Parasitismo: asociacin biolgica entre dos especies vivas diferentes, donde el parsito vive a expensas del hospedador, obteniendo de ste nutrientes y proteccin fsica.

Parsito: es metablicamente dependiente del hospedador y puede eventualmente producirle dao.

Parasitosis: es un caso de parasitismo en el que existen manifestaciones clnicas producto del parasitismo.

Comensalismo: Tipo de asociacin biolgica en

que un agente biolgico vive a expensas de otro sin producirle dao.

Comensales No es anormal tenerlos. Reflejan contaminacin fecal del medio. Se deben informar en el examen de laboratorio. No requieren terapia farmacolgica

Protista

Animalia

Protozoo Flagelata Sarcodina Ciliata Esporozoa

Helmintos

Arthropoda

Plathelmintos Nematoda Acanthocephala

Cestodes Trematodes

Algae Slime molds

X X

X

Para estudiar la bioqumica, morfologa, fisiologa y metabolismo de los

parsitos Para obtener informacin acerca del desarrollo y las necesidades

nutricionales del parsito Para estudios de infeccin controlados Para el diagnstico de algunas parasitosis: como complemento de otros

mtodos, para la produccin de antgenos / anticuerpos usados en ensayos inmunolgicos.

Para el screening de drogas, para diferenciar aislamientos resistentes o susceptibles a determinado agente quimioteraputico

Para estudios epidemiolgicos, para diferenciar distintos aislamientos Para la produccin de vacunas

En general el cultivo de estos organismos se utiliza ms en investigacin y docencia y no tanto con fines diagnsticos.

Cuando se requiere un nmero importante de parsitos libre de contaminantes bacterianos o de

materiales del hospedador

axnico: el parsito crece en ausencia de ninguna otro tipo de clula

xnicos: el parsito se crece en presencia de una microbiota indefinida (ej: cultivo primario de parsitos a partir de muestras de MF)

monoxnicos: el parsito crece en presencia de una nica especie adicional (ej. aislamiento Acanthamoeba de biopsias de crnea en presencia de E. coli)

polixnicos: el parsito crece junto a otros organismos, pero todos ellos de identidad conocida in vitro in vivo

Caractersticas propias

de los parsitos

Numerosas variables a considerar para

el cultivo

Ciclos de vida complejos: Distintos hospedadores Distintas formas

morfolgicas o estados Formas intracelulares Localizacion subcelulares Respuesta inmune del

hospedador Mecanismos protectores

del parsito

Distintas temperaturas optimas

Distintos requerimientos nutricionales

Cultivos axnicos/monoxnicos

Distintas especies, cepas o aislamientos pueden comportarse de manera diferente

Simular el habitat de un parsito dentro del hospedador, especialmente en un sistema

de cultivo in vitro, puede ser extremadamente complejo, aun

asumiendo que uno ha determinado todas las variables relevantes

Medios de cultivo complejos definidos e indefinidos Componentes del medio Co-factores o complementos Suero (SFB, suero de caballo, suero humano) Diferentes marcas o lotes Material plstico/vidrio Formas de esterilizacin Forma y tiempo de almacenamiento Agua Alta variabilidad de los componentes, pueden resultar nocivos

para el crecimiento del parsito

Entamoeba histolytica Leishmania spp. Trichomonas vaginalis (InPouch TV) Strongyloides stercoralis (Harada Mori) Amebas de vida libre en infecciones SNC

El cultivo de microorganismos suele ser de gran ayuda para la identificacin del agente infeccioso:

Para infecciones bacterianas, el cultivo es frecuentemente el Gold Standard.

En infecciones virales, por rickettsias o amebas, representan un buen mtodo de referencia.

En la mayora de las infecciones parasitarias, el cultivo no es usado de rutina para la identificacin del parsito, pero si es frecuentemente usado como complemento de otros mtodos diagnstico o para la confirmacin del agente causal, por ejemplo para infecciones por:

Entamoeba histolytica Giardia intestinalis Trichomonas vaginalis Balantidium coli Diantamoeba fragilis* Blastocystis hominis* * parsitos de importancia clnica controversial

El cultivo generalmente no es usado con fines diagnsticos como primera opcin, sino su identificacin por microscopa

Debido a sus habitats naturales, son frecuente aislados en presencia de bacterias y hongos El xito del cultivo requiere el control o eliminacin del crecimiento bacteriano/fngico.

