sintesis y actividad antimicrobiana de nuevos …

a

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE SAN NICOLÁS DE HIDALGO

FACULTAD DE QUÍMICO FARMACOBIOLOGÍA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE MAESTRÍA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS ÁREA TEMÁTICA EN BIOTECNOLOGÍA ALIMENTARIA

“SÍNTESIS Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE NUEVOS DERIVADOS DE FLUOROQUINOLONA

SUSTITUÍDOS EN LA POSICION 7”

TESIS

QUE PRESENTA:

Q.F.B. YOLANDA VALENCIA BARAJAS

PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS

ASESOR:

D.C. LUIS CHACÓN GARCÍA

MORELIA, MICHOACÁN, SEPTIEMBRE DE 2010

U.M.S.N.H Síntesis y actividad antimicrobiana de nuevos derivados de fluoroquinolonas

Facultad de Químico Farmacobiología

El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Diseño Molecular del Instituto de

Investigaciones Químico-Biológicas bajo la asesoría del Dr. Luis Chacón García. Se contó con

apoyo económico CONACYT 47907 CIC-UMSNH 2.18.

Asimismo, la QFB Yolanda Valencia Barajas contó con beca de maestría otorgada por

CONACYT.

Las pruebas de actividad biológica se realizaron en el laboratorio del Centro

Multidisciplinario de Estudios en Biotecnología de la Universidad Michoacana de San Nicolás

de Hidalgo, con el apoyo de la Dra. Alejandra Ochoa Zarzosa.

U.M.S.N.H Síntesis y actividad antimicrobiana de nuevos derivados de fluoroquinolonas

Facultad de Químico Farmacobiología

Parte de este trabajo se presentó en los siguientes congresos:

“Síntesis de nuevos derivados de Fluoroquinolona”. Quinta reunión de la Academia Mexicana

de Química Orgánica. Zacatecas, Zac. Mayo de 2009.

“Síntesis y actividad antimicrobiana de nuevos derivados de Fluoroquinolona”. Cuarto

Congreso Estatal de Ciencia y Tecnología, celebrado durante los días 12 y 13 de noviembre de

2009.

“Síntesis y actividad antimicrobiana de nuevos derivados de Fluoroquinolona”. Primer Foro

Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad

Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, realizado en la ciudad de Uruapan, Mich. en

noviembre de 2009.

U.M.S.N.H Dedicatoria

Facultad de Químico Farmacobiología Yolanda Valencia Barajas

Dedicatoria

A mis padres: Hoy en este día en el que culmino un nuevo ciclo de mi vida, en el cual hago una pausa en

mí caminar, sólo para agradecer a las dos personas más importantes en mi vida, a las que

debo en todo momento amar y agradecer por existir y permitirme encontrarme en esta nueva

etapa de crecimiento profesional, pero sobre todo impulsarme en todo momento así como

ayudarme a sostenerme y levantarme de cada tropiezo a través de su amor y apoyo

incondicional, quienes sin escatimar esfuerzo alguno sacrificaron gran parte de su vida para

verme convertido en una persona de provecho y quienes siempre me recordaron que el señor

es la guía, y con los que siempre podré contar, mis padres Gudelia Barajas Castañeda y José

Valencia Echeverría. Quienes me guiarón por el buen camino sabiendo ser duros cuando se

requería, complacientes cuando lo merecía y amorosos a lo largo de toda mi vida, y a quienes

nunca podré pagarles ni con todas las riquezas más grandes del mundo; ante todo esto solo

me queda decir por siempre y por todo gracias…mamá y papá.

¡Que Dios los bendiga!

A mis hermanos: De los seres que aprendo cada día, con quienes he compartido la dicha que ofrece nuestro

hogar y familia, quienes han sido mis amigos y confidentes, y de quienes recibo siempre su

cariño y apoyo incondicional Alicia, Gudelia, J. Manuel, Noé y Juan Diego Valencia Barajas.

A mis Tíos: Isaac, Eduardo, Leodelí, Pedro y Aurora por su amistad, cariño y apoyo que siempre me

brindan y quienes me han acompañado en cada una de las diferentes etapas de mi vida.

¡Gracias!

A mi esposo y mi hijo: Joel Ayala Sistos y Alexander Ayala Valencia ya que con su cariño, así como comprensión

han motivado y alegrado mi vida, por ser las personas que me transmiten su alegría y con

quienes he encontrado la felicidad. ¡Gracias mis dos amores!

U.M.S.N.H Agradecimientos


Agradecimientos

A mi asesor de tesis: Dr. Luis Chacón García, por brindarme la oportunidad de la realización

de este proyecto, por su asesoría, paciencia, confianza, amistad, dedicación, apoyo moral y

académico ante mí, durante la estancia de la maestría. Gracias y mi más sincero afecto y respeto

hacia usted.

A mis maestros: Dra. Alejandra Ochoa Zarzosa, Dr. Joel Edmundo López, Dra. Judit Aviña,

Dra. Claudia Contreras, M.C. Rocío Lara, Prof. Emiliano Pérez y Prof. Salvador Martínez

quienes respetando su trabajo me hicieron participe de su sabiduría y que no sólo me

transfirieron el conocimiento, sino me proporcionaron las herramientas necesarias para la toma

de las mejores decisiones en el campo laboral al cual pretendo incorporarme. A demás de que de

ellos a prendí la importancia, conocimiento y compañía que dan los libros los cuales abrieron mi

mente y mejoraron mis expectativas, pero más que nada los valores y éticas que me infundieron,

tanto profesional como personalmente.

A todos mis amigos: con los cuales he crecido y descubierto el mundo, los que me han dejado

escoger como a otra parte de mi familia, que también comparten mis triunfos y descalabros, los

cuales son un apoyo más; compañeros de vida, con los cuales me han dado la oportunidad de

afianzar el verdadero valor de la amistad gracias a todos mis compañeros de laboratorio y a

Marbella, René, Alfredo, Lucy, Selene y Alejandra.

Al personal por la ayuda técnica de datos espectroscópicos: Concepción Armenta y José Luis

Salvador, gracias por su apoyo para la caracterización de este trabajo ya que sin ustedes no

hubiera sido posible su realización.

Al Instituto de Investigaciones Químico Biológicas ya la Facultad de Químico-

Farmacobiología: por la oportunidad que me brindo para llevar acabo mis estudios de postgrado

y con ello mi superación personal.

Al CONACYT: por su apoyo económico para la realización de este proyecto de investigación,

el cual no hubiera sido posible sin su valiosa cooperación.



Pero ante todo agradezca a Dios que me ha dado la vida y permitido culminar con esta etapa de

mi vida, que no es sólo sino el abrir a la puerta de un comienzo a una nueva etapa de vida, en la

cual no seré uno más, por que comprometido con la innovación, la actualización y la

competitividad, lograré cada día con el cumplimiento de las nuevas metas planteadas.



D.C. Alejandra Ochoa Zarzosa

D.C. Judit Aviña Verduzco

M.C. María del Carmen Ramírez Medel

D.C. Carlos Cortés Penagos

Por aceptar ser mis sinodales y por sus valiosas aportaciones en el

Trabajo experimental y escrito.

U.M.S.N.H Índice General

Facultad de Químico Farmacobiología I

ÍNDICE GENERAL

CONTENIDO Página

ÍNDICE DE FIGURAS III LISTA DE COMPUESTOS VII ÍNDICE DE TABLAS IX ABREVIATURAS X

I. RESUMEN -1

II. INTRODUCCIÓN 2

III. ANTECEDENTES 6 3.1. Historia de las quinolonas 6

3.2. Mecanismo de acción de las quinolonas antibacterianas 9 3.3. Relación estructura-actividad de las quinolonas ---12 3.4. Aminoácidos -15 IV. HIPÓTESIS 17

V. OBJETIVOS 17

5.1. Objetivo general 17 5.2. Objetivos específicos -18

VI. MATERIAL Y MÉTODOS 20

6.1. Procedimiento general para la síntesis de los precursores sustituidos en la posición 7 de la fluoroquinolona 20

- 6.2. Síntesis de compuestos derivados de amina sustituida en el carboxilo en posición 3 de la quinolona 21

6.2.1. Esterificación de la quinolona 21

U.M.S.N.H Índice General

Facultad de Químico Farmacobiología II

6.3.- Síntesis de compuestos derivados de aminoácidos sustituidos en la posición 7-(N´-

piperacinil) del ciprofloxacino. - 22

6.3.1. N-Protección de los aminoácidos --- 22

6.3.2. Reacción de N-acilación de ciprofloxacino con -aminoácidos protegidos 22

6.3.3. N-Desprotección de las nuevas fluoroquinolonas; CbzHN-aa-Cpx- - 23

6.4. Prueba de Difusión con Disco -- 24

6.5. Evaluación de la concentración mínima inhibitoria de los nuevos análogos

de fluoroquinolonas sobre cepas de Escherichia coli, y Staphylococcus - 25

aureus VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 26 7.1. Obtención y caracterización de los nuevos compuestos derivados de fluoroquinolonas -26 7.2. Actividad antibacteriana -34 7.2.1. Actividad antimicrobiana de los N-aminoalquil fluoroquinolonas - 34 VIII. CONCLUSIONES - 45 IX. REFERENCIAS 46 - - X. ANEXOS -52

U.M.S.N.H Índice de Figuras

Facultad de Químico Farmacobiología III

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura básica de las quinolonas (X = C o N). 2

