i evaluaciÓn de la actividad antimicrobiana de los

i

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE LOS

EXTRACTOS ETANÓLICOS Y/O ACEITES ESENCIALES DE LAS

ESPECIES VEGETALES Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,

Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata FRENTE A

MICRORGANISMOS PATÓGENOS Y FITOPATÓGENOS

ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN

JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá D.C., Colombia

Julio 18 de 2008

ii






ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al titulo de

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL Bogotá D.C.

Julio 18 de 2008

iii






ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

APROBADO

_____________________________ ___________________________ María Eugenia Torres Alberto Gómez Mejía

Microbióloga Industrial Doctoris Scientiae Juridicae Director Codirector

______________________________ Prof. Miguel Pinzón Asesor Estadístico

iv






ANDREA JIMENA LIZCANO RAMÓN

JENNY LISSETH VERGARA GONZÁLEZ

APROBADO

______________________________ ________________________________

Ingrid Schuler. Phd Janeth Arias Palacios M.Sc. Decana Académica Directora de Carrera Facultad de Ciencias Microbiología Industrial

v

DEDICATORIA

Durante estos años ha habido momentos inolvidables, para alegrarse, para entristecerse pero sobre todo para sentirse orgulloso de haber terminado un camino bastante largo. Cuando ya estoy a unas pocas semanas de graduarme, es que me doy cuenta de tantos momentos que tal vez, pasaron desapercibidos, y ahora llegan como buenos recuerdos. Muchísima gente involucrada en estos años han hecho que este tiempo no fuera una lucha sino más bien, como una aventura. A todos ellos….Muchas Gracias. Dedico esta página a mis padres: Eduardo y Elizabeth, mis hermanos: Eli, Caro y Jorge, mi novio Héctor, a Dios, Ecopetrol y amigos, a los que me han enseñado que tenemos algo muy importante para ofrecernos unos a otros y a todos aquellos que han logrado pasar toda la clase de experiencias, mirando el miedo cara a cara, con fuerza, valor y confianza, para con orgullo decir: “ He sobrevivido una vez más, y estoy en capacidad de manejar lo que venga ”.

Jenny Lisseth Vergara González

Dedico este trabajo a todas las personas que me acompañaron en el transcurso de mi vida, en especial, a mi papá, mí mamá, mis hermanas (Martha y Liliana), mi tía Libia por apoyarme en los momentos en que mas los necesite, ayudarme y aconsejarme en los momentos más duros. Aquellas personas que me soportaron durante estos años, a quienes con regaños y un poco de afán por verme crecer como persona supieron comprenderme y aquellos que tal vez no me vieron como la mejor pero siempre con un pensamiento de que podría serlo. A todos ellos Gracias.

Andrea Jimena Lizcano Ramón

vi

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos al Jardín Botánico de Bogotá D.C José Celestino Mutis por facilitarnos

materiales y equipos para el desarrollo de este trabajo.

Al equipo de trabajo de las instalaciones de Subdirección Científica por su

colaboración, paciencia y dedicación para la culminación de nuestro trabajo de grado.

A la Microbióloga Industrial María Eugenia Torres por sus consejos y por compartir

desinteresadamente sus amplios conocimientos y experiencia.

A Freddy Alejandro Ramos por transmitirnos sus conocimientos y darnos seguridad

Al Dr. Alberto Gómez Mejía por su confianza y apoyo incondicional

A Héctor Lancheros por su contribución a la realización de este estudio aportándonos

su orientación estadística en la elaboración y discusión de nuestro trabajo de grado.

Al profesor Miguel Pinzón por su compromiso y conocimientos estadísticos

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

PDA (Agar papa dextrosa)

DCM (Diclorometano)

EX1 (Extracto etanólico hojas de Valeriana pilosa)

EX2 (Extracto etanólico hojas de Hesperomeles ferruginea)

EX3 (Extracto etanólico hojas de Myrcianthes rhopaloides)

EX4 (Extracto etanólico hojas de Passiflora manicata)

CDC (Centro para el Control y Prevención de Enfermedades)

FR1 (Fase acuosa de Extracto hojas Passiflora manicata)

FR2 (Fase diclorometano de Extracto hojas Passiflora manicata)

FR3 (Fase alcohol isoamílico de Extracto hojas Passiflora manicata)

AE1 (Aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides)

C + (Control positivo)

C - (Control Negativo)

Cm (Cloramfenicol)

gl (Grados de libertad)

viii

TABLA DE CONTENIDO

Pág

1. INTRODUCCIÓN

2. MARCO TEÓRICO

2.1 GENERALIDADES METABOLITOS SECUNDARIOS

2.1.1 Antecedentes de los metabolitos secundarios de origen vegetal

2.1.2 Importancia de los metabolitos secundarios

2.1.3 Metabolito secundario

2.1.4 Metabolismo secundario

2.2 EXTRACTOS

2.2.1 Consistencia de los extractos

2.2.1.1 Extractos blandos

2.2.1.2 Extractos firmes o de consistencia pilular

2.2.1.3 Extractos secos

2.2.1.4 Extractos fluidos

2.2.2 Características de los extractos

2.2.3 Conservación de los extractos

2.3 METODOS

2.3.1 Métodos de extracción

2.4 MOLÉCULAS ACTIVAS EN EL ÁMBITO MEDICINAL E INDUSTRIAL

2.4.1 Los Alcoholes

2.4.2 Los Fenoles

2.4.3 Cumarinas

2.4.4 Alcaloides

2.4.5 Los Aldehídos

2.4.6 Los Terpenoides

2.4.7 Flavonas

2.4.8 Los Isoflavonoides

2.4.9 Los Alcaloides

ix

2.4.10 Quinonas

2.4.11 Tanoides o Taninos

2.4.12 Los aceites esenciales

2.4.13 Saponinas

2.4.14 Esteroides y Triterpenos

2.4.15 Cromenos y Benzofuranos

2.4.16 Sesquiterpenlactonas

2.5 ESPECIES VEGETALES

2.5.1 Valeriana pilosa

2.5.1.1 Características generales

2.5.1.1.1 Descripción

2.5.1.1.2 Distribución geográfica

2.5.1.1.3 Fitoquímica

2.5.1.1.4 Usos

2.5.2 Myrcianthes rhopaloides

2.5.2.1 Características generales de la especie


2.5.2.1.2 Distribución Geográfica

2.5.2.1.3 Propagación tradicional:

2.5.2.1.4 Cosecha

2.5.2.1.5 Usos

2.5.2.1.6 Bromatología y Aporte Nutricional


2.5.3 Passiflora manicata

2.5.3.1 Características generales de las especies



2.5.3.1.3 Usos

2.5.4 Hesperomeles ferruginea


x



2.5.4.1.3 Usos

2.5.4.1.4 Fitogeografía y ecología


2.6 MICROORGANISMOS SELECCIONADOS

2.6.1 Hongo fitopatógeno

2.6.1.1 Alternaria sp.

2.6.2 Microorganismos patógenos

2.6.2.1 Candida albicans

2.6.2.2 Staphylococcus aureus

2.6.2.3 Escherichia coli

2.6.2.4 Bacillus subtillis

2.7 ANTIMICROBIANOS

2.7.1 CLORAMFENICOL

2.7.1.1 Origen

2.7.1.2 Mecanismos de acción del cloramfenicol

2.7.1.3 Mecanismos de resistencia bacteriana al cloramfenicol

2.7.1.4 Constitución química

2.7.1.5 Propiedades

2.7.2 GRISEOFULVINA

2.8 MÉTODOS DE EVALUACIÓN ANTIMICROBIANA

2.8.1 Método de difusión en gel

2.8.2 Método de dilución

2.8.3 Método de Bioautografia

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del problema

3.2 Justificación de la Investigación

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

xi

4.2 Objetivos Específicos

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 LOCALIZACIÒN

5.2 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS

5.3 TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

5.4 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

5.4.1 Extracto Etanólico

5.4.2 Aceite Esencial

5.5 MICROORGANISMOS

5.5.1 Cepas

5.5.2 Aislamiento de las cepas

5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS

5.6.1 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana

5.6.1.1 Técnica de difusión de disco en Agar

5.6.1.1.1 Bacterias

5.6.1.1.2 Levadura

5.6.1.1.2.1 Evaluación antifúngica

5.6.1.1.3 Hongo

5.6.2 Ensayo biodirijido

5.7 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

5.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7. CONCLUSIONES

8. RECOMENDACIONES

9. BIBLIOGRAFANEXOS

xii

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Promedio de halos de inhibición (mm) Vs. Extractos vegetales frente al

control positivo para S. aureus.


control positivo para E. coli.


control positivo para B. subtillis.


control positivo para C. albicans.


control positivo para Alternaria sp

Gráfica 6. Diámetro de halos de inhibición Vs. Microorganismos seleccionados para

las diferentes fases.

Gráfica 7. Halos de inhibición Vs. Fracciones para cada microorganismo

Gráfica 8. Halos de inhibición Vs Microorganismos seleccionados frente al aceite

esencial de M. rhopaloides

xiii

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Valeriana pilosa

Figura 2. Myrcianthes rhopaloides

Figura 3. Passiflora manicata

Figura 4. Hesperomeles ferruginea

Figura 5. Características Macro y Microscópicas de Alternaria sp

Figura 6. Características Macro y Microscópicas de Candida albicans.

Figura 7. Características Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus

Figura 8. Características Macro y Microscópicas de Escherichia coli

Figura 9. Características Macro y Microscópicas de Bacillus subtillis

Figura 10. Rotavapor Heidolph LABOROTA 4000-EFFICIENT

Figura 11. Proceso para la obtención de extractos a partir del material vegetal

Figura 12. Montaje Hidrodestilación hojas de Myrcianthes rhopaloides

Figura 13. Fraccionamiento hojas de Passiflora manicata

Figura 14. Fase diclorometano (DCM) de extracto hojas Passiflora manicata

Figura 15. Fase Acuosa - Fase Alcohol Isoamílico de extracto hojas de Passiflora

manicata

Figura 16. Proceso para la obtención de fracciones a partir del material vegetal

Figura 17. Ensayos biológicos con extractos vegetales EX1 (Valeriana pilosa), EX2

(Hesperomeles ferruginea), EX3 (Myrcianthes rhopaloides), EX4 (Passiflora

manicata), C+ (Control positivo), C- (Control Negativo) frente a microorganismos

patógenos y fitopatógenos A. Escherichia coli, B. Candida albicans, C.

Staphylococcus aureus, D. Bacillus subtillis, E. Alternaria sp.

Figura 18. Ensayo biológico de las fracciones (FR1: Fase acuosa, FR2: Fase

Diclorometano, FR3: Alcohol isoamilico) del extracto de Passiflora manicata frente

a E. coli

Figura 19. Ensayo biológico del aceite esencial del extracto de M. rhopaloides frente

A. B. subtillis y B. C. albicans

xiv

INDICE TABLAS

Tabla 1. Análisis bromatológicos proximales para M. rhopaloides (contenido/100g

de pulpa)

Tabla 2. Peso en gramos del material vegetal a extraer.

Tabla 3. Especies, Parte a estudiar y Extractos a evaluar

Tabla 4. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de

extractos vegetales de hojas de Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,

Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para S. aureus.



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para E. coli.



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para B. subtillis.



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para C.albicans.



Myrcianthes rophaloides y Passiflora manicata para Alternaria sp..

Tabla 9. Tabla análisis de varianza para los efectos de dos factores

Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para microorganismos

seleccionados

Tabla 11. Prueba de comparación de medias de Tukey para extractos

Tabla 12. Análisis de varianza para S. aureus

Tabla 13. Prueba de comparación de medias de Tukey para S. aureus

Tabla 14. Análisis de varianza para E. coli

Tabla 15. Prueba de comparación de medias de Tukey para E. coli

xv

Tabla 16. Análisis de varianza para B. subtillis

Tabla 17. Prueba de comparación de medias de Tukey para B. subtillis

Tabla 18. Análisis de varianza para Candida albicans.

Tabla 19. Prueba de comparación de medias de Tukey para Candida albicans

Tabla 20. Análisis de varianza para Alternaria sp.

Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para Alternaria sp.


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para E. coli.


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para S. aureus.


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para B. subtillis.


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Candida albicans.

Tabla 26. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar y de

fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Alternaria sp.



seleccionados

Tabla 29. Prueba de comparación de medias de Tukey para fracciones.

Tabla 30. Análisis de varianza para S. aureus con las diferentes fracciones










xvi

Tabla 40. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar de aceite

esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para B. subtillis.


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para S. aureus.


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para E. coli.


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Alternaria sp.


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Candida albicans.



seleccionados con respecto al aceite esencial.

xvii

INDICE DE ANEXOS

ANEXO 1 PREPARACIÓN AGAR MUELLER HINTON

ANEXO 2 PREPARACIÓN AGAR CHROMOCULT

ANEXO 3 PREPARACIÓN AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

ANEXO 4 PREPARACIÓN AGAR BAIRD PARKER

ANEXO 5 PREPARACIÓN DE AGAR BPLS (Verde brillante, Rojo de fenol,

Lactosa y Sacarosa)

xviii

RESUMEN

El presente trabajo se realizó en los laboratorios de las instalaciones de la

Subdirección Científica del Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis, con el

fin de observar y determinar el efecto antimicrobiano de extractos etanólicos

vegetales y aceite esencial obtenidos a partir de 4 especies Valeriana pilosa,

Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata priorizadas

dentro del proyecto de Uso Sostenible del Distrito Capital y la región frente a

microorganismos patógenos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus

aureus, Candida albicans y un hongo fitopatógeno Alternaria sp, cepas adquiridas de

la Pontificia Universidad Javeriana.

Para la obtención de los extractos etanólicos se utilizó el material vegetal seco

previamente triturado, el cual fue macerado en frio utilizando como solvente etanol

durante 48 horas, se realizó reflujo con etanol-agua(9:1) para su posterior

concentración a presión reducida. Para obtener aceite esencial a partir de las hojas de

Myrcianthes rhopaloides se utilizó la técnica de hidrodestilación.

Luego de obtener los extractos a evaluar se midió la actividad antimicrobiana

utilizando la técnica de difusión de disco en agar de Kirby-Bauer, prueba que

permitió medir la suceptibilidad In Vitro de los microorganismos patógenos y

fitopatógenos seleccionados frente a sustancias de origen natural con potencial

antimicrobiano, utilizando 300 μg de extracto obtenido por especie vegetal,

utilizando de igual manera como control positivo 10 μg de cloramfenicol y agua

estéril como control negativo.

Al analizar los resultados de los diferentes ensayos se observó que el extracto

etanólico de Passiflora manicata presentó mayor actividad antimicrobiana frente a E.

coli, Candida albicans y B. subtillis, razón por la cual se seleccionó para fraccionar el

extracto crudo utilizando como solventes diclorometano, agua y alcohol isoamílico,

xix

demostrando que la fase acuosa fue la de mayor efecto inhibitorio frente a todos los

microorganismos evaluados. Los resultados obtenidos para el aceite esencial obtenido

con las hojas de Myrcianthes rhopaloides mostraron inhibición solo frente a Candida

albicans.

En este trabajo se concluyó que Passiflora manicata fue el extracto etanólico que

presentó mayor acción frente a todos los microorganismos, permitiendo realizar el

fraccionamiento con los diferentes solventes identificando a la fase acuosa como la

responsable del principio activo con potencial antimicrobiano; cabe anotar que para

dar continuidad a futuras investigaciones entorno a la potencialidad antimicrobiana de

la especies es necesario el aislamiento y la elucidación de la molécula capaz de

inhibir a los microorganismo seleccionados.

xx

ABSTRACT

The present work was performed in the Laboratories of the Scientific Subdirection of

Botanical Garden of Bogotá José Celestino Mutis, in order to observe and determine

the antimicrobial effect of ethanolic plant extracts and essential oil, obtained from 4

species Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rophaloides and

Passiflora manicata chosen for the Sostenible Use project of the Capital District and

the Region. These species were tested against the pathogen microorganisms

Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans and the

phythopathogen fungus Alternaria sp, which were acquired from the storage of the

Pontificia Universidad Javeriana.

For the obtainment of the ethanolic extracts we used dried plant material that was

previously crushed; this was cold macerated using ethanol as a solvent during 48

hours. We used reflux ethanol-water (9:1) in order to concentrate it in a reduced

pressure.

For the obtainment of the essential oil from the leaves of Myrcianthes rophaloides

we used the hydrodistillation technique.

After, we measured the antimicrobial activity using the difussion disc agar technique

of Kirby-Bauer. This technique allows us to measure the In vitro oversensitivity of

the pathogen and phytophatogen microorganisms, to the natural origin substances

which have antimicrobian potential. We took 300 μg of each extract, using 10 μg of

cloramfenicol as a postive control and water as a negative control.

As a result of the different tests, we observed that the ethanolic extract of Passiflora

manicata had a better antimicrobial activity against E.coli, Candida albicans and B.

subtillis. For this reason we chose the extract of Passiflora manicata and divided it

using dichloromethane, water and isoamilic alcohol as solvents. We found that the

xxi

aqueous phase showed the highest antimicrobial effect against all the evaluated

microorganisms.

The results for the essential oil which was obtained from the leaves of Myrcianthes

rophaloides showed that Candida albicans was inhibited the most.

In this work we concluded that Passiflora manicata was the ethanolic extract that

showed the best results against all the microorganisms, permiting the division with

the different solvents. We identified that the aqueous phase was responsible for all of

the principle actions because there was the antimicrobial potential.

In order to continue fututre investigations about antimicrobial potential of plant

species it is necessary to find and isolate the specific molecule able to inhibit the

microorganism chosen.

xxii

1. INTRODUCCIÓN

Se puede afirmar que el uso de las plantas medicinales nació con el hombre. Desde

tiempos prehistóricos hasta comienzos del siglo XIX se utilizaron por ensayo error,

aquellos extractos que brindaban curar enfermedades. Esta práctica médica pasaba y

se perfeccionaba de generación en generación, por lo cual se denominó medicina

tradicional.