T. vaginalis, G. intestinalis: pueden establecerse directamente cultivos axnicos

E. histolytica, B. hominis: cultivo en presencia de otros organismos (xnicos, monoxnicos) y posterior axenizacin

D. fragilis, B. coli: no se han cultivado axenicamente

Amebas del intestino humano: Son las mas numerosas . Entre ellas la de mayor patogenicidad y de mayor importancia medica es: Entamoeba histolytica.

Amebas no patgenas intestinales (comensales): E. coli, E dispar, E hartmanni , Endolimax nana y Iodamoeba butschlii. Entamoeba gingivalis es un comensal de la boca.

Amebas de vida libre (productoras de meningoencefalitis): Capaces de invadir el sistema nervioso central y producir cuadros de meningoencefalitis: son los gneros Acanthamoeba y Naegleria.

Protozoo unicelular Ciclo de vida simple: forma replicativa

(trofozoto) y forma de resistencia (quiste). Transmisin por ingestion de quistes en agua

o alimentos contaminados con materia fecal (MF)

Humanos pueden infectarse con al menos 6 especies de Entamoeba, pero solo E. histolytica es patgena

Es la 3 causa de mortalidad y morbilidad por infecciones parasitarias en el hombre (despus de malaria y schistosomiasis)

Se estiman 50,000-100,000 muertes al ao Tratamiento: metronidazol (Flagyl)

Cultivado por primera vez en 1925 por Boeck y Drbohlav en un medio bifsico inclinado de huevo, previamente usado para aislar flagelados intestinales

Locke-egg (LE)* es una versin modificada usada hasta hoy Dobell y Laidlaw introdujeron el uso de almidn de arroz como

fuente de carbohidratos para cultivos xnicos, (no es rpidamente metabolizado por bacterias permitiendo alcanzar el balance ameba-bacteria requerido)

Otros medios bifsicos con suero, agar y extracto de huevo, Medio de Robinson*

Medios monofsicos: Infusin yema de huevo de Balamuth, Medio de Jones, TYSGM-9 de Diamond*

* Medios ms usados actualmente para el cultivo de amebas, tambin usado para otras especies de Entamoeba y para Endolimax nana

Cultivos Monoxnicos: Cleveland y Sanders,1930: primer cultivo con una nica bacteria en medio

bifsico Cultivos monoxnicos con tripanosomtidos (T. cruzi, Crithidia fasciculata) Hoy solo se usan como punto intermedio para alcanzar un cultivo axnico.

Cultivos Axnicos: Primera vez logrado por Diamond en 1961 en un medio bifsico complejo 1968: Medio monofsico TP-S-1 (Diamond 1978: Medio monfsico TYI-S-33* (Diamond et al.) Medio de cultivo axnico casero PEHPS, con extractos de hgado y

pncreas, es una alternativa a los medios comerciales (Said-Fernandez et al.1988)

Cultivos Clonales: Obtencin de colonias clonales en agar (Gillin y Diamond,1978; Mueller y

Petri, 1995) Micromanipulacin para obtener clonar cultivos xnicos (Farri 1978) y

axnicos (Diamond et al. 1976)

* Medios ms usados actualmente

Principales componentes para medios axnicos: Fuente de pptidos y aminocidos (Trypticasa Peptona

de casena) Acidos nucleicos (extracto de levadura) Carbohidratos (glucosa) Lpidos (suero) vitaminas

La axenizacin de cultivos de E. histolytica es un proceso largo y demandante, donde un cultivo xenico es primeramente adaptado al crecimiento monoxnico, generalmente con un kinetoplstido como organismo aociado, y luego es llevado de un estilo de vida fagoctico a uno donde los nutrientes son obtenidos por pinocitosis. Todo el proceso suele durar meses

Para que cultivamos amebas? Para poder diferenciar E. histolytica, la nica especie del gnero que

causa enfermedad invasiva, de otras especies morfologicamente idnticas (E. dispar) mediante anlisis de isoenzimas y evitar tratamiento innecesario.