Figura 2. Estructura del Ciprofloxacino 1. 3

Figura 3. Aminoalquil fluoroquinolonas sustituidas en la posición 3 y 7. 4

Figura 4. Aminoacil fluoroquinolonas N-carboxibenciladas sustituidas en el nitrógeno

dista de la piperazina en posición 7. 4

Figura 5. N-Aminoacil fluoroquinolonas sustituidas en el nitrógeno distal de la piperazina

en posición 7. 5

Figura 6. Estructura del 1-etil-7-cloro-3-carboxiquinolona (26) subproducto que permitió

obtener el ácido nalidíxico (27). 6

Figura 7. Estructura de las quinolonas de la primera generación. 7

Figura 8. Cronología de la aparición de las principales quinolonas. 8

Figura 9. Modelo propuesto de la interacción de las quinolonas consigo mismas y con el

sitio de unión (ADN).- 11

Figura 10. Relación estructura-actividad de la molécula de quinolona. 12

Figura 11. Aminoalquil fluoroquinolonas sustituidas en posición 3 y 7. 18

Figura 12. Aminoacil fluoroquinolonas sustituidas en posición 7 con aa. 18

Figura 13. Aminoalquil fluoroquinolonas. 21

Figura 14. Carbamatos de los diferentes aminoácidos elegidos. 22


Facultad de Químico Farmacobiología IV

Figura 15. Aminoacil fluoroquinolonas N-carboxibenciladas sustituidas en el nitrógeno 23

dista de la piperazina en posición 7

Figura 16. N-Aminoacil fluoroquinolonas sustituidas en el nitrógeno distal de la

piperazina en posición 7. 23

Figura 17. Estructura de los compuestos sustituidos en C-7 (1-3) y sus

análogos sustituidos en C-3 (4-6). 27

Figura 18. Espectros de RMN 1H. Hemiacetal de la FQ sustituida en posición 7(Comp 2). 28

Figura 19. Espectro de RMN 1H del Ciprofloxacino. 29

Figura 20. -aminoácidos N-protegidos. 30

Figura 21. Compuestos derivados de aa-protegidos sustituidos en la posición 7 de la FQ. 31

Figura 22. Espectro de RMNH1 del aminoácido protegido y de su producto

de reacción con la FQ. 32

Figura 23. Espectro de RMNH1 del aminoácido protegido y de su producto

de reacción con la FQ. 32

Figura 24. Espectro de RMNH1 del compuesto 17; Cpx-Ala. 33

Figura 25. Actividad antimicrobiana del Ciprofloxacino, Compuestos sustituidos en C-7

y C-3 frente a S. aureus (A) y E. coli (B) en ensayos de difusión radial. 35

Figura 26. Actividad antibacteriana de nuevos análogos de FQ en posición 7

frente a S.aureus. 36

A


Facultad de Químico Farmacobiología V

Figura 27. Actividad antibacteriana frente a E. coli. Control: Cpx, Compuestos 2 y 4

FQ sustituidas en C 7 y Compuestos 6 y 7 FQ sustituidas en C 3. 36

Figura 28 . N- aminoacil fluoroquinolonas. 38

Figura. 29. Aminoacil fluoroquinolonas. 39

Figura 30. Actividad antimicrobiana de análogos de FQ frente a E.coli. 40

Figura 31. Actividad antimicrobiana de análogos de FQ frente a S.aureus. 42

Figura 32. Actividad antimicrobiana en pruebas de dilución en tubo frente a S.aureus

y E.coli en μmol/mL. 43


y E.coli en μg/mL. 44

Figura 34. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en DMSO de 42. 53


Figura 36. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en CDCl3 de 2. 54

Figura 37. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en CDCl3 de 3. 54





Facultad de Químico Farmacobiología VI

Figura 41. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en DMSO de CDCl3. 56


U.M.S.N.H Índice de Compuestos

Facultad de Químico Farmacobiología VII

LISTA DE COMPUESTOS

U.M.S.N.H Índice de Compuestos

Facultad de Químico Farmacobiología VIII

N

O

OH

OF

NN

O

HN

N

O

OH

OF

NNH2N

O

N

O

OH

OF

NN

OH2N

OH

N

O

OH

OF

NN

OH2N

N

O

OH

OF

NN

OH2N

N

O

OH

OF

NNH2NO N

O

OH

OF

NN

OH2N

HN

N

O

OH

OF

NNH2NO

N

O

OH

OF

NNH2NO

H3C

HH

H

H

CH3

H

OHO

HH

NH2

17

1819

20 21 22

23 24 25

N

OH

OO

CH2CH3

F

Cl

26

N N

OH

OO

N

OH

O

O

O

C2H5

NN

OH

O

O

O

C2H5

N

OH

O

O

O

OCH3

N

N N

OH

O

N

O

C2H5

N

N N

OH

O

N

O

C2H5HN

27 28 29

3031 32

OH

OHNO

O

33

N

O

OH

OF

NN

OHN

OH

O

O H

16

OHHN

OO

O

OH

OHN

HN

O

O

OHHN

OO

O

OH

ON

OH

OHN

OH

O

O OH

OHNO

O

OHHN

OO

OH3C H H

O

O

H

OHO

H

HH

34 3637

35

4038 41

OH

HN

OO

O

NH2

H

39

U.M.S.N.H Índice de Tablas

Facultad de Químico Farmacobiología IX

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Concentración mínima inhibitoria de los compuestos 1-7. 37

Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria de los compuestos 1-24. 40

U.M.S.N.H Abreviaturas

Facultad de Químico Farmacobiología X

ABREVIATURAS

aa

Ala

ADN

Desplazamiento químico

Aminoácido

Alanina

Ácido desoxirribonucleico

ATP Adenosin trifosfato

Asp

Cbz

Asparagina

Benciloxicarbonilo

CbzCl Cloroformiato de bencilo

DMSO Dimetilsulfóxido

E. coli Escherichia coli

Fen Fenilalanina

Fig. Figura

Gli Glicina

hr Hora

Lis Lisina

mg Miligramo

CMI Concentración mínima inhibitoria

min Minuto

ml Mililitro

mm Milímetro

g Microgramo

l Microlitro

m Micromol

NCCLS National Comittee for Clinical Laboratory Standars

ppm Partes por millón

Pro

RMN de 1H

Prolina

Resonancia Magnética Nuclear de Hidrógeno

S. aureus Staphylococcus aureus

U.M.S.N.H Abreviaturas

Facultad de Químico Farmacobiología XI

Try

Tyr

Triptófano

Tirosina

U.M.S.N.H Resumen

Facultad de Químico Farmacobiología 1

I. RESUMEN

Las fluoroquinolonas son agentes antimicrobianos de amplio espectro que se han

convertido en fármacos de primera elección para varias enfermedades infecciosas (Hooper

2003). Por ello en la actualidad las quinolonas (ciprofloxacino, levofloxacino, ofloxacino, étc.)

se encuentran dentro de los agentes antimicrobianos más utilizados. De acuerdo a los estudios

realizados sobre su estructura, se ha observado que la naturaleza del sustituyente en posición 7

afecta significativamente su preferencia hacia la ADN girasa o ADN topoisomerasa IV; y por

lo mismo, esta parte de la molécula ha sido la más sometida a cambios estructurales. En la

búsqueda de compuestos potencialmente citotóxicos que presenten actividad frente a la

enzima topoisomerasa, en el presente trabajo se obtuvo una serie de N-aminoalquil

fluoroquinolonas y N-aminoacil fluoroquinolonas, a partir de una sustitución en el carbono de

la posición 7 de la molécula, los análogos pueden ser usados como precursores de nuevos

compuestos de interés. A los nuevos compuestos se les evaluó su actividad antimicrobiana

frente a cepas Escherichia coli y Staphylococcus aureus mediante el método de Kirby-Bauer y

pruebas de dilución en tubo. Los resultados de actividad antimicrobiana frente a ambas cepas

de dos N-aminoalquil fluoroquinolonas sustituidas en la posición 7, muestran que a altas

concentraciones los compuestos inhiben el crecimiento bacteriano de manera similar al

ciprofloxacino. Sin embargo, al sustituir en la posición 3 se pierde completamente la actividad.

Por otro lado se obtuvieron N-aminoacil fluoroquinolonas que presentaron mayor actividad

antimicrobiana que el compuesto de referencia.

U.M.S.N.H Introducción


II. INTRODUCCIÓN

Las quinolonas por ser agentes antimicrobianos de origen completamente sintético, no

son modeladas a partir de ningún antibiótico natural. El término quinolona se ha establecido

para nombrar estructuras bicíclicas heteroatómicas, constituidas por un núcleo piridona-

funcionalizada con un ácido carboxílico y fusionada a un anillo aromático. Las diferentes

posiciones de las quinolonas se numeran partiendo del heteroátomo de nitrógeno como se

indica en la figura 1(Mella et al. 2000).

Figura 1. Estructura básica de las quinolonas (X = C o N).

Dependiendo de la incorporación de átomos de nitrógeno en el núcleo básico de las

quinolonas, estas se clasifican en cuatro grupos diferentes:

1.- Naftiridinas: contienen un átomo de nitrógeno en las posiciones 1 y 8.

2.- Cinolinas: presentan un átomo de nitrógeno en las posiciones 1 y 2.

3.- Quinolinas: se caracterizan por contener un único átomo de

Nitrógeno en la posición 1.

4.- Piridopirimidonas: presentan nitrógenos en las posiciones 1,6 y 8.

De estas subfamilias, solo las 4-quinolinas y las 4-naftiridinas han sido llevadas a la

clínica, aunque la más utilizada en la síntesis de nuevos análogos es la 4-quinolina por dar

lugar a derivados con actividad notable (Gutierrez, Zufiaurre, 2004). La estructura básica o

farmacóforo de estos compuestos, que ha sido sometida a más variaciones en sus

sustituyentes, está constituído por un anillo piridona con un carboxilato en posición 3, el



núcleo central de la molécula es el anillo 4-oxo-1,4-dihidroquinoleina. (Wolfson y Hooper,

1989).

