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EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UN
PÉPTIDO SINTÉTICO EN PATOTIPOS Y COMENSALES DE Escherichia coli.
KAREN DAYANA MÉNDEZ JAIMES
STEPHANY YULIETH MENDOZA ESPINEL
JULY ANDREA MORENO AMÉZQUITA
UNIVERSIDAD DE SANTANDER – UDES
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
BUCARAMANGA
2018
EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UN
PÉPTIDO SINTÉTICO EN PATOTIPOS Y COMENSALES DE Escherichia coli.
KAREN DAYANA MÉNDEZ JAIMES
STEPHANY YULIETH MENDOZA ESPINEL
JULY ANDREA MORENO AMÉZQUITA
Proyecto de grado presentado como requisito para optar al título de
Bacteriólogas y Laboratoristas Clínicas
Tutores
Sergio Yebrail Gómez Rangel
Ana Elvira Farfán García
UNIVERSIDAD DE SANTANDER – UDES
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO
BUCARAMANGA
2018
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DEDICATORIA
Dedico este logro a mi madre, Flor Jaimes, por ser el pilar más importante en mi vida, por ser quien me
inspira a ser mejor cada día y por infundir en mí el deseo de superación. A mi padre, Eugenio Méndez, por
su esfuerzo y compromiso para brindarme su apoyo en mi formación personal y profesional. A mi hermano,
Cristian Méndez, por aconsejarme siempre que lo necesito. A mi compañero incondicional, Jesús Jerez, por
estar conmigo siempre y por apoyarme para realizar cada sueño de mi vida.
Karen Dayana Méndez Jaimes
Dedico este trabajo a Dios, por protegerme durante todo mi camino, por fortalecer mi corazón e iluminar
mi mente y permitirme haber llegado hasta este momento tan importante de mi formación profesional.
De manera especial a mi madre Juliana, pues ella es quien sentó en mí, las bases de responsabilidad y
perseverancia, mi motor de arranque y mi constante motivación para seguir adelante y cumplir con éxito
cada una de mis metas. A mi padre Cesar, quien con su cariño, esfuerzo y apoyo incondicional me brinda
todo lo que necesito para poder alcanzar cada una de mis metas.
A mi hermanito Santiago, que siempre ha estado junto a mí, por preocuparse siempre por mí y acompañarme
en este trabajo constante. A mis tías y abuela, que son como mis segundas madres, por inculcar en mí la
valentía de seguir cumpliendo cada uno de mis sueños, velando por mi bienestar y educación, siendo mi
apoyo en todo momento. A Jhonatan, mi complemento perfecto, por tantos aportes y consejos para el
desarrollo de esta tesis, por su cariño y gran amor, por querer siempre lo mejor para mí y darme su mano de
apoyo y motivación cuando más lo necesito.
Stephany Yulieth Mendoza Espinel.
Como todo resultado, ha sido el fruto de múltiples esfuerzos, hoy quiero dedicar este proyecto a mi familia,
por ser el mayor regalo que me ha dado el creador, a mi madre Marina por ser ejemplo de fortaleza y
dedicación, quien con su cariño me enseña y me motiva a creer en mí. A mi padre Yesid por su sabiduría,
por enseñarme a ver cada situación de la vida como una oportunidad para aprender algo nuevo. A mi
hermano Fabián, quien con su espíritu alegre ha sido el mejor compañero y amigo, por estar dispuesto a
apoyarme, deseando siempre las mejores cosas para mi vida. Finalmente dedico a cada una de las personas
que en este camino han aportado en mi formación personal y profesional permitiéndome tener la convicción
de querer dar lo mejor de mí en cada una de las cosas que haga.
July Andrea Moreno Amézquita
7
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar, queremos agradecerle a Dios por habernos guiado durante todo el
camino que hemos recorrido, fortaleciéndonos espiritualmente para estar un paso
más cerca de alcanzar nuestra meta de ser excelentes profesionales.
A nuestro Docente tutor Sergio Yebrail Gómez Rangel, quien con su sabiduría y
experiencia nos guío y acompañó durante todo el proceso, por su constante
compromiso, paciencia y por la confianza que depositó en nosotras para la
realización de este proyecto.
A nuestra cotutora Ana Elvira Farfán García, quien siempre estuvo dispuesta a
orientarnos, aportando sus conocimientos en el transcurso del proyecto.
Al proyecto de convocatoria interna 068-16, donde se anidó este trabajo de grado y
se pudieron obtener los recursos necesarios para la realización de esta
investigación.
A la Universidad de Santander y al equipo de Laboratorio de Investigaciones
Biológicas y Biotecnológicas por la disponibilidad del material y las instalaciones
requeridas para desarrollar este trabajo.
Por último, queremos agradecer a la base de todo, a nuestras familias quienes
siempre han sido nuestro apoyo incondicional y nuestra constante motivación en
cada uno de los proyectos que deseamos realizar en nuestra vida profesional y
personal.
8
CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 17
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 19
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 23
3. OBJETIVOS ....................................................................................................... 25
3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................................... 25
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 25
4. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 26
4.1 GENERALIDADES DE Escherichia coli ........................................................... 26
4.2 RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS ................................................... 28
4.2.1 Mecanismos de resistencia ........................................................................... 29
4.2.2 Plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos ............... 31
4.3 PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS (PAM) ......................................................... 32
5. ESTADO DEL ARTE .......................................................................................... 37
6. METODOLOGÍA ................................................................................................ 52
6.1. TIPO DE ESTUDIO ......................................................................................... 52
6.2 HIPÓTESIS ...................................................................................................... 52
6.3 MATERIALES .................................................................................................. 52
6.3.1 Cepas bacterianas ........................................................................................ 52
6.3.2 Péptido .......................................................................................................... 52
6.4 PROCEDIMIENTOS ........................................................................................ 53
6.4.1 Reconstitución de la cepa ............................................................................. 53
6.4.2 Ensayos de inhibición ................................................................................... 53
6.5 ANÁLISIS DE LOS DATOS ............................................................................. 55
6.6 ASPECTOS ÉTICOS ....................................................................................... 55
7. RESULTADOS ................................................................................................... 57
9
7.1. ENSAYO DE INHIBICIÓN............................................................................... 57
7.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA: CMI vs CBM ................................................ 59
8. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 61
9. CONCLUSIONES .............................................................................................. 68
10. RECOMENDACIONES .................................................................................... 69
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 70
10
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos. 1. Interacción de
membrana; 2. Funciones inmunomoduladoras; 3. Formación de poro en forma
anular; 4. Mecanismo de agregado; 5. Forma de poro en forma de barril; 6.
Interacciones con el ADN y proteínas relacionadas; 7. Mecanismos que alteran la
síntesis y plegamiento de proteínas ....................................................................... 36
Figura 2. Fuentes de péptidos antimicrobianos. .................................................... 37
11
LISTA DE GRÁFICOS
Pág.
Gráfica 1. Ensayo de inhibición del péptido en cepas de E. coli evaluadas ........... 58
Gráfica 2. Concentración mínima inhibitoria por patotipos de Escherichia coli ...... 59
12
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Ensayo de inhibición del péptido en cepas de E. coli evaluadas ............. 57
Tabla 2. Actividad Antimicrobiana CMI vs CMB ..................................................... 60
13
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Análogo: Molécula con alguna modificación en su estructura.
Anfipático: Compuesto que presenta en su estructura regiones hidrofílicas e
hidrofóbicas dentro de la misma molécula.
Antibiótico: Sustancia química producida por un ser vivo o fabricada por síntesis,
capaz de paralizar el desarrollo de ciertos microorganismos patógenos, por su
acción bacteriostática, o de causar la muerte de ellos, por su acción bactericida.
Comensal: Organismo que obtiene alimentos o protección a expensas de otro sin
producirle daño ni beneficio.
Enfermedad diarreica aguda: Presencia de tres o más deposiciones en 24 horas,
con una disminución de la consistencia habitual y una duración menor de 14 días.
Farmacorresistencia: Fenómeno que se produce en los microorganismos que
provoca la reducción de la actividad de los antimicrobianos a los cuales eran
tradicionalmente sensibles.
Patotipo: Poblaciones de la misma especie que difieren por su capacidad
patogénica.
Péptido antimicrobiano: Moléculas efectoras del sistema inmune innato, cuyas
familias se encuentran en casi todos los organismos, desde bacterias hasta
mamíferos.
Plásmido: Pequeña molécula de ADN extracromosómico que a menudo se
encuentran en bacterias y otras células.
Quimiotáctico: Sustancia que induce a determinadas células a migrar hacia el
órgano diana.
14
ABREVIATURAS
EDA: Enfermedad diarreica aguda.
PAM: Péptidos antimicrobianos.
OMS: Organización mundial de la salud.
CMI: Concentración mínima inhibitoria.
CMI50: Concentración mínima del antibiótico que es capaz de reducir en un 50% la
población bacteriana.
CBM: Concentración bactericida mínima.
ETEC: Escherichia coli enterotoxigénica.
EHEC: Escherichia coli enterohemorrágica.
EIEC: Escherichia coli enteroinvasiva.
EPEC: Escherichia coli enteropatógena.
EAEC: Escherichia coli enteroagregativa.
DAEC: Escherichia coli adherencia difusa.
Ib: Impatiens balsamina.
VRE: Resistente a vancomicina.
CLSI: The Clinical and Laboratory Standards Institute.
UFC: Unidades formadoras de colonia.
15
RESUMEN TITULO: EVALUACIÓN IN VITRO DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE UN PÉPTIDO SINTÉTICO EN PATOTIPOS Y COMENSALES DE Escherichia coli. AUTORES: KAREN DAYANA MÉNDEZ JAIMES
STEPHANY YULIETH MENDOZA ESPINEL JULY ANDREA MORENO AMÉZQUITA
PALABRAS CLAVE: Péptidos antimicrobianos, Impatiens balsamina, Patotipos, Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Bactericida Mínima. DESCRIPCIÓN En los últimos años las bacterias han ido desarrollando diversos mecanismos de
resistencia frente a los antibióticos, lo que ha generado un gran problema de salud
pública. Los péptidos antimicrobianos (PAM) han surgido como una estrategia
prometedora en la generación de nuevos agentes antimicrobianos debido a sus
múltiples mecanismos de acción, los cuales incluyen interacciones con la membrana
celular, inhibición de la síntesis proteica y de ácidos nucleicos, funciones
inmunomoduladoras y quimiotácticas, amplio espectro de actividad y la baja
probabilidad en el desarrollo de resistencia.
En este trabajo se evaluó la actividad antimicrobiana del péptido sintético Ib
derivado de la planta Impatiens balsamina en cepas comensales y patotipos de
Escherichia coli. El potencial inhibitorio se llevó a cabo mediante la determinación
de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) y la Concentración Bactericida Mínima
(CBM). El péptido demostró tener un buen potencial inhibitorio al presentar
concentraciones de CMI entre 0,7 y 12,5 µM. Particularmente, la actividad es
diferente en cada cepa, y no se asocia directamente al patotipo. Dentro del estudio
se incluyeron cepas comensales, las cuales presentaron valores de CMI más bajos
que los patotipos, esto se puede relacionar con la deficiencia de mecanismos de
patogenicidad en estas cepas.
Adicionalmente los péptidos demostraron tener actividad bactericida en la mayoría
de cepas, mediante la determinación de la CBM. Estos datos contribuyen al aporte
que tienen estas sustancias como potencial para contrarrestar la
farmacorresistencia.
16
ABSTRACT TITLE: IN VITRO EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF A SYNTHETIC PEPTIDE IN PATHYTES OF Escherichia coli DIARROGENICS.