Para distintas aplicaciones en investigacin Cmo obtenemos los parsitos?

Muestras de MF Biopsias rectales Abscesos hepticos(en este caso, agregar bacterias para cultivo

xenico. A menos que la muestra provenga de un paciente con disenteria, las

amebas estarn en la forma de QUISTE

El cultivo de Entamoeba histolytica, debe establecerse como un CULTIVO XENICO.

Quienes son los organismos no deseados y como los eliminamos?

Blastocystis hominis (infeccin parasitaria ms comun en el hombre): capaces de crecer en todos los medios usados para cutltivos xenicos de Entamoeba.

Con Acriflavina (tb afecta a las bacterias y por consiguiente a las amebas) Mtodo de Dobell y Laidlaw (1926): Tratamiento con 0.1N HCl a RT 10 min, lavar

con H2Od y re-inocular en el medio de cultivo con bacterias adecuadas. HCl mata bacterias, hongos, B.hominis, trichomonas intestinales y amebas no

enquistadas, permaneciendo viables e intactos los Quistes. Mtodo de Smedley (1956): Pelletear todos los organismos presentes en el

cultivo, lavar con H2Od 15min a RT, volver a centrifugar e inocular medio de cultivo fresco. La mayora de los trofozoitos de Entamoeba sobreviven a este tratamiento, mientras que B. hominis generalmente no. Algunos B. hominis pueden sobrevivir, en ese caso se debe repetir el tratamineto.

Otros organismos como hongos o trichomonas generalmente desaparecen de los cultivos xnicos luego de varios pasajes

Debemos evitar que organismos no deseados crezcan superando a las amebas.

Medio LE o medio de Robinson, ideales para comenzar el cult a partir de una muestra de MF.

TYSGM-9 ms usado para obtener grandes nmeros de amebas a partir de cultivos ya establecidos.

En todos los casos, agregar almidn de arroz (y antibiticos) al medio previo a la inoculacin

INCULO: MF emulsificada en solucin salina Eliminar partculas grandes mediante filtracin o flotacin,

que a su vez concentra los quistes Partculas ms pequeas de MF pueden ser incluidas Es conveniente incluir porciones de MF que parezcan mucosas o

sanguinolientas si estn presenten en la muestra. Cultivar en paralelo con/sin ATB (Peni/strepto o eritromicina) Crecer a 35.5 C por 48 hs. Las amebas se pueden observar adheridas a las paredes de vidrio del tubo o

sobre el medio inclinado en cultivos bifsicos. Si a las 48 hs no se observa crecimiento, se hace un pasaje a ciegas: Se enfria el

tubo en H2O helada 5 min p despegar las amebas del vidrio, se descarta el SN y se inocula medio fresco con el sedimento resuspendido en el lquido remanente (1ml)

Muestra Fecal

Cultivo Xnico

Cultivo Monoxnico

Cultivo Axnico

Adaptacin a una nueva forma de vida

Separar elementos grandes Enriquecer en Quistes de E. histolytica

# Organismos asociados: C. fasciculata, T. cruzi: son crecidos como cultivo stock a RT, y no crecen a la T optima de crecimiento de amebas 8ATB: depende de la flora pte. en el cultivo xenico; x ej. Cocktail de rifampin, amikacin, oxitetraciclina, cefotaxima

Lavado PBS p/ eliminar exceso de bacterias Crecer los Trofozoitos en pcia. de su nuevo microorganismo alimento# y ATB8 Eliminar gradualmente el ATB a medida q n amebas Luego de 2 pasajes sin ATB, se puede considerar el cult libre de bacterias

Cult estable sin bacterias Pasajes en mismo medio, pero sin Critidia: los flagelados van desapareciendo por dilucin e ingesta por las amebas.

Pasajes aprox cada 48-72hs.

Variaciones entre aislamientos y flora pte. impide generalizar el tamao del inculo, la cantidad de arroz o de ATB a utilizar para el crecimiento ptimo.

Inspeccin visual previa al pasaje

El cultivo restante del pasaje se puede guardar a 33 C como 'backup'.

Pasaje: Enfriar el cultivo (xnico o axnico) en baos de hielo p despegar los trofozoitos del vidrio, mezclar por inversin, tomar un inculo y pasar aspticamente a un nuevo tubo con medio fresco.