Actualmente las quinolonas son de los agentes antimicrobianos más utilizados, entre

los que destacan el ciprofloxacino, levofloxacino y ofloxacino. El ciprofloxacino (fig. 2) ha

sido muy utilizado en la clínica terapéutica por presentar mayor espectro de actividad, con

microorganismos Gram positivos y con una gran actividad sobre Gram negativos (Muytjens,

1983).

Figura 2. Estructura del Ciprofloxacino 1.

De acuerdo a los estudios realizados sobre su estructura, se ha observado que la

naturaleza del sustituyente en la posición 7 afecta significativamente la preferencia de las

fluoroquinolonas por su blanco de acción molecular (ADN girasa o ADN topoisomerasa IV);

por lo cual, esta parte de la molécula ha sido la más sometida a variaciones.

En el presente trabajo se presentan nuevos derivados de fluoroquinolona, a partir de

sustituciones en las posiciones 3 o 7 de la molécula y evaluarlos frente a cepas de S. aureus y

E. coli. La primera serie de compuestos que se describe la constituyen las aminoalquil

fluoroquinolonas (fig. 3).

El segundo grupo de compuestos que se expone, lo integran análogos de

fluoroquinolona sustituidos en la posición 7 con aminoácidos previamente protegidos. Aunque

no es el objetivo obtener las aminoacil fluoroquinolonas N-carboxibenciladas (fig.4) se

consideró importante explorarlas para ver su efecto respecto a las fluoroquinolonas

desprotegidas.

N

OH

OOF

NHN1

2

345

6

7

8

1



Figura 3. Aminoalquil fluoroquinolonas sustituidas en la posición 3 y 7.

Figura 4. Aminoacil fluoroquinolonas N-carboxibenciladas sustituidas en el nitrógeno

dista de la piperazina en posición 7.

La liberación del Cbz y desprotección de los aminoácidos de los compuestos

previos, dio origen a las N-aminoacil fluoroquinolonas (fig.5). Los compuestos obtenidos

enriquecen el panel de fluoroquinolonas con potencial uso terapéutico.




piperazina en posición 7.

U.M.S.N.H Antecedentes


III. ANTECEDENTES

3.1. HISTORIA DE LAS QUINOLONAS

Desde la antigüedad el hombre ha tenido interés por descubrir las causas que generan

una enfermedad y el modo de combatirla. Esta búsqueda ha permitido obtener antibióticos

como la penicilina, descubierta por Fleming, o el ácido nalidíxico por Lesher en 1962.

En el año 1960, Barton obtuvo 80 compuestos quinolónicos, uno de las cuales fue

aislado durante la síntesis del antimalárico cloroquina, el cual demostró tener actividad

antimicrobiana (Barton 1960). Posteriormente al realizar una modificación a este compuesto

26 (fig. 5) permitió la síntesis del ácido nalidíxico (27) primer quinolona introducida en la

clínica en 1967 en el tratamiento de las infecciones urinarias causadas por enterobacterias.

Figura 6. Estructura del 1-etil-7-cloro-3-carboxiquinolona (26) subproducto

que permitió obtener el ácido nalidíxico (27).

La aparición del ácido nalidíxico que presentó una modesta actividad frente a

microorganismos Gram negativos, marcó el inicio del desarrollo de las quinolonas como

agentes antibacterianos. No fue hasta mediados de los años 70, cuando aparecen nuevos

compuestos como; el cinoxacino, miloxacino, ácido piromídico, ácido oxolónico y

pipemídico, que junto con el ácido nalidíxico conformaron la primera generación de

quinolonas (figura 7).



Figura 7. Estructura de las quinolonas de la primera generación.

Las modificaciones estructurales en la molécula de la quinolona, particularmente la

introducción de fluor en la posición 6, dieron como resultado las quinolonas de segunda,

tercera y cuarta generación, mejor conocidas en la literatura farmaceútica como

fluoroquinolonas, ampliando con ello su espectro de acción contra los microorganismos Gram

positivos (Emmerson et al 2003., Rohlfing et al 1976). La primera de ellas, el norfloxacino,

fue descrita en 1973. Este compuesto resultó ser más activó que sus predecesores, pero por su

mala absorción oral y por lo tanto bajos niveles de concentración en plasma después de su

administración, su uso está limitado a infecciones de las vías urinarias.

La introducción de nuevos radicales en la quinolona dió lugar al pefloxacino,

enoxacino, lomefloxacino, fleroxacino, ciprofloxacino y ofloxacino de manera simultánea.

Estas nuevas fluoroquinolonas presentaron un mayor espectro de actividad (ampliado a

organismos Gram positivos y con una gran actividad sobre Gram negativos). El ciprofloxacino

y el ofloxacino presentaron mayor biodisponibilidad que sus predecesoras promoviendo su uso

para el tratamiento de infecciones sistémicas, además de las infecciones urinarias.

La tercera generación de quinolonas incluye compuestos con mayor complejidad

estructural con respecto a las generaciones anteriores. Estos presentan mayor espectro de

N N

OH

OO

N

OH

O

O

O

C2H5

NN

OH

O

O

O

C2H5

N

OH

O

O

O

OCH3

N

N N

OH

O

N

O

C2H5

N

N N

OH

O

N

O

C2H5HN

Ácido nalídixico Ácido oxolínico Cinoxacino

Miloxacino Ácido piromídico Ácido pipemídico

27 28 29

30 31 32



acción frente a Gram positivos, por ejemplo Streptococcus pneumoniae (Piddock 1994) así

como patógenos anaerobios (Appelbaum 1999) y atípicos (Jacobs 1999). En este grupo se

encuentran derivados como: esparfloxacino, temafloxacino, y tosufloxacino; además del

grepafloxacino, moxifloxacino y levofloxacino.

Por otra parte, las quinolonas de cuarta generación al igual que las de tercera incluyen

compuestos que actúan frente a Gram positivos, Gram negativos y atípicos. Sin embargo, las

quinolonas de cuarta generación son más potentes y actúan frente a un mayor número de

patógenos anaerobios (Appelbaum 1999). A Este grupo pertenecen el: clinafloxacino,

gatifloxacino, moxifloxacino, trovafloxacino, sitafloxacino y gemifloxacino.

En la figura 8 se esquematiza a de manera general la evolución generacional de las

fluoroquinolonas.

Figura 8. Cronología de la aparición de las principales Quinolonas.

El desarrollo de las quinolonas se ha visto favorecido, no solo por la posibilidad de

modificar su estructura básica, sino también por la posibilidad de cambiar sustituyentes en

todas las posiciones de la molécula, excepto la posición 3 que presenta el carboxilato y el

carbonilo de la posición 4. Así, la actividad antibacteriana de la molécula de quinolona

depende no solo de mantener el núcleo intacto, sino también de la naturaleza de los radicales

periféricos que conforman la molécula así como también de su relación espacial como es el

19701960 1980 1990 2000-2008 Futuro

Flumequino Ac. pipemídico Ac. oxolínico

Ciprofloxacino Ofloxacino

GrepafloxacinoLevofloxacino Gatifloxacino

Gemifloxacino Garenoxacino

Moléculas Hibridas

NadifloxacinoNuevas Fluoroquinolonas

Ac. Nalidíxico Norfloxacino Temafloxacino



caso del levofloxacino, que es el enantiómero puro, mas activo que el ofloxacino que es la

mezcla racémica del mismo compuesto.

Cabe destacar, que no todos los compuestos sintetizados y activos han llegado a usarse

en la práctica terapeútica. A muchos de ellos se les suspendieron sus ensayos clínicos y otros

fueron retirados del mercado debido a problemas de toxicidad y/o efectos adversos, como

fueron los casos del gemifloxacino, clinafloxacino, trovafloxacino o grepafloxacino

(Rubinstein 2001).

De igual manera, algunas fluoroquinolonas han sido atractivas terapeúticamente para

infecciones poco convencionales como es el caso del moxifloxacino que recientemente se ha

considerado un buen candidato para el tratamiento de la úlcera de Buruli producida por

Mycobacterium ulcerans y para la cual se cuenta en la actualidad con un tratamiento costoso y

poco eficiente de rifampicina y estreptomicina combinadas. Cabe mencionar que, para la

Organización Mundial de la Salud, la úlcera de Buruli es considerada como una de las 14

enfermedades tropicales desatendidas (neglected tropical diseases) y que representan un

problema pues se dan principalmente en condiciones de pobreza y conllevan discapacidades

funcionales, lo que genera costo laboral y menor posibilidad de pagar el tratamiento, lo cual da

lugar a un círculo vicioso. Es importante mencionar el ejemplo pues algunas regiones de

México, sobre todo las de mayor pobreza entran en este esquema por lo que hay una urgencia

por encontrar soluciones a problemas locales del mismo tipo que la úlcera de Buruli (Bechtle

2010).

3.2. MECANISMO DE ACCIÓN DE LAS QUINOLONAS ANTIBACTERIANAS

Las quinolonas ejercen su acción antibacteriana tras penetrar en el citoplasma

bacteriano mediante un mecanismo de difusión pasiva a través de los canales acuosos

transmembranales de las porinas o de la capa de los lipopolisacáridos. Una vez dentro de la

célula, actúan por mecanismos que son complejos y aunque bastante estudiados no del todo

conocidos (Taléns 2001).



El blanco de acción de las quinolonas son dos topoisomerasas bacterianas tipo II: ADN

girasa y topoisomerasa IV. Estas enzimas son responsables de resolver problemas topológicos

en el ADN. Las quinolonas ejercen su efecto antibacteriano inhibiendo la actividad de la ADN

girasa en bacterias Gram negativas y la topoisomerasa IV en Gram positivas (Barmard y

Maxwel 2003, Holden 2001).