AUTHORS: KAREN DAYANA MÉNDEZ JAIMES STEPHANY YULIETH MENDOZA ESPINEL JULY ANDREA MORENO AMÉZQUITA
KEYWORDS: Antimicrobial peptides, Impatiens balsamina, Pathotypes, Minimum Inhibitory Concentration, Minimum Bactericidal Concentration. DESCRIPTION In recent years, bacteria have been developing various mechanisms of resistance to antibiotics, which has generated a major public health problem. Antimicrobial peptides (PAM) have emerged as a promising strategy in the generation of new antimicrobial agents due to their multiple mechanisms of action, which include interactions with the cell membrane, inhibition of protein and nucleic acid synthesis, immunomodulatory and chemotactic functions , broad spectrum of activity and low probability in the development of resistance. In this work the antimicrobial activity of the synthetic peptide Ib derived from the plant Impatiens balsamina in commensal strains and pathotypes of Escherichia coli was evaluated. The inhibitory potential was carried out by determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and the Minimum Bactericidal Concentration (MBC). The peptide proved to have a good inhibitory potential by presenting MIC concentrations between 0.7 and 12.5 μM. In particular, the activity is different in each strain, and is not directly associated with the pathotype. The study included commensal strains, which presented lower MIC values than the pathotypes, this may be related to the deficiency of pathogenicity mechanisms in these strains. Additionally, the peptides showed to have bactericidal activity in the majority of strains, by means of the determination of the MBC. These data contribute to the contribution of these substances as a potential to counteract drug resistance.
17
INTRODUCCIÓN
Con el paso de los años, los antibióticos han ido evolucionando con el fin de
combatir las múltiples infecciones a las que el ser humano está expuesto
diariamente. A su vez, las bacterias también se han transformado utilizando diversos
mecanismos bioquímicos, genéticos y celulares como estrategias para sobrevivir y
ser resistentes a los antibióticos.1 Esta resistencia, puede ser un fenómeno de tipo
natural o adquirido; se conoce que el uso indiscriminado de estos fármacos en el
ser humano está contribuyendo al desarrollo de mecanismos de resistencia en las
bacterias, disminuyendo la eficacia de la terapia antibiótica, generando de este
modo un verdadero problema de salud pública ya que lleva a un incremento de las
estancias hospitalarias, complicaciones del paciente, aumento de la mortalidad e
incluso el aumento de los costos médicos.
En los países en vía de desarrollo, las enfermedades infecciosas son muy
abundantes. Uno de los principales microorganismos implicados es Escherichia coli,
un bacilo Gram negativo causante de diferentes tipos de infecciones. Dentro de
estas se encuentra la Enfermedad Diarreica Aguda (EDA) la cual puede afectar a
toda la población, presentando mayores índices de mortalidad en menores de cinco
años.2
1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. Evaluación de péptidos sintéticos sobre bacterias, levaduras
y mohos. 2012. Disponible en: http://bdigital.unal.edu.co/9147/1/32295622.2012.pdf 2 GÓMEZ-DUARTE, Oscar G. Enfermedad diarreica aguda por Escherichia coli patógenas en Colombia. 2015
Jun 16. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4469391/
18
Según los mecanismos de patogenicidad y los factores de virulencia se han descrito
seis patotipos de Escherichia coli,3 los cuales están asociados a distintos tipos de
diarrea con presentaciones clínicas características, en ocasiones presentadas en
grupos poblacionales específicos. Los patotipos de Escherichia coli han presentado
mecanismos de resistencia a antibióticos de primera elección como cefalotina,
carbenicilina, ampicilina y trimetoprim/sulfametoxazol, que antes mostraban un
buen potencial de inhibición frente a estas bacterias.
Con el propósito de buscar nuevas alternativas de tratamiento, en los últimos años
se han realizado investigaciones y hallazgos de péptidos con actividad
antimicrobiana, los cuales han surgido como una nueva estrategia terapéutica
contra diversas enfermedades microbianas. Estos péptidos antimicrobianos (PAM)
han mostrado gran potencial para uso clínico, debido a sus múltiples mecanismos
de acción, los cuales incluyen interacciones con la membrana celular, inhibición de
la síntesis proteica y de ácidos nucleicos, funciones inmunomoduladoras y
quimiotácticas, amplio espectro de actividad y baja probabilidad de resistencia.4
El presente trabajo muestra los resultados obtenidos al evaluar la actividad
antimicrobiana de un péptido sintético contra los patotipos de Escherichia coli
diarrogénicos.
3 FARFÁN-GARCÍA, Ana Elvira; ARIZA-ROJAS, Sandra Catherine; VARGAS-CÁRDENAS, Fabiola
Andrea y VARGAS-REMOLINA, Lizeth Viviana. Mecanismos de virulencia de Escherichia coli
enteropatógena. Disponible en: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-
10182016000400009 4 TÉLLEZ, G; CASTAÑO, J. Péptidos antimicrobianos. 2010. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14n1/v14n1a07.pdf
19
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Escherichia coli (E. coli) es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo
perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, esta bacteria se encuentra
colonizando el intestino del hombre y se considera un comensal pues se encuentra
formando parte de la microbiota del ser humano; sin embargo, presenta potencial
patógeno llegando a causar daño con diferentes cuadros clínicos, entre ellos la
enfermedad diarreica aguda (EDA).5
La EDA causada por bacterias continúa siendo un importante problema de salud en
el mundo, especialmente en los países en vías de desarrollo. Estas bacterias
colonizan el intestino del ser humano y pueden transmitirse directamente de
persona a persona, de animal a persona o indirectamente a través del agua o los
alimentos contaminados. Según su patogénesis y las características
epidemiológicas, este grupo de bacterias se divide en seis patotipos: E. coli
enteropatógena (EPEC, por sus siglas en inglés Enteropathogenic E.coli),
productora de toxina shiga (STEC), enterotoxigénica (ETEC), enteroinvasiva
(EIEC), enteroagregativa (EAEC) y difusamente adherente (DAEC) 6
En Colombia la EDA por E. coli enteropatógena, es considerada la segunda
patología más importante presentando una incidencia de 110 casos por 100.000
habitantes; con una estimación del 20 a 30% de los casos.7
5 FARFÁN-GARCÍA, ARIZA-ROJAS, VARGAS-CÁRDENAS, y VARGAS-REMOLINA, Óp. Cit. p. 16 6 OCHOA, Theresa J.; MERCADO, Erik H.; DURAND, David; RIVERA, Fulton P.; MOSQUITO, Susan;
CONTRERAS, Carmen; RIVEROS, Maribel; Lluque, Ángela; BARLETTA, Francesca; PRADA, Ana; RUIZ,
Joaquim. Frecuencia y patotipos de Escherichia coli diarrogénica en niños peruanos con y sin diarrea. 2011. 1,
Lima. s.n., Marzo de 2011, Rev Peru Med Exp Salud Publica., Vol. 28. Recuperado de:
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342011000100003} 7 GÓMEZ-DUARTE, Op. Cit. p. 15
20
A cierre de 2017 la tasa de mortalidad nacional por enfermedad diarreica aguda fue
de 26,7 casos por 1 000 000 de menores de cinco años.8
El tratamiento que se utiliza en la práctica clínica para manejar este tipo de
infecciones está basado en el uso de antibióticos que buscan la remisión de la
sintomatología presentada por el paciente; sin embargo, este se ha vuelto ineficiente
porque se ha evidenciado fenotipos de resistencia en antibióticos considerados de
primera elección como ampicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, tetraciclina,
cloramfenicol y ácido nalidíxico, lo cual lleva a complicaciones en el tratamiento. 9
La resistencia podría entenderse, principalmente, desde el mal uso que se les ha
dado a los antibióticos cómo terapia antimicrobiana. Esto podría explicarse desde
un uso indiscriminado debido a que los pacientes los consumen de forma excesiva,
emplean varios al mismo tiempo, y a un uso inadecuado pues no se están
completando los esquemas de tratamiento o no se escoge correctamente el
antibiótico según la infección y el tipo de microorganismo presente; esto
precisamente estimula un incremento en la resistencia, siendo de interés
significativo pues implica un cambio en el manejo de futuras infecciones.
Sumado a lo anterior, se han descrito los mecanismos genéticamente definidos en
las bacterias que determinan la resistencia del microorganismo, estos se adquieren
mediante mutaciones puntuales a nivel cromosómico o transferencia horizontal de
material genético entre especies relacionadas o diferentes, facilitada por algunos
elementos móviles tales como los integrones. Esto puede llevar a una diversificación
8 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD. Boletín epidemiológico semanal. [En línea] 2017. Disponible en:
http://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/BoletinEpidemiologico/2017%20Bolet%C3%ADn%20epidemiol%C3%B3gico%20semana%2052.pd
f 9 MOSQUITO, Susan; RUIZ, Joaquim Bauer, José Luis; OCHOA, Theresa J. Mecanismos moleculares de
resistencia antibiótica en Escherichia coli asociadas a diarrea. Mosquito, Susan, y otros. 2011. 4, Rev Peru Med
Exp Salud Publica, Vol. 28. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/pdf/rins/v28n4/a13v28n4.pdf
21
genética generando resistencia cruzada hacia otros antibióticos de la misma clase
o con el mismo mecanismo de acción e incluso a compuestos de familias diferentes,
siendo el principal impacto la reducción en las opciones para llevar a cabo la terapia
antibiótica.10
La OMS ha enfatizado en la importancia de buscar nuevas alternativas para
combatir la resistencia. La Asamblea Mundial de la Salud de Mayo de 2015 adoptó
un plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos, en el que se
establecen cinco objetivos, dentro de los cuales se destaca la necesidad de
aumentar la inversión en nuevos medicamentos, medios de diagnóstico, vacunas y
otras intervenciones.11 La resistencia a los antibióticos se proyecta como una de las
mayores amenazas para la salud humana en el futuro.
Como potencial terapéutico, se ha descrito que los PAM han demostrado ser muy
prometedores, debido a sus múltiples mecanismos de acción, la especificidad que
presenta, además de un amplio espectro de actividad y bajo potencial de
resistencia.12
Los péptidos antimicrobianos son las moléculas efectoras del sistema inmune
innato, cuyas familias se encuentran en casi todos los organismos, desde bacterias
hasta mamíferos. Son una familia de sustancias polifacéticas con complejos
mecanismos de acción relacionados con la interacción con el patógeno a través de
su membrana, o afectando blancos internos, como la replicación del ADN, la síntesis
10 TÉLLEZ, Germán Alberto y CASTAÑO, Jhon Carlos. Péptidos antimicrobianos. 2010. Armenia: s.n., 2010,
Vol. 14. Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14n1/v14n1a07.pdf 11 Organización Mundial de la Salud. Plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos. 2016.
[En línea] 2016. [Citado el: 20 de Mayo de 2018.] Disponible en:
http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/255204/9789243509761-
spa.pdf;jsessionid=D35DB2D9C097462212C486F601296B93?sequence=1 12 TÉLLEZ, y CASTAÑO, Óp. Cit. p. 19
22
de proteínas, la interacción con el huésped con funciones inmunomoduladoras de
la regulación del proceso inflamatorio y de la cicatrización.13
Previamente se ha descrito la actividad antimicrobiana que presenta el péptido Ib-
AMP4 y sus análogos en la cepa comensal E. coli K12, de este trabajo se evidenció
que la carga es determinante en la acción antimicrobiana, pues los péptidos
catiónicos presentaron una CMI más baja que el péptido nativo, esto sugiere que
estos péptidos modificados, pueden ser candidatos en el tratamiento contra
microorganismos.14
El presente trabajo investigó la acción antimicrobiana de uno de los análogos del
péptido Ib-AMP4, en patotipos de E. coli diarreogénicos y en cepas comensales.
Para ello, se definió la capacidad bactericida o bacteriostática.
