actividad antimicrobiana & hemolÍtica cry46aa1 1

ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA & HEMOLÍTICA CRY46AA1 1

Determinación de la Actividad Antimicrobiana y Hemolítica de Fragmentos Peptídicos

Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp

Olarte Díaz Andrés Felipe

Universidad de Santander

Facultad Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias,

Microbiología Industrial

Bucaramanga

2021



Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp


Trabajo de grado para la optar por el título de Microbiólogo Industrial

Director

Cruz Laitón Jennifer PhD

Codirector

Rueda Forero Nohora Juliana

MSc

Asesor

Orlando Suarez Miguel

MSc

Universidad de Santander

Facultad Ciencias Exactas, Naturales y Agropecuarias,

Microbiología Industrial

Bucaramanga

2021


Agradecimientos

A mis padres por apoyarme y estar presentes durante este proceso, ayudarme a cumplir

las metas propuestas y por brindarme una educación de calidad. Además, gracias por formarme

con principios y valores, que el día de hoy me ayudaron a convertirme en la persona que soy.

Jenniffer Cruz Laitón MSc, PhD, Nohora Juliana Rueda Forero MSc., Ph.D (c) y Miguel

Orlando Suarez MSc., Ph.D (c) por brindarme sus conocimientos además de apoyarme en este

proceso, darme la oportunidad de trabajar y compartir momentos que me ayudaron a crecer tanto

a nivel profesional como personal.

Agradezco al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología

UDES, donde más que compañeros de trabajo encontré una familia.

A mis compañeros de carrera, quienes son personas increíbles y excelentes

Microbiólogos, les esperan grandes metas por cumplir y en su vida muchas bendiciones.


Dedicatoria

En primer lugar, a Dios, por llenarme de bendiciones, ya que sin él nada sería posible. A

mis padres por ayudarme y confiar en mí, por ser ejemplo a seguir, por demostrarme que el

esfuerzo y la dedicación siempre tiene sus frutos, por su amor incondicional y compresión en los

momentos difíciles.


Tabla de Contenido

Resumen ........................................................................................................................................ 13

Abstract ......................................................................................................................................... 15

1 Introducción ...................................................................................................................... 17

2 Planteamiento del Problema ............................................................................................. 20

3 Justificación ...................................................................................................................... 23

4 Pregunta de Investigación ................................................................................................. 25

5 Marco Teórico ................................................................................................................... 26

5.1 Especies de Pseudomonas Patógenas en Plantas .................................................. 26

5.1.1 Descripción ............................................................................................... 26

5.1.2 Caracterización ......................................................................................... 28

5.1.3 Patogénesis ................................................................................................ 29

5.2 Impacto Ambiental por Utilización de Agroquímicos .......................................... 32

5.3 Proteínas Cry y Péptidos Antimicrobianos Derivados Como Alternativa de

Agroquímicos Comerciales ............................................................................................... 33

5.4 Actividad hemolítica ............................................................................................. 35

6 Marco Legal ...................................................................................................................... 36

7 Objetivos ........................................................................................................................... 38

7.1 Objetivo General ................................................................................................... 38

7.2 Objetivos Específicos............................................................................................ 38

8 Hipótesis ........................................................................................................................... 39

8.1 Hipótesis de Investigación .................................................................................... 39

8.2 Hipótesis Nula ....................................................................................................... 39


8.3 Hipótesis Alternativa ............................................................................................ 39

9 Metodología ...................................................................................................................... 40

9.1 Diseño de Estudio ................................................................................................. 40

9.2 Esquema Metodología .......................................................................................... 40

9.3 Materiales y Métodos ............................................................................................ 40

9.3.1 Propiedades fisicoquímicas de los péptidos .............................................. 41

9.3.2 Activación de la cepa HSL30 ................................................................... 42

9.3.3 Cinética de crecimiento............................................................................. 42

9.3.4 Estandarización del inoculo mediante absorbancia .................................. 43

9.3.5 Ensayo de actividad antimicrobiana ......................................................... 44

9.3.5.1 Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50). ................... 44

9.3.5.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB). .............................. 45

9.3.6 Determinación del porcentaje de hemólisis de los péptidos nativos en

eritrocitos de humano ............................................................................................ 45

9.3.7 Análisis de los resultados .......................................................................... 46

10 Resultados y Discusión ..................................................................................................... 47

10.1 Estructura Secundaria In Silico de los Péptidos .................................................... 47

10.2 Cinética de Crecimiento de Pseudomonas sp Fitopatógena ................................. 49

10.3 Actividad Antimicrobiana de Péptidos Frente a Pseudomonas sp Fitopatógena . 55

10.4 Actividad Hemolítica de los Péptidos en Eritrocitos Humanos ............................ 62

11 Conclusiones ..................................................................................................................... 65

12 Recomendaciones ............................................................................................................. 66

13 Referencias Bibliográfícas ................................................................................................ 67


14 Apéndices .......................................................................................................................... 76


Lista de Figuras

Figura 1 Representación esquemática de Pseudomonas sp .......................................................... 26

Figura 2 Esquema General de la Metodología. ............................................................................. 40

Figura 3Estructura secundaria de péptidos ................................................................................... 47

Figura 4 Cinética del crecimiento exponencial de Pseudomonas sp (fitopatógena) .................... 50

Figura 5 Cinética de Pseudomonas sp frente a péptidos derivados de Cry46Aa1........................ 53

Figura 6 Crecimiento de Pseudomonas sp frente al péptido Loop2-PS2Aa ................................. 54

Figura 7 Pseudomonas sp en presencia del oxicloruro de cobre. ................................................. 55

Figura 8 Actividad inhibitoria de los tratamientos frente a Pseudomonas sp............................... 56

Figura 9 Comparación del porcentaje de inhibición entre oxicloruro de cobre y el péptido más

bioactivo. ....................................................................................................................................... 58

Figura 10 Determinación de la actividad Hemolítica ................................................................... 63


Lista de Tablas

Tabla 1 Resumen de Pseudomonas Fitopatógenas, Cultivos que Afecta y enfermedades/síntomas

que Produce. .................................................................................................................................. 29

Tabla 2 Secuencia de péptidos nativos derivados del dominio 1 de Cry46Aa1 y sus propiedades

fisicoquímicas. .............................................................................................................................. 48

Tabla 3 Cinética de crecimiento control-. ..................................................................................... 52

Tabla 4 Compuestos evaluados frente Pseudomonas sp fitopatógena.......................................... 61


Lista de Abreviaturas

BC: Biología Computacional

Bt: Bacillus thuringiensis

°C: Grados Celsius

cel/mL: Células por mililitro

CMB: Concentración Mínima Bactericida

CMI50: Concentración Mínima Inhibitoria media

CMI: Concentración Mínima Inhibitoria

CN: Caldo nutritivo

Cu: Cobre

DC: Dicroísmo Circular

DE: Desviación Estándar

DO: Densidad Óptica

g/mL: Gramos por mililitro

L: Litro

µg: Microgramos

μg/mL: Microgramo sobre mililitro

MH: Agar Müller Hinton

MHC: Müller Hinton Caldo

min: Minutos

mL: Mililitro

μL: Microlitros

mm: Milímetros


ns: No hay diferencia significativa

PAM: Péptidos Antimicrobianos

s: Segundos

T: Temperatura

U/mL: Unidades por mililitro

UFC: Unidades formadoras de colonia

UFC/mL: Unidades formadoras de colonia por mililitro

UV: Ultravioleta


Resumen

Título


Nativos de la Toxina Cry46Aa1 Frente a Pseudomonas sp.

Autor


Palabras Clave

Péptidos Antimicrobianos, Proteínas Cry, Actividad Antimicrobiana, Pseudomonas sp

Descripción

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia, que se caracteriza por

producir cristales parasporales -proteínas Cry- con efectos insecticidas frente a plagas. Sin

embargo, en los últimos años se ha documentado que un grupo de proteínas Cry no presentan

actividad insecticida o hemolítica, presentan actividad frente a bacterias o células cancerígenas.

Aunque el mecanismo de acción de este grupo de proteínas no se ha elucidado completamente, la

fragmentación de ésta en péptidos, acompañada con un soporte computacional pueden dar luces

de los sitios de unión o la forma de internalización celular.

La característica anfipática de este grupo de compuestos, péptidos, es crucial para la

interacción con la membrana, donde las cargas positivas en este grupo de moléculas son

importantes para generar selectividad, al interactuar de formas distintas con las membranas

bacterianas, que están densamente poblados por fosfolípidos con carga negativa. Por

consiguiente, pueden tener una alta probabilidad de ser antimicrobianos.

Basados en estas consideraciones, en este estudio se evaluó la actividad de tres

fragmentos peptídicos derivados de la proteína Cry46Aa1 denominados: P264-G274, Loop1-


PS2Aa y Loop2-PS2Aa frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp, bacteria que se

caracteriza por afectar los cultivos de interés en la región nororiental de nuestro país.

Inicialmente, se realizó una cinética de crecimiento para conocer el tiempo de

duplicación de la cepa fitopatógena y se evaluó la actividad hemolítica de cada uno de los

compuestos. Así mismo, se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y

Concentración Mínima Bactericida (CMB) de los péptidos frente a la bacteria anteriormente

mencionada. Adicionalmente, las concentraciones analizadas de los compuestos fueron en un

rango de concentración de 4 a 150μM, siendo el péptido Loop2-PS2Aa el más bioactivo

obteniendo porcentajes de inhibición de 44.41% y 51.98% a las concentraciones de 100 µM y

150 µM, respectivamente. Asimismo, se evaluaron concentraciones más altas para este

compuesto.

Se empleó el agroquímico Oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl) como control positivo a las

mismas concentraciones que los péptidos mostrando una menor inhibición a concentraciones

bajas en comparación con el péptido Loop2-PS2Aa. Sin embargo, a la concentración

recomendada (2g/L o 9364.6 µM) para tratar especies fitopatógenas de Pseudomonas sp inhibió

el 99.9% de crecimiento, siendo esta la CMB. Con los resultados obtenidos se pretende recopilar

información acerca de posibles fragmentos bioactivos de la toxina Cry46Aa1 del dominio I, que

aún no se han evaluado frente a bacterias fitopatógenas.


Abstract

Title

Determination of the Antimicrobial and Hemolytic Activity of Native Peptide Fragments

of the Cry46Aa1 Toxin Against Pseudomonas sp.

Author


Keywords

Antimicrobial Peptides, Cry Proteins, Antimicrobial Activity, Pseudomonas sp.

Description:

Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive, aerobic bacterium characterized by producing

parasporal crystals -Cry proteins- with insecticidal effects against pests. However, in recent years

it has been documented that a group of Cry proteins do not show insecticidal or hemolytic

activity. They show activity against bacteria or cancer cells. Although the mechanism of action

of this group of proteins has not been fully elucidated, its fragmentation into peptides,

accompanied by computational support, can shed light on the binding sites or the form of cellular

internalization.

The amphipathic characteristic of this group of compounds, peptides, is crucial for the

interaction with the membrane, where the positive charges in this group of molecule are

important to generate selectivity, by interacting discriminatively with bacterial membranes,

which are densely populated by phospholipids with negative charge. Consequently, they may

have a high probability of being antimicrobial.

Based on these considerations, this study evaluated the activity of three peptide fragments

derived from the Cry46Aa1 protein called: P264-G274, Loop1-PS2Aa and Loop2-PS2Aa against


phytopathogenic species of Pseudomonas sp, a bacterium that is characterized by affecting

cultures of interest in the northeastern region of our country. Initially, growth kinetics were

performed to determine the doubling time of the phytopathogenic strain and the hemolytic

activity of each of the compounds was evaluated. Likewise, the Minimum Inhibitory

Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) of the peptides against

the aforementioned bacteria were determined. Additionally, the analyzed concentrations of the

compounds were in a concentration range of 75 to 150μM, with the Loop2-PS2Aa peptide being

the most bioactive, obtaining inhibition percentages of 44.41% and 51.98% at concentrations of

100 µM and 150. µM, respectively. Also, higher concentrations were evaluated for this

compound.