Incubar a 35.5 C, en forma vertical(c. xenicos) o a 5 de la horizontal (c. axenicos establecidos).

Congelado-descongelado de c. axnicos es muy dificil debido a que E. histolytica es mucho ms sensible que otros tipos celulares

Protocolos disponibles: Diamond, L. S. (1995) "Cryopreservation and storage of

parasitic protozoa in liquid nitrogen. J Euk Microbiol 42(5): 585-590"

Samarawickrema, N. A., et al. (2001) "A rapid-cooling method for cryopreserving Entamoeba histolytica. Ann. Trop. Med. Parasitol. 95(8): 853-855.

http://entamoeba.lshtm.ac.uk/maintain.htm

Dobell y Laidlaw 1926: describen aumento en el nmero de quistes al cultivar sin almidn por algunas generaciones y luego crecidos con almidn. Sin embargo los resultados eran muy aleatorios y poco reproducibles.

A diferencia de otros protozoos parasitos como Giardia y otras amebas que son inducidos a enquistar bajo condiciones definidas in vitro, para E. histolytica no se conocen las seales que gatillan el enquistamiento

Solo se han obtenido in vitro algunas estructuras similares a quistes (CLS) exponiendo trofozoitos axnicos a diversos estmulos: CO2 y Glc mezcla de suero bovino, Glc, tetraborato de Na,vitaminas, PO4, CaCl2, extractos de

higado y pncreas combinacin de cofactores de quitina sintasa (Mg++, Mn++, Co++) H2O2 y cationes divalentes

QUISTE: forma infectante Estudio del enquistamiento es importante para el control de infecciones y como

blanco para el diseo de drogas

1920: Nace en Philadelphia, Pensylvania 1957: TYM, The most widely used medium for the axenic cultivation of trichomonads 1961: First axenic cultivation of Entamoeba histolytica 1964: Cryopreservation and recovery of protozoa from liquid

nitrogen 1968: TPS-1, First monophasic medium for the axenic cultivation

of Entamoeba histolytica 1972: Viruses of Entamoeba histolytica 1978 - TYI-S-33: The most widely used medium for the axenic

cultivation of Entamoeba histolytica 1989: Description of ribosomal DNA plasmids in Entamoeba

histolytica 1993: Redescription of Entamoeba histolytica to distinguish it from E.

dispar

Protozoo flagelado (Diplomonadida)

Ciclo de vida simple: forma replicativa (trofozoto) y forma de resistencia (quiste).

Forma infectante: QUISTE Transmisin por ingestion de

quistes en agua o alimentos contaminados con materia fecal (MF)

Tratamiento: metronidazol (Flagyl)

1960,Karapetyan: Primera vez crecido en un cultivo con Candida guilliermondi y fibroblastos

1962,1970,1976: Cultivos monoxnicos 1979, Bingham y Meyer: cultivo axnico directo a partir del

desenquistamiento inducido por HCl (pH2) 1980,Visvesvara: cultivo axnico de Giardia en medio de

Diamond TP-S-1. Crece mejor en medio filtrado que atoclavado. 1983, Keister: Cultivo en TYI-S-33 modificado con el doble de

contenido de Cys y bilis* Tb se han descripto medios sin suero (Wieder et al. 1983) Medio casero PEHPS modificado (Vargas-Villarreal et al. 2014) Gullin y Diamond (1980):Mtodo p obtencin de clones como

colonias en agar. Medios enquistamiento y desenquistamiento en cultivos axnicos

* Medio ms ampliamente usado para el cultivo de Giardia

Establecimiento de Cultivos Monoxnicos: Aislado a partir de:

FV de biopsia duodenal Q de MF

Medio: TYI-S-33 (modificacin de Keister) con ATB y antifngicos (Anfotericina B, Moxolactama, Ticarcilina, Gentamicina,Penicilina)

Opcional: tratamiento previo de los Q con HCl Cultivo en tubos a 35.5 C en posicin vertical Cambio de medio + ATB diariamente la primer semana, cada 2 das x 2

semanas ms Mantenimiento de Cultivos Monoxnicos: ( E. histolytica, Trichomonas) Pasajes cada 72-96 hs Inculo determinado por inspeccin visual Enquistamiento in vitro: Exposicin a sales biliares Hambreado de colesterol

Trypanosoma cruzi Trypanosoma brucei Leishmania spp.