13 Ibid. p. 19 14 FLÓREZ-CASTILLO, J. M.; PERULLINI, Mercedes; JOBBA´GY, Matías; CANO CALLE, Herminsul de
Jesús. Enhancing Antibacterial Activity Against Escherichia coli K-12. of Peptide Ib-AMP4 with Synthetic
Analogues. DOI 10.1007/s10989-014-9391-2 [En línea] Disponible en:
https://link.springer.com/article/10.1007/s10989-014-9391-2
23
2. JUSTIFICACIÓN
La aparición de resistencias en las infecciones del tracto gastrointestinal causadas
por E. coli constituyen un importante problema terapéutico. El uso extensivo e
indiscriminado de antibióticos ha llevado a una mayor resistencia que exige nuevas
estrategias para tratar la infección.15
La ineficiencia de algunos antibióticos convencionales ha llevado a la búsqueda de
nuevas alternativas. Los PAM han surgido en los últimos 25 años como una familia
de sustancias con gran potencial para uso clínico, debido a sus múltiples
mecanismos de acción, amplio espectro de actividad y bajo potencial de
resistencia.16 Estos péptidos antimicrobianos se han encontrado en casi todos los
seres vivos, desde los procariotas, con las bactericinas, a los eucariotas, como
mamíferos, anfibios, insectos y plantas con una familia diversa de péptidos.17
La literatura muestra que los péptidos inhiben una gran variedad de bacterias
incluyendo Escherichia coli. Por esta razón, el uso de los PAM surgen como una
nueva estrategia para el control de infecciones bacterianas,18 debido a que pueden
ser rápidamente sintetizados a bajo costo metabólico, almacenarse en grandes
cantidades y estar disponible en el momento de la infección.19 Están compuestos de
aminoácidos, y poseen una carga neta (generalmente catiónica), en dónde sus
características anfipáticas y tamaño, favorecen su interacción con bicapas lipídicas
15 YEDERY, R.D.; ARANHA, C. Antimicrobial peptides: premises and promises. [En línea] Disponible en:
https://www.ijaaonline.com/article/S0924-8579(04)00322-X/fulltext 16 MARR, Alexandra K.; GOODERHAM, William J.; HANCOCK, Robert EW. [En línea] Disponible en:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1471489206001299?via%3Dihub 17 BULET, P.; STÖCKLIN, R.; MENIN, L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates. [En
línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15199962 18 FLÓREZ-CASTILLO, PERULLINI, JOBBA´GY, CANO CALLE, Óp. Cit. p. 20 19 CORREA GÓMEZ, Elizabeth. Evaluación de péptidos sintéticos sobre bacterias, levaduras y mohos. 2012.
[En línea] Disponible en: http://bdigital.unal.edu.co/9147/1/32295622.2012.pdf
24
principalmente aquellas que forman las membranas citoplasmáticas de patógenos
(bacterias, hongos, virus envueltos y parásitos), en las que forman poros.20
Recientemente su rango de acción se ha extendido al citoplasma bacteriano, en
donde alteran la formación del septo de la membrana citoplasmática, inhiben la
síntesis de la pared celular, la de ácidos nucleicos, la de proteínas, así como
algunas actividades enzimáticas. De esta forma, los PAM logran su acción
antimicrobiana.21
Basados en su potencial antimicrobiano, con este trabajo se logró establecer la
actividad antimicrobiana de un péptido sintético sobre 14 cepas de Escherichia coli
diarrogénicas, en dónde se evaluó la Concentración Mínima Inhibitoria del péptido
frente a esta bacteria y su efectividad bactericida.
20 GANZ, Tomas. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. 2003. [En línea] Disponible en:
https://www.nature.com/articles/nri1180 21 CASTAÑEDA-CASIMIRO, Jessica; ORTEGA-ROQUE, José Antonio; VENEGAS-MEDINA, Adriana
Marcela; AQUINO-ANDRADE, Alejandra; SERAFÍN-LÓPEZ, Jeanet; ESTRADA-PARRA, Sergio;
ESTRADA, Iris. Enero-Abril 2009. [En línea] Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/alergia/al-
2009/al091d.pdf
25
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la actividad antimicrobiana de un péptido sintético en diferentes patotipos
de Escherichia coli diarrogénicas.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Establecer la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los péptidos frente a
cepas de Escherichia coli.
Determinar la efectividad bactericida o bacteriostática que ejercen los péptidos
sobre cepas de Escherichia coli.
26
4. MARCO TEÓRICO
4.1 GENERALIDADES DE Escherichia coli
Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo de la familia
Enterobacteriaceae, se encuentra normalmente en el intestino del ser humano como
parte de la microbiota normal, sin embargo, existen cepas capaces de producir
patologías graves en el hombre como la enfermedad diarreica aguda (EDA). En
base a su mecanismo de patogenicidad y cuadro clínico, las cepas de E. coli
causantes de diarrea se clasifican en diferentes patotipos: enterotoxigénica (ETEC),
enterohemorrágica (EHEC), enteroinvasiva (EIEC), enteropatógena (EPEC),
enteroagregativa (EAEC) y adherencia difusa (DAEC).22
E. coli enterotoxigénica (ETEC) se adhiere a los enterocitos del intestino delgado y
sintetiza las enterotoxinas llamadas toxina termolábil (LT) y toxina termoestable (ST)
como su principal mecanismo de patogenicidad. Las cepas ETEC son una causa
frecuente de diarrea en lactantes de países en desarrollo, así como la causa más
común de diarrea en individuos de países industrializados que viajan a zonas menos
desarrolladas del mundo.2
E. coli enterohemorrágica (EHEC) incluye cepas de diferentes serotipos que
presentan las mismas características clínicas, epidemiológicas y patogénicas del
serotipo O157:H7, considerado como prototipo del grupo. Se adhiere a los
22 GOMES, Tânia, A.T.; ELIAS, Waldir, P.; SCALETSKYA, Isabel C.A.; GUTHA, Beatriz E.C.;
RODRIGUES, Juliana F. PIAZZA, Roxane M.F. FERREIRA, Luís C.S. MARTINEZ, Marina B. Diarrheagenic
Escherichia coli. 2016. [En línea] Disponible en: https://ac.els-cdn.com/S1517838216310917/1-s2.0-
S1517838216310917-main.pdf?_tid=aec3c19c-f468-4a0a-b6f8-
80522cb0f966&acdnat=1539986682_bd5630d356d4bfb6378c5cd35fa44898
27
enterocitos del intestino grueso, destruye las microvellosidades y produce toxinas
shiga (Stx1, Stx2), que es su principal factor de patogenicidad, responsable de las
complicaciones intestinales y sistémicas, se relaciona con brotes causados por
alimentos en países desarrollados. Puede causar diarrea con sangre, colitis
hemorrágica y el síndrome urémico hemolítico y púrpura trombocitopénica.23
El mecanismo de patogenicidad de E. coli enteroinvasiva (EIEC) es la invasión del
epitelio del colon mediante la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la
mucosa requiriendo de mucinasa y adhesinas, para entrar por endocitosis a la célula
y multiplicarse en ella logrando la diseminación a células sanas adyacentes.24
E. coli enteropatógena (EPEC) se caracteriza por la lesión histopatológica de la
superficie apical de los enterocitos, conocida como "Adherencia y Esfascelamiento";
se adhiere mediante pilis o fimbrias a los enterocitos del intestino delgado causando
la destrucción de las microvellosidades. Este patotipo se considera una de las
principales etiologías de diarrea infantil en países en desarrollo.25
Las cepas de E. coli enteroagregativa (EAEC) tienen la capacidad de incrementar
en la mucosa la producción y secreción de moco que atrapa a las bacterias
formando una biopelícula. Causa diarrea aguda o persistente, tanto en niños como
en adultos, en países en vías de desarrollo y se identifica con frecuencia en cuadros
diarreicos de personas de países industrializados y en pacientes infectados por VIH.
23 ROMEU ÁLVAREZ, Beatriz. Caracterización de cepas de Escherichia Coli de importancia clínica humana
aisladas de ecosistemas dulceacuícolas de la Habana. 2012 24 RODRÍGUEZ-ÁNGELES, Guadalupe. Principales características y diagnóstico de los grupos patógenos de
Escherichia coli. [En línea] Disponible en: http://www.adiveter.com/ftp_public/E.coli.pdf 25 Ibíd. p. 25
28
Las cepas de E. coli de adherencia difusa (DAEC) tienen como mecanismo de
patogenicidad una fimbria de superficie involucrada en el fenómeno de adherencia
difusa. Estas cepas se han asociado más a procesos diarreicos de tipo agudo y
persistente en niños que en adultos.
4.2 RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS
El impacto generado por los antibióticos desde 1940 fue en gran medida por
haberse considerado como la mejor alternativa para combatir las enfermedades de
origen infeccioso, de manera que su uso fue cada vez mayor. Desafortunadamente,
se ha visto un marcado incremento de la resistencia de los microorganismos a las
distintas familias de antimicrobianos. Este fenómeno se aceleró por el uso
inadecuado de antibióticos en diferentes sectores, propiciado por la falta de
normatividad que regule el uso de estos; así como, esquemas de tratamiento
incompletos, ventas sin receta médica, inclusive la falta de control de los residuos
de antimicrobianos generados en las plantas de producción.26
La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha resaltado el problema de salud
pública que ha generado la resistencia antimicrobiana ante la amenaza persistente
de bacterias multirresistentes, la rápida propagación de estas entre pacientes
agravando su estado de salud, a su vez provoca la prolongación de estancias
hospitalarias. Este problema además de afectar el sector de la salud, tiene
repercusión en la medicina veterinaria, el medio ambiente, y la seguridad
alimentaria.27
26 QUIÑONES PÉREZ, Dianelys. Resistencia antimicrobiana: evolución y perspectivas actuales ante el enfoque
"Una salud". Set.-dic. 2017. [En línea] Disponible en:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-07602017000300009 27 Ibíd. p. 26
29
Debido a esto la OMS ha reunido esfuerzos para enfrentar esta situación poniendo
en marcha en el 2015 el Sistema Mundial de Vigilancia de la Resistencia a los
Antimicrobianos, denominado GLASS, el cual ha revelado la presencia de
resistencia a los antibióticos en muestras de 500 000 personas de 22 países en las
que se sospechaban infecciones bacterianas. De esta forma se identificaron las
bacterias resistentes más frecuentes: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae, seguidas de Salmonella
spp.28
4.2.1 Mecanismos de resistencia. La resistencia bacteriana puede entenderse de
distintos puntos de vista, uno de ellos son las vías por las cuales se adquieren la
resistencia. La primera es de tipo natural, esta es inherente a la cepa y está
determinado por la genética del microorganismo. La resistencia adquirida, se
caracteriza por ser evolutiva, las cepas obtienen genes de resistencia a través de
plásmidos, integrones y transposones.
Otra forma de entender la resistencia bacteriana es a partir de los cambios
moleculares y bioquímicos que generan distintos mecanismos, los cuales se pueden
presentar de forma simultánea.29 A continuación se describen los principales
mecanismos bioquímicos asociados a resistencia bacteriana.
4.2.1.1 Inactivación del antibiótico por destrucción o modificación de la
estructura química: El fenotipo de resistencia se caracteriza por la producción de
enzimas que hidrolizan la estructura química del antibiótico, entre estas se
encuentran las beta-lactamasas las cuales rompen el enlace amida del anillo
28 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Datos recientes revelan los altos niveles de resistencia a los
antibióticos en todo el mundo. [En línea] Disponible en:
https://www.who.int/mediacentre/news/releases/2018/antibiotic-resistance-found/es/ 29 GIEDRAITIEN, A.; VITKAUSKIEN, A.; NAGINIEN, R.; PAVILONIS, A. Antibiotic resistance
mechanisms of clinically important bacteria. Medicina (kaunas). 2011. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21822035
30
betalactámico. Este mecanismo es significativo en bacterias Gram negativas,
también en bacterias Gram positivas, aunque estas últimas presentan mecanismos
de mayor alcance a nivel clínico. Se han descrito varios tipos de beta-lactamasas,
a su vez estas se clasifican en clases (A, B, C, y D). Los genes implicados en este
tipo de resistencia pueden ser cromosómicos o plasmídicos.30
Otras enzimas se encargan de modificar la estructura del antibiótico, dentro de estas
se encuentran la cloranfenicol acetiltransferasa, acetilasas, adenilasas y
fosfatasas.31
4.2.1.2 Alteración del sitio blanco del antibiótico: Se lleva a cabo tras la
modificación de sitios específicos de la célula bacteriana donde el antibiótico
interviene como la pared celular, la membrana celular, la subunidad 50S o 30S del
ribosoma entre otras. En Staphylococcus aureus, el principal mecanismo de
resistencia a beta-lactamicos es la producción de la proteína fijadora de penicilina.