The agrochemical Copper Oxychloride (Cu2(OH)3Cl) was used as a positive control at

the same concentrations as the peptides, showing less inhibition at low concentrations. However,

at the recommended concentration (2g/ L or 9364.6 µM) to treat phytopathogenic species of

Pseudomonas sp, it inhibited 99.9%, being this the CMB. The results obtained are intended to

gather information about possible bioactive fragments of the Cry46Aa1 toxin from domain I,

which have not yet been evaluated against phytopathogenic bacteria.


1 Introducción

Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia, que se caracteriza por

producir cristales parasporales con efectos insecticidas frente a plagas como lepidópteros,

coleópteros y dípteros, entre otros órdenes de insectos. En la década de los años 70 se definieron

dos grupos: toxinas Cry (Crystal) y toxinas Cyt (Cytolitic), de acuerdo con la producción de δ-

endotoxinas (Jouzani et al., 2017). Debido a los resultados obtenidos derivados del control de

plagas se aislaron nuevas cepas de Bt a partir de diversos nichos ecológicos donde se reveló la

producción de proteínas Cry que no presentan actividad insecticida o hemolítica, pero que han

demostrado actividad frente a microorganismos y líneas cancerígenas (Velásquez C et al., 2018).

Cry46Aa1 es un es un polipéptido de 338 residuos de aminoácidos, conformada principalmente

por hojas β, que se enrollan y alargan sobre el eje de la molécula; estructura similar a la toxina

aerolisina β-formadora de poros (TFP). Sin embargo, a pesar de sus estudios estructurales, aún

no se ha determinado un modelo completo del mecanismo de acción de la Cry46Aa1 (Yang et

al., 2019).

La fragmentación de la proteína Cry46Aa1 en secuencias más cortas- péptidos-

seleccionando regiones del dominio I puede dar luces acerca de los sitios de unión de la proteína

a membranas biológicas; o a su vez por ser este tipo de molécula con menor peso molecular,

anfipática, con amplio espectro de acción pueden también presentar una actividad antibacteriana

prometedora. Los péptidos antimicrobianos (PAMs) son oligopéptidos con un número variable

de aminoácidos (longitud de cadena entre 7 y 50 residuos), que presentan propiedades

fisicoquímicas tales como estructura secundaria α-hélice, carga total positiva e hidrofobicidad.

Estas características afectan la interacción entre los PAMs y la membrana de la célula. Los


PAMs exhiben un amplio espectro de actividad frente a bacterias Gram-positivas y Gram-

negativas, hongos, parásitos, virus y células tumorales debido a que presentan toxicidad selectiva

permitiendo atacar de manera específica la célula diana mediante mecanismos que al parecer

dificultan la aparición de fenómenos de resistencia.

Por lo anterior, el presente trabajo de investigación se enfocó en evaluar la actividad

fragmentos peptídicos nativos de la protoxina Cry46Aa1, producida por Bt tomando como

modelo la bacteria de Pseudomonas sp fitopatógena; cepa oportunista asociada como la causante

de la producción de enfermedades en cultivos como tomate, arveja papa y cebolla considerados

de interés económico en Colombia y la Región Santandereana. Este tipo de patógeno

actualmente es atacado por los agricultores utilizan compuestos bactericidas para controlar la

enfermedad (por ejemplo, oxicloruro de cobre); sin embargo, esta práctica podría causar graves

daños al medio ambiente y la salud humana y también promueve la selección de cepas patógenas

con mayor tolerancia al cobre (Cu).

Inicialmente, se estudió la cinética de crecimiento de la cepa fitopatógena Pseudomonas

sp. Luego, se evaluó la capacidad antimicrobiana de los péptidos nativos derivados del dominio I

de Cry46Aa1 denominados: P264-G274, Loop1-PS2Aa y loop2-PS2A mediante la

determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida

(CMB) frente a Pseudomonas sp fitopatógenas, como posibles compuestos líderes bioactivos.

Finalmente, se evaluó la actividad hemolítica de estos compuestos, ya que se consideran

moléculas de amplio espectro de acción antibiótica. En consecuencia, se proponen como

moléculas prometedoras dentro del desarrollo de nuevas estrategias para el control biológico y

con los resultados obtenidos se busca recopilar información acerca de posibles fragmentos


bioactivos de la protoxina Cry46Aa1, que aún no se han evaluado frente a bacterias

fitopatógenas.


2 Planteamiento del Problema

La colonización bacteriana de los tejidos vegetales es un fenómeno natural facilitado por

la presencia de nutrientes, humedad y pH. Como consecuencia, las enfermedades bacterianas son

responsables de pérdidas considerables en muchos cultivos, lo que afecta su rendimiento y

calidad en todo el mundo. Ralstonia solanacearum, Pseudomonas syringae, Xanthomonas

campestris, Xylella fastidiosa, Dickeya dadantii y algunas especies de Pectobacterium son entre

los patógenos vegetales más importantes en términos de virulencia y por tanto, con impacto

económico. Sin embargo, estas especies son solo una pequeña parte de la gran cantidad de

patógenos vegetales (Gutiérrez-Pacheco et al., 2019).

La penetración de las bacterias en la planta se efectúa a través de aberturas naturales o

heridas, después se introducen en los espacios intercelulares. Se dispersan por el viento y el agua

de lluvia, así como por insectos vectores. También, se pueden mover por el agua utilizada en los

riegos, contacto de plantas infectadas, semillas, injerto y por equipos mecánicos utilizados

causando contaminación cruzada (Bernal, 2010). En Colombia, específicamente en la región

Nororiental del país los cultivos de tomate, arveja y cebolla, cultivos de interés económico por su

oferta y demanda, (DANE, 2020), son afectados por bacterias fitopatógenas como Pseudomonas

sp, la cual aumentan su población de manera rápida y de ahí su importancia como patógeno, ya

que pueden producir enormes cantidades de células en un corto período de tiempo debido a su

crecimiento exponencial.

El género Pseudomonas, es uno de los principales patógenos oportunista tanto en plantas

como en animales, puede encontrarse presente en gran cantidad de nichos ecológicos. Además,

gracias a su poca exigencia nutricional y su alta resistencia a la gran mayoría de antimicrobianos

por el uso indiscriminado, influencia negativamente sobre ambientes y la salud humana. Este


fitopatógeno se presenta como uno de los principales problemas para los cultivos de tomate,

arveja y cebolla; entre las especies más comunes se encuentra Pseudomonas syringae (P.

syringae) y Pseudomonas sp (P. sp) causantes de manchas necróticas del tomate o manchas

bacterianas, esta enfermedad se presenta sobre frutos como pequeñas manchas negras

superficiales a veces de menos de 1 mm de diámetro, su tejido alrededor de la fruta madura

lentamente o simplemente no madura (Alvarado-Martínez, 2013). En el caso del cultivo de

alverja causa bacteriosis. Asimismo, Pseudomonas viridiflora (P. viridiflora) afecta los cultivos

de cebolla causando manchas alargadas en las hojas y putrefacción del bulbo. En el caso de

Pseudomonas cepacia (P. cepacia) causa pudrición blanda al cultivo y Pseudomonas aeruginosa

(P. aeruginosa) causa la podredumbre parda interna en estos cultivos de interés.

Los agroquímicos más utilizados para la protección de los cultivos frente Pseudomonas

sp son: el Ácido yodhídrico (HI), el antibiótico Kasugamicina y el Oxicloruro de cobre

(Cu2(OH)3Cl); estos agroquímicos, producto de la actividad agrícola intensiva, (Zayas, 2014)

pueden generar alto niveles de contaminación ambiental, intoxicaciones en mamíferos y plantas,

causar genotoxicidad, toxicidad crónica, fallo renal o necrosis tubular en plantas por el uso

indiscriminado, afectar la flora, fauna y recursos naturales producto de la acidificación,

contaminación de acuíferos y acumulación de sales que afectan las interacciones microbianas

(Vargas-González et al., 2019).

A partir del siglo 20, en la década de los 70, empezó una gran demanda de alimentos,

convirtiéndose la agricultura de gran importancia para la economía global , generando una

expansión de las áreas de cultivo y riego, así como una mayor utilización de fertilizantes y

agroquímicos buscando tener buenos rendimientos, siendo de importancia las Buenas prácticas

agrícolas (BPA) que están orientadas por un grupo de normativas que pretenden proporcionar


recomendaciones técnicas para la calidad de la producción, mostrando interés por la protección

de la salud de los consumidores, las condiciones laborales en la agricultura y principalmente

enfocados en la conservación del medio ambiente (Moreira García & Vera Pincay, 2016).

Por lo anterior, se proponen lo péptidos antimicrobianos(PAMs) como moléculas

prometedoras frente a bacterias fitopatógenas. La actividad de los PAMs es muy amplia y puede

ser dividida en 5 diferentes : (1) antibacteriana como el caso del efecto sinérgico de dos péptidos

Nisin y P10 con antibióticos convencionales contra los aislados de Acinetobacter baumannii

microorganismo altamente resistentes a los medicamentos y Pseudomonas aeruginosa resistentes

a la colistina (Jahangiri et al., 2021), del mismo modo (2) antifúngica, como la fracción Fa5 de

proteínas extraídas en frutos de Capsicum annuum L, que contiene bandas de proteínas

principales de 17 y 6,5 kDa, mostrando actividad contra las especies del género Fusarium (dos

Santos et al., 2017), (3) antiparasitaria, asi como es el caso de jelleina, un péptido derivado de la

jalea real con efecto antileishmanial y su forma conjugada de ácido láurico contra dos parásito

Leishmania major (L. major) (Zahedifard et al., 2020); por otra parte,(4) antiviral, es el péptido

P1 que inhibe la infección por el virus de la encefalitis japonesa (JEV) en células BHK-21 con

una capacidad inhibidora del 50% a una concentración de 35,9 μM (Wei et al., 2020). de otro

modo péptidos con acción (5) anticancerígena por ejempló F4d y F4e ensayados frente a

modelos de cáncer de mama en ratones, mostrando una disminución de sus tumores y

aumentando su esperanza de vida (Dehghan-Manshadi et al., 2021). Por consiguiente, cientos de

PAMs han sido probados contra casi todas las bacterias, virus y parásitos. La mayoría de los

PAMs tienen una indiscutible función frente a bacterias Gram (-) y Gram (+) y su actividad

frente a bacterias patógenas ha sido su principal campo de aplicación (Jahangiri et al., 2021).


3 Justificación

La agricultura desempeña un papel crucial en Colombia al formar parte de las bases del

sistema económico; no sólo proporcionando alimentos y materias primas, sino también

oportunidades de empleo, lo cual representa ganancias económicas para las regiones productoras;

en el país se produce cerca de 632 mil toneladas de tomate, siendo una hortaliza fácilmente

cultivada dentro del territorio colombiano donde su producción impulsa principalmente las

regiones de Santander, Boyacá y Antioquia. Durante el año 2015 se cultivaron en Colombia

cerca de 34.441 hectáreas, las cuales tuvieron una producción cercana a las 110 mil toneladas.

Además, el DANE afirmó para la misma fecha que los cultivos de cebolla tuvieron una

producción de 196.920 toneladas, con rendimientos promedios de 21,4 toneladas por hectárea al

año; siendo el departamento de Boyacá el principal productor seguido por los departamentos de

Cundinamarca, Norte de Santander y Santander. Por su parte, otro cultivo de importancia es la

arveja, siendo la segunda leguminosa de mayor importancia Según la Encuesta Nacional

Agropecuaria (DANE, 2020).

Esto cultivos sin lugar a dudas, representan la base de la economía de muchos

departamentos en Colombia y que como se mencionó anteriormente son susceptibles a ser

infectados por bacterias fitopatógenas como Pseudomonas sp (Argerich et al., 2013; Blanco,

2006). Los agricultores utilizan compuestos bactericidas para controlar la enfermedad (por

ejemplo, Oxicloruro de cobre); sin embargo, esta práctica podría causar graves daños al medio

ambiente y la salud humana y también promueve la selección de cepas patógenas con mayor

tolerancia al cobre (Velásquez Alcalá et al., 2014).