Hasta el siglo XVIII se conocieron las propiedades curativas de las plantas, su efecto

sobre el organismo y su modo de aplicación, desconociendo en muchas de los casos

la composición y caracterización de principios activos. Con el desarrollo de las

teorías de la evolución, herencia genética, el uso del microscopio y el nacimiento de

ciencias como la fitoquímica, fue posible el reconocimiento y el aislamiento de

principios activos de muchas especies vegetales. La gran mayoría de los principios

activos se han obtenido sintéticamente en laboratorios, para su posterior uso en la

preparación de medicamentos químicos. Con el paso de los años el consumo de

medicamentos sintéticos se incrementó, desplazando cada vez más el uso directo de

plantas medicinales alejándose así de la medicina tradicional.

Desde tiempos muy remotos las plantas han cumplido un papel importante en el área

terapéutica gracias a las múltiples propiedades que ellas poseen. Por esta razón en las

últimas décadas ha ido tomando cada día mayor importancia su estudio y el desarrollo

de técnicas analíticas que permitan la determinación e identificación de las sustancias

o principios activos contenidos en especies vegetales.

En la actualidad, el gran desafío para los países ricos en biodiversidad es poder

vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en

compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte del

aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en beneficio

de la sociedad.

xxiii

Colombia cuenta con un extenso banco de germoplasma, rico en moléculas activas de

gran interés para la industria farmacéutica y dada la gran disminución de

disponibilidad, uso y aprovechamiento de especies vegetales que se encuentran en

ecosistemas de Distrito Capital y la región, para entidades como el Jardín Botánico

José Celestino Mutis (JBJCM) como centro de investigación y desarrolló científico

en cumplimiento de sus objetivos misionales, contribuye con la generación del

conocimiento en cuanto al uso y el aprovechamiento de especies vegetales

promisorias presentes en los ecosistemas del Distrito Capital y la región.

Con base en lo anterior en aras de buscar alternativas de aprovechamiento y conocer

la presencia de principios activos en especies como Valeriana pilosa, Hesperomeles

ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata, priorizadas como

potenciales dentro del proyecto de “ Uso Sostenible de los recursos vegetales del

Distrito Capital y la regióni”, se planteó evaluar la actividad antimicrobiana de los

extractos etanólicos o aceites esenciales obtenidos a partir de las especies, frente a


aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp utilizando la técnica

de susceptibilidad microbiana., para determinar cual de los extractos presenta mayor

actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados.

xxiv

2. MARCO TEÓRICO

2.1 GENERALIDADES METABOLITOS SECUNDARIOS

2.1.1 Antecedentes de los metabolitos secundarios de origen vegetal

Aproximadamente hasta el año 1800, apenas se había progresado en el campo de la

Fitoquímicaii. Solo se conocían unas cuantas sustancias como el azúcar de caña,

almidón, alcanfor y ácido benzoico, debido a que su preparación era sumamente

sencilla. Mezclas complejas como grasas, aceites, esencias, breas y resinas, se habían

utilizado y elaborado, aunque prácticamente no se sabía nada acerca de su

composición. Los primeros investigadores en el campo de la Fitoquímica no llegaron

a apreciar la extrema complejidad de las materias con que realizaban sus

investigaciones y carecieron casi por completo de las técnicas necesarias para

conseguir un proceso auténtico. Se quemaron grandes cantidades de plantas para

obtener cenizas y esos primitivos investigadores se desanimaron al encontrar

diferencias mínimas entre las cenizas de una planta venenosa y otra inocua. La

expresión, la extracción acuosa y la evaporación se habían empleado tiempo atrás en

la obtención de azúcar a partir de la caña de azúcar. El farmacéutico francés Nicolás

Lémery (1645-1715) extendió el empleo de los procesos de extracción y utilizó el

alcohol como disolvente (Torres C, 2004).

Robert Boyle (1627-1691) abandonó la antigua teoría de Aristóteles de que la materia

está compuesta de cuatro elementos y aunque jamás llegó a aislar ningún alcaloide es

evidente que iba bien encaminado cuando trató el opio con carbonato potásico y

alcohol (Torres C, 2004).

En 1747 se aisló la sacarosa de muchas plantas, entre ellas de la remolacha, por el

farmacéutico alemán A.S. Marggraf (1707-1780). K. W. scheele (1742-1786), obtuvo

un gran éxito en el campo de la Fitoquímica, al aislar los ácidos cítrico, gálico,

málico, oxálico, tartárico y prúsicoiii (Torres C, 2004).

xxv

En el siglo XIX, los progresos alcanzan mayor rapidez. En 1803 se aísla el primer

alcaloide, la narcotina, y le siguieron rápidamente muchos otros, como morfina,

estricnina, emetina. Entre 1813 y1823, Chevreul dilucidó la naturaleza química de las

grasas y los aceites fijos (Torres C, 2004).

Hasta mediados del siglo XX, el principal empeño, en cuanto a la química de los

productos naturales, siguió siendo el aislamiento y determinación de la estructura de

una amplia gama de compuestos. Resulta claro que se habían establecido los

principales tipos estructurales encontrados comúnmente en las plantas. A partir de

entonces, la atención de los químicos respecto a los productos naturales fue virando

hacia la disolución de las rutas biosintéticas halladas en la planta (Torres C, 2004).

2.1.2 Importancia de los metabolitos secundarios

A lo largo de la historia, los metabolitos secundarios de las plantas han sido utilizados

por la humanidad convirtiéndose en una fuente inagotable de compuestos químicos

y complejas sustancias activas, que desde hace muchos años han sido explotadas por

el hombre (Torres C, 2004).

Así mismo es importante destacar que a pesar de todos los esfuerzos de naciones,

instituciones gubernamentales y no gubernamentales e investigadores en aumentar el

nivel y el caudal de conocimientos adquiridos sobre las metodologías de

trasformación secundaria (de frutos, flores, semillas, hojas y tallos) y de la

identificación y caracterización de los metabolitos secundarios de especies vegetales

priorizadas, en la actualidad sólo unos pocos metabolitos se utilizan de forma

industrial, por lo que se ha creado la necesidad de generar opciones y alternativas de

producción enfocadas al uso sostenible de todos aquellos recursos vegetales

disponible en el entorno trabajando activamente en la detección y caracterización de

sustancias producidas por diferentes especies promisorias que pueden tener

aplicación en la industria (cosmética, farmacéutica, textilera y agroalimentaria)

(Torres C, 2004).

xxvi

2.1.3 Metabolito secundario

Son todas aquellas moléculas activas generadas por diversas especies vegetales. Los

metabolitos son moléculas que no son necesarias para el crecimiento y la

reproducción de las plantas, pero cumplen con roles muy importantes en el reino

vegetal, pueden suponer una ventaja competitiva considerable (Torres C, 2004).

2.1.4 Metabolismo secundario

El metabolismo secundario compromete aquellos procesos químicos que son únicos

para una planta dada y no son universales. Dicho metabolismo es la química que

conduce a la formación de un producto natural. Algunas porciones de esta química

son comunes para un número de plantas diferentes o familias de plantas, pero

actualmente la química de los metabolitos secundarios es usualmente diferente de una

planta a otra, pues precursores químicos comunes pueden conducir a resultados

totalmente diferentes (Torres C, 2004).

2.2 EXTRACTOS VEGETALES

Los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido por

tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados, tales como agua, etanol

o éter, de elementos solubles, constituidos por una mezcla de principios activos y

sustancias inertes que se producen de la totalidad o de partes de una planta fresca o

seca (Ruiz & Susunaga, 2000).

2.2.1 Consistencia de los extractos

Alzate en 1990, descubrió la consistencia ideal que debían tener los extractos. De

acuerdo con este aspecto comúnmente los extractos se clasifican en cuatro grupos:

blandos, firmes, secos y fluidos (Barreto J, 1997).

xxvii

2.2.1.1 Extractos blandos

Tienen la consistencia de la miel espesa; algunas veces, debido a la absorción de la

humedad atmosférica, presentan una consistencia menos densa (Barreto J, 1997).

2.2.1.2 Extractos firmes o de consistencia pilular

Como su nombre lo indica deben tener una estrecha semejanza con la masa con la

cual se fabrican o manufacturan las píldoras; deben tener la característica especial de

no adherirse a los dedos (Barreto J, 1997).

2.2.1.3 Extractos secos

Anteriorrmente se les conocía con la denominación de “sales esenciales”. Son los

extractos en los cuales el disolvente ha sido casi completamente eliminado. Contiene

tan solo del 5 al 8% de agua. Se reducen fácilmente a polvo y facilitan su

manipulación y dosificación. La forma farmacéutica de extractos secos aparece en

varias farmacopeas (Belga, Norteamericana, noruega y mexicana), pero no indican un

método exacto para la preparación de este tipo de extractos. Golaz (1973) les dio el

nombre de extractos unitarios y los recomienda para la preparación de tinturas y

jarabe (Barreto J, 1997).

2.2.1.4 Extractos fluidos

Son preparados en una forma tal que el peso del extracto corresponde exactamente al

peso de la sustancia empleada como medicamento, desecada al aire y pulverizada

(Barreto J, 1997).

xxviii

2.2.2 Características de los extractos

Estudios realizados por Corpas y Barrero entre 1988 y 1991, permitieron fundamentar

las siguientes características específicas de los extractos:

a. Los extractos bien preparados son de color más o menos oscuros; cuando han

sido preparados al vacío, son ligeramente más claros.

b. Algunos son de color café amarillento, otros rojizos; los extractos

provenientes de hojas son verdosos debido a la clorofila.

c. Su aspecto debe ser liso, fino y homogéneo.

d. Su olor y sabor son propiedades características de la materia prima que les ha

dado su origen. Cuando son mal preparados, adquieren olor a caramelo o

confitura poco conocida.

e. La solubilidad de los extractos es variable y está en relación directa con el tipo

de preparación al cual fueron sometidos.

f. Los extractos acuosos son completamente solubles en agua y producen una

solución transparente, algunas veces ligeramente turbia, debido a que han sido

preparados con mucha anterioridad.

g. Los extractos alcohólicos son parcialmente solubles en agua y algunas veces

son totalmente insolubles, especialmente los extractos que han sido

preparados con alcohol fuerte tienen un excelente índice de disolución, en el

mismo título alcoholimétrico del alcohol con el cual han sido preparados.

h. Los extractos alcohólicos preparados con hojas, dan soluciones coloreadas de

verde, pues la eliminación de la clorofila no puede ser total. Cordell (1995)

propuso ensayos generales para someter a los extractos a pruebas específicas

xxix

para observar su calidad y composición final. Estos trabajos fueron

remontados por Corpas, quien propuso realizar ensayos de identidad a los

extractos obtenidos (Barreto J, 1997).

2.2.3 Conservación de los extractos

Labfarve (1995) determinó las alteraciones y los diferentes métodos de conservación

de los extractos. Los extractos son medicamentos en donde la alteración modifica y

varia notoriamente la naturaleza del producto. En principio, un extracto seco o de tipo

pilular se conserva mejor que un extracto acuoso. Esto no es totalmente exacto, pues

la naturaleza del producto interviene igualmente. Algunos extractos se descomponen

al aire, otros absorben humedad atmosférica. Algunos se recubren de hongos y

permiten el desarrollo de gérmenes bacterianos. Por otra parte, las alteraciones más

frecuentes consisten en modificaciones químicas no aparentes como sucede con los

extractos de flores verdes que por la oxidación de la clorofila pierden su color. Los

extractos a base de alcaloides, bajan de título, según lo demuestran las

investigaciones de Fricotel y Métin (1970). Esta disminución del título alcalóidico, es

especialmente sensible a los extractos blandos y de aspecto pilular y bastante menos

notorio en los extractos secos (Barreto J, 1997).

Según Corpas y Barriga (1993), la conservación de los extractos es indispensable y

deben cumplir las siguientes condiciones:

a. Se deben conservar protegiéndolos de la luz.

b. Los envases deben estar bien tapados.

c. Se deben conservar en un medio ambiente seco (Barreto J, 1997).

Desde luego, son numerosos los métodos que se han indicado para la conservación de

los extractos. Para mayor comodidad ellos se pueden clasificar, en dos categorías

(Barreto J, 1997).

xxx

En el primer grupo tenemos aquellos a los cuales no se les ha adicionado ninguna

materia extraña. Al segundo grupo, por el contrario, pertenecen aquellos extractos

que han sido objeto de la adición de productos extraños, de naturaleza físico-química

definida (Barreto J, 1997).

2.3 METODOS DE EXTRACCIÓN

Deben obedecer a la información de la naturaleza química de las sustancias, presentes

en la planta y al propósito de la investigación. En el caso de búsqueda de sustancias

para la comprobación de actividad biológica, la extracción del material vegetal debe

hacerse en agua o con solución disotónica (0.9 % NaCl). Frecuentemente se usa la

extracción con solventes orgánicos de bajo punto de ebullición (alcohol, acetato de

etilo) y de baja reactividad. Algunas veces es conveniente desengrasar el material

vegetal con éter de petróleo (extracto etéreo) o hexano. El alcohol es generalmente

mas eficaz para recuperar la mayoría de los metabolitos secundarios. Los extractos

son evaporados bajo presión reducida o liofilizados, en el caso de extracción con agua

(Arévalo A, 1996).

Los métodos de extracción se basan en las diferentes solubilidades de los diversos

compuestos encontrados en el material vegetal, así , para sustancias de baja polaridad

( lípidos) se utilizan como solventes el éter de petróleo y cloroformo; para sustancias

de mediana y alta polaridad el acetato de etilo, el etanol y la acetona . Las

extracciones pueden hacerse por “extracción continua en soxhlet”, en la cual el

material seco se sitúa en una cámara central y el solvente se hace evaporar en

caliente, en un recipiente inferior, el vapor del solvente asciende al condensador y

gotea sobre el material vegetal. Por “reflujo”, el material vegetal y el solvente se

colocan en un balón el cual tiene acoplado un refrigerante, se calienta, el solvente

evaporado se condensa y vuelve a mezclarse con el material vegetal. Y por

“maceración en frío “, el material se mezcla con el solvente triturado continuamente

en frío (Arévalo A, 1996).

xxxi

2.4 MOLÉCULAS ACTIVAS EN EL ÁMBITO MEDICINAL E INDUSTRIAL

No todos los componentes químicos elaborados por la planta, poseen igual interés

para la Fitoquímica. Los denominados principios activos son frecuentemente

alcaloides o heterósidos; ambos merecen por ello especial atención. Otros grupos,

como los glúcidos, grasas y proteínas, tienen importancia dietética y muchos, como

los almidones y las gomas, se emplean en técnica farmacéutica, aunque carecen de

señalada acción farmacológica. Otras sustancias como el oxalato cálcico, sílice,

lignina y materiales colorantes, pueden ser materias primas coadyuvantes en

diferentes procesos en la industria (Torres C, 2004).

2.4.1 Los Alcoholes: Los alcoholes libres no están generalmente presentes más que

en forma de trazas en las plantas vivas. Son esterificados y combinados bajo la forma

de heterósidos. Se encuentran sobre todo en los aceites esenciales. El olor de ciertos

alcoholes les da gran aplicación en la perfumería o como aromatizante (Carey, 2003).

Los alcoholes alifáticos son tensoactivos e hipotensores1. Todos los alcoholes son

tóxicos en grado diverso. Los alcoholes de las plantas umbelíferas, tienen una

toxicidad muy elevada (Carey, 2003).

2.4.2 Los Fenoles: Entre los fenoles encontrados en estado libre, se encuentran

constituyentes importantes de las esencias como el timol, el carbacrol (esencias de

tomillo), el eugenol y el chavicol. Muchos de los fenoles están en estado de éter

oxidado en las esencias, entre ellos citaremos el estragol, la miristicina, el apiol y el

atenol (Carey, 2003).

Los fenoles tienen una actividad fisiológica marcada porque poseen propiedades

antisépticas. Hidroquinol, timol (este último también antihelmíntico), eugenol

(igualmente anestésico local), el apiol es emenagogo, el anetol es carminativo2 y

1 Fitoterapia que actúa a nivel de los vasos sanguíneos. 2 Dícese de los agentes que previenen la formación de gases en el tubo digestivo o provocan la expulsión de los mismos

xxxii

antidiarreico a pequeñas dosis y veneno del SNC a altas dosis. El

tetrahidrocannabinol3 es alucinógeno. Los polifenoles del helecho son antihelmínticos

(Carey, 2003).

Son los compuestos más simples y consisten en un anillo fenólico sustituido. Algunos

ejemplos los constituyen el catecol, el pirogalol y los ácidos cinámicos y cafeico.

Plantas productoras de compuestos de estas características son el tomillo, la

manzanilla y la gayuba, cuyo principio activo, la arbutina, ha sido utilizado a lo largo

de los años en el tratamiento de la infección urinaria (Domingo D., 2003).

El mecanismo parece estar relacionado con la inhibición enzimática por los

compuestos oxidados, posiblemente mediante reacciones de grupos sulfihidrilo o por

interacciones no específicas con proteínas (Domingo D., 2003).

2.4.3 Cumarinas: Son compuestos derivados de la benzo-α-pirona, como la

cumarina, la esculetina, la umbeliferona y la escopoletina. Están presentes en las

margaritas y tienen propiedades antiinflamatorias, antitrombóticas y vasodilatadoras.

Parece que su mecanismo de acción antimicrobiano es mediante interacción con el

ADN eucariota, lo que explica también su actividad antiviral (Domingo D., 2003).

2.4.4 Alcaloides: Reciben esta denominación los compuestos nitrogenados

heterocíclicos. Pertenecen a este grupo, entre otros, sustancias como la morfina, la

heroína y la cocaína. El mecanismo de acción de los alcaloides parece ser mediante

intercalación entre la pared celular y el DNA del microorganismo (Domingo D.,

2003).

2.4.5 Los Aldehídos: Son derivados de los alcoholes primarios por deshidrogenación.

Muchos aldehídos son aromatizantes como la vainilla y el citral. Así mismo este

3 El tetrahidrocannabinol (THC) es uno de los compuestos activos de la marihuana que está siendo objeto de un gran número de estudios debido a las propiedades beneficiosas que puede ejercer sobre algunas patologías.

xxxiii

grupo fitoquímico tienen propiedades antisépticas. La vainilla por ejemplo tienen

efectos coleréticos (Carey, 2003).

2.4.6 Los Terpenoides: Son compuestos a menudo no saturados formados por

carbono, hidrógeno y oxígeno de estructura no aromática y que se encuentran sobre

todo en los aceites esenciales y en las resinas (Carey, 2003).