Las modificaciones ribosomales pueden presentarse por la acción de metilasas.32
En un estudio realizado por Mery De la Fuente, se determinó la relación que existe
en la mutación de los genes GyrA y GyrB que codifican para las topoisomerasas II
y IV y la resistencia a las quinolonas en Escherichia coli.33
30 MARTÍNEZ-MARTÍNEZ L. Mecanismos de resistencia a los antimicrobianos. [En línea] Disponible en:
http://www.humv.es/revista-valdecilla/1_1/1_mecanismos_de_resistencia_a_los_antimicrobianos.pdf 31 VIGNOLI, R.; SEIJA, V. Principales mecanismos de resistencia antibiótica. [En línea] Disponible en:
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Principalesmecanismosderesistenciaantibiotica.pdf 32 Ibíd. p. 28 33 DE LA FUENTE, Mery; DAUROS, Priscila; BELLO, Helia; DOMÍNGUEZ, Mariana; MELLA, Sergio;
SEPÚLVEDA, Marcela; ZEMELMAN, Raúl; GONZÁLEZ, Gerardo. Mutaciones en genes gyrA y gyrB en
cepas de bacilos Gram negativos aisladas en hospitales chilenos y su relación con la resistencia a
fluoroquinolonas. [En línea] Disponible en: https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-
98872007000900002&lng=en&nrm=iso&tlng=en
31
4.2.1.3 Alteración en las barreras de permeabilidad. La membrana celular tanto
de bacterias Gram negativas como de bacterias Gram positivas presenta lípidos lo
cual representa un obstáculo para la entrada de antibióticos, por este motivo su
transporte se lleva a cabo a través de canales denominados porinas. Estos
trasportadores por su constitución química, tamaño de la molécula y carga eléctrica
permiten el paso de estos compuestos. Sin embargo, la disminución en la expresión
de las porinas afectará el transporte activo a través de la membrana celular
alterando el ingreso del antibiótico a la célula bacteriana.34
4.2.1.4 Bombas de flujo. Las bombas de eflujo son proteínas trasportadoras que
llevan a cabo la expulsión de los compuestos antimicrobianos, este mecanismo
requiere gasto energético, se ha descrito en bacterias Gram positivas y Gram
negativas. Estas proteínas forman canales que exportan el agente antimicrobiano
fuera de la célula, pueden ser específicas a un tipo de compuesto o pueden expulsar
distintos tipos de antimicrobianos favoreciendo la multirresistencia.35
4.2.2 Plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos. La
Asamblea Mundial de la Salud de mayo de 2015 adoptó un plan de acción mundial
sobre la resistencia a los antimicrobianos, en el cual la OMS destaca que desde
1987 no se ha descubierto ningún tipo importante de antibiótico y los agentes
antibacterianos en fase de desarrollo no bastan para afrontar el reto de la
multirresistencia, insistiendo en la necesidad de conceptos nuevos, para ofrecer
incentivos a la innovación.36
34 PÉREZ-CANO, Héctor Javier y ROBLES-CONTRERAS, Atzín. Aspectos básicos de los mecanismos de
resistencia bacteriana. [En línea] Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/revmed/md-
2013/md133i.pdf 35 MARCHETTI, M.L.; ERRECALDE, J. Resistencia bacteriana a los antimicrobianos ocasionada por bombas
de eflujo impacto en la multiresistencia, 2011. [En línea] Disponible en:
http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/11280/Documento_completo.pdf?sequence=1&isAllowed=y 36 ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. Óp. Cit. p. 27
32
4.3 PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS (PAM)
Los péptidos son pequeñas estructuras constituidas por aminoácidos, unidos entre
sí por enlaces covalentes que presentan en sus extremos grupos amino y carboxilo
libres. Según la International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) su
tamaño oscila entre unos pocos aminoácidos hasta 50 residuos.37 La mayoría son
de origen ribosomal, pero también hay péptidos no ribosomales, que son producto
de rutas metabólicas simples, que por lo general son originados en algunos
procariotas y eucariotas inferiores como algas, esponjas y hongos.38
Estos presentan una gran variedad de estructuras como las hélices α, las hojas β y
las estructuras ricas en cisteína39, además, poseen características estructurales en
común, su carga policatiónica y su anfipaticidad, las cuales garantizan su actividad
antimicrobiana.40
Se han reportado diferentes mecanismos de acción, siendo el primer paso la
interacción electrostática entre las cargas positivas de estos y los componentes
aniónicos de las membranas celulares de los microorganismos.41 Dentro de estos
componentes se pueden mencionar: los fosfolípidos, el lípido A presente en los
lipopolisacáridos de las bacterias Gram Negativas y los ácidos teicoicos y
37 WANG, G. Antimicrobial peptides: discovery, design and novel therapeutic strategies. (G. Wang, Ed.) (1st
ed.). Wallingford: Cabi. 2010. [En línea] Disponible en:
https://nebraska.pure.elsevier.com/en/publications/antimicrobial-peptides-discovery-design-and-novel-
therapeutic-str 38 CORREA GÓMEZ, Óp. Cit. p. 21 39 JOFRÉA, Claudio; GUZMÁN, Fanny; CÁRDENAS, Constanza; ALBERICIO, Fernando; MARSHALL,
Sergio H. A natural peptide and its variants derived from the processing of infectious pancreatic necrosis virus
(IPNV) displaying enhanced antimicrobial activity: A novel alternative for the control of bacterial diseases. [En
línea] Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0196978111000428 40 2011. [En línea] Disponible en:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960894X07005665?via%3Dihub 41 GLUKHOV, Evgenia; STARK, Margareta; BURROWS, Lori L. and DEBER, Charles M. [En línea]
Disponible en: http://www.jbc.org/content/280/40/33960
33
teicurónicos presentes en las bacterias Gram Positivas.42 Después de esta
interacción y dependiendo de la relación péptido/lípidos pueden ocurrir diferentes
mecanismo de acción, dentro de los cuales se resalta las funciones
inmunomoduladoras, permeabilización de las membranas celulares, interacciones
con el ADN y proteínas relacionadas y mecanismos que alteran la síntesis y
plegamiento de proteínas43 como se muestra en la Figura 1.
Los PAM han surgido en los últimos 25 años como una familia de sustancias con
gran potencial para uso clínico, debido a sus múltiples mecanismos de acción,
amplio espectro de actividad y bajo potencial de resistencia.44 Además, son una
parte importante del sistema inmune innato de una gran variedad de seres vivos
como los anfibios, plantas, insectos, humanos e incluso se han logrado aislar de
algunas bacterias y hongos.45
Estos compuestos pueden ser rápidamente sintetizados a bajo costo metabólico,
almacenarse en grandes cantidades y estar disponible en el momento de la
infección.46
En cuanto a la actividad antimicrobiana, son moléculas eficientes ya que presentan
cuatro importantes ventajas: i) son moléculas selectivas, ii) su acción para eliminar
microorganismos es rápida, iii) poseen actividad frente a un amplio espectro de
42 BROGDEN, Kim A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitor in bacteria? 2005. [En línea]
Disponible en: https://www.nature.com/articles/nrmicro1098 43 FLÓREZ CASTILLO, Johanna Marcela. Pevaluación de la actividad antimicrobiana contra Moniliopthora
roreri (Cif & Par) Y Escherichia coli K-12 de péptidos análogos al péptido ib-amp4 encapsulados en pellets de
polivinil alcohol (PVA) y soportados sobre óxidos mesoporosos de Al(III) – Mg(II). 2016. 44 MARR, AK, GOODERHAM, WJ, HANCOCK, RE. Antibacterial peptides for therapeutic use: obstacles and
realistic outlook. Curr Opin Pharmacol. 2006;6:468-72. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16890021 45 JENSSEN, Håvard; HAMILL, Pamela; HANCOCK, Robert E. W. 2011. [En línea] Disponible en:
https://cmr.asm.org/content/19/3/491 46 ZHAO, H. Mode of Action of Antimicrobial Peptides. University of Helsinki. [En línea] Disponible en:
http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/laa/biola/vk/zhao/modeofac.pdf
34
microorganismos, y iv) los resultados de diferentes investigaciones indican que los
microorganismos no desarrollan resistencia contra los PAM.47
El espectro de actividad antimicrobiana es amplio. Se encuentra actividad
antibacteriana, en dónde recientemente se ha demostrado que el péptido Ib-AMP-4
(derivado de la planta Impatiens balsamina (Ib)) tiene una potente actividad frente a
diferentes bacterias Gram positivas y Gram negativas. En estudios realizados por
Fan y otros se demostró que al combinarse con vancomicina inhibe el crecimiento
de Enterococcus faecalis resistente a vancomicina (VRE).48 También se ha
demostrado la eficacia de otros PAM como el LZ1, este péptido inhibe el crecimiento
de Propionibacterium acnes así como de Staphylococcus epidermidis y
Staphylococcus aureus.49 Se han descrito PAM antifúngicos como el Cm-p5, Lopez
Abarrategui y otros, demostraron que tiene actividad fungistática in vitro frente a
Candida albicans.50 Otros como NaD, presentan una potente actividad frente a
varios hongos patógenos como Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea, Aspergillus
niger, Cryptococcus spp, así como a las levaduras Saccharomyces cerevisiae y C.
albicans. La acción antifúngica de este péptido está mediada por la formación de
gránulos en el citoplasma y la muerte celular.51 En cuanto a la actividad antiviral se
47 OÑATE-GARZÓN, José Fernando; MANRIQUE-MORENO, Marcela; PATIÑO GONZALEZ, Edwin.
Actividad antimicrobiana de péptidos catiónicos diseñados a partir de un péptido neutro. 2017. [En línea]
Disponible en: http://bdigital.unal.edu.co/59950/1/59665-327730-3-PB.pdf 48 FAN, X.; REICHLING, J.; WING, M. Antibacterial activity of the recombinant antimicrobial peptide Ib-
AMP4 from Impatiens balsamina and its synergy with other antimicrobial agents against drug resistant bacteria.
Pharmazie. 2013;68:628-30. [En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23923648 49 ZHANG, Z.; MU, L.; TANG, J.; DUAN, Z.; WANG, F.; WEI, L, et al. A small peptide with therapeutic
potential for inflammatory acne vulgaris. PLoS One. 2013;8(8):e72923. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3755965/ 50 LÓPEZ-ABARRATEGUI, C.; MCBETH, C.; MANDAL, SM.; SUN, ZJ.; HEFFRON, G, ALBA-
MENÉNDEZ, A, et al. Cm-p5: an antifungal hydrophilic peptide derived from the coastal mollusk Cenchritis
muricatus (Gastropoda: Littorinidae). FASEB J. 2015; 29:3315-25. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25921828 51 HAYES, BM.; BLEACKLEY, MR.; WILTSHIRE, JL.; ANDERSON, MA.; TRAVEN, A. Van der Weerden
NL. Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug
arsenal against Candida albicans. Antimicrob Agents Chemother. 2013; 57(8):3667-75. [En línea] Disponible
en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3719733/
35
conoce que las defensinas tienen actividad contra virus envueltos como desnudos,
aunque con mecanismos de acción diferentes. Algunas actúan directamente sobre
las envolturas virales, glicoproteínas y cápsides mientras que otras se unen a los
receptores celulares impidiendo su interacción con el virus o inhiben la replicación
viral.52 Las α-defensinas HNP-1 a la -3 y HD-5 han mostrado en estudios in vitro que
pueden bloquear la infección por Papilomavirus.53 También se ha descrito que las
catelicidinas tienen efecto inhibitorio en la replicación in vitro de los Lentivirus.54
Otros péptidos han mostrado actividad antiparasitaria, dentro de estos se pueden
mencionar los provenientes de insectos como la defensina A, la cual tiene actividad
contra Plasmodium spp, Leishmania spp y Trypanosoma spp.55 También se ha
descrito que el péptido recombinante HNP-1 (rHNP-1) tiene una potente actividad
contra Leishmania spp durante todo su ciclo de vida.56
Sus mecanismos de acción son múltiples e incluyen interacciones con la membrana
celular, inhibición de la síntesis proteica y de ácidos nucleicos, con funciones
inmunomoduladoras, quimiotácticas y en el proceso de cicatrización.57
52 WILSON, SS.; MAYIM, ME.; JASON, SG. Antiviral Mechanisms of Human Defensins. J Mol Bio.
2013;425(24):4965-80. [En línea] Disponible en:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022283613006220?via%3Dihub 53 WIENS, ME.; SMITH, JG. Defensin HD5 Inhibits Human Papillomavirus 16 Infection via Capsid
Stabilization and Redirection to the Lysosome. Mbio. 2017;8:1 e02304- 16. [En línea] Disponible en:
https://mbio.asm.org/content/8/1/e02304-16 54 STEINSTRAESSER, L.; TIPPLER, B.; MERTENS, J.; LAMME, E.; HOMANN, HH.; LEHNHARDT, M.;
et al. Inhibition of early steps in the lentiviral replication cycle by cathelicidin host defense peptides.