En este sentido, en la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos, péptidos nativos

derivados de las proteínas Cry producidas por Bt se proponen como una posible alternativa. Los


PAMs que suelen tener varias dianas de acción (membrana bacteriana e inhibición de proceso a

nivel intracelular), permitiendo combatir la resistencia antimicrobiana gracias a sus cargas

catiónicas que suelen interferir en la síntesis y plegamiento de proteínas a nivel intracelular

(Prada-Prada et al., 2020; Téllez & Castaño, 2010). A nivel de membrana sus mecanismos de

interacción con los componentes de las membranas bacterianas como los ácidos teicoicos,

lipoteicoicos en Gram-positivos y su interacción con las cargas negativas de los lipopolisacáridos

como es el caso del género de Pseudomonas (Yudina et al., 2007).

Basados en estas consideraciones, en la presente investigación se evaluaron estos

fragmentos peptídicos, como nuevos posibles agentes antimicrobianos, buscando identificar,

mediante ensayos in-vitro, los residuos involucrados en dicha actividad frente a Pseudomonas sp,

así como proponer y evaluar estos fragmentos peptídicos derivados de Cry46Aa1 para

reconocimiento de regiones que desencadenará en mejorar la actividad antimicrobiana. Donde se

obtuvo información sobre la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y Concentración Mínima

Bactericida (CMB) de estos Péptidos Antimicrobianos (PAM), A su vez, se obtuvo información

acerca la capacidad hemolítica de dichas regiones de interés.


4 Pregunta de Investigación

¿Cuál es la actividad antimicrobiana y hemolítica de fragmentos peptídicos derivados del

dominio I de la toxina Cry46Aa1 frente a la bacteria fitopatógena Pseudomonas sp?


5 Marco Teórico

5.1 Especies de Pseudomonas Patógenas en Plantas

5.1.1 Descripción

Uno de los grupos más variados y complejos de Gram-negativos es la bacteria del género

Pseudomonas (P.) (Figura 1), ya que contiene un gran número de especies (más de 203) y se

puede aislar de muchos abióticos diferentes (suelo, agua, aire) y ambientes bióticos (humanos,

animales, tejidos vegetales) (Barreteau et al., 2009).

Figura 1

Representación Esquemática de Pseudomonas sp

Nota. Representación esquemática: 1 = Citoplasma, 2 = Nucleoide, 3 = Membrana citoplasmática, 4 = flagelo, 5 =

Ribosoma, 6 = pared celular, 7 = cápsula, 8 = Pillis o fimbrias, 9 = Biofilm. Imagen realizada en (Bio Render, 2021).


Sus interacciones con las plantas son extensas: algunas tienen funciones como

rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) al estimular la síntesis de

fitohormonas como la auxina y giberelina y mejorando la biodisponibilidad de ciertos nutrientes

como el nitrógeno y el fosfato por solubilización (Marcelletti & Scortichini, 2014). Algunas

especies tienen actividad antagonista hacia los fitopatógenos (hongos, nematodos, levaduras,

bacterias) produciendo antibióticos, activando resistencia de las plantas, o mediante la exclusión

competitiva, como la competencia por el carbono y el hierro (Beiki et al., 2016).

El género Pseudomonas también contiene especies fitopatógenas distribuidas dentro del

linaje Pseudomonas fluorescens (P. fluorescens) en varios grupos y subgrupos filogenéticos. La

mayoría de las plantas las especies patógenas se concentran en Pseudomonas syringae, especie

que se considera la primera en el Top 10 de bacterias patógenas de plantas, además grupo

filogenético con al menos 14 especies (Oueslati et al., 2019).Otras se ubican en el grupo de

Pseudomonas putida (Pseudomonas monteilii) o en el grupo de P. fluorescens. En este último

grupo, los patógenos vegetales son encontrados dentro del subgrupo de Pseudomonas corrugata

(P. corrugata y Pseudomonas mediterranea), el subgrupo de P. fluorescens (Pseudomonas

constantinii, Pseudomonas lurida, Pseudomonas marginalis, Pseudomonas orientalis,

Pseudomonas tolaasii, Pseudomonas panacis y Pseudomonas simiae) y en el subgrupo de

Pseudomonas koreensis (Pseudomonas moraviensis).

En algunos estudios, Beiki y col., (Beiki et al., 2016) caracterizaron 5 nuevas especies

putativas de Pseudomonas que han demostrado ser patógenas para los cítricos:

P. orientalis, P. simiae, P. lurida, P. moraviensis y P. monteilii de una selección de 126 cepas de

Pseudomonas aisladas de hojas y tallos de cítricos enfermos en el norte de Irán. Las 126 cepas se

estudiaron utilizando un enfoque polifásico que incluyó caracterizaciones fenotípicas y análisis


de secuencias filogenéticas multilocus. La patogenicidad de estas cepas frente a 3 cultivos de

cítricos se demuestra en estudios de campo y de invernadero. Las cepas se agruparon

inicialmente fenotípicamente y por sus secuencias parciales del gen rpoD en 11 grupos

coherentes en la P. fluorescens linaje filogenético. Se seleccionaron y analizaron 53 cepas que

son representantes de los 11 grupos mediante la secuenciación parcial de sus genes 16S rRNA y

gyrB. Las secuencias parciales individuales y concatenadas de los tres genes se utilizaron para

construir los árboles filogenéticos correspondientes. La mayoría de las cepas se identificaron a

nivel de especie: P. lurida (5 cepas), P. monteilii (2 cepas), P. moraviensis (1 cepa), P. orientalis

(16 cepas), P. simiae (7 cepas), P. Syringae (46 cepas, distribuidos filogenéticamente en al

menos 5 patovares), y P. viridiflava (2 cepas).

Recientemente, Ouestlati y col (Oueslati et al., 2019) aislaron una colección de cepas de

Pseudomonas en diferentes regiones de Túnez en el período 2016-2017 a partir de frutos y hojas

de Citrus sinensis cv. y Citrus limon cv. Plantas con síntomas de explosión y enfermedad de

hoyo negro. En este estudio se realizó un análisis filogenético del gen de mantenimiento rpoD

para la identificación de cepas a nivel de especie. Los resultados demostraron la afiliación de

estas cepas con el género Pseudomonas y revelaron la presencia de 11 cepas que representan dos

nuevas especies putativas en dos ramas monofiléticas alas que denominaron: Pseudomonas

kairouanensis sp. nov. y Pseudomonas nabeulensis sp. nov.

5.1.2 Caracterización

Las cepas de Pseudomonas se pueden analizar morfológica y genotípicamente mediante

análisis de secuencia multilocus de la secuencia de genes rpoD, gyrB y 16S rRNA (rrs) (Oueslati

et al., 2019), y sus características fenotípicas por API 20NE y Biolog GEN III (Salazar de Vegas

et al., 2008). También, se pueden determinar los perfiles de proteínas principales y de ácidos


grasos por espectrometría de masas MALDI-TOF de células completas (Maldonado et al., 2018).

Las cepas también se han caracterizado por técnicas como REP-PCR y PCR Melting Profile

(PCR MP) para determinar el potencial de diversidad genética entre las cepas (Wei et al., 2020).

5.1.3 Patogénesis

Las Pseudomonas fitopatógenas causan enfermedades importantes en una variedad de

cultivos y los síntomas incluyen cancros, manchas de hojas y tallos, tizón, podredumbre blanda y

agallas. Los factores importantes de patogenicidad y virulencia son el sistema de secreción de

tipo III, la actividad de nucleación del hielo, la producción de metabolitos secundarios como las

fitotoxinas, las enzimas pectolíticas, los exopolisacáridos y la producción de hormonas

(Marcelletti & Scortichini, 2014).

Debido a la gran cantidad de especies de Pseudomonas fitopatógenas que existen, a

continuación, se resumen en la Tabla 1 se resumen las principales especies, cultivos que afectan

y enfermedades que producen (Beiki et al., 2016).

Tabla 1

Resumen de Pseudomonas Fitopatógenas, Cultivos que Afecta y Enfermedades/Síntomas que

Produce.

Pseudomonas patógenas Cultivo que afecta Enfermedad o síntomas

Pseudomonas agaric Agaricus bisporus

(Champiñón)

Branquias que gotean

Pseudomonas asplenii Asplenum nidus (Helecho

nido)

Mancha foliar y tizón

Pseudomonas cichorii Amplia gama de huéspedes Manchas de hojas y tallos

Pseudomonas constantinii Agaricus bisporus

(Champiñón)

Mancha marrón

Pseudomonas corrugata Solanum lycopersicum

(Tomate)

Necrosis de la médula


Tabla 1 (Continuación)

Pseudomonas patógenas Cultivo que afecta Enfermedad o síntomas

Pseudomonas fuscovaginae Oryzae sativa (Arroz)

Pudrición parda de la vaina

foliar

Pseudomonas marginalis

pv. Alfalfae

Medicago sativa (Alfalfa) Raíz parda, atrofia


pv. Marginalis

Amplia gama de huéspedes Necrosis marginal de la hoja,

pudrición blanda


pv. Pastinacea

Pastinaca sativa (Apio de

campo)

Pudrición parda de las raíces,

pudrición blanda

Pseudomonas mediterranea Solanum lycopersicum

(Tomate)

Necrosis de la médula

Pseudomonas palleroniana Oryzae sativa (Arroz) Débilmente patógeno para el

arroz

Pseudomonas salomonii Allium sativum (Ajo)

Enfermedad del café con

leche

Pseudomonas tolaasii Agaricus spp (Hongos) Mancha marrón

Pseudomonas kairouanensis

Pseudomonas nabeulensis

Citrus sinensis

Citrus limon

Explosión y enfermedad de

hoyo negro

Pseudomonas orientalis

Pseudomonas syringae

Pseudomonas. Viridiflava

Pseudomonas lurida

Pseudomonas simiaelas

Citrus macrophylla

Citrus sinensis

Citrus aurantium

Explosión de los cítricos y la

enfermedad del hoyo negro

Nota. Las enfermedades más comunes dentro de los cultivos de interés causadas por las especies fitopatógenas mas

importantes del genero de Pseudomonas

https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/citrus-limon


La mayoría de las especies patógenas de este género infectan a las plantas y sólo algunas

de ellas a los animales y al hombre, donde cabe destacar que la Pseudomonas aeruginosa es el

ejemplo de patógeno oportunista de los humanos y Pseudomonas syringae es el patógeno de las

plantas más común, estas últimas se denominan Pseudomonas fluorescentes puesto que, al crecer

en un medio nutritivo con bajo contenido de hierro producen pigmentos fluorescentes, de color

verde amarillo y con capacidad de difundirse.(Slabbinck et al., 2010)

Las infecciones bacterianas provocadas por Pseudomonas sp destruye numerosos cultivos

de interés económico en zonas tropicales y subtropicales, siendo difícil de combatir puesto que

es un patógeno multirresistente y fácilmente adaptable en el ambiente (González et al., 2009),

Donde este género produce gran cantidad de biopelículas, causantes de infecciones crónicas y a

su vez responsable de la resistencia contra algunos agroquímicos. Estas sustancia son

poliméricas altamente ordenadas, en hoja β cruzada, una estructura cuaternaria y capacidad de

auto ensamblé (Rouse et al., 2018) razón por la cual Pseudomonas sp se adhiere a las superficies

de la planta y utensilios utilizados en la agricultura, impidiendo un correcto control o

eliminación. El género Pseudomonas está compuesto por más de 100 especies, entre las especies

más fitopatógenas se encuentran: Pseudomonas cichorii causante de pérdidas postcosecha en

endivias (Cichorum endivia L.)(Alippi et al., 2002); Pseudomonas syringae causante de pecas

bacterianas en tomate y con más de 267 serotipos (Cai et al., 2011); Pseudomonas fluorescens

Migula causante de enfermedades en tomate (Solanum lycopersicum L.) y brócoli (Brassica

oleracea L.) (Pérez Álvarez et al., 2015); Pseudomonas solanacearum causante de la marchitez

bacteriana en papa (Alvarado-Martínez, 2013); Pseudomonas caryophyllí causante de la

marchitez vascular en el clavel y Pseudomonas marginalis la cual produce el ojo rosado en papa

y pudrición blanda (Peña sanchez & Paez mendieta, 2005).