La DNA girasa es una enzima tetramérica compuesta de dos subunidades A y dos

subunidades B, codificadas por los genes gyrA y gyrB respectivamente. La principal función

de esta enzima es catalizar el superenrollamiento negativo del ADN (Bates y Maxwell 2005);

es una enzima singular entre todas las topoisomerasas que se caracterizan por relajar el ADN,

siendo la única capaz de superenrollarlo, actividad exclusiva de células procariotas; aún en

organismos más evolucionados no se ha detectado una enzima capaz de llevar a cabo la

función de la girasa (Kampranis y Maxwell 1998, Holden 2001).

La topoisomerasa IV es una enzima tetramérica de secuencia muy similar a la ADN

girasa, la cual está codificada por los genes parC y parE . La topoisomerasa IV es capaz de

relajar el ADN, pero no superenrollarlo, además de mostrar potente actividad decatenadora

(Ruiz 2003, Bates y Maxwell 2005).

Las quinolonas ejercen su efecto antibacteriano involucrándose en el complejo ADN-

Topoisomerasa formando un complejo ternario Quinolona-ADN-Topoisomerasa el cual se

vuelve tóxico para la célula y provoca la muerte celular (Wilson y Gisvold 1998, Elsea et al

1992). Sin embargo, los detalles moleculares de cómo la quinolonas interfieren con la acción

de la topoisomerasa o con el complejo de ADN-Topoisomerasa no están completamente claro.

(Tuma et al. 2002, Kampranis et al 1998, Siegmund 2005).

Shen y colaboradores (1989) han propuesto que la inhibición de la ADN girasa se debe

a la unión cooperativa entre la quinolona y el ADN, modelo proveniente de estudios realizados

con el norfloxaciono donde se sugiere que en presencia de ATP, en el momento en que el

ADN se encuentra roto por la enzima, cuatro moléculas de quinolona se unen a cuatro bases

desapareadas (ADN de una sola hebra) que forman un hueco mediante puentes de hidrógeno



entre las bases y el grupo carbonilo de C-4 y el ácido carboxilíco de C-3. Las moléculas de

quinolona se unen además entre sí cooperativamente; probablemente mediante interacciones

hidrofóbicas cola con cola entre los grupos del N-1 y apilamientos entre sus anillos

aromáticos. Este modelo plantea que la enzima induce un sitio de unión específico para

quinolonas en su sustrato, el material genético (fig. 9).

Figura 9.-Modelo propuesto de la interacción de las quinolonas consigo mismas y con

el sitio de unión (ADN).

Esta propuesta implica cuatro moléculas de quinolona en cada sitio de unión; trabajos

posteriores sugieren que dos moléculas pueden ser suficientes, pero el fundamento del modelo

no se ve alterado. En ambos casos las moléculas de quinolona tienen sus grupos polares

expuestos hacia fuera interactuando con las bases del ADN y la región interna no polar

estabiliza el complejo por asociaciones lipofílicas (Mitscher 2005). El modelo de Shen no

toma en cuenta el hecho de que se requiere Mg2+ para la interacción ADN-quinolona. Ha sido

demostrado que el Mg2+ se une a las quinolonas mediante los grupos carbonilo y carboxilato

C-3 y C-4. Se ha propuesto que las quinolonas se unen a los grupos fosfodiéster de la columna

de ADN mediante una coordinación electrostática entre éstos, el Mg 2+ y los grupos C-3 y C-4

N

N

O

NO

H

H

N

N

O

NOOPHO

HO

O H

H

O

NN

N

N N

O

H

H

HO

NN

N

N NO

H

H

O

O

O

O

O

PO

HO

PO

HO

PO

HO

N

N

ON

O

H

H

N

N

O N O O P OHOH

O

HH

O

NN

N

NN

O

H

H

OH

NN

N

NN

O

H

H

O

O

O

O

O

PO

OH

POOH

PO

OH

NO

OHO

F N

NH

N O

HOO

FN

HN

N O

HOO

FN

HN

NO

OHO

F N

NH



del fármaco y que esta coordinación puede ser estabilizada por la interacción entre las bases y

la quinolona (Noble et al. 2003).

Otra modificación que se ha hecho al modelo de Shen es incluir interacciones

electrostáticas entre el sustituyente del C-7 de la quinolona y la subunidad B de la girasa

(Turel 2002).

3.3. RELACIÓN ESTRUCTURA-ACTIVIDAD DE LAS QUINOLONAS

A partir de la extensa búsqueda en la síntesis de nuevas quinolonas, se han logrado

definir las características que pueden aportar diversos sustituyentes alrededor de la región

farmacófora. Este estudio detallado de la relación estructura-actividad ha permitido asociar

cada posición de la fluoroquinolona con su actividad específica, optimizando sus propiedades

antimicrobianas y reduciendo resistencia y toxicidad (Hooper, 1998). En la figura 10 se

muestra la actividad que presentan cada uno de los diferentes radicales de la quinolona.

Figura 10. Relación estructura-actividad de la molécula de quinolona.

Posición 1. En esta posición resulta indispensable un nitrógeno que puede presentar

distintos sustituyentes. Los primeros compuestos (Ácido Nalidíxico, Norfloxacina, Enoxacina)

presentaban etilo en esta posición pero se observó que al sustituir un grupo apolar más

Aumento Actividad. Penetración celular

Unión a la

Topoisomerasa

Radical próximo al sitio de unión del

ADN

Actividad

frente a Gram Positivos

N

OCOOH

R2

R1R8R7

R6

R5R4

Unión a las Topoisomerasas y espectro de acción

Modifica la farmacocinética

Unión de la molécula al ADN



voluminoso la actividad aumentó. El sustituyente ciclopropilo está presente en numerosas

fluoroquinolonas dado que confiere excelente potencia. En el caso de Levofloxacina y

Ofloxacina, un tercer anillo une el nitrógeno 1 y carbono 8 y le dá mayor actividad frente a

Gram positivos (Mtscher 2005).

Posición 2. No se sabe mucho de la relación estructura-actividad de los sustituyentes

en esta posición C-3 (Chu 1990). Se han realizado pocas modificaciones, con poco éxito, en

esta posición sobre todo por la cercanía a los grupos carboxilo y ceto presentes en C-3 y C-4

que son fundamentales para la unión a topoisomerasas bacterianas. De manera que el

sustituyente comúnmente encontrado en está posición es el hidrógeno (Mitscher 2005).

Posición 3 y 4. En estas posiciones se localiza el grupo carboxilo y el grupo ceto que

no pueden ser modificados por ser esenciales para la actividad antimicrobiana de la molécula

(Fernández 2004). Ambas posiciones de la molécula son parte fundamental en la formación

del complejo Quinolona-Enzima-ADN. Su función es la de unirse al ADN, posiblemente

forman algún puente de hidrogeno (Mitscher 2005, Peterson 2001) o deben estar coplanares

para acoplarse con Mg +2 y reconocer al ADN de modo que fijan el complejo e inhiben la

girasa o topoisomerasa IV (García et al. 2002).

Posición 5. Los sustituyentes en esta posición deben de ser pequeños y en algunos

casos al ser polares incrementan la actividad antibacteriana. Se han introducido sustituyentes

como; N, COH, CNH2, CNH(CH3)2, CNHAc, CCH3, CEt, CCl y CF. Los halógenos

sustituidos en esta posición contribuyen significativamente a la fototoxicidad (Mistcher 2005).

La mayoría de las quinolonas presentan un hidrogeno en esta posición y aunque un grupo

amino (esparfloxacino), o un grupo hidroxilo o metilo (grepafloxacino) incrementan la

actividad frente a Gram-positivos (Peterson 2001, Gutiérrez 2004, Anderson 2003), ambas

quinolonas están asociadas a efectos adversos por los sustituyentes que presentan en esta

posición (Higgins 2003).

Posición 6. La adición de un átomo de flúor en esta posición mejoró la actividad de las

quinolonas predecesoras y dio lugar a lo que conocemos como fluoroquinolonas. Se cree que



el átomo de flúor aumenta la actividad de estas moléculas porque facilita su penetración a

través de la membrana bacteriana, más que por modificar la interacción con la enzima

(Roychoudhury et al.2002). Otros sustituyentes que han sido estudiados en esta posición con

resultados poco satisfactorios son: Cl, Br, CN, NO2, CH3 y NH2 (Mitscher 2005).

Posición 7. Ha sido la posición más versátil a sustituciones y por lo tanto una gran

cantidad de análogos han sido preparados empleando diferentes sustituyentes en esta posición.

Una conclusión interesante, despues de obtener una gran variedad de análogos, fue que un

sistema cíclico que contenga dos o tres grupos amino secundario o terciario favorece la

actividad significativamente. Asimismo, la naturaleza del sustituyente en esta posición afecta

considerablemente la preferencia de las quinolonas por su blanco de acción (ADN girasa o

Topoisomerasa IV) por ser responsable de la unión de la quinolona a la enzima. También está

relacionado con cambios de la actividad y espectro de acción, y de algunos parámetros

farmacocinéticos como la vida media o la solubilidad de la molécula. La mayoría de los

ensayos realizados en esta posición indican que los sustituyentes en C-7 se relacionan

mediante interacciones electrostáticas con el sitio de unión a las enzimas. Desde el punto de

vista sintético, esta posición es fácilmente sustituida cuando se parte de la quinolona 6,7-

difluorada mediante una reacción de sustitución nucleofílica aromática de esta con una amina

que contenga carácter nucleofílico. El inconveniente relativo es que pueda existir competencia

del carboxilato, que generalmente se tiene protegido en forma de ester, por el nucleófilo (Chu

1990).