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https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F10_2013_191 56 DABIRIAN, S.; TASLIMI, Y.; ZAHEDIFARD, F.; GHOLAMI, E.; DOUSTDARI, F.; MOTAMEDIRAD,
M, et al. Human Neutrophil Peptide-1 (HNP-1): A New Anti-Leishmanial Drug Candidate. PLOS Neglected
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bacteria. Exprt Rev Anti Infect Ther. 2007;5:951-9. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18039080
36
Los péptidos antimicrobianos se plantean como un grupo de sustancias que
entrarían al arsenal clínico, ya que suponen ventajas con respecto a los antibióticos
convencionales, principalmente asociado a un bajo índice de resistencia, y a la baja
concentración que se use para su actividad.58
Figura 1. Mecanismo de acción de los péptidos antimicrobianos. 1. Interacción
de membrana; 2. Funciones inmunomoduladoras; 3. Formación de poro en
forma anular; 4. Mecanismo de agregado; 5. Forma de poro en forma de barril;
6. Interacciones con el ADN y proteínas relacionadas; 7. Mecanismos que
alteran la síntesis y plegamiento de proteínas
Fuente: ÉLLEZ, Germán Alberto; CASTAÑO, Jhon Carlos. Péptidos antimicrobianos. [En
línea] Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14n1/v14n1a07.pdf
58 TÉLLEZ, Germán Alberto; CASTAÑO, Jhon Carlos. Péptidos antimicrobianos. [En línea] Disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/inf/v14n1/v14n1a07.pdf
37
5. ESTADO DEL ARTE
Los péptidos antimicrobianos son pequeñas moléculas producidas por todo tipo de
organismos en la naturaleza, tanto eucariotas como procariotas, y funcionan como
componentes clave del sistema inmune innato, actuando como la primera barrera
de defensa natural contra microorganismos invasores.59 Se encuentran
prácticamente en todas las formas de vida y son producidos por todos los
organismos que van desde bacterias a plantas, vertebrados e invertebrados (Figura
2).60
Figura 2. Fuentes de péptidos antimicrobianos.
Fuente: KUMAR, Prashant; KIZHAKKEDATHU, Jayachandran N.; and STRAUS, Suzana K. Antimicrobial Peptides: Diversity, Mechanism of Action and Strategies to Improve the Activity and Biocompatibility In Vivo. 2018 Jan 19. [En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5871973/
59 ZASLOFF M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 2002; 415: 389– 395. [En línea]
Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11807545 60 KUMAR, Prashant; KIZHAKKEDATHU, Jayachandran N.; and STRAUS, Suzana K. Antimicrobial
Peptides: Diversity, Mechanism of Action and Strategies to Improve the Activity and Biocompatibility In Vivo.
2018 Jan 19. [En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5871973/
38
La lisozima fue la primera molécula con actividad antimicrobiana reportada, esta se
identificó en 1922 por Alexander Fleming después de que mucosidades
procedentes de su estornudo, cayeran sobre una placa de Petri en la que crecía un
cultivo bacteriano y unos días más tarde notó que las bacterias habían sido
destruidas en el lugar donde se había depositado el fluido nasal, observando que
estas secreciones respiratorias presentaban poderes bactericidas. La llamó lisozima
combinando dos palabras: lisado y enzima.61,62
En 1942, se intentó aislar de cepas de Bacillus brevis la tirotricina, esta pudo
fraccionarse obteniéndose dos sustancias individuales, la gramicidina y la tirocidina,
los cuales son péptidos con uso clínico.63 El efecto de la gramicidina se demostró al
tratar con éxito las heridas infectadas en la piel de cobayo y además se comprobó
su efectividad para proteger frente a la infección por neumococos, estos fueron los
primeros PAM que se fabricaron comercialmente como antibióticos64. En el mismo
año, también se aisló a partir de la planta Triticuma estivum el PAM purotionina, que
resultó ser efectivo contra hongos y bacterias patógenas con la capacidad de inhibir
el crecimiento de algunos fitopatógenos tales como Pseudomonas solanacearum,
Xanthomonas campestris y Corynebacterium michiganense.65
61 ZHANG, Ling-Juan; GALLO, Richard L. Antimicrobial peptides. [En línea] Disponible en: https://ac.els-
cdn.com/S0960982215014098/1-s2.0-S0960982215014098-main.pdf?_tid=96fc32f0-3d52-4393-80a9-
f0b07d74d297&acdnat=1541277356_55b16b7adb2f37c420a3e47a1a9910cd 62 FLEMING, A. Antibiotic therapy, an introductory article. Med. Illus1950;10:477-478. [En línea] Disponible
en: https://www.nejm.org/doi/full/10.1056/nejmoa012122 63 GAUSE, G. F. & BRAZHNIKOVA, M. G. Gramicidin S and its use in the Treatment of Infected Wounds.
[En línea] Disponible en: https://www.nature.com/articles/154703a0 64 Antimicrobial Peptides: Their History, Evolution, and Functional Promiscuity. [En línea] Disponible en:
https://application.wiley-vch.de/books/sample/3527332634_c01.pdf 65 WANG, G. Computational Peptidology, Methods in Molecular Biology. In: Zhou P, Huang J (eds.). Improved
Methods for Classification, Prediction, and Design of Antimicrobial Peptides. New York: Springer
Science+Business Media; 2015. p. 44- 66. [En línea] Disponible en:
https://link.springer.com/protocol/10.1007%2F978-1-4939-2285-7_3
39
A principios de los 80’s, en el laboratorio de Hans Boman y colaboradores inyectaron
bacterias a pupas de un tipo de polilla del género Hyalophora cecropia, después de
siete días detectaron en la hemolinfa de las pupas la presencia de un péptido
catiónico de 37 aminoácidos con actividad antimicrobiana contra E. coli y otras
bacterias Gram-negativas.66 Este péptido fue secuenciado, caracterizado y
nombrado como la familia de las cecropinas, siendo el mejor informado en esa
época.67
A mediados de los ochenta, Robert Lehrer y colaboradores reportaron las
estructuras de una clase abundante de péptidos almacenados en células
polimorfonucleares de humanos y conejos. Estos péptidos llamados defensinas
presentaban actividad contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas.68
En 1987 Michael Zasslof descubrió que la piel de la rana Xenopus laevis contenía
glándulas ricas en péptidos catiónicos con actividad antimicrobiana, mismos que
denominó maganinas.69 Estos péptidos, alteran la permeabilidad de las células
bacterianas causando un trastorno en el metabolismo y provocando lisis celular.70
En 1990, hubo una rápida expansión en el campo del conocimiento de los PAM; En
1997 Ravi Tailor y colaboradores lograron aislar cuatro péptidos de semillas de la
planta Ib, estos se denominaron Ib-AMP1, Ib-AMP2, Ib-AMP3, e Ib-AMP4, estos
66 STEINER, H., ENGSTROM, BENNICH, BOMAN. Sequence and specificity of two antibacterial proteins
involved in insect immunity. Nature, 1981;292:246-248. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7019715 67 Antimicrobial Peptides: Their History, Evolution, and Functional Promiscuity. [En línea] Disponible en:
https://application.wiley-vch.de/books/sample/3527332634_c01.pdf 68 SELSTED, H., GANZ, SCHILLING. Primary structures of three human neutrophil defensins. J Clin Invest,
1985;76:1436-1439. [En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC424095/ 69 ZASLOFF, M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization
of two active forms, and partial cDNA sequence of precursor. Proc Natl Acad Sci, 1987;84:5449-5453. [En
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[En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7612236
40
péptidos se caracterizan por ser de cadena corta (20 aminoácidos), las moléculas
son de carácter ácido, y presentan en su estructura residuos de cisteína que les
permite la formación de enlaces disulfuro.71 La actividad inhibitoria del péptido se
evaluó mediante la concentración mínima inhibitoria 50 (CMI 50), los ensayos fueron
realizados en bacterias incluyendo E. coli y hongos. En los resultados se demostró
una mejor actividad antimicrobiana del Ib-AMP4 en comparación de los otros
péptidos aislados, además la acción antimicrobiana se comparó con el péptido
antibiótico Maganina, obteniéndose mejor actividad en los péptidos Ib-AMP.72
Un año más tarde, Patel y colaboradores, estudiaron la composición estructural del
péptido Ib-AMP1, con el objetivo de comprender la relación estructura / función de
dicha molécula. Utilizaron el dicroísmo circular (DC) para determinar la estructura
del péptido y con ello demostraron la presencia de un giro en la molécula cuya
conformación le confiere carácter anfipático, el cual le permite la interacción con la
membrana celular bacteriana.73
En estudios recientes, Xiaobo Fan evaluó la interacción del péptido Ib-AMP4 en una
membrana lipídica diseñada de manera sintética; mediante las mediciones de DC
se determinó la presencia de una hoja Beta que le favorece la inserción en la bicapa
lipídica. La inserción y la presión del péptido provocaron que la membrana se
arrugara y formara poros, lo cual permite elucidar el modo de acción del péptido en
membranas bacterianas.74
71 RAVI, H.; TAILOR, David P.; ACLAND, Sheila; ATTENBOROUGH, BRUNO P. A.; CAMMUE, IAN J.
EVANS, RUPERT W.; OSBORN, John A.; RAY, SARAH B. and WILLEM F. Broekaert. A Novel Family of
Small Cysteine-rich Antimicrobial Peptides from Seed of Impatiens balsamina Is Derived from a Single
Precursor Protein. [En línea] Disponible en: http://www.jbc.org/content/272/39/24480.full 72 ZASLOFF, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84, 5449–5455. 1987 [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3299384 73 PATEL, SU.; OSBORN, R.; REES, S.; THORNTON, JM. Structural Studies of Impatiens balsamina
Antimicrobial Protein (Ib-AMP1)† [En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9454588 74 FAN, Xiaobo; KORYTOWSKI, Agatha; MAKKY, Ali; TANAKA, Motomu; WINK, Michael. Ib-AMP4
insertion causes surface rearrangement in the phospholipid bilayer of biomembranes: Implications from
41
En estudios complementarios a este, se identificó la interacción del péptido y las
membranas celulares, concluyendo la importancia de la configuración que debe
adoptar la molécula para una correcta inserción, proporcionando una posible
explicación a la resistencia atribuida a la inserción, además se evaluó la actividad
inhibitoria de los grupos de péptidos Ib-AMP, mediante la CMI50, los ensayos fueron
realizados en bacterias y en hongos. Sin embargo, en E. coli la CMI50 fue
>500µg/mL, lo que indica la necesidad de emplear altas concentraciones para
ejercer su efecto inhibitorio.75
Con el fin de mejorar la actividad antibacteriana de los péptidos, diferentes
investigadores optaron por modificar la molécula sustituyendo aminoácidos de su
estructura. Oñate, Manrique y Patiño, demostraron la relación de la carga de los
péptidos con la actividad antimicrobiana; En su ensayo, se modificó un péptido
neutro, creando dos con cargas catiónicas diferentes (+5 y +9). Estos fueron
evaluados contra Escherichia coli, y Staphylococcus aureus. Los péptidos +5 y +9
mostraron las CMI más bajas en la bacteria Gram-negativa mientras que en las
Gram positivas necesitó de una concentración 20 veces mayor. Esto puede
explicarse debido a que la densidad de carga de la superficie de la membrana
determina la magnitud de la atracción electroestática y la atracción electroestática
a su vez, conduce las moléculas del péptido cargadas positivamente hacía las
membranas lipídicas de las bacterias cargadas negativamente. Sin embargo, el
péptido +9 demostró la mayor actividad antibacteriana para ambos grupos de
bacterias en comparación con el péptido neutro. Por lo tanto, estos factores son
importantes en la determinación de la molécula a investigar, debido a que la
densidad de carga de la superficie de la membrana determina la magnitud de la
quartzcrystal microbalance with dissipation. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29106975 75 Ibid. p. 39
42
atracción electroestática y a su vez, conduce las moléculas del péptido cargadas
positivamente hacía las membranas lipídicas de las bacterias cargadas
negativamente. Identificando un mejor potencial inhibitorio.76
Mecanismo de acción de los péptidos
Los mecanismos de acción de los péptidos son múltiples, dentro de estos se
encuentran las interacciones con la membrana celular, la inhibición de la síntesis
proteica y de ácidos nucleicos, además de presentar funciones
inmunomoduladoras. En la membrana celular es donde se ha descrito con mayor
frecuencia la actividad antimicrobiana, se ha entendido que los PAM catiónicos
interactúan por fuerzas electrostáticas con los fosfolípidos cargados negativamente
en la membrana bacteriana causando la rotura. Hay varios mecanismos propuestos,
los más aceptados son el modelo de "barril de madera" y el "modelo de alfombra".