5.2 Impacto Ambiental por Utilización de Agroquímicos

Actualmente la explotación de los recursos naturales, más específicamente el recurso

agua, se está viendo cada vez más afectado por la actividad del hombre; lo que generan gran

escasez del recurso y compromete la calidad del mismo. Esto se debe, en mayor proporción a

actividades agroindustriales que a través de vertimiento o filtración de los desechos producidos

directamente al agua; de arroyos, manantiales, ríos y mares, empeoran la condiciones físico-

químicas del líquido y por ende generan impactos negativos al ambiente en general. Por otra

parte, la contaminación con químicos peligrosos y sólidos es uno de los mayores problemas

provocado por la agricultura intensiva; entre estos contaminantes se destacan los compuestos

xenobióticos por su alta toxicidad y dificultad para ser degradados afectando la salud de las

poblaciones aledañas (Zayas, 2014).

Gran cantidad de sustancias xenobióticas son utilizadas en la agricultura, algunas de estas

sustancias son: compuestos químicos orgánicos e inorgánicos, representando un serio problema

para el ambiente por su genotoxicidad. Para ello, se tiene en cuenta el desarrollo y utilización de

nuevos métodos que generen un menor impacto ambiental. Por lo tanto, la utilización de

microorganismos (Bacterias, Hongos, algas, protozoos etc.) o metabolitos (proteínas, enzimas,

toxinas) que puedan ser utilizados para metabolizar, transformar, retener, mineralizar o para el

control biológico surgen como una alternativa que nos permite reducir el impacto ambiental

generado por los agroquímicos.

Así mismo, el sector agrícola representa aproximadamente el 70% de todas las

extracciones de agua dulce a nivel mundial (WWAP (Programa Mundial de Evaluación de los

Recursos Hídricos de las Naciones Unidas), 2017) o Según (OECD, 2017) se prevé que entre el

2000 y el 2050 la demanda mundial de agua para la producción industrial aumentará un 400%.


Cabe resaltar que se estima que para los próximos 30 años habrá un incremento del 10% al 15%

en la carga de nitrógeno que aportan los ríos a los ecosistemas costeros (Gleeson & Wada, 2012),

hundimiento del suelo y la intrusión de agua salada, todo esto debido a la demanda por la

producción de alimentos asociados al crecimiento de la población.

5.3 Proteínas Cry y Péptidos Antimicrobianos Derivados como Alternativa de

Agroquímicos Comerciales

Por otra parte, respecto a estudios donde se evaluaron péptidos antimicrobiano

encontramos que se evaluó el péptido BTM-P1 (Arias et al., 2009), que se deriva de la secuencia

de aminoácidos de la protoxina Cry11Bb1, muestra que los péptidos policatiónicos, causan la

permeabilización de la bicapa lipídica en biomembranas, de modo potencial-dependiente.

Además, este grupo de moléculas ampliamente versátiles hace parte del sistema de defensa del

huésped de muchos organismos, incluidos insectos, plantas y animales, La mayoría de estos tipos

de péptidos demuestran actividad frente a bacterias, hongos y protozoos, igualmente el creciente

número de organismos patógenos con resistencia a antibióticos convencionales, ha despertado

interés en aplicaciones de péptidos antimicrobianos para tratar infecciones, por ejemplo los

péptidos diseñados (BTM-P1, α2a hélix) extraídos del serotipo Bt, demostraron que BTM-P1

puede inducir la inflamación mitocondrial y causan desacoplamiento del sistema de fosforilación

oxidativa. Asimismo, se ha demostrado una inhibición del crecimiento frente bacterias Gram-

positivas y Gram-negativas a una concentración de 7.1 µM. (Mary et al., 2007).

En otros trabajos similares se han cuestionado la inocuidad de las proteínas Cry

producidas por Bt para las células de mamíferos, así como para el microbiota de los mamíferos.

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos citotóxicos y antimicrobianos de

dos proteínas Cry (Cry8Ka5 y Cry1Ac), una de esta la Cry1Ac es ampliamente distribuida en


cultivos transgénicos. Se determinó la citotoxicidad en eritrocitos de mamíferos de estas dos

proteínas, así como ensayos de actividad antimicrobiana, donde no se mostró inhibición del

crecimiento de los microorganismos analizados (Farias et al., 2014). Acerca de la capacidad de

las proteínas Cry, y algunos fragmentos de estas proteínas, con dicha capacidad de limitar o

inhibir el crecimiento bacteriano, encontramos un estudio donde se midió la actividad de

diferentes proteínas Cry frente a bacterias anaeróbicas y arqueas: Clostridium butyricum,

Clostridium acetobutylicum y Methanosarcina barkeri (M. barkeri). La microscopía mostró que

la lisis de las células de M. barkeri en presencia de un fragmento de 49 kDa de la toxina Cry3Aa

es generalmente similar a la lisis de células bacterianas, que se ha detectado previamente en

presencia de Cry11A, Cry1Ab y otras proteínas Cry. Además, la Cry1D tomada de una

subespecie Bt, mostró que algunos de sus componentes como el ácido teicoico y la N-

acetilgalactosamina tienen una posible influencia sobre las toxinas Cry, mejorando su actividad

antimicrobiana (Yudina et al., 2007).

En otros estudios realizados por Kim y cho., en el 2020 (Kim et al., 2020), se evaluaron

dos péptidos PA2 y GNU7 los culés no presentaron alta actividad antimicrobiana, mientras que

sus hibrido PA2-GNU7 mostro mejor actividad específica frente a P. aeruginosa, cepa resistente

a múltiples fármacos, donde La concentración mínima inhibitoria (MIC) de PA2-GNU7 contra P.

aeruginosa fue 2 µM. Sin embargo, no presenta dicha actividad contra otras especies de

Pseudomonas.

Otros estudios similares fueron realizados por Wong y col., (Won et al., 2009) donde

probaron péptidos Gaegurinas (GGN) antimicrobianos aislados de una rana rugosa con

aproximadamente 10-50 aminoácidos, estos péptidos demostraron un amplio espectro de


actividad antimicrobiana contra Bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, hongos y

protozoos, con baja actividad hemolítica.

5.4 Actividad Hemolítica

Según (Barros Meza, J., Cabrera Álvarez, J., Fuentes Forero, J., & Garcés Wilches, 2016)

para cuantificar la citotoxicidad en eritrocitos, normalmente se emplea la medida de la

concentración letal 50, la cual consiste en que la sustancia produzca la muerte de la mitad de la

población celular, al estar expuesta por dicho compuesto por un período determinado, donde se

evalúan diferentes concentraciones del compuesto con el fin de evidenciar los efectos tóxicos y

la mortalidad de los eritrocitos.

Se han cuestionado la inocuidad de las proteínas Cry de Bt para las células de mamíferos,

así como para su microbiota. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo evaluar los efectos

citotóxicos y antimicrobianos de dos proteínas Cry, Cry8Ka5 y Cry1Ac, una de ellas la Cry1Ac

es ampliamente distribuida en cultivos transgénicos. Se determinó la citotoxicidad en eritrocitos

de mamíferos de estas dos proteínas, así como ensayos de actividad antimicrobiana, donde no se

mostró inhibición del crecimiento de los microorganismos analizados (Farias et al., 2014).


6 Marco Legal

El aislamiento HSL30 se recolectó en el marco del proyecto 1299-12-17827 titulado:

caracterización de la enzima acíl homoserina lactonasa de una cepa de Bacillus thuringiensis y la

búsqueda de nuevos microorganismos productores de lactonasas y acilasas de potencial uso

biotecnológico, desarrollado en la Universidad de Santander, de diciembre de 2005 a diciembre

de 2008 con el apoyo de la Corporación para investigaciones Biológicas CIB y la Universidad

Nacional sede Medellín. La validación de la colección biológica se encuentra en curso, pues la

colecta se realizó previo a la entrada en vigor de los decretos 1375 y 1376 del Ministerio de

Medioambiente y Desarrollo Sostenible.

Este proyecto se anida dentro del programa de Colombia científica NanoBiocáncer, a

través del proyecto de la convocatoria 811 de 2018, estancias posdoctorales. En ese sentido, las

consideraciones éticas que avalan ambos proyectos abarcan el desarrollo de este. Brevemente,

dentro de este proyecto se utilizó eritrocitos humanos, obtenidos por un donante voluntario, al

que se le aplicó el consentimiento informado estándar para la recolección de material biológico

humano, en este consentimiento se señaló que el uso exclusivo del material era para las pruebas

de hemólisis de los péptidos, en ese sentido el título 4 de las Pautas CIOMS corresponde a un

estándar de riesgo mínimo en donde se realizó una única toma de 10 ml de sangre. Posterior a los

ensayos de hemólisis el material remanente fue descartado según lo señalan las políticas

institucionales para el manejo de residuos peligrosos. Dado que estas muestras colectadas no se

almacenaron y no constituyen el foco central de la investigación, no se aplican las pautas CIOMS

en su título 11 (Recolección, Almacenamiento Y Uso De Materiales Biológicos Y Datos

Relacionados).(CIOMS & OMS, 2016).


Según el material utilizado, la naturaleza del proyecto y su contexto, que no involucra

aplicación de los péptidos evaluados en humanos, no se trabajó con derivados de células

humanas, tejidos o material similar, no se le aplican la Declaración de Helsinki, el código de

Nuremberg, la resolución 2378 de 2008 o el tratado Belmont en ninguno de sus apartados.

De acuerdo a la resolución 8430 DE 1993, Por la cual se establecen las normas

científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud. Este proyecto no está

enmarcado en ninguno de los numerales contemplados en los títulos I, II y III, puesto que no

involucra ningún tipo de trabajo en humanos o dirigido a Humanos. Para el título IV, “De la

Bioseguridad de las Instalaciones”. Los requerimientos enunciados en el Capítulo I, Artículo 63

respecto a las instalaciones en las que se realice investigación con microorganismos patógenos o

material biológico que pueda contenerlos se cumplen a cabalidad. En el Numeral d, no se

requiere vigilancia médica del personal involucrado en esta investigación. Según lo estipulado en

el Artículo 64 el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de

Santander, UDES donde se desarrolló la propuesta de Investigación, se clasifica como

Laboratorio Básico de Microbiología; y los microorganismos que se manipularan durante el

desarrollo de la propuesta corresponden al Grupo de Riesgo I, según la clasificación del Artículo

67, su manejo se realizó de acuerdo a los parámetros establecidos por la Universidad de

Santander, UDES.(Colombia, 2012).


7 Objetivos

7.1 Objetivo General

Evaluar la actividad antimicrobiana y hemolítica de fragmentos peptídicos nativos

derivados del dominio I de la Cry46Aa1 frente a una especie fitopatógena de Pseudomonas sp y

eritrocitos de mamíferos, respectivamente.

7.2 Objetivos Específicos

Determinar la cinética de crecimiento del fitopatógeno Pseudomonas sp en

presencia de los fragmentos derivados de Cry46Aa1 al estar expuesta a diferentes

concentraciones.

Determinar la actividad antimicrobiana de fragmentos peptídicos nativos de

Cry46Aa1 frente a la bacteria Pseudomonas sp fitopatógena.

Evaluar la citotoxicidad de los fragmentos peptídicos nativos de la proteína

Cry46Aa1 en eritrocitos de mamíferos.


8 Hipótesis

8.1 Hipótesis de Investigación

Los péptidos nativos derivados del dominio I de la Cry46Aa1 presentan actividad

antimicrobiana frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp y no presentan actividad

hemolítica frente a eritrocitos de mamíferos.

8.2 Hipótesis Nula

Los péptidos nativos derivados del dominio I de la Cry46Aa1 no presentan actividad

antimicrobiana frente a especies fitopatógenas de Pseudomonas sp, sin embargo, estos presentan

actividad citotóxica frente eritrocitos de mamíferos.

8.3 Hipótesis Alternativa

Los péptidos nativos derivados del dominio I de la Cry46Aa1 no presentan actividad

antimicrobiana, ni citotóxica frente al fitopatógeno Pseudomonas sp y eritrocitos,

respectivamente.


9 Metodología

9.1 Diseño de Estudio

Estudio de investigación experimental.