Muchas de las plantas, deben a sus compuestos terpénicos de las esencias, sus

propiedades aromáticas. Pero estas sustancias, poseen también propiedades

farmacodinámicas muy variadas en relación con las diferentes funciones ligadas a su

esqueleto terpénico. Algunas, son irritantes de la piel y de las mucosas, utilizándose

como rubefacientes4 (pineno en la esencia de trementina). Los azulenos tienen

propiedades antinflamatorias. El geraniol, cineol y linalol tienen propiedades

antisépticas. El ascaridol, tiene propiedades vermífugas. La tuyona tiene propiedades

abortivas y estupefacientes. Las cucurbitáceas, poseen propiedades tóxicas y

necrosantes. El ácido glicirricético tiene propiedades antinflamatorias (Torres C,

2004).

2.4.7 Flavonas: Las flavonas son estructuras fenólicas que contienen un grupo

carbonilo. Constituyen la familia más amplia de fenoles naturales. Su actividad frente

a los microorganismos probablemente se debe a que forman complejos con las

proteínas solubles y extracelulares y con las células de la pared bacteriana, de forma

similar a las quinonas. Mención especial merecen las catequinas, presentes en el té

verde, las cuales ejercen actividad frente a Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans,

Shigella y otros microorganismos. Otros flavonoides tienen en general actividad

antiviral.

2.4.8 Los Isoflavonoides: Actúan como efectivas fitoalexinas, las cuales pueden ser

definidas como compuestos antimicrobianos de pequeño peso molecular o 4 Rubefaciente se refiere a la sustancia que produce un enrojecimiento en la piel debido al flujo de la sangre de los vasos capilares.

xxxiv

metabolitos de estrés biológico. Ellos pueden ser constitutivos o también ser

inducidos por ataque biológico o heridas. Los constituyentes varían entre especies, y

también varían dependiendo la edad y el ambiente en el que se encuentra la planta.

Estos flavonoides inhiben la germinación de esporas de hongos y causan daño a los

sistemas de membrana. El recubrimiento de algunas semillas y algunas resinas de

árboles son particularmente ricas en flavonoides antimicrobianos. Esta cita e

información se debe incluir.

2.4.9 Los Alcaloides: Estos compuestos constituyen con los heterósidos y los

antibióticos la mayor parte de los principios activos de las plantas medicinales. Son

sustancias de origen biológico y sobre todo de origen vegetal, ya que en el reino

animal se encuentran raramente representadas. Los alcaloides contienen siempre

carbono, hidrógeno, nitrógeno y oxígeno. Excepcionalmente algunos alcaloides

contienen azufre (Torres C, 2004).

2.4.10 Quinonas: Las quinonas son anillos aromáticos con dos funciones ceto. Son

ubicuas en la naturaleza y causantes del color marrón que se produce en las frutas

cuando son dañadas. Poseen una alta reactividad, formando complejos con los

aminoácidos hidrofílicos de las proteínas, la mayoría de las veces inactivando la

proteína y anulando su función. Debido a esto, el potencial antimicrobiano de este

grupo es amplio (Domingo D., 2003).

2.4.11 Tanoides o Taninos: Son sustancias de origen vegetal, no nitrogenadas de

estructura polifenólica, solubles en agua, alcohol y acetona. Estas sustancias son de

sabor astringente y tienen la propiedad común de curtir la piel, haciéndola

imputrescible e impermeable al fijarse sobre sus proteínas (Domingo D., 2003).

El término tanino se empleó para denominar ciertas sustancias presentes en extractos

vegetales capaces de combinarse con proteínas de la piel animal, evitando su

putrefacción y convirtiéndola en cuero. Constituyen un grupo de sustancias fenólicas

xxxv

poliméricas y se pueden dividir en hidrolizables y condensados, en función de que

puedan o no ser hidrolizados. Se han descrito más de 30 taninos que pueden inhibir

hongos y bacterias (Domingo D., 2003).

2.4.12 Los aceites esenciales: Estos productos llamados comúnmente esencias son

sustancias olorosas volátiles contenidas en los vegetales. Su volatilidad les diferencia

de los aceites fijos que producen de los lípidos. Son particularmente abundantes en

las Coníferas, Rutáceas, Umbelíferas, Mirtáceas y Labiadas (Torres C, 2004).

Son compuestos causantes del agradable olor de determinadas plantas y algunos con

poder antimicrobiano, como el mentol obtenido de la menta (Menta piperita) y la

capsaicina de la planta conocida como el pimiento rojo o chile (Capsicumm annum).

(Domingo D., 2003).

2.4.13 Saponinas: son los compenentes principales de varios extractos de plantas,

tienen actividad antiprotozoaria. Las saponinas se unen al colesterol y otros esteroles

de la membrana celular de los protozoos causando su inestabilidad, lisis y muerte

celular (Calsamiglia S, 2005).

2.4.14 Esteroides y Triterpenos: Los compuestos esteroidales pueden interferir

determinados procesos de síntesis vitales en la célula bacteriana y los triterpenos, por

su parte, pueden actuar siguiendo diversos mecanismos en dependencia de su

naturaleza química: los de naturaleza hidrocarbúrica, por ejemplo, tienen

generalmente acción depresora sobre la tensión superficial lo cual, cuando tiene lugar

en el entorno de la célula bacteriana, altera la selectividad de la membrana

citoplasmática para el intercambio de sustancias. Los triterpenos de naturaleza

alcohólica pueden alterar la naturaleza coloidal del protoplasma de la célula

provocando su muerte (Pelczar M., 1992).

xxxvi

2.4.15 Cromenos y Benzofuranos: Los cromenos y benzofuranos son productos

naturales que se han encontrado en algunas especies de Rutaceae, Liliaceae,

ciperaceae y principalmente en ciertas tribus de las Asteraceae, entre las cuales parece

ser exclusivos de las Asterreae, Eupatorieae, Heliantheae, Inulaeae y Senecioneae

(Scherriber, K., 1963).

Estos compuestos se encuentran presentes generalmente en hojas y tallos, y menos

comúnmente en raíces habiéndose encontrado en los primeros hasta un 5% sobre el

peso seco (Scherriber, K., 1963).

Muchos cromenos y benzofuranos han mostrado ser biológicamente activos como el

toxol y la dehidrotrementona que son bacteriostáticos; la tremetona, la

dehidrotremetona y la hidroxitremetona son tóxicos a los peces; el toxol y el angelato

de toxilo exhiben una debil actividad antitumor contra la leucemia linfocitica P-388;

el encecalin, el 7-hidroxiencalin y la 6- metaoxieuparina son fototóxicos a varios

hongos y bacterías; el encecalin también ha mostrado acción insecticida; así mismo

los precocenos I y II actuan como hormonas antijuveniles en los insectos (Scherriber,

K., 1963).

2.4.16 Sesquiterpenlactonas: derivadas biogenéticamente de los sesquiterpenos, son

una clase de productos naturales distribuidos menos ampliamente que estos últimos y

de ocurrencia predominante en la familia Asteraceae (notablemente en géneros

Artemisia y ambrosia), de allí que su distribución permite ser aplicada a problemas

taxonómicos especialmente en los géneros nombrados y en otras taxas (Scherriber,

K., 1963).

Son sustancias amargas que se encuentran en todas las partes de las plantas, en

concentraciones que varían entre 0,01 y 8% del peso seco, siendo las concentraciones

mayores generalmente en las hojas; son bastantes solubles en cloroformo y en eter

etílico. Presentan gran importancia por la variada acción biológica que han

xxxvii

demostrado: acción citotóxica, antitumoral, analgésica, inhibidoras del crecimiento de

bacterias, entre otras (Scherriber, K., 1963).

Estos compuestos lactónicos son primariamente clasificados en base a su esqueleto

carbocíclico como germacranólidos, guaianólidos, eudesmanólidos y pseudo-

guaianólidos, entre otros (el sufijo olido se refiere a la función lactona) (Scherriber,

K., 1963).

2.5 ESPECIES VEGETALES

2.5.1 Valeriana pilosa

Figura 1. Valeriana pilosa Fuente: Autores

Orden: DIPSACALES

Especie: Valeriana pilosa Ruiz & Pavón

Familia: VALERIANACEAE

xxxviii

Sinónimos: Valeriana longifolia H.B.K., Valeriana longifolia var. pilosa

(Ruiz & Pav.) Wedd.

Nombre Común: valeriana, Mata de gato

2.5.1.1 Características generales

2.5.1.1.1 Descripción: Hierba perenne con las hojas en una roseta basal, 10-75 cm de

alto, ramificada desde la base. Raíz central obcónica. Hojas simples, pecioladas;

lámina de la hoja lanceolada, 5-35 x 0.5-2.5 cm, subcoriácea, en la parte superior

glabra a pilosa, en la parte inferior glabra o pilosa, ocasionalmente con el nervio

medio piloso, aguda en el ápice, los márgenes enteros con pequeñas berrugas en la

parte superior que dan la impresión de dientes; peciolos dilatados y generalmente

ciliados en la base. Inflorescencia paniculoide, 2-41 x 1-8 cm, el eje piloso; eje

principal de la inflorescencia con 1-3 pares de hojas sésiles, lanceoladas a linear

lanceoladas, generalmente con el margen verrugoso, con o sin inflorescencias

parciales en sus axilas, brácteas y bracteolas superiores espatuladas, 2-10 x 1-4 mm,

glabras o pilosas en la base. Flores ginodioicas, corola infundibuliforme, la de flores

perfectas de 2-3 mm de longitud, la de flores pistiladas de 1-2.5 mm de longitud,

blanca, a menudo teñida de púrpura, glabra, 5-lobada; estambres o estilo exsertos.

Aquenios de 1.5-2 mm de longitud, de forma creciente en corte transversal, el vilano

de 3-5 mm de longitud, usualmente con 6 radios (Guzmán, 2005)

2.5.1.1.2 Distribución geográfica: El género Valeriana tiene 150 especies

distribuidas por todo el mundo, la mayoría en Sudamérica, especialmente en la

Cordillera de los Andes. Esta especie se distribuye en Ecuador, Perú y Colombia

entre los 2700 a 4250m. En Colombia se encuentra en los departamentos de

Antioquía, Caldas, Santander, Boyacá y Cundinamarca entre los 2700 a 3800m. En

Cundinamarca se halla en los páramos de Cruz verde, Sumapáz, El Tablazo,

Chingaza, San Cayetano, Chipaque, Chisacá. Esta especie crece en bosques alto

andino y páramo (Torres, 2007).

xxxix

2.5.1.1.3 Fitoquímica: Los análisis fitoquímicos preeliminares uno realizado en las

hojas y otro en los rizomas de V. pilosa mostraron la presencia de alcaloides,

esteroides y/o triterpenoides, flavonoides y taninos. Las pruebas realizadas para

cumarinas y lactonas terpénicas, glicósidos cardiotónicos y saponinas dieron

resultados negativos. La presencia de alcaloides puede estar relacionada con

alcaloides iridoidales similares a los aislados de las raíces de V. officinalis (Guzmán,

2005).

Los iridoides son la familia de compuestos monoterpenicos mas comunes en el

genero Valeriana y en la familia Valerianaceae. Aunque en un principio se creía que

estos compuestos eran los responsables de la actividad sedante de la valeriana,

algunos autores consideran que los ácidos valerénicos y otros sesquiterpenos

estructuralmente similares, que se encuentran en el aceite esencial de las raíces de V.

officinalis son los responsables de esta actividad y no los valeropotriatos

(epoxiridoides encontrados en la Valeriana). Estos resultados sugieren la necesidad de

caracterizar química y farmacológicamente la especie V. pilosa, con el fin de evaluar

su aprovechamiento como una novedosa fuente de extractos sedativos (Guzmán,

2005).

2.5.1.1.4 Usos: En general, las especies pertenecientes al género Valeriana, son

usadas con fines medicinales. En Bogotá y alrededores se encuentra muy difundido el

uso de los tallos y hojas de estas plantas, como tranquilizante, para la conciliación del

sueño y otras afecciones del sistema nervioso. Sin embargo, la mayoría de las

personas adquieren los fragmentos de estas plantas en la sección de plantas

medicinales de las plazas de mercado y en centros naturistas, muchas veces sin tener

certeza sobre la identidad de la especie a la cual corresponde dicho fragmento, ya que

son pocas las personas que reconocen esta planta en su ambiente natural (Guzmán,

2005).

xl

En Perú, se reporta además el uso de las hojas y tallos de la Valeriana pilosa para

curar las irritaciones, como desinfectante y para combatir la fiebre interna. Las raíces

de esta especie se hierven por pocos minutos y el té es utilizado como un sedante y

para disminuir el stress (Gúzman, 2005).

2.5.2 Myrcianthes rhopaloides

Figura 2. Myrcianthes rhopaloides.

Fuente : Autores

Orden: MYRTALES

Familia: MYRTACEAE

Especie: Myrcianthes rhopaloides (H.B.K.) McVaugh

xli

Nombres comunes: Hueso, Guayabo, Almanegra, Arrayán, Arrayán guayabón,

Guayabón, Arrayán negro, Arrayán de los Andes.

Sinónimos: Eugenia porphyroclada O. Berg, Eugenia rhopaloides (Kunth) DC.,

Myrtus rhopaloides Kunth

2.5.2.1 Características generales de la especie

2.5.2.1.1 Descripción: Árbol de hasta 15 m de altura, tronco cilíndrico, copa regular.

Corteza color rojizo, escamosa, resinosa y desprendible. Hojas simples, opuestas, de

limbo ovalado, consistencia coriácea; con el borde entero, a veces involuto; con ápice

marginado y base redondeada; haz glabro y lustroso, de color verde oscuro, envés

verde amarillento con la nervadura central prominente. Pecíolo corto lignificado.

Flores hermafroditas, completas y estaminoideas; cáliz dialisépalo, color verde;

corola con pétalos libres, color blanco; estambres muy numerosos, de 9-10 mm de

largo; ovario ínfero, estilo largo y estigma capitado. Fruto en drupa, carnoso, de

forma orbiculada, color rojo oscuro cuando maduro, con una sola semilla. Los frutos

pesan 2.88 g promedio; las semillas miden aproximadamente 0.82 cm de largo y 0.61

de ancho y 100 semillas pesan 0.172 g en promedio (Pico, 2004).

2.5.2.1.2 Distribución Geográfica: Se encuentra distribuida en Costa Rica,

Colombia, Ecuador, Panamá, Perú, y Venezuela desde los 2300 a 2800 m. En

Colombia se le encuentra en la cordillera Central y Oriental en el departamento de

Cundinamarca, en el altiplano Cundiboyacense y sus alrededores y en el Tolima. En

Cundinamarca en los municipios de la Calera (Santa Isabel), Facatativa. En Bogotá

D.C se encuentra en las zonas rurales de Usme (Pasquilla) y Sumapaz (Capitolio)

dentro de un rango altitudinal de 2500 a 3200m (Guzmán, 2005).

Crece en laderas bajas y pies de ladera, suelos pesados con drenaje lento, no

anegados. Frecuentemente se halla aislada en potreros junto con otros elementos

relictuales de los bosques de susca y de tíbar, como elemento silvopastoril tradicional

xlii

(potrero arbolado de arrayanes, común en toda la región andina con otros géneros y

especies de la misma familia). Es inductor preclimácico de la sere de laderas bajas,

vinculado a la mesosere del bosque de susca (Ocotea heterophylla) y la del tibaral

(bosque de Escallonia paniculata) (DAMA, 2000).

2.5.2.1.3 Propagación tradicional: Las semillas se extraen de los frutos con bisturí,

con presión de pinzas con punta delgada o bien de manera manual al presionar el

fruto carnoso, se lavan 2 a 3 veces con agua durante 2 minutos máximo cada vez. No

se realiza aplicación de jabones ni detergentes, dado el carácter fotosintético del

embrión y los cotiledones, desde el momento de maduración de los frutos. Deben

mantenerse en humedad superior al 60% desde la extracción del fruto y el lavado. No

requiere etapa de secado, posterior al lavado, por el contrario, debe mantenerse la

humedad. En medio estéril utilizando cajas de petri con papel absorbente, luz solar

parcial y temperatura ambiente en condiciones de laboratorio (17°C promedio), se

registra germinación desde el tercer día después de la hidratación hasta el séptimo

día, siendo la germinación del 100% para el día 7 (Pico, 2004).

La germinación es tipo hipogea, puesto que los cotiledones verdes permanecen en el

sustrato, en el lugar de siembra y emerge la radícula y posteriormente la plúmula

entre los cotiledones. Se deben sembrar 2 semillas por alvéolo, con una profundidad

de 1 cm, el riego debe ser cada 2 días y de manera suave (Pico, 2004).

2.5.2.1.4 Cosecha: La colecta se realiza de manera manual, halando de la parte

apical, para propagación se pueden colectar frutos con pocos días de caída en el

suelo.

El ciclo reproductivo de esta especie es poco constante y depende del tipo de suelo

pues plantas de una misma región inician fases reproductivas a diferentes épocas. En

el mes de abril en Pasquilla y Guachetá se han encontrado plantas de esta especie en

floración, plantas con frutos se encuentran en los meses de febrero en Duitama, abril

xliii

en Sumapaz, junio en el Verjón alto localidad de Chapinero y julio en la Calera. En el

JBJCM la floración generalmente inicia a principios de año en los meses de febrero a

abril y los frutos maduros son colectados cinco meses después (Pico, 2004).

2.5.2.1.5 Usos: Los frutos de ésta especie son comestibles y por su agradable sabor se

consumen directamente, en jugos con leche y dulces. La planta al igual que

Myrcianthes leucoxyla, es maderable y es empleada con fines medicinales. El uso

medicinal más frecuente en las áreas rurales de Bogotá es para combatir la diabetes,

utilizando diferentes partes de la planta. También se usa como tranquilizante

preparando las hojas en infusión y como antidiarreico, cocinando las hojas en agua

junto con el laurel (Laurus nobilis) (Molina, 2004).

Esta planta también es usada en la inducción de matorrales de Miconia spp., en la

formación de corredores y estribones ornitócoros, como barrera antiganado, cercas

vivas, ornamental y en la fabricación de postes y cabos de herramienta (DAMA,

2000).