El modelo de barril-pentagrama se basa en que el péptido presenta regiones
hidrofóbicas que se alinean con las cadenas acíclicas de los lípidos de la membrana,
mientras que las regiones peptídicas hidrófilas forman la superficie interna del canal
del poro. Los ejemplos incluyen el péptido antibiótico meticina del hongo
Trichoderma viride.77 La perforina producida por linfocitos NK y el componente C9
del complemento.78
El modelo de alfombra, se caracteriza por la organización de los péptidos en una
orientación paralela a la superficie de la membrana cubriéndola de manera similar
a una alfombra. Chang y colaboradores en un estudio realizado por impedancia
electroquímica en la superficie de la membrana evaluaron el efecto producido tras
76 OÑATE-GARZÓN, MANRIQUE-MORENO, PATIÑO GONZALEZ, Óp. Cit. p. 32 77 HAK, Y.-I., y SEONG, M.-D. Péptidos antimicrobianos: propiedades, funciones y función en la respuesta
inmune. Nueva York: Nova Science Publishers, Inc. 2013. [En línea] Disponible en:
https://www.amazon.com/Antimicrobial-Peptides-Properties-Functions-Immunology/dp/1622578430 78 The MACPF/CDC family of pore‐forming toxins. [En línea] Disponible en:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2654483/
43
la exposición a péptidos catiónicos antimicrobianos. Cuando se presenta un umbral
crítico de concentración, se disminuye la homogeneidad de la bicapa y la resistencia
de esta, rompiendo la membrana, lo que finalmente lleva a la formación de micelas
o pequeños péptidos y agregados lipídicos.79
En el modelo de poro toroidal los PAM se unen a la bicapa lipídica induciendo la
formación de monocapa, los cuales se van curvando a través del lípido formando
canales, en los cuales se van a unir la parte catiónica a los grupos polares
aniónicos.80 Yang utilizó el DC orientado para evaluar como la melitina forma el poro.
La melitina puede orientarse perpendicularmente o paralela a una bicapa lipídica,
dependiendo de la condición física y la composición de la bicapa. Los poros
transmembranarios se detectaron cuando las hélices se orientaron
perpendicularmente al plano de las bicapas, no cuando las hélices se orientaron
paralelamente.81
Se ha informado recientemente que algunos PAM de insectos ejercen actividad
antimicrobiana a través de diferentes mecanismos que incluyen la desactivación de
la proteína bacteriana y la inducción de la apoptosis en levaduras. En caso de
dirigirse a los componentes citosólicos al ingresar a la célula sin romper la
membrana, los PAM son capaces de inhibir la síntesis de proteínas bacterianas,
como la chaperona molecular DnaK. Los PAM pueden provocar la apoptosis, a
79 ROSADO, Carlos J.; KONDOS, Stephanie; BULL, Tara E.; KUIPER, Michael J.; LAW, Ruby H. P.
BUCKLE, Ashley M. VOSKOBOINIK, Ilia; BIRD, Phillip I.; TRAPANI, Joseph A. WHISSTOCK, James C.;
DUNSTONE, Michelle A. The MACPF/CDC family of pore‐forming toxins. 05 August 2008. [En línea]
Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1462-5822.2008.01191.x 80 CHINGATÉ LÓPEZ, Sandra Milena. Diseño, síntesis y evaluación “in vitro” de análogos de péptidos
antimicrobianos con potencial actividad como compuestos antituberculosos. [En línea] Disponible en:
http://bdigital.unal.edu.co/39576/1/sandramilenachingatelopez.2012.pdf 81 YANG, L.; HARROUN, T A.; WEISS, T M.; DING, L. and HUANG, H W. Barrel-stave model or toroidal
model? A case study on melittin pores. [En línea] Disponible en: https:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1301626/
44
través de la acumulación de especies reactivas de oxígeno intracelular y
mitocondrial.82
En el estudio publicado por Anette Carlsson, se determinó que la alteración en la
estructura y la permeabilidad de la membrana externa de Escherichia coli, se asocia
con una inhibición específica de la síntesis de varias proteínas de la membrana
externa, incluidas OmpC, OmpF, OmpA y LamB. La inhibición se expresa como una
reducción en los niveles de ARNm resultando en un bloqueo en la transcripción de
dichos genes.83
Por otra parte existen otros mecanismos descritos, en el caso de la lactoferrina,
proteína que se encuentra en la leche de varias especies de mamíferos, se ha
determinado su unión al LPS de la pared celular bacteriana provocando un aumento
de la permeabilidad de la membrana llevando a la lisis de las células bacterianas.84
En el trabajo realizado por Chih-Ching Yen, la lactoferrina y sus productos de
degradación (LFcin) han demostrado inhibir el crecimiento de bacterias patógenas
como E. coli, hongos e incluso virus.85 También presenta funciones
inmunomoduladoras, se ha demostrado la capacidad de estimular la fagocitosis de
las células inmunitarias y regular la respuesta inflamatoria con la activación del
82 HAK, Young-Il y MYUNG-DAE, Seong. Antimicrobial Peptides: Properties, Functions and Role in Immune
Response (Immunology and Immune System Disorders) 2013. [En línea] Disponible en:
https://www.amazon.com/Antimicrobial-Peptides-Properties-Functions-Immunology/dp/1622578430 83 CARLSSON, A.; ENGSTRÖM, P.; PALVA, E T.; BENNICH, H. Attacin, an antibacterial protein from
Hyalophora cecropia, inhibits synthesis of outer membrane proteins in Escherichia coli by interfering with omp
gene transcription. [En línea] Disponible en: https://iai.asm.org/content/iai/59/9/3040.full.pdf 84 DRAGO-SERRANO, M.E.; DE LA GARZA-AMAYA, M.; LUNA, J.S.; CAMPOS-RODRÍGUEZ, R.
Lactoferrin-lipopolysaccharide (LPS) binding as key to antibacterial and antiendotoxic effects. [En línea]
Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S156757691100422X?via%3Dihub 85 YEN, CC.; SHEN, CJ.; HSU, WH.; CHANG, YH.; LIN, HT.; CHEN, HL.; CHEN, CM. Lactoferrin: an iron-
binding antimicrobial protein against Escherichia coli infection. Biometals,2011; 24: 585-94 [En línea]
Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s10534-011-9423-8
45
complemento.86 La lactoferrina, puede ejercer su efecto antibacteriano al reducir la
disponibilidad de hierro al patógeno causante.87
Mecanismos de resistencia
La interacción entre péptidos y la membrana bacteriana es necesaria. Por lo tanto,
la resistencia debe involucrar modificaciones bioquímicas en toda la membrana,
incurriendo en costos metabólicos que pueden ser demasiado altos para mantener
durante varias generaciones.88
El mecanismo más importante de resistencia a los PAM en bacterias Gram
negativas consiste en la variación del LPS provocando la reducción en la interacción
con los PAM. Las modificaciones del LPS incluyen cambios en la electronegatividad
y/o hidrofobicidad, afectando a todas las secciones de la molécula.89
Las proteínas bacterianas secretadas, como las proteasas, son los primeros
mecanismos de defensa bacteriana que los PAM encuentran cuando interactúan
con las bacterias. La degradación proteolítica por enzimas extracelulares representa
una forma simple y efectiva de proporcionar resistencia a los microorganismos.90 El
86 KANYSHKOVA, TG.; BUNEVA, VN.; NEVINSKY, GA. Lactoferrin and its biological functions.
Biochemistry(Mosc), 2001; 66: 1-7 [En línea] Disponible en:
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thanatin is independent on multidrug-resistant spectrum of bacteria. Peptides 32:1139-1145. 2011. [En línea]
Disponible en: https://kundoc.com/pdf-the-activity-of-antimicrobial-peptide-s-thanatin-is-independent-on-
multidrug-res.html#blockreader 89 HAK, Young-Il y MYUNG-DAE, Seong. Antimicrobial Peptides: Properties, Functions and Role in Immune
Response (Immunology and Immune System Disorders) 2013. [En línea] Disponible en:
https://www.amazon.com/Antimicrobial-Peptides-Properties-Functions-Immunology/dp/1622578430 90 HWANG-SOO, Joo, CHIH-IUNG, Fu, and MICHAEL, Otto. Bacterial strategies of resistance to
antimicrobial peptides. [En línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4874390/
46
género Staphylococcus, presenta metaloproteasas como aureolisina y SepA, y
endopeptidasas como la proteasa V8, que degradan la catelicidina humana LL-37.91
Las bacterias formadoras de biopelículas presentan mayor resistencia a los PAM
que las bacterias que no forman biopelículas. Se cree que el aumento de la
resistencia se debe en parte a la disminución de la penetración de los PAM a través
de la matriz.92 En el estudio realizado por Wang X, se identificó la presencia del
locus pgaABCD de E. coli, necesario para la biosíntesis y función de un polisacárido
93 responsable de la resistencia a los péptidos catiónicos HBD-3 y LL-37, así como
a la dermicidina aniónica.94
Otra estrategia que ha demostrado la resistencia en bacterias Gram negativas es el
aumento de la rigidez de la membrana externa mediante la adición de cadenas de
acilo al lípido A. La acilación del lípido A a menudo está mediada por la enzima
PagP, que se demostró que promueve la resistencia a varios PAM como C18G,
protegrina, polimixina B, LL-37 y magainina II en S. typhimurium, E. coli, Yersinia.95
Las bacterias pueden eliminar los PAM mediante el uso de bombas de eflujo, por
ejemplo, la expresión de AcrAB-TolC en K. pneumoniae reduce la acción de la
polimixina B así como en las defensinas humanas (HNP-1, HBD-1, 2).96
91 SCHMIDTCHEN, A.; FRICK, IM.; ANDERSSON, E.; TAPPER, H.; BJÖRCK, L. Proteinases of common
pathogenic bacteria degrade and inactivate the antibacterial peptide LL-37. Mol Microbiol. 2002 Oct;
46(1):157-68. [En línea] Disponible en: https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1046/j.1365-
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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0966842X00019132 93 WANG, Xin; PRESTON, James F.; ROMEO, Tony. The pgaABCD locus of Escherichia coli promotes the
synthesis of a polysaccharide adhesin required for biofilm formation. Bacteriol. 2004 May; 186(9):2724-34.
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and MILLER, Samuel I. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides.
Cell. 1998 Oct 16; 95(2):189-98 [En línea] Disponible en: https://core.ac.uk/download/pdf/81105750.pdf 96 HWANG-SOO, Joo, CHIH-IUNG, Fu, and MICHAEL, Op. Cit. 43
47
La presencia de estos mecanismos no está relacionada necesariamente con la
resistencia, pues estos forman parte de las funciones celulares, como lo son las
moléculas encargadas de la formación de una matriz de biopelículas. Por otro lado,
hasta el momento no se han reportado mecanismos asociados a la resistencia de
péptidos Ib, sin embargo, esto no excluye que se puedan presentar.