9.2 Esquema Metodología

La metodología desarrollada comprendió las etapas de la Figura 2.

Figura 2

Esquema General de la Metodología.

Nota. Este fue el esquema utilizado para analizar los compuestos P264- G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa también

denominados 3891, 3897 y 3899 respectivamente

9.3 Materiales y Métodos

La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular y

Biotecnología (Biomol) de la Universidad de Santander (UDES).


La cepa utilizada en la investigación fue HSL30 la cual presenta un 98% de homología

para Pseudomonas sp según los análisis de secuencia, mostrados en el proyecto 1299-12-17827,

donde además se evaluó su capacidad para causar afectaciones en rodajas de papa, con

aproximadamente 108 UFC mostrando una capacidad de infección en esta solanácea importante

dentro de la agricultura, La cepa HSL30 se obtuvo de un aislado de suelos contaminados con

órgano clorados en Agustín Codazzi (Departamento del Cesar), los cuales se encontraban cerca de

cultivos de papa y tomate con sintomatología referente al género Pseudomonas (Sánchez et al.,

2013)

9.3.1 Propiedades Fsicoquímicas de los Péptidos

Los péptidos sintéticos: P264-G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa fueron utilizados

para la realización de los ensayos propuestos. Estos compuestos fueron sintetizados mediante la

estrategia F-moc en bolsitas de té, purificados en una columna C-18, caracterizados por

Cromatografía líquida de alta resolución acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) y

Dicroísmo Circular (DC) en el Laboratorio de Síntesis de Péptidos de la Pontificia Universidad

Católica de Valparaíso (PUCV), Valparaíso-Chile y se encontraban disponibles en el Grupo de

Investigación de Biología Molecular y Biotecnología (Biomol) de la Universidad de Santander

(UDES).

Inicialmente, se preparó una solución stock de cada uno de los péptidos en tampón

fosfato de sodio (10 mM pH 7,2) y los compuestos fueron almacenados hasta su uso a -80 ° C.

En la (Tabla 2) se pueden apreciar las secuencias de los péptidos nativos y sus propiedades

fisicoquímicas, las cuales fueron calculadas en el servidor de péptidos (Bachem AG, 2020).

La selección de los compuestos se realizó teniendo en cuenta los datos obtenidos a partir

de los análisis de Biología Computacional (BC) de las regiones de Cry46Aa1 que posiblemente


presente interacción con membranas biológicas. Los péptidos evaluados fueron: 2 péptidos

derivados del Loop1 y Loop2 denominados: Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa, y un péptido

derivado del dominio I denominado P264-G274.

9.3.2 Activación de la Cepa HSL30

Para la activación de la cepa HSL30, se realizó en un criovial del aislado de Pseudomonas

sp. Posteriormente, se inocularon 100μL en caldo nutritivo (CN) por 24h a 37°C, el cual contiene

peptona y la glucosa (C6H12O6) que brindan nutrientes, donde las peptonas son fuentes de

nitrógeno orgánico, carbono, azufre y vitaminas. La glucosa es la fuente de carbohidratos

(Condalab, 2019), estos componentes permiten la recuperación efectiva en el cultivo de

Pseudomonas sp.

Posteriormente, la cepa activada en CN se pasó a un medio Agar Müller Hinton (MH) y

Müller Hinton Caldo (MHC), buscando adaptar la cepa antes de los ensayos antimicrobianos, este

medio es utilizado para las pruebas de sensibilidad y susceptibilidad de las baterías frente

antimicrobianos (HiMedia, 2016). Por lo anterior, se utilizó en este estudio para evaluar la cinética

de crecimiento, la Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50) y Concentración Mínima

Bactericida (CMB), además de ser el medio utilizado para preparar las concentraciones peptídicas

de los fragmentos de Cry46Aa1 y el oxicloruro de cobre como control positivo.

9.3.3 Cinética de Crecimiento

Con el fin de conocer las fases de crecimiento y adaptación del microorganismo

Pseudomonas sp se determinó su cinética de crecimiento. En breve, se adicionaron 5 mL de

inóculo del microorganismo de interés (Pseudomonas sp) y 45 mL del medio Müller Hinton

Caldo (MHC) (pH 6.5). Luego, el caldo de cultivo se incubó (incubadora Shaker®) con agitación

constante a 100 rpm y 37°C. Posteriormente, se evaluó el crecimiento de la cepa durante 13


horas, realizando mediciones cada hora por medio de una densidad óptica de 600 nm

conociendo la absorbancia y un valor aproximado de células/mL dada por el equipo (BIO-RAD

SmartspecTM Plus) (Engel, 2011), . En cada medición se determinó el conteo de

microorganismos viables en Unidades Formadoras de colonias por mililitro (UFC/ml) utilizando

el método de siembra en placa con agar Müller Hinton (MH). Las siembras se realizaron

utilizando diluciones desde 10-1 hasta 10-9 en solución salina al 0,7%. Las cajas fueron incubadas

por 24 h a 37°C y las colonias fueron contadas. Se tuvo en cuenta únicamente las cajas de Petri

con conteos entre 30 y 300 colonias. Las siembras se realizaron por triplicado con el fin de tener

mayor confianza mediante un promedio de UFC/mL (Jurado-Gámez et al., 2015). Partiendo de

estos resultados la cinética de crecimiento se inició a una concentración de 17x106 UFC/mL

expresando los resultados mediante una curva de crecimiento donde se compara la OD600 y las

UFC/mL (Hernández-García & Acebo-González, 2013).

9.3.4 Estandarización del Inoculo Mediante Absorbancia

Con el fin de facilitar la preparación del inoculo y tener mayor claridad de las UFC/mL

presentes al inicio de cada ensayo, se implementó el método de turbidimetría fundamentado

como un fenómenos ópticos, permitiendo mediciones con buena linealidad y seguridad, siendo

altamente utilizado en los procesos de cinética microbiana y procesos biotecnológicos, otorgando

una mayor estabilidad del proceso y alta tasa de reproducibilidad (Hernández-García & Acebo-

González, 2013). las mediciones de absorbancia se realizaron a una longitud de 600 nm para

conocer la concentración bacteriana, teniendo en cuenta la concentración inicial en la cinética de

Pseudomonas sp, se utilizó el OD600, buscando obtener una absorbancia igual a 0.1, para esto se

dejó el inoculo 12h y se realizaron diluciones hasta obtener la lectura requerida.


9.3.5 Ensayo de Actividad Antimicrobiana

La evaluación de la actividad antimicrobiana de los péptidos frente a Pseudomonas sp, se

determino como se ha documentado previamente (Chen et al., 2017).

9.3.5.1 Concentración Mínima Inhibitoria Media (CMI 50). La concentración mínima

inhibitoria media (CMI 50) se determinó mediante el método de microdilución descrito en el

protocolo m07-a9 del clinical and laboratory standards institute (Clinical Laboratory Standards

Institute, 2018). brevemente, se colocaron diluciones de los péptidos P264-G274, Loop1-PS2Aa y

Loop2-PS2Aa en caldo Müller Hinton (MHC) en una microplaca de 96 pocillos a concentraciones

en el intervalo de (75, 100 y 150, 200, 300, 400, 500 μM). Se utilizó Oxicloruro de cobre como

control positivo en la concentración de 2g/L como se recomienda (Argerich et al., 2013), mientras

que el caldo correspondiente sin péptido se utilizó como control negativo. El preinóculo bacteriano

se preparó a partir de un subcultivo de Pseusomonas sp en MHC incubado durante 18-24 horas a

37 ± 2˚C. La suspensión de bacterias se diluyo a 1x108 unidades formadoras de colonias UFC/mL,

obteniendo una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de McFarland, confirmada por

espectrofotometría al alcanzar una absorbancia entre 0.08-0.1 a una longitud de onda de 600 nm;

obteniendo una concentración final de 17 x106 UFC/mL para posteriormente añadir la suspensión

bacteriana a la placa de 96 pocillos que contenía los péptidos diluidos previamente. Después, la

absorbancia de cada pocillo a 600 nm (OD600) se midió usando un lector de microplaca (Varioskan

Lux, Thermo Fisher Scientific Inc. MA, EE. UU.) El volumen final de 200 μL por pocillo consistió

en 100 μL del compuesto y 100 μL de la suspensión bacteriana, estas a una concentración de 2x

para compensar la dilución. La Concentración Mínima Inhibitoria media (CMI50) se definió como

la concentración más baja de péptido que previene el crecimiento del 50% de la población


bacteriana al observar absorbancias bajas en comparación a la cinética de Pseudomonas sp, Todos

los resultados fueron el promedio de tres medidas independientes.

9.3.5.2 Concentración Mínima Bactericida (CMB). La CMB se determinó como se

describe en el Protocolo M26-A del CLSI, 1999 (Prada-Prada et al., 2020). Para este caso, se

inocularon subcultivos en placas de agar nutritivo, agregando 100 μL de los pocillos tratados con

péptidos que en el ensayo de CMI50 no muestren un crecimiento visible del microorganismo. Los

cultivos de agar nutritivo se incubaron a 37 ± 2˚C durante 18-24 horas, y se estimó el número de

UFC. La CMB se interpretó como la concentración de compuesto en el que el recuento de

colonias fue igual o inferior a 10.

9.3.6 Determinación del Porcentaje de Hemólisis de los Péptidos Nativos en Eritrocitos de

Humano

Se determinó la hemólisis en eritrocitos humano midiendo el porcentaje de células no

viables inducida a diferentes concentraciones de los compuestos en un rango de concentración de

75 a 150 µM. Como control positivo se utilizó una suspensión que contenía los eritrocitos y

Tritón X-100 al 1%. Esta combinación desordena la membrana en todos los niveles y mediante

mecanismos independientes la solubiliza produciendo un 100% de hemólisis. El porcentaje de

hemólisis se calculó mediante la siguiente ecuación: (%) Hemolisis = ((As+A0) /(A100-A)) x

100%.

Donde As es la absorbancia de la muestra que es evaluada, A100 es la absorbancia de los

eritrocitos lisados en 0,1% Tritón X-100 y A0 es la absorbancia sin presencia de hemólisis.

Todos los ensayos se realizaron por triplicado (Fern et al., 2010). Los péptidos que presentaron

baja hemólisis (<20%) fueron utilizados en las siguientes fases a nivel experimental.


9.3.7 Análisis de los Resultados

Todos los ensayos experimentales se realizaron por triplicado en 3 ensayos

independientes y los resultados obtenidos se analizaron en el software estadístico Graphpad

Prism 9, mediante un análisis one-way ANOVA y Tukey. Además, se determinó el promedio, la

desviación estándar, el coeficiente de variación teniendo en cuenta las réplicas en los ensayos al

analizar los compuestos P264-G274, Loop1-PS2Aa, loop2-PS2Aa y Oxicloruro de cobre con sus

concentraciones (75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 μM y 2g/L) mediante gráficos, tablas,

esquemas, entre otros.


10 Resultados y Discusión

10.1 Estructura Secundaria In Silico de los Péptidos

En la (Figura 3), se muestra la estructura secundaria in silico de los péptidos obtenidos

con el software PEP-FOLD 3.5 , en la cual se puede observar que los péptidos que presentan una

estructura simulada de α-hélice (Lamiable et al., 2016).

Figura 3

Estructura Secundaria de Péptidos

Nota. estructura secundaria teórica in silico de P264- G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa también denominados

3891, 3897 y 3899 respectivamente

La concentración inicial de cada uno de los péptidos del dominio 1 de la proteína

Cry46Aa1 fue determinada por espectrometría UV-Vis a una longitud de onda de 220 y 280 nm


(Tabla 2). Partiendo de estas concentraciones se prepararon soluciones stock de 500 µM en un

tampón fosfato de sodio (10 mM pH 7,2).

Tabla 2

Secuencia de Péptidos Nativos Derivados del Dominio 1 de Cry46Aa1 y sus Propiedades

Fisicoquímicas.