2.5.2.1.6 Bromatología y Aporte Nutricional: Los resultados del análisis

bromatológico proximal expresados en base húmeda para M. rhopaloides son

presentados en la tabla 1, los cuales al ser comparados con los mismos obtenidos para

M. leucoxyla, evidencian que un menor aporte nutricional. Sin embargo, esta especie

representa un potencial de aprovechamiento muy interesante desde el punto de vista

de alimentos (Molina, 2004).

xliv

Nutriente Contenido

Proteína (g) 2.9

Grasa (g) 0.3

Fibra (g) 2.4

Cenizas(g) 1.4

Calcio (mg) 100mg

Fósforo (mg) 38

Hierro ppm 28

Tabla 1. Análisis bromatológicos proximales para M. rhopaloides (contenido/100g

de pulpa)

2.5.2.1.7 Fitoquímica: El aceite esencial obtenido por hidrodestilación de hojas M.

rhopaloides recolectadas en Ecuador fue caracterizado por CGAR y CGAR-EM,

identificando 40 compuestos de los cuales la mayoría corresponden a alcoholes y

aldehídos monoterpenicos como geranial (34%), neral (25%), α-pineno (7%), β-

pineno (9%) y algunos sesquiterpenos (1.5%). Al comparar estos resultados con lo

reportado por Guzmán et al. 2005 para M. leucoxyla, se encuentra que los aceites

tienen en común el alto contenido de monoterpenos tales como el α-pineno y β-

pineno, aunque detectados en concentraciones mayores para el aceite esencial de M.

rhopaloides, además de 1,8-cineol, mirceno, linalol, terpinen-4-ol, y nerolidiol

(Guzmán, 2005).

xlv

2.5.3 Passiflora manicata

Figura 3. Passiflora manicata

Fuente: Autores

Familia: PASSIFLORACEAE

Especie: Passiflora manicata (Juss.) Pers.

Sinónimos: Passiflora meridensis H. Karst., Passiflora rhodantha Harms, Tacsonia

manicata Juss.

Nombre Común: Flor de la pasión, Tacso (Nariño), Curubo de Monte (Quindío),

Diablito (Ecuador)

xlvi


2.5.3.1.1 Descripción: Plantas pubescentes o glabras en las superficies adaxiales de

las láminas foliares, flores y frutos. Tallos angulares, esencialmente glabros o

pubescentes. Hojas ovadas, trilobuladas, de 4.2 a 10.0 cm de largo y 5.0 a 12.0 cm de

ancho, con ángulos de aproximadamente 45º entre lóbulos medios y laterales, con

lóbulos oblongos u ovados, agudos o acuminados en el ápice, redondeadas o

ligeramente acorazonadas en la base, glandular-aserradas en las márgenes,

densamente pubescentes en la superficie abaxial, con tricomas ondulados,

transparentes, blancuzcos, de aproximadamente 0.3 mm de largo, glabras en la

superficie adaxial, con tricomas escasos repartidos sobre las venas foliares; pecíolos

de 1.4 a 4.1 cm de largo, con 4 a 9 nectarios generalmente estipitados, de 1 a 2 mm de

largo repartidos sobre la superficie adaxial; estípulas generalmente suborbiculares, de

1.5 a 2.0 cm de largo y 0.5-1.0 cm de ancho, con dentaciones gruesas en el margen.

Pedúnculo grueso, de 4.6 a 7.5 cm de largo; brácteas ovadas, libres hasta la base o

unidas cerca de la base, de 2.0 a 4.0 cm de largo y 1.0 a 2.0 cm de ancho, acuminadas

o agudas en el ápice, cuneadas o redondeadas en la base. Flores erectas de 5.0 a 5.6

cm de largo; hipantios cilíndricos, de aproximadamente 2 cm de largo; sépalos

oblongos o lanceolados de 3.0 a 3.6 cm de largo, de aproximadamente 6 mm de

ancho, verdosos abaxialmente, rojos adaxialmente; pétalos sub-iguales a los sépalos,

rojos; corona en 3 o 4 series, con filamentos de hasta 4 mm de largo, con series más

exteriores color morado, con la serie interior de color blanco; opérculo localizado

aproximadamente a 1 cm de la base del hipantio, de aproximadamente 1 cm de largo,

doblado, membranáceo, blanco. Frutos obovados u oblongos, de 3.5 a 5.5 cm de largo

y 2.0 a 3.7 cm de ancho, con pericarpio coriáceo, verde al madurar; semillas

obovadas a acorazonadas, de 3.5 a 5.1 mm de largo y 2.0 a 3.0 mm de ancho, con

testa reticulada, color café oscuro; arilo anaranjado poco suculento (Escobar, 1988).

Esta especie presenta características intermedias entre los subgéneros Tacsonia y

Passiflora. La flor es erecta, presenta una corola color rojo intenso, con un hipantio

xlvii

más corto que en el subgénero Tacsonia, pero más largo que en subgénero Passiflora;

es autógama y altamente polimórfica (Escobar, 1988).

2.5.3.1.2 Distribución geográfica: Es nativa de Venezuela, Colombia, Ecuador y

Perú. Posiblemente es originaria de los Andes de Perú y Chile, entre 1400m -2800 m

de altitud. Crece de forma silvestre como una enredadera (Torres, 2007).

2.5.3.1.3 Usos: El fruto no es considerado como comestible porque no se puede

diferenciar claramente el estado maduro del estado inmaduro, durante el cual los

frutos pueden tener efectos tóxicos y sicótropos (de ahí su nombre de “diablito” en el

Ecuador). El interés de esta especie proviene de su potencial para el mejoramiento

genético de las curubas, por su cercanía con ellas y su rusticidad. Es resistente a los

nemátodos y a las enfermedades fúngicas (antracnosis, oidio y Alternaria sp) (Torres,

2007)

xlviii

2.5.4 Hesperomeles ferruginea

Figura 4. Hesperomeles ferruginea. Fuente: Autores

Orden: ROSALES

Familia: ROSACEAE

Especie: Hesperomeles ferruginea (Pers.) Benth.

Nombres Comunes: Mortiño (Cordillera Central, Cundinamarca), noro (Cordillera

central, Valle del Cauca), cerote (Cauca, Huila), guayabo de páramo (Cauca, Valle),

manzano (Cauca, Santander). Huagra manzana, jalo, pujín, quique (Ecuador).

xlix

Sinónimos: Crataegus ferruginea Pers., Eriobotrya cordata Lindl., Hesperomeles

lanuginosa Ruiz & Pav. ex Hook., Hesperomeles oblonga Lindl., Mespilus ferruginea

(Pers.) Poir., Osteomeles ferruginea (Pers.) Kunth.

2.5.4.1.1 Descripción: Arbustos hasta 5 m de altura, ramas pubescentes o glabras

hacia las puntas. Estipulas, 2 a 6 mm de largo y 0.5 a 1 mm de ancho, pubescentes a

glabras, usualmente persistentes; pecíolos 0.5 a 2 cm de longitud, pubescentes. Hojas

más o menos oblongas, elípticas u ovadas, 3 a 10 cm de largo y 1.5 a 8 cm de ancho,

coriaceas o subcoriaceas, ápice redondeado, base redondeada, obtusa o subcordada,

margen serrado o biserrado, superficie adaxial frecuentemente puberula a glabra,

reticuladas o suavemente abullada, con venas inmersas, superfice abaxial pubescente

con venas prominentes. Inflorescencia en forma de cima con 10 a 100 flores,

densamente pubescentes; pedúnculo de 5 a 40 mm. Brácteas florales, 5 a 10 mm de

largo y 1 a 1.5 mm de ancho; pedícelo de 2 a 5 mm de longitud. Flores 5 a 9 mm de

largo; hipantio urceolado a crateriforme; sépalos 1.5 a 3 mm de largo, ápice agudo;

pétalos ampliamente elípticos u obovados, 2.5 a 5 mm de largo, glabros, pubérulos o

ciliados, blancos o cremas comúnmente teñidos de rosa o rojo. Fruto de 5 a 8 mm de

largo y 6 a 8 mm de ancho, rojo. Semillas de 2.5 a 3 mm de largo y 1 a 1.5 mm de

ancho (Guzmán, 2005).

2.5.4.1.2 Distribución geográfica: Se encuentra distribuida a lo largo de Suramerica,

en Colombia, Ecuador, Perú y Venezuela. Se encuentra entre los 2800 y 3900 m. En

Cundinamarca se localiza en los municipios de Cogua, La Aguadita, San Miguel y

Represa del Neusa. En Bogotá D.C. en las Localidades de Ciudad Bolívar, Sumapaz,

Usme y en los Cerros Orientales. También se encuentra en los departamentos del

Boyacá, Cauca, Cesar, Magdalena, Norte de Santander y Risaralda. Esta especie se

encuentra en relictos de bosque andino, asociada a matorrales densos en cañadas y

ocasionalmente en linderos de predios en forma aislada, es una especie persistente en

zonas de disturbio antrópico (Rangel, 2000).

l

Se desarrolla en suelos ácidos orgánicos y algo arcillosos, se han encontrado

asociaciones micorríticas de tipo vesículo arbuscular, en cuanto a aspectos climáticos

no soporta heladas prolongadas y se producen defoliaciones frecuentes. Esta planta

esta más adaptada a paramos húmedos que H. goudotiana (Rangel, 2000).

2.5.4.1.3 Usos: En las áreas rurales del sur de Bogotá D. C. esta especie al igual que

H. goudotiana es bastante conocida y utilizada. El fruto maduro se consume

directamente, o se usa para preparar mermeladas, dulces y yogurt. En el departamento

de Boyacá los frutos de mortiño se tuestan con azúcar o panela, y se prepara “masato”

para las fiestas de San Pedro a finales de Junio (Cardozo, 2005).

Por otra parte, a partir de esta planta se obtiene la madera para fabricar cabos de

azadón y cercas vivas (Molina, 2004), lo que esta ocasionando una gran disminución

en las poblaciones de esta especie, hecho que también se evidencia en países como

Ecuador, donde H. ferruginea se encuentra amenazada por la fragmentación de

hábitat y por la tala a la que es sometida por la calidad de su madera; además la

regeneración natural no es eficiente y los pocos árboles que alcanzan a rebrotar en las

áreas intervenidas son muy susceptibles a enfermedades (Ordóñez, 2006).

2.5.4.1.4 Fitogeografía y ecología: Posición sucesional: inductores preclimácicos

priserales. Aparece como subordinada en las priseres del encenillal, denotando las

facies de suelos húmedos. Es un importante elemento protector de los bordes

relictuales, por sus espinas. Su papel como subdominante del clímax de subpáramo

húmedo, indica también su función mediadora del ascenso del límite superior del

bosque y la regeneración del encenillal sobre subpáramos húmedos y potreros por

encima de los 3200 msnm. Es uno de los precursores leñosos más frecuentes en los

pastizales altos de Holcus lanatus en el subpáramo degradado (Torres, 2007).

2.5.4.1.5 Fitoquímica: Aún no se han publicado estudios acerca de la composición

química de los frutos, hojas y otras partes de H. ferruginea, sin embargo cabe esperar

li

que no difiera de la composición de otras especies de su mismo género, como la

observada en H. goudotiana donde se encuentran esteroides, triterpenoides,

flavonoides y taninos. Además por la coloración de sus frutos es muy probable que

contenga compuestos polifenólicos tipo antocianinas que pueden ser utilizadas como

colorantes en la industria de alimentos y posiblemente como antioxidantes (Garzón,

2006).

No se han publicado estudios sobre la actividad biológica que pueda tener H.

ferruginea, sin embargo en otras especies como H. cuneata Lindl., H. obtusiofolia

(Pers.) Lindl. H. heterophylla Hook., se ha encontrado que los frutos y las hojas

tienen actividad antiinflamatoria sobre los riñones y el hígado (Garzón, 2006).

2.6 MICROORGANISMOS SELECCIONADOS

2.6.1 Hongo fitopatógeno

La mayoría de los hongos fitopatógenos forman hifas, es decir, talos tubulares, que se

extienden mediante crecimiento apical y un sistema organizado de ramificación. La

red de hifas que resultan de dicho crecimiento se conoce como micelio y el micelio

interconectado producto de un propágulo o de la fusión de hifas de dos o más

propágalos se denomina colonia (Ayala S, 1998).

lii

2.6.1.1 Alternaria sp.

Figura 5. Características Macro y Microscópicas de Alternaria sp.

Forma parte de los llamados hongos imperfectos. Produce manchas en hojas, frutos y

tallos, además de necrosis foliar (Arévalo A, 1996). Algunas de la enfermedades más

comunes causadas por Alternaria spp, incluye el tizón temprano de la papa, el tomate

y el brócoli; mancha de la hoja del tabaco, del geranio, hule, gladiola y kenaf; tizón

de la zanahoria, macha circular en la remolacha, mancha concéntrica del cártamo,

pudrición negra del fruto en el chile. Causa manchas y tizón en la cebolla, manchas

en frutas como la manzana, el limón y la naranja. Estas manchas son generalmente

café oscuras o negras, frecuentemente numerosas y dispuestas en anillos concéntricos

que le dan la apariencia de tablero de tiro (Ayala S, 1998).

Sobre las ramas y tallos de plantas tales como el tomate, aparecen varias manchas

obscuras, profundas y con frecuencia en forma de blanco. A veces las lesiones del

tallo en las plántulas forman cánceres que pueden extenderse, cubrir el tallo y matar a

la planta, o si se forman cerca de la superficie del suelo pueden desarrollarse y

originar una pudrición del cuello. (Forero N, 1997)

Características macroscópicas: Colonias vellosas, de superficie rugosa y borde

regular, de color gris intenso en el anverso y negro en el reverso (Ayala S, 1998).

Características microscópicas: Conidios grandes y pequeños entre lazados (Ayala S,

1998).

liii

2.6.2 Microorganismos patógenos

2.6.2.1 Candida albicans

Figura 6. Características Macro y Microscópicas de Candida albicans.

La especie patógena más frecuente en el hombre es la Candida albicans. Estos

hongos viven como saprofitos sobre la piel y las mucosas del tracto respiratorio,

digestivo y genital femenino, de preferencia en pacientes diabéticos y durante el

embarazo (Roncancio B, 2001). Es una levadura, redonda u ovoide con 3 mcm de

diámetro, con o sin gemación. Forma parte de la flora normal de la boca, tubo

digestivo y vagina. Y esta considerada como la más patógena de este género (Arévalo

A, 1995). Es frecuente ver las invasiones superficiales (piel y mucosas) producidas

por este hongo (Roncancio B, 2001). La forma generalizada se produce por vía

hemática y se manifiesta por lesiones o abscesos en casi todos los órganos y tejidos.

Microscópicamente se puede observar que en el tejido se forma un micelio con hifas

delgadas y seudohifas, además de células micéticas levaduriformes pequeñas. Estas

células pueden mostrar gemación. Las hifas y seudohifas penetran en el tejido como

lo hacen las raíces de una planta (Roncancio B, 2001).

Se relaciona con los alimentos ya que es una levadura presente en la fermentación de

éstos, atacando alimentos ricos en grasa, a pesar de ello otras especies de Candida sp

liv

tienen importancia industrial produciendo ácidos orgánicos, etanol a partir de

nutrientes especiales, enzimas como la lipasa utilizada en la producción de jabón,

lípidos en sustratos ricos en glucosa y vitaminas como la riboflavina, entre otras

(Roncancio B, 2001).

Presenta rasgos clínicos como dolor de esófago y dificultad para comer, infección del

torrente sanguíneo y enfermedad diseminada normalmente con fiebre, raramente:

pulmonía, osteomelitis y artritis.

Según el CDC y la división de enfermedades bacterianas y micóticas posee una

incidencia de 8 casos/100000 en la población general, en los pacientes VIH positivos

se presenta como una infección oportunista (Roncancio B, 2001).

2.6.2.2 Staphylococcus aureus

Figura 7. Caracterísiticas Macro y Microscópicas de Staphylococcus aureus.

Son cocos Gram positivos de 0,5 - 1 mcm de diámetro, inmóviles, aerobios o

anaerobios facultativos, caracterizados por su agrupación en forma de racimo. Crecen

a una temperatura óptima de 37 °C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente

alcalino de 7.6 la adición de glucosa favorece el crecimiento (Peñaranda, 2003).

Forma parte de la flora normal de mucosas y piel e intervienen en procesos

patológicos diversos como infecciones supurativas e intoxicaciones alimenticias

(Arévalo A, 1996). Más del 95% de los Staphylococcus aureus producen proteína A,

lv

la cual puede estar asociada a la célula o al medio extracelular, con una importante

afinidad por la fracción Fc de la Ig G. La presencia de proteína A o coagulasa es de

gran utilidad clínica para diferenciar Staphylococcus aureus de otras especies de

Estafilococos (Uribe C, 2003). Staphylococcus aureus es una bacteria que puede

causar infección en todos los grupos de edad tanto en forma esporádica como

epidémica y se ha identificado como una de las principales causas de infección de

heridas quirúrgicas. Su principal forma de transmisión es por contacto (Uribe C,

2003).

La capacidad de S. aureus para fermentar los azúcares como maltosa, manitol,

trehalosa es positiva. La producción de una nucleasa termoestable es un buen

indicador de la presencia S. aureus, al igual que la conversión de nitratos a nitritos

(Peñaranda O, 2003).

Elaboran diversas enzimas: proteasas, lipasas, fosfatasas, gelatinasas, catalasas y

coagulasas (Peñaranda O, 2003).

En cultivo puro resisten una concentración de fenol al 1% durante 15 minutos, pero

solo los mata una concentración al 2%. Soportan el calor húmedo a 60 °C durante 30

minutos. Muchas cepas de S. aureus toleran concentraciones altas de cloruro de sodio

(7,5 a 10%), y son fácilmente inhibidos por colorantes como el violeta de genciana

(Peñaranda O, 2003).

lvi

2.6.2.3 Escherichia coli

Figura 8. Características Macro y Microscópicas de Escherichia coli.

Es un bacilo de 1 – 3 µm por 0.5 µm, que se presenta sólo, en pares, en cortas

cadenas o formando grupos. En general es móvil (por flagelos perítricos), aunque

existen variantes inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general es no

cápsulado y Gram negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante

frecuente; en los viejos se presentan formas de una dimensión mayor (Peñaranda O,

2003).

En agar forma colonias circulares de 3 a 5 mm convexas, de borde continuo o un

tanto ondulado, brillantes y de coloración blanca un poco amarillenta. Con

producción de ácido y gas, fermenta la lactosa y un gran número de carbohidratos;

algunas cepas son lactosa negativas. Es indol positiva, rojo de metilo positiva, Voges

Proskauer (VP) negativa y no utiliza el citrato. Produce H2S en determinados medios.