Posición 8. Los sustituyentes en esta posición presentan un papel determinante en la

afinidad de las quinolonas por la ADN girasa o topoisomerasa IV. Este efecto se complementa

por la naturaleza del sustituyente en posición 5, especialmente si este es un átomo de flúor. Se

ha observado que la presencia de un sustituyente metoxilo en C-8 incrementa la potencia de la

quinolona sin incrementar la fototoxicidad (que es una de las propiedades de reactividad y

toxicidad de estos compuestos), como lo haría un halógeno en la misma posición. La primer

modificación exitosa en esta posición fue el cambio del N (del ácido nalidíxico) por CH, lo

que mejoró notablemente las características farmacocinéticas. Otros grupos que han sido



investigados en esta posición incluyen: etoxilo, OH, OCH2F, OCHF2, OCF3 y SMe. (Suto et

al. 1992, Heddle 2002, Hayashi et al. 2004, Mitsher 2005).

3.4. AMINOÁCIDOS

Los aminoácidos tanto esenciales como no esenciales, sintéticos o que cumplen alguna

función como los neurotransmisores han sido explorados en la Química Medicinal y muchos

de ellos incluso, forman parte de importantes antibióticos como los precursores de penicilina.

Por su parte, los péptidos también han sido de interés medicinal. La secuencia de

aminoácidos de algunos de estos péptidos se controla por el código genético como es el caso

de los péptidos antimicrobianos derivados de histonas. Estudios realizados sobre péptidos

codificados por el ADN han permitido la síntesis de aquellos en donde no está involucrado

directamente el ADN. Algunos péptidos como la histogranina derivada de histonas, han

aportado información que permiten obtener compuestos con posible aplicación biológica. Es

interesante resaltar, por las características de esta tesis, que estudios realizados sobre la

histogranina indican que su mecanismo de acción es similar al de las quinolonas es decir que

involucran la ADN gyrasa. Al realizar la relación estructura actividad del la histogranina se

encontró que la acción antibacteriana que presenta, se debe algunos grupos que se encuentran

en la porción del C-terminal de la molécula; grupo básico, fenilo y fenol (Lemaire et al 2008).

Un péptido cíclico (-Gli-pCl-Fen-Tir-d-Arg) fue sintetizado con la finalidad de

mimetizar el efecto de la histogranina e imitar los principales grupos fenol y fenilo. Este

compuesto, aunque no superó la actividad antimicrobiana de las fluoroquinolonas como el

ciprofloxacino, si presento actividad frente a la ADN gyrasa (Lemaire et al 2008).

En 2003 se reportó la síntesis y caracterización de un compuesto derivado de

ciprofloxacino, sustituido en el C-3 con un -aminoácido; glicina (este aminoácido figura en el

compuesto cíclico que se mencionó anteriormente). El compuesto se probó frente a E.coli,

B.subtilis y S.aureus sin embargo, no presentó ninguna influencia en la actividad



antimicrobiana. Lo anterior debido a que, como se mencionó anteriormente, el carboxilo libre

en C-3 resulta esencial para la actividad de las fluoroquinolonas.

Considerando la necesidad de buscar nuevos compuestos con actividad antibacteriana,

sobre todo en cepas multiresistentes, y a que los aminoácidos acoplados a fluoroquinolonas

abren la posibilidad de ampliar el panel de compuestos a explorar; en el presente trabajo se

describe la síntesis y actividad en cepas Gram negativas y positivas de nuevas

fluoroquinolonas sustituidas en el C-3 y C-7.

U.M.S.N.H Hipótesis y Objetivos


IV. HIPÓTESIS

Al funcionalizar la posición 7 de las fluoroquinolonas con aminas como el

aminoacetaldehído dimetil acetal, etanolamina, N,N- dimetil etilendiamina y alfa-aminoácidos

que pueden interactuar con las topoisomerasa, dá lugar a compuestos con actividad

antimicrobiana con posibilidades de actuar frente a microorganismos Gram positivos y Gram

negativos.

V. OBJETIVOS

V.1.- OBJETIVO GENERAL

Obtener nuevos compuestos derivados de fluoroquinolonas sustituidos con aminas

funcionalizadas con grupos capaces de actuar con la girasa, a partir de los cambios propuestos

en la posición 7 de la molécula y evaluar su actividad antibacteriana frente a cepas de

microorganismos Gram positivos y Gram negativos.



V.2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1.- Sintetizar y caracterizar estructuralmente los compuestos 2-6, sustituidos con

aminas en posición 7 y 3.

Figura 11.- Aminoalquil fluoroquinolonas sustituidas en posición 3 y 7.

2.- Obtener, purificar y caracterizar los compuestos Ciprofloxacino- -aminoácilos

17-25.

Figura 12.- Aminoacil fluoroquinolonas sustituidas en posición 7 con aa.



3.- Evaluar la actividad antimicrobiana de los nuevos compuestos obtenidos mediante

el método de Kirby-Bauer, frente a microorganismos Gram positivos y Gram negativos.

4.- Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria de los nuevos análogos que

presenten actividad antimicrobiana.

U.M.S.N.H Material y Métodos


VI. MATERIAL Y MÉTODOS

Los espectros de Resonancia Magnética Nuclear de protón (1H) se obtuvieron con un

equipo Varian Mercury Plus de 200 MHz y/o 400 MHz. Se utilizó como referencia TMS y

como disolvente cloroformo (CDCl3) o dimetil sulfoxido deuterados. La quinolona empleada

como materia prima fue el ácido 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluoro-1,4-dihidro-4-oxoquinolin-3-

carboxílico y ciprofloxacino disponible comercialmente. Las aminas utilizadas para la síntesis

de los compuestos fueron el 1-aminoacetaldehído dimetil acetal, la N, N-dimetiletilendiamina,

la etanolamina y los respectivos aminoácidos. Todos los reactivos fueron de origen comercial

de la empresa Aldrich. El Ciprofloxacino se obtuvo a partir de un producto comercial para lo

cual se trituró una tableta de clorhidrato de Ciprofloxacino monohidratado equivalente a 500

mg, hasta obtener un polvo fino y se colocó en un vaso de precipitado con 10 mL de agua

destilada. Se sometió a agitación por treinta minutos con la finalidad de disolver la sal y se

dejó en reposo hasta precipitación del excipiente. La mezcla se filtró y se obtuvo una solución

clara a la cual se agregó gota a gota una solución de CH3ONa/CH3OH hasta que se observo un

precipitado color blanco. El precipitado se filtro y se dejo secar a temperatura ambiente

obteniendo un sólido blanco que mostró las señales de RMN 1H y 13C de ciprofloxacino.

Para las pruebas de actividad antibacteriana se emplearon cepas de Escherichia coli

enteropatógena ATCC 0111 y Staphylococcus aureus ATCC 27543, este último aislado de un

caso de mastitis clínica. Ambas cepas fueron cultivadas en medio Luria-Bertani (LB) a 37° C.

6.1.- PROCEDIMINTO GENERAL PARA LA SÍNTESIS DE LOS PRECURSORES

SUSTITUIDOS EN LA POSICIÓN 7 DE LA FLUOROQUINOLONA.

Se colocaron 0.01 mol de ácido 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluoro-1,4-dihidro-4-

oxoquinolin-3-carboxílico en un matraz balón; posteriormente se adicionaron 0.05 mol de la

amina correspondiente. La mezcla se sometió a reflujo, aplicando calor hasta alcanzar una

temperatura que oscilo entre 110 y 120 ºC, agitando vigorosamente durante 6 horas. Durante

este lapso de tiempo se observó una mezcla totalmente líquida, la cual fue cambiando de color



(amarillo a marrón en el caso del aminoacetaldehído dimetil acetal. Sin embargo, cuando se

usa N,N-dimetiletilendiamina se observa una mezcla heterogénea con una tonalidad amarilla).

Transcurrido el tiempo de reacción la mezcla se llevó a sequedad y se purificó por

cromatografía en columna utilizando sílica y como eluente MeOH:AcOEt. Los cristales

obtenidos mostraron las señales esperadas en RMN1H. El rendimiento calculado para estos

compuestos fue del 75 %.

Figura 13. Aminoalquil fluoroquinolonas.

6.2. SÍNTESIS DE COMPUESTOS DERIVADOS DE AMINAS SUSTITUIDAEN EL

CARBOXILOEN POSICIÓN 3 DE LA QUINOLONA.

6.2.1. Esterificación de la Quinolona.

Para obtener el compuesto derivado de amina sustituido en el carboxilo de la

quinolona, fue necesario primero esterificar la molécula. La esterificación se realizó en base

al siguiente procedimiento:

Se colocaron 0.01 mol de la ácido 7-cloro-1-ciclopropil-6-fluoro-1,4-dihidro-4-

oxoquinolin-3-carboxílico a esterificar en 10 mL de metanol (observándose un precipitado

blanco insoluble), enseguida se sometió a baño de hielo por 15 minutos. Después se sometió a

agitación y se agregaron 0.012 mol de cloruro de tionilo gota a gota. Conforme paso el tiempo

la quinolona solubilizó completamente. Se continúo agitando por 1 día (3 horas para la

reacción con amiohemiacetal), transcurrido este tiempo se dejo en reposo durante 18 horas

permitiendo que se formaran cristales transparentes. Finalmente se filtro y los cristales

obtenidos se llevaron a un estado de sequedad. Las señales mostradas en la RMN1H

confirmaron la esterificación de la quinolona.