Péptido Secuencia PM

[g/mol]

Carga

neta a

pH

7.0

Hidrofilicidad

media

Residuos

hidrófilos

/N° total de

residuos

Concentración

inicial [µM]

P264-

G274

(3891)

PARDV**

TTSG-NH2 1129.24 +1 0,2 36%

1274.2

Loop1-

PS2Aa

(3897)

NNETY**

AVKP-

NH2

1295.42 +1 -0,1 45%

1251

Loop2-

PS2Aa

(3899)

TYFNA**

PPITA-

NH2

1320,55 +2 -0,6 17%

3041

Nota. Los péptidos fueron cuantificados por espectrometría UV-Vis y sus datos de concentración están expresados

en μM, Los asteriscos pueden corresponder a los aminoácidos= L, F, N, V y K(Peso molecular (PM), Punto

isoeléctrico (pI), estas propiedades fueron calculadas utilizando el software (Bachem AG, 2020)

Para llevar acabo los ensayos de este trabajo, lo primero que se hizo fue determinar las

propiedades físico-químicas de los fragmentos peptídicos derivados de Cry46Aa1, como se

aprecia en los resultados de la Tabla 2, donde se muestra que en el péptido perteneciente al

Loop1-PS2Aa obtuvo un 45% de residuos hidrófilos, siendo este menos bioactivo en

comparación al péptido Loop2-PS2Aa, ya que este último tiene menor porcentaje de residuos

hidrófilos con un 17%, por tal motivo este péptido tiene mayor cantidad de residuos hidrofóbicos

y por ende se puede insertar en las bicapas lipídicas de la membrana más fácilmente.


Adicionalmente, en la Tabla 2, se muestran las cargas netas positivas a pH 7.0 de +1, +1

y +2 para los péptidos P264-G274, Loop1-PS2Aa y Loop2-PS2Aa, respectivamente donde este

última muestra una dominancia de sus cargas catiónicas frente a los demás péptidos evaluados,

característica que le podría facilitar su interacción de forma más factible con las superficies

aniónicas. (Yang et al., 2019). Por su parte, los asteriscos en estos péptidos se expresan para

mantener la confidencialidad puesto que tiene un valor biotecnológico y un campo de acción

considerable, debido a que demostraron tener actividad tanto en Pseudomonas sp como en líneas

cancerígenas.

10.2 Cinética de Crecimiento de Pseudomonas sp Fitopatógena

El crecimiento del inóculo de la cepa bacteriana Pseudomonas sp, fue medido a una

longitud de 600 nm. Para realizar ensayos microbiológicos bajo condiciones equivalentes es

necesario trabajar con la misma cantidad de biomasa en una fase de crecimiento similar

(Hernández-García & Acebo-González, 2013), por tal motivo se utilizó una curva de calibración

que relaciona dicha UFC con una magnitud física tal como la absorbancia. No obstante, la

absorbancia no es una medida directa del número de células viables, por esto fue necesario realizar

mediciones de biomasa mediante el método de conteo en placa, el cual permitió contar células

vivas. En la Figura 4, se muestran los resultados obtenidos a partir del comportamiento de la cepa

HSL30 a nivel experimental.

La cepa HSL30 utilizada en este proyecto, es un serotipo de Pseudomonas fitopatógena,

la cual se conoce que causa afectaciones como manchas necróticas, bacteriosis, putrefacción,

entre otras patologías en cultivos de papa y tomate. Sin embargo, no se conocía su curva de

crecimiento. Por tal motivo, fue necesario identificar su comportamiento de crecimiento en el

medio Müller-Hinton (MH), como se muestra en la Figura 4. No obstante, las condiciones del


biorreactor, la composición del medio y la procedencia de la cepa pueden inferir en el

crecimiento como se denota en un estudio, donde realizaron la cinéticas de crecimiento de

Pseudomonas sp suministrando variables como el coeficiente volumétrico de trasferencia de

oxigeno (kLa), además de otras variables como 600rpm, temperatura y medios modificados,

razón por la cual se muestras diferentes resultados en sus cinéticas mostradas (Guerra-López &

Zúñiga-Dávila, 2018).

Figura 4

Cinética del Crecimiento Exponencial de Pseudomonas sp (Fitopatógena)

0 5 10 15

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0

5×107

1×108

1.5×108

Tiempo (h)

0D

60

0

UF

C/m

L

OD600

UFC/mL

Nota. La grafica azul corresponde a la densidad óptica medida a una longitud de 600nm, mientras que la gráfica roja

muestra el crecimiento de Pseudomonas sp expresado en UFC

Con el fin de realizar los ensayos antimicrobianos inicialmente se consideraron las

variables como: velocidad de crecimiento, concentración inicial, tiempo de duplicación;

incremento total de células, entre otras en la cepa HSL30. Por tal motivo, se realizaron

mediciones durante 24 tiempos, con el fin de evaluar la cinética de crecimiento mostrada en la

Figura 4, para esto se utilizó el medio de cultivo Müller Hinton (MHB), este último fue el


utilizado en los ensayos antimicrobianos (CMI50 y CMB) debido a que permite una correcta

difusión de los compuestos, además de estabilidad de los pedidos al momento de hacer las

lecturas, por consiguiente, permite obtener datos más reproducibles.

En la Figura 4 se observa la medición de la densidad óptica a una longitud de onda de

600nm (OD600). Adicionalmente, con el fin de conocer las UFC se tomó una alícuota de cada

tiempo, sembrándose en agar MH, obteniéndose una relación entre las dos variables graficadas.

La OD inicial de 0.0899 a 600 nm correspondió a un recuento que fue de 17x106 UFC/mL. Por

su parte, para el tiempo 8 la OD fue de 0.4530 y su conteo de viables fue 9x107UFC y en el

tiempo final -medición Nº24- la OD fue realizada cada media hora presentando 0.5038 de

absorbancia con un conteo de 1x108 UFC. Con estos resultados se pudo calcular la concentración

inicial siendo de 17x106 UFC la requerida en cada ensayo. Además, de conocer el crecimiento de

la Pseudomonas sp (fitopatógena) en ausencia de les péptidos derivados de la proteína Cry y el

agroquímico, haciendo posible determinar su inhibición, midiendo sus variaciones después de

cada tratamiento.

Luego de graficar los resultados de la OD600 y las UFC se determinaron diferentes

variables, las cuales se encuentran en Tabla 3, con la finalidad de determinar su cinética y tener

claridad del comportamiento de la cepa HSL30, analizando la fase logarítmica que llegó hasta el

tiempo 17 que corresponde a 8.5 horas. Adicionalmente, se obtuvo el tiempo de duplicación de la

Pseudomonas sp (fitopatógena) con 142.85 min, estos datos se encuentran soportados por un

coeficiente de determinación (R2) de 0.9824, lo cual da una alta confiabilidad de la cinética de

esta bacteria ya que las mediciones se realizaron por triplicado, con un total de datos los cuales

se evaluaron datos estadísticos como el promedio y la desviación estándar.


Tabla 3

Cinética De Crecimiento Control

Variable valor

C(b0) 17x106

Fase latencia 0

Velocidad específica de crecimiento (μ h-1 ) 0,084

Fin fase log (h) 8,5

Tiempo de duplicación (min) 142.85

Incremento cel. Total 83x107

Incremento cel. Fin fase log 79x106

Coeficiente de determinación R2 0,9824

Nota. Las variables C(b0) corresponde a la concentración inicial de Pseudomonas sp, las demás variables se

identificaron como se indica en literatura (Bansal et al., 2011; Jurado-Gámez et al., 2015)

De este modo se realizó un ensayo de cinética de crecimiento en el cual se evaluó los

péptidos pertenecientes a la proteína Cry46Aa1 a una concentración de 150 μM como se observa

en la Figura 5, permitiendo cumplir con el objetivo 2 y asimismo determinar el péptido más

bioactivo. De los péptidos evaluados tanto el P264-G274 y el Loop 1-PS2Aa mostraron una

linealidad en su crecimiento, no obstante, su medición final en el tiempo estuvo cerca al

comportamiento de crecimiento de Pseudomonas sp, por esta razón se descartaron como

candidatos del péptido más activo. Por el contrario, el Loop 2-PS2Aa evidencio el mejor

comportamiento entre compuestos evaluados revelando una curva de crecimiento menor a la

obtenida por el oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl), a la concentración de 150 μM, dicho

compuesto a las 9 horas presento el fin de su fase logarítmica, entrando a una fase estacionaria.

Mientras que el control + (Cu2(OH)3Cl) [9364.7 μM] mostro una densidad óptica sobre el eje x a

partir del tiempo 4, llevando a cabo su fin, ya que evita el crecimiento en un lapso de 4 horas.


Figura 5

Cinética de Pseudomonas sp Frente a Péptidos Derivados de Cry46Aa1

0 5 10 15

0.0

0.2

0.4

0.6

Tiempo (h)

OD

60

0

Loop2-PS2Aa [150μM]

P264-G274 [150μM]


Cu2(OH)3Cl [150μM]

Pseudomonas sp

Cu2(OH)3Cl [9364.7µM]

ns

Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns (no hay diferencia

significativa) = P> 0,05, * =P ≤ 0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001)

De los péptidos ensayados de Cry46Aa1, el que mayor actividad mostro fue el 3899

(Loop2-PS2Aa), siendo catalogado en nuestro estudio como el péptido más bioactivo, razón por

la cual se analizaron nuevas concentraciones desde 200 hasta 500 μM a parte de una

concentración adicional de 1514 μM, mostradas en la (Figura 6) para determinar su

comportamiento en el tiempo y evaluar el péptido más activo frente a Pseudomonas sp

fitopatógena, se realizó un bucle cinético con mediciones en varioskan Lux, Thermo Fisher

Scientific Inc, MA, EE.UU., cada 30min por 12h, sin embargo la concentración de 200 a 500 μM

no mostraron una diferencia significativa al observar la sobre posición de las curvas de

crecimiento, donde a partir de estas concentraciones se evidencio el fin de la fase logarítmica a

partir de las 8 horas, mientras que la concentración de 1514 μM comienza su fase estacionaria en

el momento 5.5.


Figura 6

Crecimiento de Pseudomonas sp Frente al Péptido Loop2-PS2Aa

0 5 10 15

0.0

0.2

0.4

0.6

Tiempo (h)

OD

60

0





Loop2-PS2Aa [1514µM]

Pseudomonas sp

ns

✱✱✱✱Cu2(OH)3Cl [9364.7µM]

Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns = P> 0,05, * =P ≤

0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) entre las cinéticas de crecimiento de los diferentes

compuestos

La Figura 7 muestra la inhibición del crecimiento de la cepa bacteriana HSL30 en un

rango de concentraciones de 200 μM hasta 9364.7 μM del Oxicloruro de cobre. Los resultados

mostraron que la concentración de 200 μM tiene un P- valor de 0.0052 con respecto a la

concentración de 500 μM, donde se aprecia una diferencia significativa donde la concentración

de 200 μM comienza su fase estacionaria a las 9 horas, mientras tanto, la concentración de 500

μM termina su fase logarítmica a las 4.5 horas, estas dos concentraciones tiene una fase de

latencia hasta la 1.5 horas. Cabe destacar que todos los crecimientos evaluados iniciaron con una

absorbancia cercana a 0.08.


Figura 7

Pseudomonas sp en Presencia del Oxicloruro de Cobre.

0 5 10 15

0.0

0.2

0.4

0.6

Tiempo (h)

OD

60

0

Cu2(OH)3Cl [9364.7µM]

Cu2(OH)3Cl [500μM]

Pseudomonas sp

Cu2(OH)3Cl [200μM]✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱

Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns = P> 0,05, * =P ≤

0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001)

10.3 Actividad Antimicrobiana de Péptidos Frente a Pseudomonas sp Fitopatógena

Adicionalmente, como cumplimiento del tercer y último objetivo, se realizó la actividad

antimicrobiana de los compuestos desde la concentración de 75 a 150 μM como se evidencia en

la (Figura 8), buscando seleccionar el péptido más bioactivo frente a la cepa HSL30 con el fin de

determinar la CMI50 se evaluaron concentraciones desde 0,5μM hasta la concentración de

150μM. Sin embargo, las primeras concentraciones no presentaron un inhibición considerable

(Datos mostrados en el Apéndice A en un rango de concentración de 0.5 a 50 μM) por tal razón

solo se analizó su actividad inhibitoria para las concentraciones de 75, 100 y 150 μM donde el

péptido nativo derivado de la proteína Cry46Aa1 que mayor actividad antimicrobiana exhibió

fue el péptido 3899 (Loop2-PS2Aa) con un porcentaje de inhibición de 20.55%, 44.41% y

51.98%, respectivamente frente a la cepa Pseudomonas sp fitopatógena. Por otro lado, respecto

al péptido 3891 (P264-G274) la concentración que mayor porcentaje de inhibición obtuvo fue a


150μM con un porcentaje de 14.7% y, en los porcentajes de inhibición en las concentraciones de

75 y 100 µM no se mostraron diferencia significativa entre ellas con un P-valor del 0.516. El

péptido 3897 (Loop1-PS2Aa) presentó los porcentajes de inhibición más baja – péptido menos

activo- de todos los compuestos evaluados. Además, no mostró diferencias significativas al

analizar las concentraciones evaluadas (75, 100 y 150 µM).