Acidifica y coagula la leche. Pueden necesitarse pruebas adicionales en casos de E.

coli aislada de colitis hemorrágicas, las cuales son típicamente negativas a sorbitol.

Este bacilo es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento

es de 37 °C, pero posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de

temperaturas; el pH favorable es de 7 alguna cepas producen hemolisina (Peñaranda

O, 2003).

Se ha considerado inicialmente sólo como un habitante del intestino, desde hace cerca

lvii

de tres décadas se empezó a estudiar su poder enteropatógeno. Se ha visto que las

cepas toxigénicas de E. coli pueden producir una enterotoxina termolábil (TL),una

termoestable (TS) o ambas. La TL es una proteína de alto peso molecular, que

bioquímicamente es muy similar a la toxina de Vibrio cholerae, activando la

adenilciclasa. Es inactivada a 60 ºC. La TS es una pequeña molécula relativamente

estable al ser hervida (Rodríguez V, 1995).

2.6.2.4 Bacillus subtillis

Figura 9. Características Macro y Microscópicas de Bacillus subtillis.

Son bacilos Gram positivos de tamaño 1 por 8 mcm, inmóviles, aerobios o anaerobios

facultativos, formadores de endosporas. Habitan en el suelo, agua, aire y son

contaminantes del ambiente de laboratorio. Este microorganismo es obligado en esta

clase de bioensayos por su gran sensibilidad. (Arévalo A. 1996)

Se encuentra con frecuencia en tierra y en vegetales, también se encuentra en diversos

productos alimenticios, produciendo infecciones aéreas o por contacto, se considera

un microorganismo perjudicial pero no peligroso en carne en la cual ataca las

proteínas. Este bacilo hidroliza el almidón y reduce los nitratos, no produce indol a

veces forma una escasa cantidad de ácido sulfúrico, sus esporas son menos

termorresistentes que las de los géneros térmofilos. (López L., 2001)

Esta bacteria no se desarrolla en la leche cruda porque mediante la acidificación

lviii

continuada producida por los streptococcus lácticos, se entorpece su crecimiento; a

pesar de esto a una temperatura alta adecuada, este bacilo muchas veces puede

coagular la leche pasteurizada por medio de los fermentos de laboratorio sin previa

acidificación y tras reposar un largo período puede sobrevenir la peptonización.

Esta bacteria también es importante porque produce subtilicina, una bacteriocina que

inhibe o mata especies estrechamente relacionadas o incluso a cepas diferentes de la

misma especie. (López L., 2001)

Algunas enfermedades causadas por este son:

- Mancha blanca del trigo

- Daños en cultivo de tejidos de la palma datilera

- Daños en óvulos y semillas de papa (López L., 2001)

2.7 ANTIMICROBIANOS

Desde el siglo XVIII se han empleado sustancias químicas para el tratamiento de las

emnfermedades infecciosas. Paul Ehrlich, quien formulo los principios de toxicidad

selectiva, reconoció las reacciones químicas específicas entre microorganismos y

medicamento, la aparición de la resistencia a estos y el papel de la terapéutica

combinada para combatirlos. Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se

acrecentó el interés en sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas

antibióticos, de ahí surgió la penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol,

etc. Las cuales también han sido obtenidas sintéticamente, a través de modificación

química, total o parcial, de las moléculas por biosíntesis (Manrique E, 1997).

El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de

diferentes maneras: por inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones

de la membrana celular, de la traducción de material genético y de la síntesis de

ácidos nucleicos (Manrique E, 1997).

El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es

lix

perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades,

estas sustancias pueden actuar de dos maneras:

a. Como microbiocidas, es decir, que matan las formas vegetativas de los

gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias

y fungicidas refiriéndose a hongos.

b. Como microbiostatico, es decir que inhibe el crecimiento de microorganismos

y se denominará, bacteriostático o fungistático, según se refiera a bacterias o a

hongos, respectivamente (Barreto J, 1997)

2.7.1 CLORAMFENICOL

2.7.1.1 Origen

El Cloramfenicol (Cm) es un antibiótico clásico de amplio espectro que es producido

por diversas especies del género bacteriano Streptomyces. Este agente antimicrobiano

es único entre los compuestos naturales ya que contiene un grupo nitrobenceno

conectado a un grupo propanol, así como un grupo amino conectado a un derivado

del ácido dicloroacético. El Cm es una de las moléculas más simples, razón por la que

fue el primer antibiótico cuya síntesis química fue desarrollada para la producción

comercial a gran escala y que ha sido modificado en múltiples para la obtención de

moléculas análogas con mejor actividad antimicrobiana. A pesar de la toxicidad del

Cm, algunas veces éste se usa como antibiótico sistémico debido a su efectividad

contra infecciones causadas por Samonella typhi y se recomienda en pacientes con

meningitis de tipo bacteriana causada por Enterococcus faecium, Haemofilus

influenzae, Neisseria meningitidis y Streptococcus pneumoniae, especialmente en

aquellos que son alérgicos a los β – lactámicos. Además, debido a que la molécula de

Cm es pequeña y con características poco polares, este antibiótico es capaz de

difundir a través de células eucarióticas y paredes de células procarióticas. De hecho,

la solubilidad lipídica de este antibiótico es la que permite que el Cm penetre bien

lx

dentro del cerebro, razón por las que sus potencialidades se aumentan para tratar

infecciones en estos sitios donde otros antibióticos no podrían llegar a producir los

efectos deseados. Además el Cm sigue siendo un antibiótico de elección para el

tratamiento tópico de una amplia variedad de infecciones bacterianas incluyendo las

causadas por anaerobios (Morales Y, 2007).

2.7.1.2 Mecanismos de acción del cloramfenicol

El mecanismo de acción principal del Cm sobre diversas bacterias, involucra la

inhibición de la síntesis de proteínas en las cepas sensibles. El ácido ribonucleico

mensajero (ARNm), derivado del proceso de transcripción es usado como molde por

el complejo ribosomal donde la información es convertida a proteínas (traducción).

Los ribosomas son la unidad funcional de la traducción y actúan como un catalizador.

El Cloramfenicol se une a la subunidad 50S bloqueando las funciones principales de

los ribosomas como la reacción de la PTasa, la terminación de la traducción y

causando un proceso de traducción impreciso. La inhibición de la síntesis de las

proteínas causada por el Cm en la mayoría de los microorganismos susceptibles

produce un efecto bacteriostático (Morales Y, 2007).

Los ribosomas eucarióticos son más largos, complejos y difieren significativamente

de los procariotas, razón por la cual los agentes antimicrobianos como el

Cloramfenicol no interfieren considerablemente con ribosomas eucarióticos y poseen

más especificidad sobre los ribosomas de las células procariotas (Morales Y, 2007).

2.7.1.3 Mecanismos de resistencia bacteriana al cloramfenicol

Los microorganismos han desarrollado distintas estrategias para competir por los

nutrientes en su hábitat, algunos han mejorado sus sistemas de quimiotaxis y otros

han elaborado compuestos antimicrobianos para inhibir a otros miembros del

ambiente. Diversas son las sustancias antagónicas que los microorganismos producen

para dominar su hábitat, por ejemplo los antibióticos de amplio espectro, los

lxi

productos del metabolismo como ácidos orgánicos, las moléculas quelantes de hierro

(sideróforos) y las bacteriocinas (Morales Y, 2007).

2.7.1.4 Constitución química

Fórmula global C11H12Cl2N2O5

Peso molecular: 323.13

Estructura química

2.7.1.5 Propiedades

Es un polvo blanco o blanco amarillento, inodoro, intensamente amargo; es poco

soluble en agua, muy soluble en alcohol, propilenglicol, acetona y acetato de etilo. Es

prácticamente estable en soluciones neutras o ligeramente ácidas, pero se destruye

rápidamente en solución alcalina (Morales Y, 2007).

lxii

2.7.2 GRISEOFULVINA

Obtenida de especies de Penicillium. Utilizada en infecciones micóticas. Es un

análogo de las purinas y así conlleva a un error de la secuencia de los aminoácidos

para la lectura del RNAm, inhibiendo así, la mitosis fúngica. La resistencia está dada

por cambios en la permeabilidad de la membrana celular. Tiene acción fungistática,

bloquea la reproducción del hongo, inhibiendo la mitosis fúngica. (Manrique E,

1997).

2.8 MÉTODOS DE EVALUACIÓN ANTIMICROBIANA

Estas técnicas fueron desarrolladas al observar que los microorganismos eran capaces

de inducir resistencia al antimicrobiano que se ha utilizado contra él durante un

período largo de tiempo, esta resistencia puede deberse a diversos mecanismos como:

a. Producción de una sustancia que destruye el antibiótico.

b. Adaptación del metabolismo bacteriano para inhibir el antibiótico.

c. La pared celular del microorganismo se vuelve impermeable al antibiótico.

d. Un fago comunica la resistencia por transducción

e. Desaparición de cepas sensibles y supervivencia de cepas resistentes por un

fenómeno de selección natural.

f. Producción de cepas mutantes (Arévalo A, 1996).

Existen varias técnicas para evaluar los antimicrobianos: métodos de dilución,

método de difusión en gel y método de bioautografía (Arévalo A, 1996).

2.8.1 Método de difusión en gel

Se basa fundamentalmente en incorporar al medio de cultivo el antibiótico o el

microorganismo en concentración conocida para que luego de solidificado el medio

se adicione la contraparte y observar inhibición de crecimiento o halos de inhibición

según la técnica utilizada. Esta técnica también abarca la llamada de discos de papel,

lxiii

en la cual el antibiótico a ensayar viene incorporado a discos de papel absorbente en

concentración conocida, los cuales se colocan sobre la superficie de una caja de agar

sembrado masivamente con el microorganismo en estudio, luego de incubar a la

temperatura y tiempo adecuados se observan halos de inhibición de crecimiento

(Arévalo A, 1996).

Las ventajas de los métodos de difusión son que utilizan una pequeña cantidad de la

muestra evaluar y ofrecen la posibilidad de ensayar varias sustancias contra un

mismo microorganismo (Arévalo A, 1996).

Con éstas técnicas y realizando diluciones de los diferentes antimicrobianos a probar

se puede la concentración Mínima Inhibitoria (MIC), que se define como la menor

concentración de antibiótico en µg/mL capaz de inhibir el desarrollo in vitro del

microorganismo en estudio y la concentración Mínima Bactericida (MBC),

considerándose como la menor concentración del antibiótico en µg/mL que mata los

microorganismos in vitro (Arévalo A, 1996).

2.8.2 Método de dilución

También llamado turbidimétrico, consiste en hacer diluciones seriadas del antibiótico

en µg/ml en caldo de cultivo y un tubo como control de crecimiento de

microorganismo, los tubos se inoculan con una suspensión calibrada del

microorganismo y se incuban a temperatura y tiempo determinados, finalizado el

período de incubación, los tubos se examinan visualmente para comprobar la

existencia o no de turbidez. (Manrique E, 1997)

2.8.3 Método de Bioautografia

Este método consiste en incluir los cromatogramas obtenidos por cromatografía en

capa fina en un medio de cultivo. Para ello se utilizan placas cromatográficas de sílica

gel 60f 254 de MERCK o de celulosa las cuales se colocan en las cajas petri

lxiv

correspondientes. Previamente se procede a eliminar el disolvente para evitar falsas

bandas de inhibición. (Manrique E, 1997)

La bioautografía ha sido considerada como el ensayo más eficiente para la detección

de componentes antimicrobiales, porque esta permite la localización de la actividad

en un complejo matriz y por lo tanto permite un directo aislamiento de los

constituyentes activos. El ensayo de bioautografia puede dividirse en tres grupos:

a. bioautografía directa: Donde los microorganismos crecen directamente sobre

la capa fina cromatográfica.

b. bioautografia de contacto: Donde los componentes antimicrobiales son

transferidos de la fina capa cromatográfica y son inoculados en una caja de

agar a través de contacto directo.

c. bioautografia cubierta de agar o inmersión de bioautografia: Es donde el

medio de agar sembrado es aplicado encima de la fina capa cromatografica.

(Manrique E, 1997)

lxv

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

3.1 Formulación del problema

¿Tendrán actividad antimicrobiana los extractos etanólicos o aceites esenciales

obtenidos a partir de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles

ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata contra los


aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp ?

3.2 Justificación de la Investigación

En la actualidad, el gran desafío para los países ricos en biodiversidad es poder

vincular y convertir el conocimiento proveniente de los recursos biológicos en

compuestos, procesos, métodos, herramientas o productos útiles, como parte del

aprovechamiento y la explotación sostenible de la diversidad biológica en beneficio

de la sociedad. El Distrito Capital posee especies cuyas propiedades medicinales no

han sido estudiadas por completo, y con el fin de de generar conocimiento en cuanto

a las posibles propiedades farmacológicas se han seleccionado las especies

Myrcianthes rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana

pilosa que posiblemente pueden tener propiedades antimicrobianas, ya que especies

de su misma familia y género han sido estudiadas preliminarmente por tener

principios activos bactericidas y fungicidas.

Este trabajo de grado se basa en evaluar la actividad antimicrobiana de extractos

etanólicos de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea,

Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para demostrar la capacidad

inhibitoria que ejercen éstas sustancias obtenidas de estas plantas contra los


lxvi

aureus, Candida albicans y el hongo fitopatógeno Alternaria sp para formar parte

del desarrollo científico de la sociedad, estudiar microbiológicamente las propiedades

terapéuticas de plantas colombianas ya que resulta imprescindible descubrir nuevas

sustancias con actividad antibiótica frente a microorganismos resistentes y con alta

capacidad infectiva, aumentando la calidad de vida del hombre.

lxvii

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y aceites esenciales de las

especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes

rhopaloides y Passiflora manicata frente a los microorganismos patógenos

Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus, Candida albicans y el

hongo fitopatógeno Alternaria sp. mediante la Prueba de Sensibilidad

Antimicrobiana.

4.2 Objetivos Específicos

- Realizar la prueba de sensibilidad antimicrobiana a cada uno de los extractos

vegetales utilizando los microorganismos seleccionados.

- Determinar cual de los extractos obtenidos presenta mayor acción contra los

microorganismos Escherichia coli, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus,

Candida albicans y Alternaria sp.

lxviii

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 LOCALIZACIÒN

El presente trabajo se llevó a cabo en las instalaciones de los laboratorios de la

Subdirección Científica del Jardín Botánico José Celestino Mutis de la ciudad de

Bogotá D.C (JBJCMB).

5.2 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS

Se recolectó el material vegetal para cada especie vegetal de la siguiente forma:

Myrcianthes rhopaloides Jardín Botánico Bogotá José Celestino Mutis

Passiflora manicata Ubate – 2800 mt

Hesperomeles ferruginea Guacheta - 2400 mt

Valeriana pilosa Páramo Cruz Verde (Choachí, Cundinamarca)

Tabla 2. Peso en gramos del material vegetal a extraer.

Especie vegetal

Parte de la planta

Peso (g) de material vegetal

Peso (g) de extracto total

Peso (g) extracto utilizado

Myrcianthes

rhopaloides

Hojas 220 0.348 0.03

Passiflora manicata

Hojas 200 0.253 0.03

Hesperomeles

ferruginea

Hojas 200 0.222 0.03

Valeriana pilosa

Hojas 250 0.436 0.03

5.3 TRATAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

lxix

Las plantas de las diferentes especies se separaron por partes, se lavaron con agua,

para luego secarlas a temperatura ambiente; una vez secas se cortaron

independientemente con el fin de obtener partículas uniformes, lo cual facilito el

proceso de extracción, y se peso el material vegetal para conocer la cantidad exacta a

extraer, ver Tabla 2.

5.4 OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

Tabla 3. Especies, Parte a estudiar y Extractos a evaluar

ESPECIES PARTE A

ESTUDIAR

EXTRACTOS A

EVALUAR

Myrcianthes

rhopaloides

Hojas Extracto Etanólico y

aceite esencial

Passiflora manicata Hojas Extractó Etanólico

Hesperomeles

ferruginea

Hojas Extracto Etanólico

Valeriana pilosa Hojas Extracto Etanólico

5.4.1 Extracto Etanólico

Se recolectó el material vegetal descrito en la Tabla 2, posteriormente se puso a secar

a temperatura ambiente y cuando se secó se disminuyó el tamaño de partícula de

forma manual. Para obtener el extracto se adicionó el solvente (etanol 90%) y se dejó

en maceración fría durante 48 horas. Posteriormente se puso en reflujo a 60ºC en

baño termostatado tres veces durante 4 horas, se concentró el extracto utilizando el

rotavapor y se dejó secando el mismo a temperatura ambiente. Los extractos

obtenidos se almacenaron hasta el momento de utilizarlos a 4ºC. (Torres, 2004)

lxx

Figura 10. Rotavapor Heidolph LABOROTA 4000-EFFICIENT

De estos extractos se sacaron alícuotas para hallar la concentración en peso de cada

extracto y su equivalencia en gramos (g), con ellos se evaluó la actividad

antimicrobiana contra bacterias, hongo y levadura, a una concentración específica

para cada caso. (Arévalo A, 1996)

lxxi

RECOLECCIÓN DE LA PLANTA

SEPARACIÓN DE LAS PARTES DE LA PLANTA

OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO

FLÓCULO FILTRADO

CONCENTRAR EXTRACTO

REFRIGERAR 4ºC

Figura 11. Proceso para la obtención de extractos a partir del material vegetal

5.4.2 Aceite Esencial: Con el material vegetal semi–seco se realizó una

Hidrodestilación con arrastre a vapor durante 4 horas utilizando un destilador de

aceites esenciales con capacidad 3 litros (Torres, 2007).

lxxii

Figura 12. Montaje hidrodestilación hojas de Myrcianthes rhopaloides.

5.5 MICROORGANISMOS

5.5.1 Cepas: Se utilizaron los siguientes microorganismos Escherichia coli, Bacillus

subtillis y Sthaphylococcus aureus., los cuales fueron seleccionados bajo los

siguientes criterios.

• representan diferentes grupos

• Son agentes patógenos para humanos, por su relación con los diferentes

cuadros clínicos que causan

• Crean resistencia con mucha facilidad

lxxiii

En el caso del hongo fitopatógeno, (Alternaria sp) se seleccionó bajo el criterio:

• Es un microorganismo que ataca con mucha frecuencia algunas de las

especies vegetales presentes en el arbolado urbano.