6.3. SÍNTESIS DE COMPUESTOS DERIVADOS DE AMINOACIDOS SUSTITUIDOS

EN LA POSICIÓN 7-(N´-PIPERACINIL) DEL CIPROFLOXACINO

6.3.1. N-Protección de los aminoácidos.

En un matraz balón provisto de agitación se suspendió el aminoácido libre en NaOH

1N a 0°C, posteriormente se adicionaron 1.1 equivalentes de cloroformiato de bencilo (CbzCl)

y se mantuvo el pH de reacción en 10. La mezcla se dejó reaccionando por 12 h a temperatura

ambiente. Transcurrido el tiempo de reacción, la mezcla se lavó con CH2Cl2 tres veces; la fase

orgánica se desecho y la fase acuosa se acidificó con HCl 1 N hasta pH menor a 4, el producto

se extrajo de la fase acuosa con CH2Cl2. La fase orgánica se seco con Na2SO4 anhidro, se filtro

por gravedad y se llevó a sequedad.

Figura 14.- Carbamatos de los diferentes aminoácidos elegidos.

6.3.2. Reacción de N-acilación de ciprofloxacino con -aminoácidos protegidos.

En un matraz balón se colocó 1 mmol de Ciprofloxacino en CH2Cl2 , enseguida se

adicionó 1 mmol del -aminoácido correspondiente, 1.05 mmoles de HOBt, 1.05 mmoles de

HBTU, y 2 mmoles de DIEA. La mezcla se sometió a agitación y se dejó reaccionando por 12

h a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de reacción, a la mezcla se le realizaron tres



lavados con agua destilada y tres lavados con una solución saturada de NaHCO3. La fase

orgánica se secó con Na2SO4 anhidro, se filtró por gravedad y se llevó a sequedad.

Figura 15. Aminoacil fluoroquinolonas N-carboxibenciladas sustituidas en el

nitrógeno dista de la piperazina en posición 7.

6.3.3.- N-Desprotección de las nuevas fluoroquinolonas; CbzHN-aa-Cpx.

En un matraz balón se colocó 1 mmol de la fluoroquinolona N-protegida disuelta en

una mezcla metanol: cloruro de metileno (50:50), 10% (w/w) de Pd/C al 10%. Esta mezcla se

sometió a agitación y se saturó con H2, se dejó reaccionar por 3 h a presión atmosférica.

Transcurrido el tiempo de reacción se filtró, sobre celita, al vacio y se eliminó el disolvente a

vacío.


piperazina en posición 7.



6.4. PRUEBA DE DIFUSIÓN CON DISCO.

La medición de la actividad antibacteriana de los nuevos análogos de fluoroquinolona,

se obtuvieron mediante el método de Kirby-Bauer (NCCLS). Las pruebas se realizaron frente

a microorganismos Gram positivos y Gram negativos; Escherichia coli y Staphylococcus

aureus.

Primeramente, se sembró una cepa del microorganismo correspondiente en una placa

de Agar LB y se dejó incubar a una temperatura de 37 ºC durante 24 horas. Para esto se

seleccionaron colonias perfectamente aisladas y se transfirieron a un tubo que contenía 3 mL

de caldo LB. El caldo de cultivo se incubó a 37 ºC por un lapso de 4-6 horas hasta que alcanzó

una absorbancia de 0.2 a 560 nm. El inóculo ajustado que se obtuvo, de acuerdo a la

determinación de las UFC previamente realizada, contuvo aproximadamente 6X104 UFC/ml

en Escherichia coli y 9.12X106 UFC/ ml en Staphylococcus aureus. Después de haber

obtenido la turbidez adecuada se introdujó un hisopo de algodón dentro de la suspensión

ajustada, el cual se rotó varias veces presionando firmemente en las paredes del tubo para

eliminar el exceso de inóculo. La superficie de la placa del Agar LB se inoculó por

estriamiento masivo, rotando la placa 90º, para la distribución homogénea del inoculo. Se dejó

secar durante 5 minutos para eliminar el exceso de humedad.

Se colocaron los sensidiscos y se presionan con la pinzas estériles para obtener un

contacto completo con la superficie del Agar. Los discos se aplicaran a una distancia no menor

de 24 mm entre cada uno de ellos procurando no colocar mas de 5 sensidiscos por placa. Las

placas se incubaron a 37º durante un lapso de tiempo de 24 horas; y después del tiempo de

incubación se examinaron midiendo los diámetros de inhibición en milímetros con una regla

convencional. A partir de los resultados obtenidos, se comparó la sensibilidad con el control

positivo; el ciprofloxacino.



6.5. EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIADE LOS

NUEVOS ANÁLOGOS DEFLUOROQUINOLONAS SOBRE SEPAS DE

ESCHERICHIA COLI, Y STAPHYLOCOCCUS AUREUS.

Para determinar la CMI se realizaron pruebas de sensibilidad por dilución en tubo

(NCCLS): se resembraron las 2 cepas anteriormente mencionadas por cuadrantes en una placa

de agar LB para tenerlas frescas, se dejaron incubar a 37ºC durante 24 hrs. Enseguida se

tocaron con asa estéril 3 colonias y se inocularon en matraz con 325 mL de caldo LB, se

homogenizaran agitando y se dejaron incubar durante 4-6 hrs hasta alcanzar una absorbancia

de 0.2 a 560 nm.

Con cada patógeno se trabajó con una batería de 10 tubos con 3 repeticiones, a los

cuales se adicionaron la respectiva fluoroquinolona previamente microdiluida. La

concentración de la fluoroquinolona del primer tubo fue de 100 μg/ml, esta concentración se

disminuyó sucesivamente hasta obtener una concentración de 2X10-2 μg/ml del compuesto en

el tubo número 10. Las muestras obtenidas se incubaron con agitación a 37 °C por 24 hrs.

Transcurrido este tiempo se detecto el último tubo sin crecimiento y la concentración de éste

se reporto como la CMI.

U.M.S.N.H Resultados y Discusión


VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS NUEVOS COMPUESTOS DERIVADOS DE FLUOROQUINOLONAS.

El primer grupo de compuestos a sintetizar fue la serie de N-aminoalquil

fluoroquinolonas, en donde la amina se incorporó en la posición 7 de la quinolona y en el

carbonilo del carboxilato, C-7 y C-3 respectivamente. En este último caso, dando lugar a las

correspondientes amidas. Aunque se sabe por reportes de relación estructura actividad de

fluoroquinolonas que el carboxilato no debe ser sustituido pues es esencial en el mecanismo de

acción molecular al reconocer al ADN, los derivados que se incorporaron, en este estudio, no

son alquilaminas sencillas sino funcionalizadas con grupos que pueden presentar interacciones

con el ADN al poseer en su estructura átomos de nitrógeno y oxígeno. Así, se incorporó el

amino dimetilacetal (compuestos 2 y 5) que presenta dos oxígenos capaces de formar puentes

de hidrógeno y que además es un excelente sintón para obtener compuestos como derivados de

glicina. Otro sustituyente elegido fue el 1,2-aminoetanol que en un momento dado permitiría

comparar la actividad del amionoacetal con respecto a un alcohol libre (compuestos 3 y 6).

Los compuestos 4 y 7 fueron derivados en los que se sustituyeron con N´,N´-

dimetiletilendiamina. Esta diamina resulta de particular interés pues es sabido que, al

encontrarse como sustituyente en intercaladores del ADN, la afinidad por el material genético

se incrementa considerablemente como es el caso del compuesto citotóxico DACA. Cabe

señalar que ninguno de los compuestos propuestos (2 - 7) habían sido descritos (fig. 17).

La síntesis de las fluoroquinolonas sustituidas en el anillo aromático se llevó a cabo en

condiciones típicas de sustitución nucleofílica aromática (SNAr) partiendo, del ácido 7-cloro-

6-fluoro-1,4-dihidro-oxoquinolina-3- carboxílico en ausencia de disolvente y a reflujo. Los

derivados sustituidos en el carboxilo no requirieron tratamiento sintético especial pues

afortuanadamente se aislaron de la misma mezcla de reacción aunque con bajos rendimientos,

lo cual en principio no preocupaba pues se trataba de experimentar primeramente la actividad



biológica y, en caso de ser necesario, llevar a cabo una síntesis mas específica de amidas a

partir de ácidos carboxílicos y aminas.

La caracterización de los compuestos se realizó por RMN 1H y 13C, en donde se

observó que las señales mostraban patrones de desplazamiento químico similares entre los

análogos sustituidos en C-7 y los sustituidos en C-3.

Figura 17. Estructura de los compuestos sustituidos en C-7 (1-3) y sus Análogos sustituidos en C-3 (4-6).

De esta forma, los espectros obtenidos para los compuestos sustituidos con aminas en

C-7 mostraron que las señales de los hidrógenos en las posiciones 5 y 8 se ven desplazadas

hacia campo alto, con respecto al material de partida (fig. 18), lo cual indica la presencia de un

grupo electrodonador cerca de éstos. Sin embargo, es clave la aparición de la señal de amida

cerca de 10 ppm, para los compuestos sustituidos en 3, con respecto a la señales del protón del

grupo amino, sustituido en 7 (Ver anexo fig. 41).

Aunque el compuesto sustituido en la posición 3 es un subproducto de la reacción de

SNAr, para el caso de la adición de la N,N-dimetil-1,2-etilendiamina el rendimiento fue bajo y

se exploró la reacción partiendo del derivado esteríficado del ácido 7-F-8-Cl-quinolona-3-

carboxílico obteniendo mejores rendimientos, lo cual es en cierta medida de esperarse puesto

que para que se lleve a cabo una reacción tipo SNAr se requiere romper la aromaticidad del

anillo bencénico mientras que la reacción de adición-eliminación de esteres es enegéticamente

mas favorecida dado que no se rompe aromaticidad y el carbonilo es considerablemente más

electrófílico.

4

N23

567

8

O

OHF

NH

O

O

O

N

N

OOF

Cl

N

H

N

OH

OOF

NH

N

N

N

OOF

Cl

O

H O

N

OH

OOF

NH

HO

N

N

OOF

Cl

OH

H

2 3 4

5 6 7

1



Figura 18. Espectros de RMN 1H. Hemiacetal de la FQ sustituida en posición 7(Comp 2).