A pesar que, el Cu2(OH)3Cl obtuvo resultados con altos niveles de inhibición, estos no

superaron al péptido (Loop2-PS2Aa), posterior a esto se evaluaron concentraciones de 200 μM a

9364.7 μM. La CMI50 del péptido Loop2-PS2Aa (>100 µM) fue 3 veces menor en comparación

con el control positivos que fue de mayor a 300 µM (Tabla 4).

Figura 8

Actividad Inhibitoria de los Tratamientos Frente a Pseudomonas sp

P264-

G27

4

Loo

p1-PS2A

a

Loo

p2-PS2A

a

Cu 2

(OH

) 3C

l

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tratamiento

% I

nh

ibic

ión

Pse

ud

om

on

as

sp

✱✱✱✱

ns

✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱

ns

[75μM]

[100μM]

[150μM]

[9364.7µM]

Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns (no hay diferencia

significativa) = P> 0,05, * =P ≤ 0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados

entre ellos


La alta actividad inhibitoria obtenida por los péptidos derivados del dominio 1 de la

Cry46Aa1 podrían tener relación con los péptidos catiónico encontrados en plantas, animales e

insectos, los cuales cumplen funciones de defensa contra bacterias, hongos y algunos protozoos,

donde se cree que esta función antimicrobiana se debe a las cargas positivas de los péptidos los

cuales le permiten interactuar con la membrana de estos organismos, además sus características

anfipáticas le permiten mejorara su eficacia y selectividad (Djenane et al., 2017). En

comparación con el estudio de Lemeshko donde se evaluó el péptido BTM-P1-que contiene 4

residuos de aminoácidos hidrófobos en el extremo N-terminal- lo cual se presume que juegan un

rol muy importante en la incorporación del péptido en una bicapa lipídica, facilitando la

permeabilización de la membrana. Los péptidos derivados de la proteína Cry46Aa1 evaluados

como los de Cry11Bb1, forma canales iónicos debido a su naturaleza anfipática transmembrana,

donde se puede sugerir que los péptidos evaluados podrían tener un mecanismo de barril o poro

toroidal, ya que el número de residuos y la carga positiva permite que estos se inserten en la

membrana interaccionando electrostáticamente con lípidos cargados negativamente, causando

una pérdida del equilibrio osmótico y de la potencial membrana.

En todos los casos la inhibición aumentó a medida que incrementó la concentración,

indicando que esta actividad es dosis-dependiente. Sin embargo, esta diferencia no fue muy

marcada en el péptido 3897 (Loop1-PS2Aa) en las concentraciones de 75 y 100 µM, las cuales no

mostraron diferencia significativa con un p-valor de 0.9299, mientras que la segunda y tercera

concentración su p-valor fue de 0,57.

Comparando el potencial inhibitorio entre el Oxicloruro de cobre y el péptido 3899

(Loop2-PS2Aa) se determinaron los porcentajes de inhibición mostrados en la (Figura 9) y la

Tabla 4. El péptido más bioactivo- Loop2-PS2Aa - obtuvo una inhibición mayor al 50% frente a


la cepa HSL30 a una concentración de 150 μM con un porcentaje de 51.98%, mientras que del

Oxicloruro de cobre fue 31,97% a la misma concentración. Al comparar la concentración de 300

μM del péptido 3899 (Loop2-PS2Aa) y el agroquímico se aprecia una diferencia significativa del

0.0146 donde el péptido de la Cry46Aa1 exhibió un porcentaje de inhibición del 55.2% mientras

que el Cu2(OH)3Cl tan solo un 44,59%.

Figura 9

Comparación del Porcentaje de Inhibición entre Oxicloruro de Cobre y el Péptido más

Bioactivo.

Loop2-PS2Aa Cu2(OH)3Cl

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tratamiento

% I

nh

ibic

ión

Pse

ud

om

on

as

sp

✱✱✱✱

ns

ns

✱

✱✱✱✱

[200μM]

[300μM]

[400μM]

[500μM]

[1514 µM]

[9364.7µM]

Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor (ns (No hay diferencia

significativa) = P> 0,05, * =P ≤ 0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados

entre ellos para identificar diferencia del porcentaje de inhibición y comparar el péptido más activo con el

Cu2(OH)3Cl

Al evaluar la siguiente concentración donde se evalúo A 400 μM los dos compuestos

lograron una diferencia significativa con tan solo 0.346 donde el compuesto de la Cry46Aa1

tiene un porcentaje del 56,78%, mientras que el Cu2(OH)3Cl tiene un 52.93% de inhibición, en


este punto se empieza a ver una mejoría por parte del oxicloruro de cobre, en la concentración de

500 μM los compuestos evaluados con unos porcentajes de inhibición del 57,52% para el

compuesto 3899 (Loop2-PS2Aa) y 59,73% para el Cu2(OH)3Cl, al comparar los dos compuestos

a la concentración recomendad de oxicloruro de cobre para eliminar la Pseudomonas sp (9364.7

μM de Cu2(OH)3Cl) se aprecia una inhibición por parte del agroquímico del 99,6% de la cepa

HSL30 mientras que nuestro péptido más bioactivo alcanzo una inhibición del 64,21% con un P-

valor <0,0001 y una diferencia media de 35.45 como se aprecia en la (Figura 9).

Estos resultados nos sugieren que la actividad del péptido más bioactivo puede estar

asociado en su gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos como Thr, Tyr, Phe, Ala, Val y Ile los

culés le permiten insertarse en la bicapa lipídica en mayor proporción y de forma más fácil,

donde se puede ver una relación dependiente a la concentración, es así como los péptidos

anclados forman poros gracias a sus aminoácidos hidrofílicos que quedan expuestos causando la

pérdida del equilibrio osmótico y el potencial membrana, donde el péptido 3899 (Loop2-PS2Aa)

tiene tan solo un 17% de residuos hidrofílicos, siendo el péptido con mayor cantidad de residuos

hidrofóbicos, con un 83%, también se puede ver un mecanismo de forma anular o alfombra,

donde el péptido alcanza una concentración limite en membrana, razón por la cual las células

bacterianas presentan un colapso de la membrana causando su muerte por la pérdida de

citoplasma, por consiguiente estos péptidos podrían tener la capacidad de traspasar dicha

membrana y unirse a proteínas como el ARN polimerasa, y la topoisomerasa I, al encontrarse

con estos péptidos pueden causar la inhibición del crecimiento bacteriano de las Pseudomonas sp

fitopatógenas mediante la interacción de los ácidos nucleicos, además se estaría afectando la

síntesis proteica, al alterar las enzimas involucradas en la síntesis proteica (Won et al., 2009).


Se considera posible que estos péptidos puedan tener efectos dentro del plegamiento de

proteínas, al inhibir las chaperonas de Pseudomonas sp este péptido podría tener efectos en la

cadena respiratoria, al inhibir su consumo y formar especies reactivas de oxígeno, además de

tener efectos con los precursores de peptidoglucano, lo cual brinda un amplio esquema de los

diferentes mecanismos de acción que podría tener este péptido con la cepa HSL30, razón que de

ser posible sugiere su utilización en plantas infectadas con Pseudomonas sp (Kwon et al., 2019).

Con el fin de determinar la capacidad de eliminar el 99,9% de la población bacteriana, se

realizó un ensayo de CMB para identificar la concentración más baja con dicho efecto, sin

embargo, el oxicloruro de cobre a 9364.7 μM fue el único compuesto que demostró dicha

capacidad. Para finalizar los resultados, en la Tabla 4 se identifica el resumen de las

concentraciones utilizadas en cada compuesto, los porcentajes de inhibición frente a las cepas

HSL30 y su CMI50 y CMB. El péptido con menor porcentaje de inhibición frente a la cepa

HSL30 fue el Loop1-PS2Aa. mientras que el péptido más Loop2-PS2Aa fue que presento mayor

porcentaje de inhibición y una CMI50 > a 100 μM. por tanto, el oxicloruro de cobre presento una

CMI50 3 veces mayor a la del Loop2-PS2Aa. De los compuestos evaluados el único que presento

una CMB fue el oxicloruro de cobre ya que fue evaluado a una concentración mayor que el resto

de los compuestos como se aprecia los diferentes compuestos evaluados junto a sus

concentraciones y porcentajes de inhibición. A pesar que el oxicloruro de cobre mostro mayores

porcentajes de inhibición, a partir de la concentración de 500μM, el péptido más activo obtuvo

bajos porcentajes de actividad hemolítica, convirtiéndolo en un compuesto más seguro para su

manipulación y con poco riesgoso de causar intoxicación, además los péptido de Cry46Aa1 tiene

una mayor capacidad de inhibición de las biopelículas formadas por la cepa HSL30 como se

muestra en ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.


Tabla 4

Compuestos Evaluados frente Pseudomonas sp Fitopatógena

Compuesto evaluado Concentración % Inhibición

Cepa HSL30

CMI50

(µM) CMB

P264-G274 (3891) 75μM 10.67

>150 >150 µM 100μM 11.29

150μM 14.74

Loop1-PS2Aa (3897) 75μM 9.60

>150 >150µM 100μM 10.00

150μM 10.59

Loop2-PS2Aa (3899) 75μM 20.56

>100 >1514 µM

100μM 44.42

150μM 51.98

200μM 53.57

300μM 55.19

400μM 56.78

500μM 57.52

1514 µM 64.21

Oxicloruro de cobre

(Cu2(OH)3Cl) 75μM 23.79

>300 9364.7 µM

100μM 26.37

150μM 30.97

200μM 31.98

300μM 44.59

400μM 52.93

500μM 59.73

9364.7 µM 99.6

Nota. Los compuestos P264-G274 y Loop1-PS2Aa solo fueron evaluados hasta la concentración de 75μM por sus

bajos porcentajes de inhibición.

En otro estudio similar, se evaluó el péptido BTM-P1 de la pro toxina Cry11Bb1, frente a

bacterias Gram-negativas, como Gram-positivas, evidenciando una CMI a 7.1 µM donde según


este estudio su actividad biológica puede explicarse por un mecanismo que implica la formación

de canales permeables a iones en la biomembranas, por tal motivo se encuentra una notable

diferencia, sin embargo, se evaluó contra Pseudomonas aeruginosa obteniendo una inhibición

del 80 y 86 %, aunque sus altos niveles de actividad antimicrobiana, pudieron deberse a sus

cadenas de mayor tamaño y su mayor cantidad de cargas catiónicas que le permiten interactuar

con las superficies aniónicas de los microorganismos (Arias et al., 2009).

En un trabajo similar los investigadores desarrollaron librerías de peptídicos mutantes, el

péptido PA2- GNU7 mostro selectividad contra Pseudomonas aeruginosa este péptido mosto

una CMI de 2 µM, sin embargo, no tiene actividad contra otras especies recalcando que las

cargas positivas son esenciales, aunque de igual forma los aminoácidos, son de gran importancia

debido a su ordenamiento espacial que le permite interferir en ciertos procesos, por tal motivo la

creación de librerías peptídicas en estos estudios son de gran importancia ya que nos permiten

probar diferentes moléculas prometedoras basándose en estudios computacionales y

modelamiento de proteínas, evaluando estos compuestos biotecnológicos a partir de proteínas

nativas o mutantes (Kim et al., 2020).