5.5.2 Aislamiento de las cepas

Patógenas: Se realizó la siembra de los microorganismos en Agar Mueller Hinton,

las cuales se incubaron a 35 ºC durante 24 horas, posterior a esta incubación se

sembró cada microorganismo en medio selectivo para cada uno. Para E. coli

Chromocult (Colonias azul/violeta oscuro), para S. aureus Baird Parker (colonias

negras, lustrosas, convexas, 1–5 mm de diámetro, rodeado de un halo claro de 2-5

mm de anchura. Dentro del halo claro presencia de anillos opacos no visibles antes de

las 48h de incubación) y BPLS (colonias naranja) para B. subtillis. Se realizó la

determinación de las características macroscópicas y microscópicas para cada

microorganismo realizando Coloración de Gram (Torres, 2007).

Fitopatógeno: Se realizó la siembra en medio PDA y se incubo a 27º C, durante 3- 5

Días. Posteriormente se determinaron las características macro y microscópicas

realizando Coloración con azul de lactofenol (Torres, 2007).

5.6 ENSAYOS BIOLÓGICOS

5.6.1 Prueba de susceptibilidad antimicrobiana: Se utilizó la técnica de difusión de

disco en Agar de Kirby-Bauer, prueba que permite medir la susceptibilidad in Vitro

de microorganismos patógenos y fitopatógenos frente a una sustancia o a la mezcla

de varias sustancias desconocidas de origen vegetal con potencial antimicrobiano

(Torres, 2007).

lxxiv

5.6.1.1 Técnica de difusión de disco en Agar

5.6.1.1.1 Bacterias

Luego de tener las cepas totalmente aisladas en sus respectivos medios se tomó por

cada microorganismo de 4 a 5 colonias y se colocó en 5 mL de solución salina al

0.85%, se ajustó las concentraciones con el Tubo No. 0.5 Mc Farland (1.5 x 106

UFC/mL). Luego la suspensión ajustada se sembró masivamente con escobillón

estéril en el Agar Mueller Hinton para cada microorganismo. Posteriormente se

tomaron los discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con

una concentración de 30 mg/mL de acetona, se dejaron secar en una caja de petri

cerrada luego se distribuyeron en cada una de las cajas que contenían Agar Mueller

Hinton. El control positivo fue un disco con cloramfenicol (10mg/mL) y el control

negativo fue agua estéril.

Para hallar las concentraciones de los extractos se tomaron 0.03g y se adicionaron en

1mL de acetona, para la concentración del control positivo se tomaron 0.01g y se

adicionaron en 1 mL de acetona.

Se dejó incubando a 37ºC durante 24 horas, luego del periodo de incubación se

realizó la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los ensayos de actividad

antimicrobiana se realizaron cinco (5) veces.

5.6.1.1.2 Hongo

5.6.1.1.2.1 Evaluación antifúngica

Comprende la realización de los ensayos biológicos para determinar la actividad

antifúngica. Existen varios métodos para la evaluación de la actividad antifúngica de

productos vegetales, los cuales se pueden agrupar en los tres siguientes:

- Método de crecimiento radial sobre un medio de Agar en caja de petri.

lxxv

- Método de crecimiento en cultivo líquido (el cual puede ser medido como un

aumento en el peso seco o como un aumento en la turbidez).

- El método conocido como bioautografía (el cual utiliza una suspensión de

esporas fúngicas, mientras que el extraído a analizar se separa previamente

por cromatografía en capa delgada (CCD).

Se prefirió en este caso el método de crecimiento radial puesto que es el bioensayo

más adecuado para hongos de rápido crecimiento. Se utilizó Agar PDA, este se

incubó a 27 ºC de 5 a 10 días. Después de la incubación se añadió 10 mL de agua

destilada para remover las estructuras del hongo, de allí se tomaron 0,1 mL para

realizar siembra masiva con escobillón estéril. Se tomaron los discos de papel

estériles a los cuales se les adicionó 10 µl de extracto con una concentración de 30

mg/mL de acetona. Se utilizó Griseofulvina como control positivo y como control

negativo agua estéril.

Se dejaron incubando a 27 ºC de 3 – 5 días, luego del tiempo de incubación se realizó

la lectura de los halos de inhibición (mm). Todos los ensayos de actividad

antimicrobiana se realizaron cinco (5) veces.

5.6.1.1.3 Levadura

Teniendo la cepa totalmente aislada de Candida albicans, se tomaron de 4 a 5

colonias y se colocaron en un tubo que contenía 5 mL de solución salina al 0,85%, se

ajustó la concentración con el tubo Nº 0.5 Mc Farland (1.5 x 106 UFC/mL), luego la

suspensión ajustada se sembró masivamente con escobillón estéril en Agar PDA.

Posteriormente se tomaron discos de papel estériles a los cuales se les adicionó 10 µl

de extracto con una concentración de 30 mg/mL de acetona. El control positivo fue

un disco de papel con Griseofulvina (10mg/mL) y el control negativo fue agua estéril.

lxxvi

En todos los ensayos la lectura de los halos de inhibición (mm) de la actividad

antimicrobiana se determinó de la siguiente manera:

C = A - B

C = Tamaño del halo de inhibición ( mm)

A = Tamaño del halo + disco de papel filtro

B = Tamaño del disco de papel filtro(6 mm)

5.6.2 Ensayo biodirigido: Se realizó un estudio bioguiado al extracto que presentó

mayor actividad antimicrobiana, realizando una serie de fraccionamientos utilizando

diferentes solventes (diclorometano, alcohol isoamílico y agua) para determinar cual

fracción es la responsable de la actividad antimicrobiana. Se tomó aproximadamente

de 0.2 a 0.4 g de extracto vegetal y se disolvió en agua, se mezcló y se adicionó

diclorometano (DCM), esto se agitó en un embudo de decantación y se le sacó el gas

abriendo la llave, este proceso se realizó 3 veces. Se mantuvo sobre un soporte

metálico dejando que se separaran las fases (acuosa – DCM) luego se sacó la fase

acuosa en un vaso de precipitado y aparte la fase de diclorometano.

lxxvii

Figura 13. Fraccionamiento hojas de Passiflora manicata.

Figura 14. Fase diclorometano (DCM) de extracto hojas Passiflora manicata.

lxxviii

La fase acuosa se volvió adicionar al embudo de decantación y se agrego alcohol

isoamílico, se agitó y se dejo escapar el gas abriendo la llave, este proceso se realizó

3 veces. Se dejo sobre el soporte esperando que se separaran las fases (acuosa –

alcohol isoamílico), posteriormente se obtuvo la fase acuosa y la fase de alcohol

isoamílico por separado.

Figura 15. Fase Acuosa - Fase Alcohol Isoamílico de extracto hojas de Passiflora

manicata.

Al final del procedimiento cada fase fue secada en el rotavapor para conocer el peso

(g) extracto de la fracción obtenida.

lxxix

Figura 16. Proceso para la obtención de fracciones a partir del material vegetal

5.7 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

La presente investigación estuvo basada en un estudio experimental cuantitativo que

buscaba encontrar la mayor actividad antimicrobiana representada en halos de

inhibición que tuvieran los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes

rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa y

determinar cual de ellos era el mejor frente a microorganismos patógenos y

fitopatógenos. En la experimentación se determinaron cinco (5) tratamientos

diferentes, cada uno contó con cinco (5) repeticiones.

lxxx

5.8 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La presente investigación estuvo basada en un estudio experimental cuantitativo, el

análisis estadístico se determinó por medio de la prueba ANOVA (Análisis de

varianza) y la comparación de medias de Tukey.

Cada ensayo se realizó cinco (5) veces.

Hipótesis nula: Ninguno de los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes

rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa

presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados de

referencia (Patógenos y fitopatógenos).

Hipótesis alterna: Todos los extractos obtenidos de las especies Myrcianthes

rhopaloides, Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea y Valeriana pilosa

presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados de

referencia (Patógenos y fitopatógenos).

Variables: Las variables planteadas en el presente trabajo contribuirán a la

determinación de aquellas especies que tienen propiedades antimicrobianas.

• Dependiente: Tamaño de Halo de inhibición medido en mm.

• Independiente: Tipo de microorganismo y tipo de extracto

lxxxi

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Es común el empleo popular de partes vegetales con la finalidad de obtener diversos

efectos terapéuticos. Varios estudios han validado científicamente la eficacia de

numerosos usos de la medicina tradicional utilizada por la gente. Entre las variadas

aplicaciones terapéuticas de los vegetales, se incluyen aquellas con finalidad

antimicrobiana (Garzón, 2006).

Con el objetivo de evaluar la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y

aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles

ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata frente a los


aureus, Candida albicans y Alternaria sp, se diseñó un experimento en el que se

compara la capacidad de los extractos vegetales de inhibir el crecimiento de los

microorganismos a través de la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana, usando el

Cloramfenicol (Cm) y la griseofulvina como control positivo, teniendo en cuenta que

es un antibiótico de amplio espectro activo en técnicas in vitro contra un gran

número de bacterias, ya que previene la formación de enlaces peptídicos y la síntesis

proteica en gran variedad de organismos Gram negativos y Gram positivos.

La inhibición de la síntesis de proteínas causada por el Cm en la mayoría de los

microorganismos susceptibles produce un efecto bacteriostático (Morales Y., 2007).

En el presente trabajo se utilizó una dosis de Cm (10 mg/mL), que al compararla con

la dosis de los extractos etanólicos de las plantas (30 mg/mL), determinó que la

concentración del extracto es tres (3) veces mayor que la del antibiótico, lo cual

mostró efectividad presentando una no correlación con la dosis empleada para el

antibiótico sintético, lo que nos permitió inferir que la concentración del extracto

debe ser más elevada, por ser una mezcla compleja de sustancias, mientras que el Cm

lxxxii

es una molécula sintética, la cual contiene sus parámetros ya estandarizados (Torres,

2007).

En este experimento, la capacidad antimicrobiana es medida a través del diámetro del

halo de inhibición, el cual es afectado por dos factores: El microorganismo y el

extracto vegetal, en donde la actividad antimicrobiana de varios extractos vegetales es

evaluada sobre los diferentes microorganismos seleccionados. A continuación se

presentan cinco gráficas (gráfica 1 - 5) que describen los resultados del experimento

conducido. En todos los casos, los puntos representan los diámetros de los halos de

inhibición que se obtuvieron en el experimento para cada extracto vegetal

considerado. En todos los ensayos se tomó como patrón de referencia el control

positivo para determinar cual era el que tenía mayor actividad antimicrobiana.



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para S. aureus.

Extractos

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

EX1 4 6 5 4 4 4.6 0.894

EX2 5 4 4 3 4 4.0 0.707

EX3 9 9 6 6 7 7.4 1.516

EX4 1 0 1 2 2 1.2 0.836

Control

Positivo

24 24 19 19 26 22.4 3.209

lxxxiii


control positivo para S. aureus.

Se observa claramente que el diámetro de los halos de inhibición del extracto vegetal

Passiflora manicata fue menor al de los demás extractos en presencia del

microorganismo Staphylococcus aureus, es decir, que el poder inhibidor de este

extracto vegetal es mínimo. Se observa también que frente a este microorganismo el

extracto que presentó mejor actividad fue el de Myrcianthes rhopaloides, el cual

estuvo más cercano al valor obtenido para el control positivo (Gráfica 1).

Las posibles razones para que el crecimiento del microorganismo se viera poco

afectado es la existencia de mecanismos de resistencia por parte de S. aureus, la cual

esta relacionada con la activación de una síntesis de la pared celular, con

hiperproducción de proteínas ligadoras de penicilinas, engrosamiento de la pared y el

encarcelamiento de fármacos por hiperproducción de los componentes de pared

(Tavares, 2000).

Otros mecanismos que posee la bacteria son la producción de la enzima coagulasa

que hace que se deposite el material de fibrina sobre los cocos protegiéndoles del

ataque por las células del hospedador, producción de proteasas, nucleasas y lipasas

lxxxiv

que sirven para despolimerizar las proteínas del hospedador, los ácidos nucleicos y

las grasas, el desarrollo de una vía bioquímica resistente la cual puede tener lugar por

intercambio genético bloqueando el agente antimicrobiano y por eflujo donde el

microorganismo es capaz de bombear hacia afuera el antimicrobiano que va entrando

en la célula. Estudios previos han demostrado que S. aureus posee genes que le

permiten generar resistencia contra biocidas (Agentes químicos y antibióticos)

(Tavares, 2000).



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para E. coli.

Extractos

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

Σ

EX1 6 6 6 9 9 7.2 1.643

EX2 4 7 6 4 6 5.4 1.341

EX3 9 10 12 9 10 10 1.224

EX4 24 19 24 14 12 18.6 5.549

Control

Positivo

24 24 24 19 19 22 2.738

lxxxv


control positivo para E. coli.

En el caso de Escherichia coli se evidencia que el poder inhibidor del extracto vegetal

Passiflora manicata es muy similar al del Control Positivo (C+), representando una

buena actividad antimicrobiana para este. Sin embargo los demás extractos

presentaron actividad aunque mucho menor en comparación con el control positivo y

con el extracto de Passiflora manicata (Gráfica 2).

E. coli hace parte de las bacterias Gram negativas, además del peptidoglicano, poseen

una capa adicional en su pared que esta compuesta de lipopolisacáridos. Esta capa

representa una segunda bicapa lipídica, que no consta solamente de fosfolípidos como

la membrana plasmática, sino que contiene polisacáridos y proteínas. Los lípidos y

polisacáridos están estrechamente unidos en la capa externa formando estructuras

lipopolisacáridas específicas. La presencia del lipopolisacárido justifica que la

membrana externa se denomine generalmente capa de lipopolisacárido o simplemente

LPS. Los mecanismos de resistencia de estas bacterias pueden presentarse como

alteración del sitio blanco o diana de antimicrobianos, disminución de la

permeabilidad de la pared por poseer una pequeña capa de peptidoglicano, la cual es

más sensible, adquisición de mecanismo de eflujo y cambio de vía metabólica

lxxxvi

externa, lo anterior podría sugerir que el extracto etanólico de Passiflora manicata

puede poseer sustancias capaces de contrarrestar los mecanismos de resistencia del

microorganismo, como por ejemplo las saponinas las cuales actúan sobre los lípidos

de la membrana ocasionando alteraciones y provocando muerte celular; así como lo

indica la Tabla Nº 5 presentando solo una diferencia de 2 unidades frente al control

positivo.



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para B. subtillis.

Extractos

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

EX1 7 5 6 9 9 7.2 1.789

EX2 5 7 6 4 4 5.2 1.303

EX3 14 14 19 24 22 18.6 4.560

EX4 34 36 39 34 36 35.8 2.049

Control

Positivo

34 39 39 34 39 37 2.738

lxxxvii


control positivo para B. subtillis.

Se observa para Bacillus subtillis que el efecto inhibidor de los extractos es mayor al

compararlos frente a los demás microorganismos evaluados, en este caso para

Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata, siendo este último el más cercano al

control positivo, definiendo que el extracto tiene el mejor poder inhibidor, lo cual se

traduce en que dicha especie puede ser una fuente natural de antimicrobianos

cumpliendo un papel importante en el área terapéutica capaz de inhibir un bacilo

Gram positivo esporulado, de tomar una molécula de DNA y transformarla, siendo

este un elemento natural que el microorganismo posee como factor de competencia y

resistencia regulada, existiendo proteínas especiales que juegan un papel en el

transporte y procesamiento del DNA. Estas proteínas específicas de competencia

incluyen una proteína de unión del DNA que esta asociada a la membrana, una

autolisina de la pared celular y varias nucleasas (Gutowski-Eckel, 1994) (Gráfica 3).

de nutrientes esenciales como el nitrógeno y el carbono, proceso que solo dura 8

horas.

Este microorganismo fue el más sensible en todos los ensayos biológicos

posiblemente puede deberse a la estructura de su pared celular ya que como es un

microorganismo Gram positivo es menos compleja pues esta compuesta por una

lxxxviii

membrana citoplasmática y una capa gruesa de peptidoglicano en comparación con

los microorganismos Gram negativos que tienen una pared más compleja ya que

posee una membrana citoplasmática, un delgada capa de peptidoglicano,

lipopolisacáridos y proteínas.



Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata para C.albicans.

Extractos

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

EX1 0 4 4 0 0 1.6 2.190

EX2 2 3 0 5 6 3.2 2.387

EX3 1 4 9 4 5 4.6 2.880

EX4 3 4 5 9 6 5.4 2.302

Control

Positivo

8 8 9 9 8 8.4 0.547



Myrcianthes rophaloides y Passiflora manicata para Alternaria sp..

Extractos

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

EX1 1 4 4 2 1 2.4 1.516

EX2 2 3 4 2 2 2.6 0.894

EX3 2 8 2 5 6 4.6 2.607

EX4 3 4 6 4 4 4.2 1.095

Control

Positivo

5 8 8 5 6 6.4 1.516

lxxxix


control positivo para C.albicans.


control positivo para Alternaria sp

En las gráficas 4 y 5 se puede apreciar que para la levadura y el hongo fitopatógeno

ninguno de los extractos vegetales, incluido el Control Positivo (C+), logró generar

halos con diámetro superior a 10 mm. Lo que indica que los extractos vegetales no

presentaron una eficiente actividad antimicrobiana frente a este tipo de

xc

microorganismos, por ser complejos y adicionalmente poseer diversos mecanismos

de resistencia entre las que encontramos la pared celular compuesta de polisacáridos,

proteínas, lípidos, iones inorgánicos y mananos. Los polisacáridos (Quitina) y

glucanos no celulósicos. Los resultados anteriormente expuestos sugieren que los

extractos evaluados son más eficientes con bacterias debido a que sus estructuras y

metabolismo celular es mucho menos complejo que el de los hongos (Tavares, 2000).