Actividad antimicrobiana de péptidos sobre Escherichia coli
La actividad antimicrobiana de diferentes péptidos sintéticos, ha sido evaluada
frente a diferentes cepas de E. coli, obteniendo buenos resultados. Como las
investigaciones realizadas por Huertas y colaboradores,97 en dónde evaluaron la
actividad antibacteriana de péptidos análogos de la lactoferricina bovina contra E.
coli ATCC 11775, mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria
y la concentración mínima bactericida, utilizando un ensayo de microdilución en
placa con caldo Mueller – Hinton con 90 µL de péptido (440 µg / ml) el cual fue
diluido en serie (200, 100, 50, 25, 12.5 y 6.2 µg / mL) y se inoculó 10 µL (2×10 6
CFU/mL) a cada pocillo. Dentro de las características más importantes de estos
análogos, es que son péptidos cortos que contienen 25 aminoácidos con una alta
proporción de residuos básicos, poseen una carga neta de +8, y propiedades
anfipáticas. Este estudio muestra que los análogos peptídicos sintéticos de la
lactoferricina bovina exhiben un alto grado de actividad antibacteriana contra E. coli,
obteniendo como mejor resultado una CMI de 6.2 µg / mL y para el péptido sin
modificaciones una CMI > 200 µg / mL. Lo cual propone, una mejor actividad en los
péptidos que presentan modificaciones. Estudios han sugerido que esta actividad
mejorada se debe a que la región N-terminal de la lactoferrina se une al Lípido A,
que corresponde a un fragmento de lipopolisacárido.98 Se ha sugerido que este
97 Molecules. Artículo Synthetic Peptides Derived from Bovine Lactoferricin Exhibit Antimicrobial Activity
against E. coli ATCC 11775, S. maltophilia ATCC 13636 and S. enteritidis ATCC 13076. [En línea] Disponible
en: https://www.mdpi.com/1420-3049/22/3/452/htm 98 FARNAUD, S.; EVANS, R. Lactoferrin a multifunctional protein with antimicrobial properties. Mol.
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https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0161589003001524
48
análogo peptídico interactúa con la membrana plasmática bacteriana a través de
interacciones electrostáticas entre las moléculas cargadas negativamente de la
superficie bacteriana y los residuos cargados positivamente del péptido. Luego, los
residuos hidrófobos, como el triptófano, interactúan con la bicapa lipídica,
induciendo la alteración de la membrana, lo que conduce a la inestabilidad y
permeabilidad de la membrana y finalmente, la lisis celular.99
En otro estudio, Sánchez y colaboradores, evaluaron la actividad antibacteriana del
péptido RP13 frente a E. coli ATCC 32218, el cual fue preparado modificando la
secuencia original de aminoácidos presente en el péptido RP11, invirtiendo la
posición de los aminoácidos lisina y tirosina.100 La actividad antimicrobiana del
péptido se evaluó mediante la determinación de la CMI empleando diferentes
concentraciones del péptido (100, 80, 60, 50, 25 y 12,5 μg /mL). Con los resultados
lograron demostrar un efecto inhibitorio del RP13 sobre el crecimiento bacteriano,
obteniendo una CMI de 60 μg/mL, en dónde se comparó con el diseño del péptido
RP11, el cual no mostró ninguna actividad antibacteriana contra E. coli. Esto
propone un probable impacto en el cambio estructural físico-químico de la molécula
que le permite interactuar con la bacteria, ocasionando su poder antibacteriano.101
Sin embargo, se esperaban CMI más bajas, por lo que proponen una posible
degradación proteolítica del péptido, lo que lleva a la pérdida de la actividad
antimicrobiana y por ende se refleja un valor alto para la CMI.102
99 SINHA, M.; KAUSHIK, S.; KAUR, P.; SHARMA, S.; SINGH, T. Antimicrobial Lactoferrin Peptides: The
Hidden Players in the Protective Function of a Multifunctional Protein. Int. J. Pep. 2013, 2013, 1–12. [En línea]
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HERNÁNDEZ, Beatriz; VÁZQUEZ, Alfredo. In vitro determination of the short-chain synthetic peptide RP13
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antimicrobial activities, cytotoxicity and mechanistic studies. Chem Med Chem 2010; 5: 86-95. [En línea]
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Antimicrob Agents Chemother 2005; 49: 269-75. [En línea] Disponible en:
https://aac.asm.org/content/49/1/269
49
Otros estudios se han basado en evaluar el mecanismo de acción de los péptidos
antimicrobianos para lograr su actividad inhibitoria sobre E. coli. Choi, Yang y
Weisshaar, determinaron la CMI del péptido humano catelicidina LL-37 sobre cepas
de E. coli MG1655, utilizando el método de microdilución en caldo en condiciones
de fermentación aeróbica y anaeróbica y tomaron como CMI la concentración más
baja para la cual no se percibió crecimiento (<0.05 Optical Dispersion (OD)) después
de 6 h.103 En este ensayo, observaron que la CMI en condiciones de fermentación
anaeróbica era 4 veces mayor para LL-37 que en condiciones aeróbicas,
observando que el paso inicial en el ataque es la unión del LL-37 catiónico a la capa
de lipopolisacáridos aniónicos (LPS), seguido de la permeabilización de la
membrana externa y una vez internalizado el péptido, encontraron eventos de estrés
oxidativo los cuales pueden contribuir de manera indirecta en la acción
antimicrobiana del péptido.104
Péptido Ib-AMP
Los péptidos son obtenidos a partir de la síntesis en fase sólida, técnica desarrollada
por Bruce Merrifield en 1963. Los péptidos pertenecientes a la familia Ib-AMP son
derivados de Impatiens balsamina; poseen dos características estructurales
importantes, conservan cuatro residuos de Cisteína (Cys) que forman puentes
disulfuro y poseen varios residuos de Arginina (Arg) en su secuencia de
aminoácidos por lo que son péptidos policatiónicos.105
103 CHOI, Heejun; YANG, Zhilin; WEISSHAAR, James C. Oxidative stress induced in E. coli by the human
antimicrobial peptide LL-37. [En línea] Disponible en:
https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006481 104 STARR CG, HE J, WIMLEY WC. Las interacciones de la célula huésped son una barrera importante para
la utilidad clínica de los antibióticos peptídicos. ACS Chem Biol. 2016; 11 (12): 3391–9. pmid: 27797468. [En
línea] Disponible en: http://www.scielo.org.co/pdf/cesm/v32n3/0120-8705-cesm-32-03-235.pdf 105 FLÓREZ CASTILLO, Óp. Cit. p. 32
50
Estas moléculas tienen la ventaja de ser específicas para determinados
microorganismos, lo que ha aumentado el interés como posibles agentes
antimicrobianos; por ende, se han realizado estudios de su estructura y actividad
antimicrobiana.
Thevissen y colaboradores en 2009, analizaron el efecto de la eliminación de los
enlaces disulfuro sobre la actividad antifúngica del péptido Ib-AMP4 sobre Fusarium
culmorum. Para ello reemplazaron los residuos de Cys por residuos de ácido alfa-
aminobutírico y adicionaron residuos de Arg. Los péptidos obtenidos con estas
modificaciones mantuvieron la actividad antifúngica contra el microorganismo
estudiado. Por otro lado, al eliminar los enlaces disulfuro y adicionarle un residuo de
Trp en la posición 18 y uno de Arg en la posición 20 se presentó un leve aumento
de la actividad antifúngica.
Flórez, generó 6 análogos del péptido Ib – AMP4 mediante la sustitución de ciertos
residuos por arginina y triptófano, adicionalmente se eliminaron los enlaces disulfuro
reemplazando los residuos de cisteína por metionina, en estos evaluó la actividad
antibacteriana frente a E. coli K-12 la cual fue determinada empleando medio de
Mueller – Hinton y el método de macrodilución en punto fijo en presencia de
diferentes concentraciones de cada análogo, obteniéndose para todos, a excepción
de Ib – M4, valores de CMI menores de 50μM, esto indica que las modificaciones
realizadas en la secuencia del péptido mejoran la actividad antibacteriana.106
106 Ibid. p. 26
51
Actualmente, los reportes de investigaciones en péptidos Ib-AMP es limitada, lo que
genera un interés por realizar estudios relacionados a su actividad antimicrobiana
principalmente frente a patógenos como Escherichia coli.
52
6. METODOLOGÍA
6.1. TIPO DE ESTUDIO
El estudio realizado es de tipo experimental in vitro.
6.2 HIPÓTESIS
El péptido presenta potencial inhibitorio sobre los patotipos y comensales de
Escherichia coli, demostrando su utilidad como agente con potencial terapéutico.
6.3 MATERIALES
6.3.1 Cepas bacterianas. Se emplearon 14 cepas de Escherichia coli, incluyendo
11 cepas de los patotipos y 3 cepas comensales, obtenidas del cepario del
Laboratorio de Investigaciones Biológicas y Biotecnológicas, las cuales fueron
aisladas y caracterizadas en un estudio anterior. Las cepas tenían hasta 3 pases en
cultivo previo a la experimentación.
6.3.2 Péptido. Se empleó un péptido sintético resuspendido y alicuotado a una
concentración de 200 µM para cada ensayo. Fue suministrado por el grupo de
investigación de ciencias básicas de la universidad de Santander.
53
6.4 PROCEDIMIENTOS
6.4.1 Reconstitución de la cepa. Las cepas utilizadas en el estudio se encontraban
almacenadas a -80°C, para la resuspensión se cultivaron en medio LB (Luria
Bertani) con incubación a 37°C durante 18-24horas. Se incluyeron tubos sin inóculo
bacteriano como control de crecimiento.
6.4.2 Ensayos de inhibición. La inhibición en las cepas de E. coli incluidas se
estudió desde dos perspectivas: i) la capacidad inhibitoria del compuesto que se
midió mediante la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI); y ii)
la capacidad bactericida del péptido evaluada mediante la concentración bactericida
mínima (CBM).
6.4.2.1 Concentración mínima inhibitoria: La inhibición microbiana del péptido
sintético se evaluó mediante la determinación de la CMI, la cual se define cómo la
concentración más baja en la cual el péptido impidió el crecimiento del
microorganismo.
Los ensayos se llevaron a cabo teniendo en cuenta los estándares aprobados por
The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en la guía M07-A9: Methods
for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically.107
Se utilizó un inóculo de 5 x 105 UFC/mL de E. coli y se incubó 18 horas en presencia
del péptido sintético a concentraciones de 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1, 1.5 y 0.7 µM
Pasado este tiempo, la lectura de la CMI se interpretó como la concentración más
baja donde no se observó crecimiento de la bacteria, representado por la ausencia
107 CLSI.2012. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically;
Approved Standard—Ninth Edition
54
de turbidez en el pozo. Esta lectura se confirmó cuantitativamente por
espectrofotometría a 505 nm. En los ensayos se utilizó inóculo bacteriano sin
péptido (control positivo), pozos con caldo Mueller Hilton sin inóculo (control
negativo) y control de inhibición con estreptomicina cómo antibiótico de referencia.
Los ensayos se realizaron por triplicado.
6.4.2.2 Concentración Bactericida Mínima (CBM): Posterior al ensayo de
inhibición, se determinó la actividad bactericida del péptido sintético sobre cada una
de las cepas. Esta se define cómo la concentración más baja en la cual el péptido
elimina más del 99% del microorganismo presente en la dilución, entendido como
un crecimiento bacteriano menor a 10 colonias.
La determinación de la CBM se consideró a partir de los resultados obtenidos en la
CMI; para esto, se utilizó el sobrenadante de aquellas concentraciones en las cuales
no se observó crecimiento bacteriano (turbidez).
De este sobrenadante se tomaron 100µL, los cuales fueron sembrados en Agar
sangre usando la técnica de siembra masiva, y posteriormente se incubaron a 37°C
durante 24 horas.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación se observó el crecimiento
correspondiente del microorganismo, y la CBM se interpretó como la menor
concentración que mostró un crecimiento ≤10 colonias en el agar sembrado.