A) Promastigote de Leishmania spp. pte. en el insecto vector B) Epimastigote de Trypanosoma cruzi pte. en el insecto vector C) Trypomastigote tpica forma sangunea de Trypanosoma spp D) Amastigote: estadio intracelular de T. cruzi y Leishmania spp. N, nucleo; K, kinetoplasto; F, flagelo

cambios en la disponibilidad de nutrientes cambios de temperatura diferentes formas del parsito adaptacin a los distintos habitats

vertebrado insecto

1904: Novy y Mc. Neal medio p T. brucei brucei 1908: Nicolle, modificacin del medio anterior

Medio NNN: agar sangre inclinado, inoculado con materiales infectados Los parsitos crecen en el H2O condensada sobre la sup del agar

1950: Tobie et al. Medio bifsico: Solucin de Locke con Glc sobre agar sangre nutritivo

Buen crecimiento, pero difcil cosechar los parsitos para estudios posteriores En el cultivo, las formas sanguneas se transforman en epimastigotes (insecto) Cultivos prolongadosPrdida de infectividad y/o virulencia

Formulacin de Medios parcialmente definidos Desarrollo de cultivos sobre una feeder layer de cultivo de tejido que

provee nutrientes para el crecimiento de tripanosomas

Medio HX25 sin sangre con hemina

Medio para cultivo de formas sanguneas sobre

feeder layer de fibroblastos

Requiere un agente reductor (BME)y Cistena gran variablidad con distintos sueros tripanosomas salivaria ms difciles de cultivar

Esquema gral para aislar T. cruzi o T. brucei de muestras de sangre o tejido de un hospedador vertebrado.

Protozoo flagelado (Kinetoplastida) Agente causal de la Enfermedad de Chagas Ciclo de vida complejo: 2 hospedadores

Hospedador vertebrado: mamferos inlcuido el hombre (zoonosis) Hospedador invertebrado: insectos vectores triatominos (Triatoma, Rhodnius,

y Panstrongylus)

Distintas formas morfolgica y metablocamente diferentes: tripomastigotas (sanguneos y metacclicos) epmastigotas amastigotas

Transmisin : vectorial (a traves de las heces de la vinchuca: stercoraria) transfusiones, transplantes Transplacentaria o vertical (Chagas congnito) oral (ingesta de alimentos contaminados con heces de vinchuca infectada) accidentes de laboratorio

Tratamiento: Benznidazol, Nifurtimox

Diferencias morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y

metablicas entre los distintos estados

Diferentes requerimientos para el cultivo

Cultivo de epimastigotes (vector): Medios indefinidos Citri y Grossowickz (1955):Medio bifsico con jugo de tomate,

hemoglobina y plasma humano Medio parcialmente definido con hidrolasa de caseina, hemina, BSA,

factores de crecimiento Zeledon (1959): medio basado en infusin cerebro-corazn (BHI), 10%

sangre cordero (medio selectivo p Tc, T.rangeli no crece) Medios semidefinidos y definidos 1977: Modificacin del medio HX25 desarrollado p T. brucei Hendricks et al. (1978) Medio 199, Medio de Grace (p cult de celulas de

insecto) Otros medios definidos desarrollados para el cultivo de Tc conteniendo

catalasa de hgado Sadigursky y Brodskyn (1986), introducen medio sin sangre: LIT: Infusin

hgado, triptosa, glucosa (inicialmente se usaba sin SFB y con RPMI 1640 y M199)

Incorporacin de hemina y SFB Crecimiento a 28C

Cultivo de amastigotes (intracelular): Cultivo sobre tejidos:

Kofoid et al. 1935, infeccin de musculo cardaco embrionario in vitro

Cultivo sobre clulas crecidas en monocapa Vero CHO RAW

Medios libres de clulas: Villalta y Kierszenbaum (1982):purificacin de amas por centrifugacin en gradiente, cultivo en medio Leibovitz L-15 modificado