Para el análisis de los datos se planteó el siguiente modelo:

yij = µ + αi +βi+ (αβ)ij + ij

Donde yij es el valor del halo de inhibición en cada observación, µ es la media

general, αi es el efecto del factor A (microorganismo), βj es el efecto del factor B

(extracto utilizado), (αβ)ij es el efecto de la interacción de los dos factores €ij es el

efecto de error aleatorio. ij = 5

Se plantean hipótesis para probar los efectos de cada factor y de la interacción de

estos. Para los efectos del factor A (microorganismo) se plantea:

H0: α1 = α2 = α3 = α4 = α5 = 0

Hi: al menos un αi ≠ 0

Para probar los efectos del factor B (extracto) se plantea:

H0: β1 = β2 = β3 = β4 = β5 = 0

Hi: al menos un βi ≠ 0

Para probar el efecto de la interacción de los factores A y B se plantea:

xci

H0: (αβ)ij = 0 para toda i, j

Hi: al menos una (αβ)ij ≠ 0

En todas las tablas están sombreados de rojo los microorganismos que presentaron

mayor resistencia y los extractos que tuvieron mayor actividad antimicrobiana; de

azul están sombreados los microorganismos más sensibles y los extractos con menor

actividad antimicrobiana.


Fuente de variación

Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.

MICR 4783,12 4 1195,78 222,93 0,000 EXTRAC 3993,68 4 998,42 186,13 0,000 MICR *

EXTRAC 3260,8 16 203,8 37,99 0,000

Error 536,4 100 5,36 Total 12574 124

R Squared = ,957 (Adjusted R Squared = ,947)

La tabla 11 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores

(Microorganismo – Extracto) y de la interacción es menor a 0.05, por lo tanto se

rechazan las hipótesis nulas, es decir, existen diferencias significativas de los halos de

inhibición entre los microorganismos analizados y se presenta un efecto significativo

del extracto utilizado sobre el tamaño de los halos de inhibición; también se presenta

un efecto significativo de la interacción microorganismo*extracto.

xcii


seleccionados

N SUBSET

MICR

Alternaria sp. 25 4.04

C. Albicans 25 4.64

S. aureus 25 7.92

E. coli 25 12.64

B. subtillis 25 20.76

Sig. 0.89 1 1 1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que Alternaria sp. y C.

albicans son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, los

otros microorganismos presentaron halos de inhibición significativamente superiores,

en orden de menor a mayor inhibición están: S. aureus, E. coli y B. subtillis.

Tabla 11. Prueba de comparación de medias de Tukey para extractos.

N SUBSET

EXT.

Hesperomeles ferruginea 25 4.08

Valeriana pilosa 25 4.6

Myrcianthes rhopaloides 25 9.04

Passiflora manicata 25 13.04

Control positivo 25 19.24

Sig. 0.93 1 1 1

La prueba de comparación de medias de Tukey entre extractos muestra que los

extractos 2 y 1 presentaron menor efecto inhibidos, pues presentan los menores

xciii

promedios de tamaño de halo; los extractos 3, 4 y 5 (control positivo) presentan

tamaños de halo progresivamente superiores, con diferencias significativas entre sí.

Como se presentó efecto significativo de la interacción entre los factores extracto y

microorganismo, se evaluaron las diferencias por cada microorganismo, utilizando el

siguiente modelo:

yijk= µ + αi + ℇijk

Donde yijk es el valor del halo de inhibición en cada observación, µ es la media

general, αi es el efecto del extracto utilizado y ℇijkes el efecto de error aleatorio.

Tabla 12. Análisis de varianza para S. aureus


Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.

EXTRAC 1407.44 4 351.86 120.5 0,000 Error 58.4 20 2.92 Total 1465.84 24


La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo del extracto sobre el

halo de inhibición en S. aureus.

xciv


N SUBSET

EXT.


Hesperomeles ferruginea 5 4 4

Valeriana pilosa 5 4.6 4.6



Sig. 0.11 0.98 0.11 1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que el control positivo presenta

un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con los

extractos; el extracto 3 presenta un efecto significativamente superior al del extracto

2.



Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.




halo de inhibición en E. coli.

xcv


N SUBSET

EXT.



Myrcianthes rhopaloides 5 10


Control positivo 5 22

Sig. 0.144481 0.397581



extractos 1,2 y 3. El extracto 4 presenta un efecto significativamente al del extracto 2.



Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.




halo de inhibición en B. subtillis.

xcvi


N SUBSET

EXT.





Control positivo 5 37

Sig. 0.775186 1 0.955519



extractos 1,2 y 3. El extracto 4 presenta un efecto significativamente al del extracto 2.

Los extracto 4 y 5 no presentan diferencia significativa entre ellos.



Suma de cuadrados

gl Cuadrados Medios

F

Sig.




halo de inhibición en Candida albicans.

xcvii


N SUBSET

EXT.



Myrcianthes rhopaloides 5 4.6 4.6

Passiflora manicata 5 5.4 5.4


Sig. 0.086117 0.086117



extractos 1, 2. Los extractos 3 y 4 no presentan diferencias significativas entre ellos.



Suma de cuadrados

gl Cuadrados Medios

F

Sig.




halo de inhibición en Alternaria sp.

xcviii


N SUBSET

EXT.



Passiflora manicata 5 4.2 4.2

Myrcianthes rhopaloides 5 4.6 4.6


Sig. 0.248543 0.248543


un promedio de halo de inhibición estadísticamente no significativo entre todos los

extractos. Los extractos 1 y 2 no presentan diferencias significativas entre ellos, al

igual que los extractos 3 y 4.


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para E. coli.

Extracto

Passiflora

manicata

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

(mm)

Σ

FR1 10 8 8 9 8 8.6 0.894

FR2 0 0 0 0 0 0 0

FR3 0 1 0 2 0 0.6 0.894

Control

positivo

21 22 18 19 21 20.2 1.643

xcix


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para S. aureus.

Extracto

Passiflora

manicata

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

(mm)

σ

FR1 5 4 3 3 5 4 1

FR2 0 0 0 0 0 0 0

FR3 0 0 0 0 0 0 0

Control

positivo

18 19 18 20 20 19 1


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para B. subtillis. Extracto

Passiflora

manicata

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

(mm)

Σ

FR1 6 5 6 4 5 5.2 0.836

FR2 0 0 0 0 0 0 0

FR3 1 1 0 2 1 1 0.707

Control

positivo

30 32 34 32 34 32.4 1.673

c


fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Candida albicans.

Extracto

Passiflora

manicata

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

Σ

FR1 3 5 4 4 3 3.8 0.836

FR2 0 1 0 1 0 0.4 0.547

FR3 0 0 0 0 0 0 0

Control

positivo

12 11 13 11 13 12 1

Tabla 26. Tamaño halos de inhibición (mm), promedio, desviación estándar y de

fraccionamiento de hojas de Passiflora manicata para Alternaria sp.

Extracto

Passiflora

manicata

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

(mm)

σ

FR1 4 5 0 0 5 4.7 0.577

FR2 0 0 0 0 0 0 0

FR3 0 0 0 0 0 0 0

Control

positivo

22 23 22 20 20 21.4 1.342

ci

Gráfica 6. Diámetro de halos de inhibición Vs. Microorganismos seleccionados para

las diferentes fases.

Con base en el análisis de los resultados estadísticos se determinó que el extracto más

eficiente frente a todos los microorganismos evaluados fue el de la especie Passiflora

manicata, siendo este extracto el candidato para realizar el fraccionamiento para

determinar cual fración era la responsable de la actividad antimicrobiana. En la

Gráfica 6 se aprecian las diferencias entre el diámetro promedio del halo de

inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata en presencia de los

microorganismos seleccionados para cada una de las fases (FR1, FR2, FR3). Se

observa que el comportamiento del halo de inhibición en FR2 y FR3 del extracto

vegetal es muy similar, adicionalmente que el diámetro del halo de inhibición en FR1

es más parecido al halo del Control Positivo (C+) en comparación a las otras dos

fases.

cii

Gráfica 7. Halos de inhibición Vs. Fracciones para cada microorganismo

En la Gráfica 7 se aprecian las diferencias entre el diámetro promedio del halo de

inhibición del extracto vegetal Passiflora manicata en sus tres fases para todos los

microorganismos seleccionados. Se observa que el comportamiento de Bacillus

subtillis es mayor para FR1 en comparación con las siguientes fases (FR2 y FR3).

También se muestra que el microorganismo con menos actividad antimicrobiana fue

C. albicans ya que el promedio de halos de inhibición fue tan solo 3.8 mm para FR1

en comparación con el mejor de B. subtillis que fue de 5.2 mm, en este caso el

Control positivo (C+) fue de 12 mm.

Por otra parte las tres fases evaluadas (FR1, FR2, FR3) estuvieron definidas de

acuerdo a la polaridad de cada solvente, es decir, de mayor a menor polaridad. Donde

FR1 es una mezcla de compuestos de alta polaridad en los cuales posiblemente se

pueden encontrar taninos, proteínas hidrosolubles y azúcares responsables de la

actividad antimicrobiana evaluada, tal como lo sugiere Domingo & Lopez Brea

(2003) 1 al definir que los extractos vegetales poseen una gran cantidad de

compuestos químicos con carácter antimicrobiano, algunos de los cuales muestran

una actividad in Vitro comparable a los de los microbianos sintéticos utilizados en la

ciii

clínica, lo que podemos comparar con el extracto etanólico de Passiflora manicata al

observar los resultados obtenidos en el tamaño de halos de inhibición del extracto

Vs. control positivo.

De esta manera en la fase FR1 se observó halos de inhibición superiores a los de las

demás fases indicando que en ella se encuentra la molécula responsable del principio

activo con marcada actividad antimicrobiana. La fracción FR2 fue la que obtuvo el

menor rendimiento en la evaluación antimicrobiana para el extracto vegetal de

Passiflora manicata.



Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.

MICR 347.76 4 86.94 83.59615 0,000 FRAC 7306.59 3 2435.53 2341.856 0,000

MICR * FRAC

836.96 12 69.74667 67.0641 0,000

Error 83.2 80 1.04 Total 8574.51 99


La tabla 29 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores

(Microorganismo – Extracto) y de la interacción es menor a 0.05. Existen diferencias

significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se

presenta un efecto significativo de la fracción utilizada sobre el tamaño de los halos

de inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción

microorganismo*fracción.

civ


seleccionados

.

N SUBSET

MICR

C. albicans 20 4.05

S. aureus 20 5.75

Alternaria sp. 20 6.05

E. coli 20 7.35


Sig. 1 0.884324 1 1

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que Candida albicans y S.

aureus son los microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, los

otros microorganismos presentaron halos de inhibición significativamente superiores,

en orden de menor a mayor inhibición están: Alternaria sp., E. coli y B. subtillis.

Tabla 29. Prueba de comparación de medias de Tukey para fracciones.

N SUBSET

EXT.

FR2 25 0.08

FR3 25 0.32

FR1 25 4.88

C+ 25 21

Sig. 0.83908 1 1

cv

La prueba de comparación de medias de Tukey entre fracciones muestra que las

fracciones 2 y 3 presentaron menor efecto inhibidor, pues presentan los menores

promedios de tamaño de halo; las fracciones 1 y 4 (control positivo) presentan

tamaños de halo progresivamente superiores, con grandes diferencias significativas

entre sí.

Tabla 31. Análisis de varianza para S. aureus con las diferentes fracciones


Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.

FRAC 1223.75 3 407.9167 815.8333 0,000 Error 8 16 0.5 Total 1231.75 19



halo de inhibición en S. aureus.


N SUBSET

FRAC.

FR2 5 0

FR3 5 0

FR1 5 4

C+ 5 19

Sig.

1 1 1

cvi


un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con las

fracciones; la fracción 1 presenta un efecto significativamente al de las demás

fracciones.

Tabla 32. Análisis de varianza para E. coli con las diferentes fracciones


Suma de cuadrados

gl Cuadrados Medios

F

Sig.

FRAC 1331.35 3 443.7833 412.8217 0,000 Error 17.2 16 1.075 Total 1348.55 19


La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de las fracciones sobre

el halo de inhibición en E. coli.


N SUBSET

FRAC.

FR2 5 0

FR3 5 0.6

FR1 5 8.6

C+ 5 20.2

Sig. 0.797264 1 1


un promedio de halo de inhibición significativamente superior al observado con todas

cvii

las fracciones. La fracción 1 presenta un efecto significativamente superior a las

fracciones 2 y 3.

Tabla 34. Análisis de varianza para B. subtillis con las diferentes fracciones


Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.

FRAC. 3526.55 3 1175.517 1175.517 0,000 Error 16 16 1 Total 3542.55 19


La tabla de análisis de varianza muestra un efecto significativo de la fracción sobre el

halo de inhibición en B. subtillis.


N SUBSET

FRAC.

FR2 5 0

FR3 5 1

FR1 5 5.2

C+ 5 32.4

Sig. 0.416163 1 1



fracciones 1,2 y 3. La fracción 1 presenta un efecto significativamente superior al de

las otras.

cviii



Suma de cuadrados

gl Cuadrados Medios

F

Sig.

FRAC. 464.95 3 154.9833 309.9667 0,000 Error 8 16 0.5 Total 472.95 19



halo de inhibición en Candida albicans.


N SUBSET

FRAC.

FR3 5 0

FR2 5 0.4

FR1 5 3.8

C+ 5 12

Sig. 0.807829 1 1



fracciones. La fracción 1 presentan diferencias significativas con respecto a las

fracciones 2 y 3.

cix



Suma de cuadrados

gl Cuadrados Medios

F

Sig.

FRAC 1596.95 3 532.3167 250.502 0,000 Error 34 16 2.125 Total 1630.95 19



halo de inhibición en Alternaria sp.


N SUBSET

FRAC.

FR2 5 0

FR3 5 0

FR1 5 2.8

C+ 5 21.4

Sig. 1 1 1


un promedio de halo de inhibición estadísticamente significativo para todas las

fracciones. La fracción 1 presenta diferencias significativas entre ellas.

cx


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para B. subtillis.

Aceite

Esencial

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

AE 1 9 1 2 9 9 6 4.123

Control

positivo

34 37 34 39 34 35.6 2.302


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para S. aureus.

Aceite

Esencial

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

AE 1 24 19 19 14 19 19 3.535

Control

positivo

27 27 30 29 29 28.4 1.341


aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para E. coli.

Aceite

Esencial

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

σ

AE 1 6 4 7 4 3 4.8 1.643

Control

positivo

16 15 15 17 15 15.6 0.894

cxi


esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Alternaria sp.

Aceite

Esencial

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

Σ

AE 1 19 14 19 17 19 17.6 2.191

Control

positivo

28 27 27 29 29 28 1


aceite esencial de hojas de Myrcianthes rhopaloides para Candida albicans.

Aceite

Esencial

Replica 1

(mm)

Replica 2

(mm)

Replica 3

(mm)

Replica 4

(mm)

Replica 5

(mm)

X

Σ

AE 1 24 22 20 24 22 22.4 1.673

Control

positivo

26 24 29 27 24 26 2.121

Gráfica 8. Halos de inhibición Vs Microorganismos seleccionados frente al aceite

esencial de M. rhopaloides

La Gráfica 8 muestra que el microorganismo que mejor se comporto frente al aceite

cxii

esencial fue Candida albicans. En general las bacterias Gram positivas (Bacillus

subtillis, S. aureus) fueron mas sensibles que la bacteria Gram negativa (E. coli) la

cual fue más resistente frente a este, pudiendo tener su causa en la diferencia que

presentan estas bacterias en cuanto a su pared celular, lo cual determinará la

penetración o no del terpenoide a la célula bacteriana para que produzca su acción

bacterioestatica ( Maguna, 2006).

Según Maguna (2006) uno de los principales mecanismos de acción propuestos para

los terpenoides consiste en la disrupción de la membrana celular bacteriana mediante

tres (3) posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones

pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando el

empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos tres efectos produce la

muerte en la célula bacteriana

Entonces podríamos considerar que el hecho de que las bacterias Gram negativas

presenten mayor sensibilidad, entre otras cosas, puede deberse a su pared celular

menos compleja dado que tiene una capa simple (red de mureína delgada), mientras

que en las Gram positivas es una estructura de multicapa (red de mureína muy

desarrollada y llega a tener hasta 40 capas) (Maguna, 2006).

Con base en lo anterior y de acuerdo con lo reportado por iii Hernández & Rodríguez

(2001), se confirma con los resultados obtenidos para el aceite esencial evaluado de

las hojas de Myrchianthes rhopaloides encontrando que también posee actividad

antibacteriana y antifúngica como otras especies vegetales de familia de Myrtaceae.

Finalmente se puede establecer que los extractos etanólicos de las especies vegetales

evaluados poseen de leve a moderada actividad antimicrobiana frente a los

microorganismos seleccionados, encontrando que el que posee mas potencial

bacteriostático y fungistático es el extracto obtenido a partir de las hojas de Passiflora

manicata, el cual teniendo un amplio espectro de inhibición puede ser capaz de

cxiii

inhibir tanto micoorganismos Gram positivos, Gram negativos y hongos siendo mas

efectivos frente al primer grupo mencionado, adicionalmente la fracción del extracto

crudo identificada con potencial antimicrobiano fue la fase en donde pueden

encontrarse compuestos de alta polaridad como taninos y proteínas entre otros reportados por diversos autores como responsables de dicha actividad (Ver figura 18,

19 y 20 )

En cuanto Myrcinathes rhopaloides se confirma que al aceite esencial obtenido a

partir de las hojas posee actividad antibacterina como lo han reportado para especies

de la familia de las Mirtaceas.



Suma de cuadrados

gl Cuadrados medios

F

Sig.

MICR 1352.72 4 338.18 63.56767 0,000 ACEITE 2035.22 1 2035.22 382.5602 0,000 MICR * ACEITE

970.48 4 242.62 45.60526 0,000

Error 212.8 40 5.32 Total 4571.22 49


La Tabla 47 muestra que el nivel de significación para los efectos de los dos factores

(Microorganismo – Aceite) y de la interacción es menor a 0.05. Existen diferencias

significativas de los halos de inhibición entre los microorganismos analizados y se

presenta un efecto significativo del aceite utilizado sobre el tamaño de los halos de

inhibición; también se presenta un efecto significativo de la interacción

microorganismo*aceite.

cxiv


seleccionados con respecto al aceite esencial.