10.4 Actividad Hemolítica de los Péptidos en Eritrocitos Humanos

Los ensayos de actividad hemolítica son de gran importancia para determinar el potencial

y efecto que pueden tener los compuestos al estar en contactos con los mamíferos, apreciándose

una posible citotoxicidad en las células sanguíneas. En la (Figura 10), se muestran los resultados

obtenidos de la actividad hemolítica de los péptidos nativos de la proteína Cry46Aa1, y el

agroquímico Oxicloruro de cobre Cu2(OH)3Cl, para esta actividad se utilizó como control

positivo el Tritón X-100, sustancia química que permite una lisis total de los glóbulos rojos.


Figura 10

Determinación de la Actividad Hemolítica

P264-

G27

4

Loop1-PS2A

a

Loop2-PS2A

a

Cu 2

(OH) 3Cl

Trito

nX-1

00

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Tratamiento

Acti

vid

ad

Hem

oli

tica

(%

) [75μM]

[100μM]

[150μM]

TritonX-100

✱✱✱✱

✱✱✱✱

Nota. Los péptidos derivados del dominio 1 de Cry46Aa1 ensayados frente eritrocitos de mamíferos P264-G274

(3891), Loop1-PS2Aa (3897) y Loop2-PS2Aa (3899) en las concentraciones de 75 μM, 100 μM y 150 μM. El Tritón

x-100 fue utilizado como nuestro control positivo. Las barras representan el promedio de las mediciones, además

estas muestran su desviación estándar.

La actividad hemolítica (Figura 10) de los compuestos evaluados de la Cry46Aa1,

muestran una citotoxicidad inferior al 20% en el rango de concentración de 75 a150 µM del 3891

y 3897, lo cual indica que las concentraciones evaluadas, no alcanzaron la concentración letal

media, con excepción del agroquímico Cu2(OH)3Cl, el cual sobrepaso este porcentaje a partir de

la concentración de 100 μM con un 56,77% de hemolisis, a pesar que las diferencias

significativas de los compuestos, a compararse con el control positivo, la diferencia absoluta


entre el Oxicloruro de cobre Cu2(OH)3Cl, a la concentración de 150 μM y el Triton-X100 fue de

solo 5.39%. Estos resultados muestran claramente la alta actividad hemolítica del agroquímico

evaluado, podría afectar salud, tal cual indican otros estudios que hablan de las intoxicación con

cobre a consecuencia de la ingestión del Oxicloruro de cobre (Cu2(OH)3Cl), en la agricultura y la

ganadería, son un problema muy común, como muestra el estudio realizado en salta (Poodts,

2010), donde se evaluaron 54 vacas con crías y algunos toros que había tenido ingesta de este

agroquímico muy común, sobreviviendo tan solo 6 vacas, estos mamíferos presentaron una

intoxicación crónica por cobre debido a la ingestión prolongada de cantidades pequeñas del

metal, debido a que esta zona se dedica a la agricultura donde es recurrente el uso del oxicloruro

de cobre, el cual se acumula en el organismo hasta alcanzar niveles tóxicos en animales y

personas. En otro estudio similar se evaluó la inocuidad de dos proteínas Cry altamente

utilizadas en cultivos transgénicos (Cry8Ka5 y Cry1Ac), estas frente a células de mamíferos,

además de pruebas hemolíticas, donde se encontró nula actividad frente a eritrocitos, así como

contra las células de mamíferos (Farias et al., 2014).


11 Conclusiones

En este trabajo se identificó que el péptido 3899, correspondiente al Loop2-PS2Aa,

presentó mitigación dentro de la cinética de crecimiento de la cepa HSL30, evidenciándose en

sus porcentajes de inhibición, a su vez este péptido presentó una CMI50, por tanto, fue >100 μM

mientras que en los otros dos péptidos estudiados Loop1-PS2Aa y P264-G274 fue de >150 μM.

Esto podría deberse, a la gran cantidad de aminoácidos hidrofóbicos como Thr, Tyr, Phe, Ala,

Val y Ile los culés le permitirían insertarse en la bicapa lipídica en mayor proporción y de forma

más fácil, donde se puede ver una relación dosis-dependiente a la concentración, por otro lado, el

Cu2(OH)3Cl el cual obtuvo una CMI50 a partir de la concentración >300 µM. Sin embargo, el

agroquímico, fue la más alta hemolisis de todos los compuestos, superando la HC50 a partir de la

concentración de 100 μM con un 56,7% y obteniendo un 94,6% con la concentración de 150 μM,

lo que permitió concluir que este agroquímico es efectivo frente la cepa HSL30, a pesar de su

alta actividad hemolítica.

Finalmente, dentro de las propiedades fisicoquímicas más relevante de los péptidos

antimicrobianos se encuentra que la carga positiva es un parámetro importante. Sin embargo, las

colas negativas permiten que el péptido penetre la membrana. En consecuencia, fue determinante

la presencia de estas cargas en el péptido Loop2-PS2Aa como se evidencia en la actividad

antimicrobiana.


12 Recomendaciones

En este trabajo se logró identificar que el péptido 3899, correspondiente al péptido

denominado Loop2-PS2Aa, fue el más activo entre los péptidos evaluados derivados de la

proteína Cry46Aa1.Por lo que se recomienda, evaluar concentraciones más altas, que permitan

obtener resultados que igualen la inhibición del control positivo, con la ventaja de minimizar el

impacto ambiental y el uso de estos agroquímicos a base de metales pesados.

Adicionalmente, se recomienda realizar ensayos donde se pueda evaluar un efecto

sinérgico entre el péptido más activo y el Cu2(OH)3Cl, con el fin de aumentar y a su vez ayudar a

minimizar las concentraciones utilizadas de agroquímicos a base de metales pesados como el Cu,

disminuyendo sus altos niveles de citotoxicidad.

Finalmente, también se recomienda diseñar nuevas librerías de péptidos mutados,

intensificando la carga catiónica con Aas como Arginina o Lisina, y además tener en cuenta los

aminoácidos Thr, Tyr, Phe, Ala, Val e Ile, los cuales se cree que son los responsables de la

inserción en la bicapa lipídica. Además, de marcarlos con fluorescencia para analizar su

mecanismo de acción ensayando actividad in vitro en la cepa HSL30 y otras especies

fitopatogenas de importancia económica.


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Apéndices

Para determinar la CMI50 se evaluaron concentraciones desde 0,5μM hasta la

concentración de 50μM.Sin embargo, las primeras concentraciones fueron irrelevantes, por tal

razón solo se analizó su actividad inhibitoria desde la concentración de 16μM donde el péptido

de Cry46Aa1 que mejor resultado mostro para esta concentración fue el 3891 (P264-G274) con

un 6,76% de inhibición frente a Pseudomonas sp fitopatógena

Apéndice A. Actividad de los tratamientos frente a Pseudomonas sp cepa HSL30

Para las concentraciones de 32μM y 50μM el péptido que mayor porcentaje de inhibición

obtuvo fue el 3899 (Loop2-PS2Aa) con un 13,60% y 16,38% respectivamente, sin embargo, el

Cu2(OH)3Cl obtuvo un mayor porcentaje de inhibición en la concentración de 50μM con un

20,05%.

En todos los casos la inhibición aumento a medida que incremento la concentración,

indicando que esta actividad es dosis-dependiente, sin embargo, esta relación se presentó menos

marcada en algunos casos, por ej. El péptido 3891 (P264-G274) sus primeras dos

concentraciones no mostraron diferencia significativa con un p-valor de 0,2490, en el caso del

péptido 3897 (Loop1-PS2Aa) su p-valor para primeras concentraciones fue de 0,9631 y la última

concentración de 50Μm con respecto a la anterior obtuvo un p-valor de 0,1208. Todos los

tratamientos obtuvieron una diferencia significativa con respecto al control- y control+ según el

test de Tukey su P ≤ 0.0001.


Tratamientos frente a Pseudomonas sp concentración de 16μM hasta 50μM

P264-

G27

4

Loop1-PS2A

a

Loop2-PS2A

a

Cu 2

(OH) 3Cl

Pseud

omon

as sp

Cu 2

(OH) 3Cl

0

50

100

Tratamiento

% I

nh

ibic

ión

Pse

ud

om

on

as

sp

[16μM]

[32μM]

[50μM]

[9364.7µM]

Pseudomonas spns✱✱✱✱

ns✱

✱✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱

Nota. Los Símbolos expresados en la gráfica, indican el análisis de significancia del p-valor ( ns = P> 0,05, * =P ≤

0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados entre ellos

Una de las mayores problemáticas, para los agricultores y una ventaja para ciertas

bacterias fitopatógenas, como es el caso de Pseudomonas sp, es la formación de biopelículas,

estructuras tan complejas que permite la asociación y organización de estos macroorganismos,

además hace parte del medio para llevar a cabo su comunicación o mecanismo conocido como

quórum sensing (QS) y a su vez le confiere protección contra agroquímicos y fijación a las

diferentes superficies. En la Tabla A2 Con el objetivo de determinar la actividad antibiofilm de

los péptidos del dominio 1 de la toxina Cry46Aa1, estos se ensayaron en diferentes

concentraciones, se muestran las mediciones de la OD595 para medir la formación de

biopelículas obteniendo los valores más bajos con el péptido 3899 (Loop2-PS2Aa ) lo cual no

sugiere que este fue el tratamiento con menor formación de biopelícula, su p-valor para la

concentración de 16 μM, 32 μM y 50 μM con respecto al control- fue ≤ 0.0001, mientras que el


Cu2(OH)3Cl mostro las absorbancias más altas indicando que su actividad no fue tan buena, al

determinar su p-valor en relación con el control-, en 16 μM no se encuentra diferencia

significativa obteniendo un 0,2723, mientras que cuando se relacionas las concentraciones de 32

μM y 50 μM entre ellas, estas no muestran diferencia significativa con un p-valor del 0.9277.

Densidad óptica de los tratamientos antibiofilm

P264-

G27

4

Loo

p1-PS2A

a

Loo

p2-PS2A

a

Cu 2

(OH

) 3C

l

contr

ol -

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

Tratamiento

OD

59

5

[16μM]

[32μM]

[50μM]

[1x108ufc/mL]

ns

ns

✱✱✱✱

✱✱

ns

ns

✱✱


0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados entre ellos y el control –

En todos los casos se puedo determinar que, al aumentar la concentración, se disminuyó

las absorbancias, por tal razón al evaluar su % inhibitorio durante la formación de biopelículas en

Pseudomonas sp, esta se ve relacionada con la concentración

En el Tabla A3, los péptidos evaluados de Cry46Aa1, el que mayor actividad antibiofilm

tuvo fue el 3899 (Loop2-PS2Aa), donde su concentración de 16 μM presento un 47,61% de

inhibición, la concentración de 32μM mostro una disminución en la formación del 51,75%,


mientras que para le concentración de 50μM fue del 57,13%, así mismo el Cu2(OH)3Cl presento

un 4,67%, 16,11% y 18,58% respectivamente, los valores de p-valor al comparar las

concentraciones más altas estuvo en un P ≤ 0.0001, excluyendo los péptidos 3891 (P264-G274)

y 3897 (Loop1-PS2Aa) que tuvieron una diferencia significativa entre ellos ≤ 0,0083, al

comparar todos las concentraciones con el control- se aprecia un P ≤ 0.0001.

Actividad antibiofilm de los tratamientos frente a Pseudomonas sp

P264-

G27

4

Loop1-PS2A

a

Loop2-PS2A

a

Cu 2

(OH) 3Cl

Contr

ol -

Cu 2

(OH) 3Cl

0

50

100

Tratamiento

% I

nh

ibic

ión

Pse

ud

om

on

as

sp

[16μM]

[32μM]

[50μM]

[9364.7µM]

Control -ns✱✱✱✱

ns✱

✱✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱

✱✱✱✱


0,05, ** = P ≤ 0,01, ***=P ≤ 0,001, ****=P ≤ 0.0001) los datos fueron analizados entre ellos para identificar

diferencia del porcentaje de inhibición e identificar el péptido más activo.

actividad antimicrobiana & hemolÍtica cry46aa1 1

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