Describa como se hidrata el medio de cultivo una vez pesado.

13. ¿De cuantas maneras se puede ajustar el pH del medio de cultivo?

14. ¿Cómo se distribuye el medio de cultivo antes de su esterilización?

15. ¿Cómo se conservan los diferentes medios una vez elaborados?

16. ¿Cómo se comprueba la esterilidad de los medios de cultivo recién elaborados?

17. ¿Qué proceder debe seguirse cuando se va a realizar la siembra en un medio que está conservado en refrigeración?

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