El espectro de RMN 1H de la fluoroquinolona esterificada (figura 42 ver anexo), con

respecto al espectro del hemiacetal de la fluoroquinolona sustituida en posición 3 mostró

diferente desplazamiento del protón en posición 2, además de la ausencia del metilo en

posición 3. La señal para el hidrógeno del carbono 2 se desplaza hacia campo bajo, indicando

la presencia de un grupo que genera un efecto electroatractor para este hidrógeno. Estas

señales indican la formación del precursor de fluoroquinolona sustituido en posición 3 (figura

41 ver anexo).

Como se mencionó, el compuesto 2 resulta interesante para funcionalizar la estructura

con análogos de glicina, mismos que servirían para incorporar a su vez otros aminoácidos y

obtener peptídos sustituidos en esa posición. De esta manera el hemiacetal de la

fluoroquinolona se sometió a reaccionar de diversas formas con la finalidad de liberar el acetal

y obtener el aldehído correspondiente. Desafortunadamente, a pesar de probar diversas

metodologías, se obtenían compuestos inestables que al revelarlos en cromatografía de placa

fina con 2,4-dinitrofenilhidrazina evidenciaban la presencia de aldehído pero que al momento

de purificarlo se obtenían compuestos inestables y difíciles de caracterizar.



En la búsqueda de nuevas opciones se optó por partir del ciprofloxacino, una

fluoroquinolona funcionalizada en la posición 7 con piperacina, y sustituirlo en el nitrógeno

distal de la misma. Recientemente, se describió una metodología que permitió incorporar

alanina en esta posición y es la que se utilizó en este trabajo para obtener la serie de análogos

restante (Machuca 2010).

Primeramente, se obtuvo el ciprofloxacino que, por razones de economía, se aisló de

tabletas comerciales mediante extracciones por disolvente y el uso de metóxido de sodio. Para

corroborar la extracción adecuada del ciprofloxacino se analizó por RMN 1H y se

identificaron las señales correspondientes de cada protón de la molécula, como se ilustra en la

figura 19.

Figura 19. Espectro de RMN 1H del Ciprofloxacino.



Los aminoácidos que se eligieron para ser sustituidos en la posición 7 del

ciprofloxacino fueron la tirosina (Tir), glicina (Gli), D-alanina (Ala), tryptofano (Tri),

fenilalanina (Fen), asparagina (Asn), prolina (Pro), lisina (Lis) y DL-alanina. El criterio de

elección tuvo que ver con la disponibilidad de los mismos y con la facilidad del manejo en las

condiciones de reacción como solubilidad.

El primer paso en la ruta sintética fue la N-protección de los aminoácidos

anteriormente mencionados; para lo cual se utilizó cloroformiato de bencilo para la formación

del grupo N-Cbz, bajo el procedimiento descrito previamente. El carbamato correspondiente

de cada aminoácido (fig. 20) se obtuvo en rendimientos por arriba del 60%.

Figura 20. -aminoácidos N-protegidos.

Al realizar las reacciónes de obtención de los compuestos ciprofloxacino-aminoácido-

Cbz que se muestran en la figura 21, se observó que al incrementar las cantidades de los

reactivos de que se parte mejoran significativamente los rendimientos de un 60% a 80-90%.

La formación de los compuestos ciprofloxacino-aminoácido-Cbz se llevó a cabo

mediante el acoplamiento del aminoácido y el nitrógeno secundario de la piperacina mediante

la activación del carboxilo libre del aminoácido con HBTU. La estructura de cada uno de ellos



se confirmó mediante RMN 1H; la comparación de los desplazamientos químicos se muestran

en la figura 22.

Figura 21. Compuestos derivados de aa-protegidos sustituidos en la posición 7 de la FQ.

Al comparar los espectros del aminoácido protegido con respecto a sus derivados

productos de acoplamiento con fluoroquinolona se observa una diferencia en los

desplazamientos químicos de los protones del grupo amino del aminoácido protegido y el

protón del metino hacia campo bajo, lo cual da indicio de la presencia de un grupo

electroatractor cercano a ellos indicando que el ciprofloxacino se adicionó. Algo que llama la

atención es que las señales de la piperacina se encuentran separadas dado que lo más común es

que estas sean equivalentes al menos en lo que refiere a los metilenos vecinos de un mismo

nitrógeno. Esta ausencia de equivalencia química y magnética es típica de piperacinas

disustituidas con conformación restringida en donde los protones ecuatoriales presentan

diferente desplazamiento químico con respecto a los axiales (Chacón 1993).

En las Figuras 22 y 23 se ilustran, como ejemplos de esta transformación, los espectros

de RMN 1H de la D-alanina N protegida y su producto de acoplamiento con el nitrógeno distal

de la piperacina del ciprofloxacino.



Figura 22. Espectro de RMNH1 del aminoácido protegido y de su producto de reacción con la FQ.

Figura 23. Espectro de RMNH1 del aminoácido protegido y de su producto de reacción con la FQ.



Aunque el objetivo sintético es obtener los derivados aminoacilados, los intermediarios

generados (compuestos 8-16) también resultan atractivos para formar parte del panel de

compuestos a probar como inhibidores del crecimiento bacteriano.

La desprotección del grupo protector carboxibenzoilo, para liberar alcohol bencílico y

el amino del aminoacilo, se llevó a cabo mediante la reacción típica de hidrogenólisis. El

espectro de RMN 1H de la alanil fluoroquinolona mostró las señales indicativas tanto de la

desprotección del Cbz como las de la presencia del aminoacilo como se muestra en la Figura

24. El resto de los productos fueron caracterizados tambien por RMN tanto de 1H como de 13C

e IR.

Figura 24. Espectro de RMNH1 del compuesto 17; Cpx-Ala.

Al igual que la primera serie de compuestos aquí descritos, los derivados

aminoacilados 8 – 24 son también novedosos y se describen por primera vez.



6.2. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

Para medir la actividad biológica de los nuevos compuestos obtenidos se realizaron

pruebas microbiólogicas en 2 cepas de referencia; Staphylococcus aureus (ATCC) y

Escherichia coli (0111). Se eligieron estas cepas para realizar los ensayos debido a que es

importante observar la actividad que presentan los nuevos análogos de fluoroquinolona tanto

en microorganismos Gram positivos como Gram negativos.

Se realizaron ensayos de difusión en disco y determinación de la concentración

mínima inhibitoria (CMI) de los nuevos análogos mediante la prueba de Kirby-Bauer y el

método de microdilución en tubo (NCCLS) respectivamente. La concentración mínima

inhibidora (CMI) se define como la concentración mínima del fármaco capaz de inhibir el

crecimiento de un determinado microorganismo. La CMI, es utilizada como referencia

internacional y es el valor más comúnmente aceptado en este tipo de estudios. Asimismo, el

compuesto de referencia para ensayos de actividad antibacteriana de nuevas fluoroquinolonas

es el ciprofloxacino. La CMI para el ciprofloxacino se determinó experimentalmente y de

manera paralela con los ensayos de los compuestos probados coincidiendo con los datos

descritos, esta fue de 1.7 μg/ml frente a S.aureus y 1.6 μg/ml frente a E. Coli.

6.2.1. Actividad antimicrobiana de los N-aminoalquil fluoroquinolonas.

En un primer ensayo se determinó la actividad antimicrobiana de los compuestos 2-7

por ensayos de difusión radial; método de Kirby-Bauer. Se observó que dos de los compuestos

sustituidos en C-7 presentan actividad antimicrobiana. El hemiacetal de la fluoroquinolona

inhibe el crecimiento bacteriano tanto en bacterias Gram positivas como Gram negativas y la

1-etan-2-ol amina en C-7 solo inhibe a bacterias Gram negativas (figura 25). Los nuevos

compuestos sustituidos en C-3 no presentaron actividad antimicrobiana, lo que corrobora que

esta posición de la quinolona debe estar libre aún cuando los sustituyentes sean capaces de

interactuar con el ADN.



Figura 25. Actividad antimicrobiana del Ciprofloxacino, Compuestos sustituidos en C-7 y C-3 frente a S. aureus (A) y E. coli (B) en ensayos de difusión radial.

Al determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) de los compuestos 2-7

mediante la prueba de dilución en tubo, se observó que el hemiacetal de la FQ en C-7 presenta

una CMI de 12.5 μg/ml ó 3.7X10-3 μmol/ml (tabla 1). Como se observa en la figura 26 y 27

este compuesto inhibe mejor que el Ciprofloxacino a altas concentraciones.

Al observar que el acetal de la fluoroquinolona en C-3 no presentaba actividad

antibacteriana se optó por usarla como control negativo.

La actividad antibacteriana de los nuevos análogos en C-7 sustituidos con aminas

frente a microorganismos Gram negativos se confirmó al determinar su CMI. La etanolamina

sustituida presentó una CMI de 9.4x10-4 μmol/ml y el acetal de FQ 1.8x10-3 μmol/ml (Tabla 1).

Los compuestos presentan una actividad comparable con el ciprofloxacino a altas

concentraciones.

b)

Ciprofloxacino Hemiacetal C-7 Etanolam C-7

b)

A

A

a)a)



Figura 26. Actividad antibacteriana de nuevos análogos de FQ en posición 7 frente a S.aureus. Control positivo: ciprofloxacino, acetal de la FQ; Comp 2, control negativo:

acetal de la FQ: Comp 6.

Figura 27. Actividad antibacteriana frente a E. coli. Control: Cpx, Compuestos 2 y 4 FQ sustituidas en C 7 y Compuestos 6 y 7 FQ sustituidas en C 3.