Crecimiento a 37C (33-38 C) en atmsfera de CO2 2-3 das pi, se observan amastigotes 5-7 das pi, comienzan a salir tripomastigotes

Cultivo de epimastigotes (vector): Medio indefinido Medios semidefinidos y definidos Cultivos sin suero

Cultivo de amastigotes (intracelular): Cultivo en tejido completo Cultivo con clulas Medios libres de clulas

Cultivo de epimastigotes cultivos axnicos en LIT o BHIT suplementar con Hemina y 10% SFB pasajes cada 4-7 das criopreservacin

Cultivo de amastigotes (intracelular) 1. Obtencin de tripomastigotes (forma infectante):

Cultivos envejecidos (metacic. espontnea) Metaciclognesis in vitro: Medios TAU, Grace Tripomastigotes obtenidos de animales o clulas

infectados 2. Infeccin in vitro de clulas en monocapa

Lneas celulares Vero, CHO, RAW

Metaciclognesis in vitro

Obtencin de tripomastigotes (forma infectante) a partir de un cultivo axnico de epimastigotes (forma pte. en el insecto vector)

Cultivos envejecidos (metacic. espontnea) Medios TAU Medio de Grace (p cult de clulas de insecto)

Baker (1987): La metaciclognesis no ocurrir en condiciones que permitan el crecimiento exponencial

Los helmintos son ms difciles de cultivar que los protozoos. La complejidad de los helmintos dificulta obtener el ciclo completo en condiciones artificiales.

Los parsitos intracelulares obligados

(Plasmodium, coccidia) se crecen en presencia de cultivos celulares

Aguilar-Daz H, Daz-Gallardo M, Laclette JP, Carrero JC. (2010). In vitro Induction ofEntamoeba histolytica Cyst-like Structures from Trophozoites. Simon G, ed.PLoS Neglected Tropical Diseases.;4(2):e607. doi:10.1371/journal.pntd.0000607.

Ahmed, N. H. (2014). Cultivation of parasites. Tropical Parasitology, 4(2), 809. http://doi.org/10.4103/2229-5070.138534

Ajoko, C., & Steverding, D. (2015). A cultivation method for growing bloodstream forms of Trypanosoma brucei to higher cell density and for longer time. Parasitology Research, 114(4), 16112. http://doi.org/10.1007/s00436-015-4346-x

Arrowood, M. J. (2002). In vitro cultivation of cryptosporidium species. Clinical Microbiology Reviews, 15(3), 390400. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=118076&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

Breidbach, T., Ngazoa, E., & Steverding, D. (2002). Trypanosoma brucei: in vitro slender-to-stumpy differentiation of culture-adapted, monomorphic bloodstream forms. Experimental Parasitology, 101(4), 22330. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12594963

Clark, C. G., & Diamond, L. S. (2002). Methods for cultivation of luminal parasitic protists of clinical importance. Clinical Microbiology Reviews, 15(3), 32941. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=118080&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

Desai, S. A. (2013). Insights gained from P. falciparum cultivation in modified media. TheScientificWorldJournal, 2013, 363505. http://doi.org/10.1155/2013/363505

Leelayoova, S., Taamasri, P., Rangsin, R., Naaglor, T., Thathaisong, U., & Mungthin, M. (2002). In-vitro cultivation: a sensitive method for detecting Blastocystis hominis. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 96(8), 8037. http://doi.org/10.1179/000349802125002275

Mller, J., & Hemphill, A. (2013). In vitro culture systems for the study of apicomplexan parasites in farm animals. International Journal for Parasitology, 43(2), 11524. http://doi.org/10.1016/j.ijpara.2012.08.004

Schuster, F. L. (2002). Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews, 15(3), 34254. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=118083&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

Schuster, F. L., & Sullivan, J. J. (2002). Cultivation of clinically significant hemoflagellates. Clinical Microbiology Reviews, 15(3), 37489. http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=118086&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

Visvesvara, G. S., & Garcia, L. S. (2002). Culture of protozoan parasites. Clinical Microbiology Reviews, 15(3), 3278. Retrieved from http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=118078&tool=pmcentrez&rendertype=abstract

http://entamoeba.lshtm.ac.uk/index.htm http://www.cdc.gov/parasites/amebiasis/biology.html