N SUBSET

MICR

E. coli 10 10.2


Alternaria sp. 10 22.8 22.8

S. aureus 10 23.7 23.7

C. albicans 10 24.2

Sig. 1 0.055535 0.657771

La prueba de comparación de medias de Tukey indica que E. coli y S. aureus son los

microorganismos que presentaron menores halos de inhibición, en general no hay

diferencias significativas entre el valor promedio de los halos de inhibición y los

microorganismos seleccionados.

cxv

A B C

D E

Figura 17. Ensayos biológicos con extractos vegetales EX1 (Valeriana pilosa), EX2 (Hesperomeles ferruginea), EX3 (Myrcianthes rhopaloides), EX4(Passiflora manicata) , C+ (Control positivo), C- (Control Negativo) frente a microorganismos patógenos y fitopatógenos A. Escherichia coli, B. Candida albicans, C. Staphylococcus aureus, D. Bacillus subtillis, E. Alternaria sp.

Figura 18. Ensayo biológico de las fracciones (FR1: Fase acuosa, FR2: Fase Diclorometano, FR3: Alcohol isoamilico) del extracto de Passiflora manicata frente a E. coli

cxvi

A B

Figura 19. Ensayo biológico del aceite esencial del extracto de M. rhopaloides frente A. B. subtillis y B. C. albicans

cxvii

7. CONCLUSIONES

• El extracto etanólico de hojas de Passiflora manicata reveló la mayor

actividad antimicrobiana contra los microorganismos seleccionados, siendo

Bacillus subtillis el microorganismo con los valores más altos de inhibición.

• Los microrganismos Gram positivos evaluados fueron más sensibles al poder

inhibidor de los extractos etanólicos, siendo los hongos los que mostraron

más resistencia.

• La fase acuosa del extracto etanólico crudo de las hojas de Passiflora

manicata mostró mayor actividad antimicrobiana con todos los

microorganismo seleccionados en comparación con la fase de diclorometano y

la fase de alcohol isoamílico evaluada.

• El aceite esencial obtenido de las hojas de Myrchiantes rhopaloides presentó

mayor actividad antimicrobiana obtenida frente a los microorganismos

evaluados.

• El extracto etanólico obtenido de Passiflora manicata puede constituirse en

una fuente de principios activos que contribuyan al descubrimiento de

antimicrobianos de origen natural los cuales pueden ser utilizados como linea

base para la sintesis de moléculas útiles a nível farmacéutico.

• El estudio realizado permitió conocer algunas de las potencialidades de uso de

las especies Passiflora manicata, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes

rhopaloides y Valeriana pilosa presentes en los ecositemas del Distrito

Capital y la región contribuyendo al aumento del conocimiento de las mismas.

cxviii

8.RECOMENDACIONES

• Se recomienda identificar, separar y elucidar la molécula presente en la fase

acuosa del extracto crudo de Passiflora manicata responsable de la actividad

antimicrobiana reportada en el presente trabajo, con el fin de generar

alternativas para la obtención de nuevos antimicrobianos de amplio espectro a

partir de una fuente de origen natural .

• Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la

concentración inhibitoria mínima de la fase acuosa con el objetivo de utilizar

el extracto obtenido en la formulación de nuevos productos con potencial

biocida.

• Se recomienda realizar estudios in vivo con el fin de determinar la estabilidad

del extracto obtenido frente a agentes físicos y químicos que puedan interferir

en la actividad antimicrobiana descrita en el presente trabajo.

cxix

9.BIBLIOGRAFIA

ALONSO G.N., BETANCOURT B.J., MARTÍNEZ M.J. 1996. Actividad

Antimicrobiana de Schinus terebentnifolius Raddi (Copal), Rev. Cubana plant Med

México D.F. 1(3): 37-39

ARÉVALO A. MYRIAM, ENCISO R ALEXANDRA. 1996. Determinación de la

actividad antimicrobiana (bacterias, hongos y levaduras) de algunas especies de

Espeletias encontradas en el páramo de Guasca. Carrera Bacteriología. Facultad

Ciencias Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana.

Trabajo de Pregado. Bogotá D.C. Pág. 14,16 ,17 ,18 , 21, 22, 23, 24, 25.

AYALA S. MARIA CLAUDIA, BUZZI A. BERENA DE LOURDES. 1998.

Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos de la raíz de Pentacalia Corym

Bosa (Beth) Cuatr. Contra Altemaria sp., Trichoderma viride y Fusarium

Oxysporium. Carrera Bacteriología. Facultad de Ciencias. Departamento de

Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregado. Bogotá D.C.

Pág. 9, 10.

BARRETO B. JUAN FELIPE. 1997. Efectos Antimicrobianos del diente de león

(Taxaxacum officinale) y el gualanday (Jacaranda obtusifolia) sobre Staphylococcus

aureus y Pseudomonas aeruginosa causantes de enfermedades de la piel. Carrera

Bacteriología. Facultad Ciencias Básicas. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo

de Pregrado.Bogotá D.C. Pág 9, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29.

CARDOZO, RITO HERNÁN. 2005. Investigación básica y aplicada en el

aprovechamiento de recursos biogenéticos de la flora del altiplano cundiboyacense

que posean proyección agroalimentario. Informe técnico inédito. Jardín Botánico José

Celestino Mutis - Subdirección Científica. Bogotá. 84 p.

cxx

CAREY, F.A. 2003. Organic Chemistry, 5ª ed. McGraw-Hill.

CALSAMIGLIA SERGIO, CASTILLEJOS LORENA, BUSQUET MARTHA. 2005.

Estrategias nutricionales para modificar la fermentación ruminal en vacuno lechero.

XX1 Curso de especialización FEDNA. Universidad Autonoma de Barcelona.

Departamento Ciencia Animal de los Alimentos. España.

DEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO DE MEDIO AMBIENTE (DAMA). 2000.

Protocolo Distrital de Restauración Ecológica: guía para la restauración de

ecosistemas nativos en las áreas rurales de Santa Fé de Bogotá. Departamento

Técnico Administrativo Medio Ambiente, Alcaldía Mayor de Santa Fé de Bogotá,

Bachaqueros, Fundación Estación Biológica. Santa Fé de Bogotá. Pág 288.

DOMINGO D., LÓPEZ – BREA M. 2003. Plantas con actividad antimicrobiana.

Rev. Esp Qimioterap. España. 16(4): 385 – 393.

ESCOBAR, L. K. 1988. Passifloraceae. Passiflora, Subgéneros: Tacsonia, Rathea,

Manicata y Distephana. Flora de Colombia No. 10.Universidad de Antioquia Dep.

Biologia, Medellin. p. 140.

FORERO A. NANCY PATRICIA, GRANICA H. MARCELA. 1997. Evaluación

dekfkf la actividad antifúngica de la raíz de Pentacalia ledifolia (HBK) Cuatr.

Carrera de Bacteriología. Facultad de Ciencias Básicas. Pontificia Universidad

Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. Pág 8, 9.

GARZÓN CARLOS. 2006. Análisis Bromatológics y fitoquímicos básicos de las

especies priorizadas dentro del marco del proyecto Uso sostenible de los recursos

vegetales del D.C y la región. Informe técnico inédito. Jardín Botánico José Celestino

Mutis-Subdirección Científica. Bogotá. 133 p.

cxxi

GUTOWSKI–ECKEL Z., KLEIN C., SIEGERS K., BOHM K., HAMMELMANN

M., ENTIAN K. 1994. Growth phase-dependent regulation and membrane 15

localization of SpaB, a protein involved in biosynthesis of the lantibiotic subtilin.

Appl. Environ. Microbiol. 60:1-11.

GUZMÁN-C, JAIME R. 2005. Propagación in vitro de especies pertenecientes a las

familias Rosaceae (Hesperomeles goudotiana y Rubus glaucus), Ericaceae

(Macleania rupestris y Vacinium meridionale) y Cactaceae (Opuntia ficus indica).

Informe técnico inédito. Jardín Botánico José Celestino Mutis - Subdirección

Científica. Bogotá. Pág 93.

HERNANDEZ DIAZ LIZET, RODRIGUEZ JORGE. 2001. Actividad

antimicrobiana de plantas que crecen en Cuba. Rev Cubana Plant Med.. 6(2): 44 – 47.

JARDÍN BOTÁNICO JOSÉ CELESTINO MUTIS BOGOTÁ. 2006. Ficha Técnica:

Especies promisorias Proyecto de Uso Sostenible de los recursos vegetales del

Distrito Capital y la Región. Bogotá D.C. Colombia.

LÓPEZ B. LUZ ANGELA, PEREZ L. ANGELA ADRIANA. 2001. Aplicación del

test bioautográfico para la determinación de actividad antifúngica y antibacteriana.

Carrera Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias Básicas. Pontificia

Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. Pág 10, 11.

MAGUNA FABIANA P., ROMERO ANA M., GARRO OSCAR A., OKULIK

NORA B. 2006. Actividad antimicrobiana de un grupo de terpenoides. Resumen E

057 Nº 355. Argentina. Universidad Nacional del Nordeste.

MANRIQUE EDNA, MOSQUERA OLGA. 1997. Evaluación de la actividad

antimicrobiana de los extractos y fracciones obtenidas a partir de Espeletia murilloii

cuatr. Y Espeletopsis guacharaca. Carrera Bacteriología. Facultad de Ciencias

cxxii

Básicas. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. Pág 15,

16.

MOLINA NATALIA. 2004. Estudio etnobotánico. Informe técnico inédito. Jardín

Botánico de Bogotá José Celestino Mutis - Subdirección científica. Bogotá D. C.

MORALES E. YOLANDA, HERRERA Ma DEL CARMEN, MUNOZ R. JESÚS.

2007. Cloramfenicol, un antibiótico clásico como alternativa en el presente. Rev.

Mexicana de Ciencias Farmacéuticas. México D.F. 38(001): 58 – 69.

ORDÓÑEZ, L., AMBROSE, K., BORJA, R. M., CUEVA, K. & GONZÁLEZ, L.

2006. Proyecto “La biodiversidad como sustento de vida en los bosques de ceja

andina: uso sustentable de la agrobiodiversidad de los bosques de ceja de montaña del

Carchi - Ecuador”, Anexos 1-4 Informe final del Proyecto Ceja Andina. Ecopar,

IDRC & CRDI. 86 p.

PELCZAR M. J., REID, R. D. (1992). Microbiología. Editorial Pueblo y Educación.

La Habana. 664 pp.

PEÑARANDA LIBIA MERCEDEZ, SIERRA M. MARTHA E. 2003 Evaluación de

la actividad antimicrobiana de los extractos de partes aéreas de las especies Bursera

Simanba y Bursera Graveolens contra algunos microorganismos patógenos. Carrera

Microbiología. Facultad Ciencias. Básicas. Departamento Microbiología. Pontificia

Universidad Javeriana. Trabajo de Pregado. Bogotá D.C. Pág. 50, 51, 52, 53, 61 y 68.

PICO ADRIANA. 2004. Realizar un evento para el intercambio de experiencias sobre

el uso de recursos florísticos nativos y productivos para la seguridad alimentaria,

entre productores de la Localidad de Sumapaz. Informe técnico. Departamento

Administrativo de Medio Ambiente, DAMA. Bogotá.

cxxiii

RANGEL, J. O. 2000. Flora: 126-378, in Colombia diversidad biótica III. La región

de la vida paramuna de Colombia. Rangel, J.O (Editor). Universidad Nacional de

Colombia. Editorial Unibiblos. Bogotá.

RODRIGUEZ V. PIEDAD M, URIBE MARTINEZ NELVA E. 1995. Efecto

antagónico de Lactobacillus casei y Lactobacillus acidophilus frente E. coli y

Shiquella sp aislados de materia fecal obtenida de un grupo de niños entre 1 y 7 años.

Carrera Bacteriología. Facultad Ciencias. Departamento Microbiología. Pontificia

Universidad Javeriana. Trabajo de Pregrado. Bogotá D.C. Pág. 20.

RONCANCIO B. DIANA Y. 2001. Determinación de la actividad antimicrobiana de

los extractos obtenidos a partir de hojas y corteza de Protium Calnense (Burseráceas)

frente a microorganismos patógenos transmitidos por diferentes vías. Carrera

Microbiología Industrial. Facultad de Ciencias. Departamento Microbiología.

Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregado. Bogotá D.C. Pág. 31, 48, 49 y

50.

RUIZ GIRALDO MARTHA C, SUSUNAGA SUSUNAGA CLARA M. 2000.

Actividad antimicrobiana presente en partes aereas de las especies Bursera

simaoruba y Bursera graveolens (BURSERACEAS), frente a microorganismos

como: Agrobacterium tumefaciens, Erwinia carotovora, Fusarium oxysporum,

Trichoderma viride y Botrytis cinerea. Carrera Microbiología Industrial. Facultad de

Ciencias. Departamento Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo

Pregrado. Bogotá D.C, Pág. 40

SCHERRIBER, K., AURICH, O, OSKKE, G. 1963. Solanum Alkaloiden XVIII.

Dunnschitcht Chromatographie von Solanm – Seroidalkaloiden und

Steroidsapogeninen. J. Chromatogr. 12, 63 – 69 (R 2.12 2.15)

cxxiv

STEYERMARK A, 1978. Flora y vegetación de las montañas de Ávila, de la Silla y

del Naiquatá. Ministerio del Medio ambiente y los Recursos Naturales Renovables.

Caracas. Venezuela. Pág 866.

TAVARES WALTER. 2000. Bactérias gram-positivas problemas: resistência do

estafilococo, do enterococo e do pneumococo aos antimicrobianos. Rev. da Sociedade

Brasileira de Medicina Tropical. Rio de Janeiro,Brasil. 33 (3).

TORRES, C. M. 2004. Investigación en la trasformación secundaria de frutos,

tubérculos, flores, hojas o tallos de especies pertenecientes a ecosistemas andinos. .

Informe Técnico. Jardín Botánico José Celestino Mutis – Subdirección Científica.

Bogotá D. C. Pag. 2-14.

TORRES, C. M. 2007. Investigación en procesos de transformación de sustancias de

interés presentes en hojas, tubérculos, semillas y frutos de especies andinas, para

generar productos agroindustriales que pueden ser destinados a nivel industrial,

medicinal o alimenticio. Segundo Informe Técnico. Jardín Botánico José Celestino

Mutis – Subdirección Científica. Bogotá D. C.

URIBE. CLAUDIA F.2003. Seguimiento epidemiológico de infección nosocomial

por Staphylococcus aureus meticilino resistente mediante electroforesis de campo

pulsado. Carrera Microbiología. Facultad de Ciencias. Departamento Microbiología.

Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Pregado. Bogotá D.C. Pág. 21 y 22.

cxxv

ANEXO 1

PREPARACIÓN AGAR MUELLER HINTON

Composición g/L

Infusión de carne 2

Hidrolizado de caseína 17.5

Almidón 1.5

Agar – Agar 13

Preparación

Disolver 34 g/L, esterilizar con cuidado en autoclave (10 min a 115ºC). Enfriar

eventualmente a 45 – 50 ºC para incorporar del 5 al 10% de sangre desfibrinada.

Verter placas. pH: 7.4 ± 0.2. Las placas con medio de cultivo sin la sangre son claras

y de color parduzco opalecescent.

cxxvi

ANEXO 2

PREPARACIÓN AGAR CHROMOCULT

Composición g/L

Peptona 3

Cloruro sódico 5

Dihidrógenofosfato potásico 1.7

Hidrógenofosfato dipotásico 3

Piruvato sódico 1

Triptófano 1

Lauril sulfato sódico 0.1

Mezcla de cromógenos 0.2

Agar – Agar 12

Preparación

Disolver 27 g/L en agua desmineralizada por calentamiento en el baño de agua

hirviendo o en vapor fluente, enfriar a 45 – 50 ºC y verter en placas. pH 6.8 ± 0.1 a

25 ºC.

El empleo se rige según los correspondientes métodos de investigación para agua y

alimentos. Incubación: 24 horas, eventualmente hasta 48 horas a 35 – 37 ºC.

cxxvii

ANEXO 3

PREPARACIÓN AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

Composición g/L

Infusión de patata (preparada a partir de 200 g de patata) 4

Glucosa 20

Agar – Agar 15

Preparación

Disolver 39 g/L y esterilizar en autoclave (15 min, a 121ºC). pH: 5,6 ± 0,1.

Para ajustar el pH a aprox. 3,5, incorporar al medio de cultivo, a 45 – 50ºC, una

solución estéril de ácido tartárico al 10%, a razón de 14 mL/L.

Las placas con medio de cultivo son claras e incoloras.

Este medio de cultivo se siembra, por estría, en superficie, o mediante el

procedimiento de incorporación. Incubación: hasta 5 días a temperatura ambiente.

Levar a cabo la investigación de acuerdo con los correspondientes fines de empleo.

ANEXO 4

cxxviii

PREPARACIÓN AGAR BAIRD PARKER

Composición g/L

Peptona de caseína 10

Extracto de carne 5

Extracto de levadura 1

Piruvato sódico 10

Glicina 12

Cloruro de Litio 5

Agar – Agar 15

Preparación

Disolver 58 g en 0.95 L, esterilizar en autoclave (15 min, a 121ºC), enfriar a 45 – 50

ºC, añadir mezclando 50 mL de emulsión de yema de huevo telurito y,

eventualmente, 50 mg/L de Sulfametacina. Verter en placas. pH: 6,8 ± 0,2.

En tanto que el medio de cultivo basal puede guardarse de 1 a 2 meses a 4ºC, el

medio de cultivo completo, vertido en placas, ha de ser utilizado dentro de las 24

horas siguientes a su preparación.

Diluir convenientemente el material a investigar y extenderlo finamente sobre la

superficie del medio de cultivo. Incubación: desde 24 hasta 48 horas a 37ºC.

ANEXO 5

cxxix

PREPARACIÓN DE AGAR BPLS (Verde brillante, Rojo de fenol, Lactosa y

Sacarosa)

Composición g/L

Peptona de 5

Peptona de caseína 5

Extracto de carne 5

Cloruro sódico 3

Hidrogenofosfato disódico 2

Lactosa 10

Sacarosa 10

Rojo de Fenol 0,08

Verde Brillante 0,0125

Agar – Agar 12

Preparación

Disolver 52 g/L, esterilizar en autoclave (15 min, a 37ºC) y verter en placas. Ph: 6,9 ±

0,1.

Las placas con medio de cultivo son claras con un color ligeramente rojizo.

Sembrar directamente con el material objeto de investigación, o a partir de un cultivo

de enriquecimiento. Deben utilizarse en paralelo medios de cultivo menos

inhibidores. Incubación: 18 a 24 horas a 37ºC.

i evaluaciÓn de la actividad antimicrobiana de los

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