Tabla 1. Concentración mínima inhibitoria de los compuestos 1-7.

N

OF

R1

OR2

O

comp. Sustituyente CMI (μmol) R1 R2 E. coli S. aureus

1 NHN

H 2.35x10-4 4.73 x10-4

2O

NH

O H 1.8x10-3 7.55x10-3

3 NNH

H NI NI

4 HONH H 9.4x10-4 NI

5 H O

NH

ONI NI

6 H NNH

NI NI

7 H HONH

NI NI

El hecho de que estos compuestos presenten actividad da la pauta para explorar

análogos y derivados de los mismos.

El segundo grupo de compuestos a evaluar corresponde a las 7-aminoacil

fluoroquinolonas , provenientes del acoplamiento del nitrógeno distal de la piperacina del

ciprofloxacino y los respectivos aminoácidos. De acuerdo a su clasificación por la cadena

lateral, en el panel de compuestos a explorar, se encuentran aminoácidos con cadenas laterales

no polares (glicina, alanina, prolina, fenilalanina y triptofano), con cadenas ácidas (ácido

aspártico), con cadenas polares pero no ionizados (tirosina) y con cadenas básicas (lisina).

Es claro que la estereoquímica en fármacos puede resultar crucial para su actividad

debido al ambiente quiral en el que desempeñan su función molecular, sea esta con proteínas,

lípidos, canales iónicos y el mismo ADN. La presencia de mezclas de enantiomeros en un

fármaco es considerado por las normas internacionales como contaminación ya que no solo

puede no ser inactivo sino tóxico. Las fluoroquinolonas que interactúan con la girasa han sido



también estudiadas desde el punto de vista quiral e incluso en el mercado farmacéutico se

encuentra el Levofloxacino que es la forma enantioméricamente pura del ofloxacino. El

levofloxacino es más activo, en términos de potencia y espectro de acción y por el hecho de

obtenerlo de forma enantioméricamente pura también es considerablemente más costoso. En

lo que respecta a la estereoquímica de los compuestos sintetizados, se puede apreciar que, con

excepción de la D- y D, L-alanina, el resto de los sintones utilizados fueron los L-aminoácidos.

El hecho de utilizar D-alanina responde a haber contado con este en anaquel y carecer de su

enantiómero L.

Figura 28 . N- aminoacil fluoroquinolonas

Con la finalidad de amipliar el estudio a un número de compuestos superior, se

evaluaron también los intermediarios en la síntesis que fueron los aminoacil fluoroquinolonas

N-carboxibenciladas (figura 28). Los ensayos se realizaron con la doble intención de, por una

parte ampliar el intervalo de compuestos y por otra conocer si resulta necesario el amino del

aminoácido en su forma libre lo cual, en cierta medida es de esperarse pues protegido se

incrementa el tamaño de la molécula y esto puede interferir en la interacción con la girasa.

La forma más común de elegir la cantidad de compuesto a utilizar en cada una de las

pruebas es en términos de μg/mL; sin embargo, considerando que los compuestos aminoacil



fluoroquinolonas poseen un mayor peso molecular que el Ciprofloxacino sólo, para que el

análisis fuera más preciso, es necesario comparar los compuestos en términos de micromoles/

mL en vez de microgramos/ mL. Por ello se utilizó la misma cantidad de compuesto en cada

una de los ensayos respecto a la FQ de referencia en términos de μmol/ mL.

Figura. 29. Aminoacil fluoroquinolonas.

Los resultados de la prueba de difusión en disco frente a Escherichia coli y

Staphylococcus aureus se presentan en las figuras 30 y 31. En lo que respecta a los halos de

inhibición frente a Escherichia coli (figura 30) y cuando se comparan los resultados del mismo

grupo de compuestos protegidos con Cbz se aprecia que todos presentan menor actividad que

el compuesto de referencia ciprofloxacino, contrario a lo que ocurre con el grupo de

compuestos con el amino libre en donde los derivados de glicina y lisina son mas activos que

el ciprofloxacino. En una comparación de ambos grupos, protegidos y desprotegidos, la

tendencia de mayor actividad entre análogos, es siempre mayor o igual en los desprotegidos

(fig. 29).

Aunque los ensayos en difusión son útiles sobretodo como estudios preliminares en

series grandes de compuestos, los resultados son más confiables en dilución en tubo pues no se



ven afectados por problemas de difusión en el agar. De hecho, los resultados cambian

radicalmente y se aprecia que el número de compuestos mas activos que el compuesto de

referencia se incrementa en los derivados D,L- y D-ala-Cbz, L-lys-Cbz, gly y L-try (fig. 30 y

31). Los datos de CMI de todos los compuestos se presentan en la tabla 1 y 2.

Figura 30. Actividad antimicrobiana de análogos de FQ frente a E.coli.

Tabla 2. Concentración mínima inhibitoria de los compuestos 1-24.

N

OF

R1

OR2

O

comp. Sustituyente CMI (μmol) R1 R2 E. coli S. aureus

8NH

N

N

O

O

O

COOH

H 3.79 x10-5 3.79 x10-5



9 NH

NN

O

CH3

O

O

H 1.89 x10-6 9.46 x10-6

10 NH

NN

O

CH3

O

O

H 1.89 x10-6 1.18 x10-6

11 NH

NN

OO

O H 9.46 x10-6 4.73 x10-6

12 NH

N

N

OO

O

H 9.46 x10-6 2.73 x10-6

13 NH

N

N

O

O

O( )3

NH2

H 1.89 x10-6 9.46 x10-6

14 N N

N

OO O

H 3.79 x10-5 3.79 x10-5

15 NH

N

N

OO

ON H 9.46 x10-6 NPI

16 NH

NN

OO

O

OH

H 9.46 x10-6 3.79 x10-5

17 N

N

O

HO

NH2OH 3.79 x10-5 3.79 x10-5

18 NN

O

NH2

H 4.73 x10-6 2.73 x10-6

19 N

N

O

NH2

H 7.57 x10-6 9.46 x10-6

20 N

N

O

NH2

H 9.46 x10-6 9.46 x10-6

21 H2NN

N

O

H 1.89 x10-6 1.89 x10-6



22 N

N

O

NH2

H2NH 9.46 x10-6 9.46 x10-6

23 NH

N

N

O

H 1.89 x10-5 1.89 x10-5

24 N

N

O

NH2HN

H 1.89 x10-5 1.89 x10-5

25 N

N

O

NH2

H 2.73 x10-6 2.73 x10-6

Figura 31. Actividad antimicrobiana de análogos de FQ frente a S.aureus.

Por su parte, con respecto a los ensayos de actividad frente a Staphylococcus aureus en

las pruebas de difusión en disco (fig. 30), el halo de inhibición es mas grande para L-Gly y L-

Lys que para el ciprofloxacino. Fuera de estos compuestos la actividad es igual o menor. Sin

embargo, cuando se analizan los datos de la figura 31, los derivados gli-Cbz, D, L-ala-Cbz, L-

gly, D-ala y L-Lys presentan una CMI por debajo que el ciprofloxacino sobretodo la L-Lys.



Asimismo, resulta interesante el comportamiento de los compuestos que contienen alanina en

su estructura. El compuesto N-protegido (D, L-alanil) presenta prácticamente el doble de

actividad que el ciprofloxacino en esta cepa pero el compuestos también N-carboxibencilado

X (D-alanil) es menos activo en un orden de diez veces de magnitud, lo que permite predecir a

priori que el derivado L-alanil será entonces a su vez más activo aún que el D, L-alanil lo cual

es posible si se recuerda que el Levofloxacino es también más activo que su componente

racémico. Este proyecto abre la puerta para experimentar la actividad de todos los compuestos

aquí descritos y su respectivo enantiómero.

Cuando se comparan las actividades de análogos frente a E. coli y S. aureus es notoria

la diferencia de actividad tanto en términos de de μmoles/ mL como de μgramos/ mL (fig. 32

y fig. 33 ) en los derivados de gly-Cbz, D-ala-Cbz, D-Lyz-Cbz, L-Try y L-Lys que presentan

frente a ambas cepas confiriéndoles cierta selectividad.


y E.coli en μmol/mL.




y E.coli en μg/mL.

Evidentemente, harán falta ensayos sobre una gama más amplia de microorganismos

Gram positivos y negativos para concluir que existe selectividad lo cual sería un resultado

importante pues la selectividad de un fármaco hace que sus efectos colaterales y secundarios

disminuyan.

U.M.S.N.H Conclusiones


VIII. CONCLUSIONES

Se demuestra que el grupo aminoacilo en la posición 7 de la fluoroquinolona afecta la

actividad antibacteriana frente a las cepas de S.aureus y E. coli, en algunos casos mejorándola

lo cual los hace buenos candidatos a ser explorados en series más amplias.

Los nuevos análogos N-aminoalquil fluoroquinolonas y N-aminoacil fluoroquinolonas

descritas enriquecen la cantidad de compuestos con actividad antibacteriana y permiten

obtener compuestos que se pueden utilizar como precursores para la síntesis de otros

compuestos de interés.

Los resultados obtenidos en esta tesis abren la puerta para sintetizar más derivados de

aminoácidos y su respectivo enantiómero.

U.M.S.N.H Referencias


IX. REFERENCIAS

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U.M.S.N.H Anexos


X. ANEXOS

U.M.S.N.H Anexos


Figura 34. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en DMSO de 42.


U.M.S.N.H Anexos


Figura 36. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en CDCl3 de 2.

Figura 37. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en CDCl3 de 3.

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Figura 41. Espectro de 1H RMN a 400 MHz en DMSO de CDCl3.

N

OOF

Cl

O

H O

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sintesis y actividad antimicrobiana de nuevos …

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