55
6.5 ANÁLISIS DE LOS DATOS
Los datos de los ensayos fueron recopilados y consolidados en hojas de cálculo
para su posterior análisis e interpretación en el programa Microsoft Excel, donde se
generaron tablas y gráficas atendiendo a las variables de cada ensayo. Se
relacionaron las Concentraciones Mínimas Inhibitorias del péptido y la
estreptomicina como antibiótico de referencia. También se analizó la variación de
los datos en relación a la concentración mínima inhibitoria del péptido encontrado
en cada uno de los patotipos y comensales. Asimismo, se estableció la actividad
antibacteriana del péptido comparando la concentración mínima inhibitoria y la
concentración bactericida mínima.
Las determinaciones y comparaciones en este trabajo no incluyeron análisis de
significancia estadística.
6.6 ASPECTOS ÉTICOS
El presente estudio no realizó la vinculación de sujetos, ni se colectaron de muestras
clínicas o biológicas. En este sentido, el presente trabajo se consideró como una
investigación de bajo riesgo para la salud humana, conforme al artículo 11 de la
resolución 008430 de 1993. Dado que el estudio no estuvo dirigido a pruebas de
medicamentos en humanos, no se considera la resolución 2378 de 2008, ni afines.
El Laboratorio de Investigaciones Biológicas y Biotecnológicas - LIBB y el
Laboratorio de Biotecnología, de la Universidad, donde se manipularon los
microorganismos está dotado con la infraestructura física requerida; estos incluyen
56
separación y especialidad de áreas, y equipos disponibles de acuerdo a los
requerimientos de seguridad biológica, según el capítulo I, título IV, resolución
008430 de 1993.
La disposición final de los residuos se realizó conforme a la reglamentación
establecida por la Universidad.
57
7. RESULTADOS
7.1. ENSAYO DE INHIBICIÓN
Tabla 1. Ensayo de inhibición del péptido en cepas de E. coli evaluadas
CMI*(µM)
Cepas Péptido Estreptomicina
Escherichia coli Enteroagregativa (EAEC) 1,5 6,25
Escherichia coli Enteroagregativa (EAEC) 0,7 6,25
Escherichia coli Enterotoxigénica (ETEC) 3,1 6,25
Escherichia coli Enterotoxigénica (ETEC) 12,5 6,25
Escherichia coli Enteropatógena (EPEC) 3,1 6,25
Escherichia coli Enteropatógena (EPEC) 1,5 100
Escherichia coli de Adherencia Difusa (DAEC) 6,25 200
Escherichia coli de Adherencia Difusa (DAEC) 3,1 50
Escherichia coli Enteroinvasiva (EIEC) 25 200
Escherichia coli productor de Toxina Shiga (STEC) 12,5 50
Escherichia coli productor de Toxina Shiga (STEC) 6,25 50
Comensal 1,5 200
Comensal 1,5 3,1
Comensal 3,1 400
*Concentración Mínima Inhibitoria
En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos en la determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del péptido en el cual las concentraciones
fueron inferiores a 12,5 µM en contraste a la estreptomicina donde se observaron
concentraciones mayores, de hasta 200 µM frente a los diferentes patotipos de
58
E.coli. En la mayoría de los patotipos el péptido presentó una CMI menor en
comparación a la estreptomicina, con excepción de una cepa del patotipo ETEC
donde la CMI del péptido fue mayor. En general, en más del 50% de las cepas la
CMI de la estreptomicina fue tres veces mayor a la del péptido (Gráfica 1).
Gráfica 1. Ensayo de Inhibición del péptido en cepas de E. coli evaluadas
Los resultados obtenidos no mostraron ninguna tendencia diferencial entre los
patotipos, como se puede observar en la Gráfica 2. Se encontraron valores altos y
bajos de CMI entre las cepas del mismo patotipo y al ser comparados con los
demás, la diferencia tuvo valores del doble o más. Estos resultados proponen que
la actividad del péptido es distinta en cada cepa, y no se asocia directamente al
1,5 0,7 3,1 12,5 3,1 1,5 6,25 3,1
2512,5 6,25 1,5 1,5 3,16,25 6,25
6,25
6,256,25
100
200
50
200
50 50
200
3,1
400
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
CM
I (µ
m)
Péptido Estreptomicina
59
patotipo. No obstante, en las cepas comensales la CMI fue semejante, y tendieron
a ser menores que en las cepas patógenas.
Gráfica 2. Concentración mínima inhibitoria por patotipos de Escherichia coli
7.2 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA: CMI vs CBM
La actividad antimicrobiana del péptido fue el resultado de la evaluación de la
concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración bactericida mínima
(CBM). Al analizar los resultados obtenidos, se encontró que la actividad descrita
en la CBM fue bactericida en la mayoría de las cepas. En dos cepas, 1 STEC y 1
comensal, la CMI y la CMB coincidieron (6,25 µM y 3,1 µM respectivamente). Solo
en una cepa del estudio no se pudo definir la CBM dado que se encontró crecimiento
de bacterias hasta la última concentración evaluada (Tabla 2).
1,53,1 3,1
6,25
25
12,5
1,50,7
12,5
1,53,1
6,25
1,53,1
0
5
10
15
20
25
30
EAEC ETEC EPEC DAEC EIEC STEC Comensal
CM
I(µ
M)
Patotipos
Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3
60
Tabla 2. Actividad Antimicrobiana CMI vs CMB
Péptido
Cepas CMI*(µM) CMB**(µM)
EAEC 1,5 25
EAEC 0,7 1,5
ETEC 3,1 12,5
ETEC 12,5 >100
EPEC 3,1 6,25
EPEC 1,5 3,1
DAEC 6,25 12,5
DAEC 3,1 6,25
EIEC 25 50
STEC 12,5 25
STEC 6,25 6,25
Comensal 1,5 3,1
Comensal 1,5 25
Comensal 3,1 3,1
*Concentración Mínima Inhibitoria **Concentración Mínima Bactericida
61
8. DISCUSIÓN
En los últimos años, se han buscado nuevas alternativas de tratamiento para las
infecciones causadas en el ser humano por diferentes microorganismos, debido a
la resistencia que se ha ido generando frente a los antibióticos. En estudios
realizados, los péptidos antimicrobianos (PAM) han sido propuestos como
estrategias prometedoras para la generación de nuevos agentes antimicrobianos,
teniendo en cuenta que son menos propensos para el desarrollo de resistencia por
parte de los patógenos.
Al estudiar la actividad antibacteriana del péptido frente a los diferentes patotipos
de Escherichia coli, se encontró que los valores de la CMI fueron menores en
comparación a los de la estreptomicina, la cual fue empleada como antibiótico
control de inhibición bacteriana (Tabla 1). Estos resultados son similares a los
hallados por Fan y colaboradores quienes demostraron que el péptido Ib-AMP4
inhibe en menor tiempo y con mayor efectividad cepas de Staphylococcus aureus
en comparación a la vancomicina usado como antibiótico de referencia.108
La literatura muestra que con frecuencia los PAM tienen actividad inhibitoria contra
diferentes microorganismos. Sin embargo, los resultados obtenidos en el presente
trabajo proponen que para poder definir algún efecto antimicrobiano en E. coli, es
necesario determinar si esta evaluación se está realizando frente a cepas
comensales o cepas patógenas; precisamente este trabajo incluyó ambos tipos de
cepas (incluyendo todos los patotipos de E. coli) ya caracterizadas en estudios
anteriores, y en todas ellas se observó que el péptido tuvo inhibición del crecimiento.
108 FAN, KORYTOWSKI, MAKKY, TANAKA, WINK, Op. Cit. p. 32
62
Con las tres cepas comensales empleadas el valor de la CMI fue similar, mostrando
concentraciones de 1.5, 1.5 y 3.1 µM, respectivamente, tal como se puede observar
en la Gráfica 2; la baja concentración inhibitoria, y la similitud en los resultados
puede asociarse por la carencia de mecanismos de patogenicidad que las cepas
producen, puesto que las cepas comensales no provocan ningún efecto negativo en
el individuo y son considerados microorganismos que no expresan factores de
virulencia. Al comparar los resultados del presente trabajo con estudios en dónde
se empleó una metodología similar para la determinación de la CMI de los péptidos,
se encontró que la molécula empleada aquí mostró un mejor desempeño de la CMI
en las cepas comensales. Ulvatne y colaboradores,109 evaluaron la actividad
antibacteriana en dos cepas de E. coli (ATCC 25922 y E. coli UC 6782) empleando
la lactoferricina B, un péptido de 25 residuos derivado de la parte N-terminal de la
lactoferrina bovina, encontrando una CMI de 30 y 10 μg/mL respectivamente; los
autores proponían que interactúa con las membranas cargadas negativamente,
provocando despolarización de la membrana citoplásmica en bacterias que son
susceptibles.110 Dentro de este mismo trabajo, también se evaluó el péptido
cecropina P1, encontrando una CMI de 3 μg/mL en cepas de E coli ATCC 25922.
Otro estudio fue el de Romo y colaboradores, en dónde evaluaron las actividades
antimicrobianas de los péptidos LfB6 y C6-LfB6 contra una cepa de E. coli ATCC
25922, obteniendo una CMI de 150 μg/mL en cada uno de los péptidos.111
109 ULVATNE, Hilde; SAMUELSEN, Ørjan; HAUKLAND, Hanne H. KRÄMER, Manuela VORLAND, Lars
H. Lactoferricin B inhibits bacterial macromolecular synthesis in Escherichia coli and Bacillus subtilis. August
2004, Pages 377–384. [En línea] Disponible en: https://academic.oup.com/femsle/article/237/2/377/530615 110 VORLAND, Lars H.; OSBAKK, Svein A.; PERSTØLEN, Torunn; ULVATNE, Hilde; REKDAL, Øystein;
SVENDSEN, John S. GUTTEBERG, Tore J. Interference of the Antimicrobial Peptide Lactoferricin B with
the Action of Various Antibiotics against Escherichia coli and Staphylococcus aureus.[En línea] Disponible en:
https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/003655499750006236 111 ROMO, Tod D.; BRADNEY, Laura A.; GREATHOUSE, Denise V.; GROSSFIELD, Alan. Membrane
binding of an acyl-lactoferricin B antimicrobial peptide from solid-state NMR experiments and molecular
dynamics simulations. August 2011, Pages 2019-2030 [En línea] Disponible en:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0005273611001039
63
El análisis de la actividad antibacteriana del péptido frente a cada uno de los
patotipos no mostró un mismo patrón en las concentraciones inhibitorias, lo cual
podría sugerir que los patotipos presentan diferencias estructurales o de expresión
genética suficientes para que la actividad del péptido antimicrobiano sea diferencial;
en este sentido su fenotipo se asociaría a una presentación clínica en el paciente, y
no necesariamente se esperarían resultados similares en los ensayos de CMI. En
las cepas estudiadas se logró observar que la CMI en algunos patotipos fue distinta;
la CMI más baja se presentó en las cepas del patotipo de EAEC con CMI de 0,7µM
y 1,5µM para las dos cepas empleadas en dicho patotipo y la más alta se dio en el
patotipo de EIEC con CMI de 25µM. Además, dentro del mismo patotipo se vieron
variaciones en algunos casos de más del doble de diferencia, como el observado
en las cepas de ETEC, donde incluso la variación fue de más del triple entre cada
una de ellas, con CMI de 3,1µM para la cepa 1 y 12,5µM para la cepa 2. Estos
resultados se pueden observar en la Gráfica 2.
Trabajos similares en la literatura son limitados, aunque se encontraron algunos que
están asociados a cepas obtenidas de aislados clínicos, sin embargo, en estas la
actividad inhibitoria no se caracteriza por patotipos; en ese sentido se podría
considerar que la conclusión es limitada, a pesar de que estos resultados también
describen una inhibición del péptido sobre la cepa. Ulvatne y colaboradores
recolectaron 20 aislamientos clínicos de E. coli y evaluaron la actividad
antibacteriana de la lactoferricina B, la cual mostró una CMI50 de 20 mg/L.112
112 ULVATNE, SAMUELSEN, HAUKLAND, KRÄMER, VORLAND, Op. Cit. p. 60
64
Ebbensgaard y colaboradores evaluaron la actividad antimicrobiana de 8 péptidos
diferentes en 8 mutantes provenientes de un aislado clínico de Escherichia coli,
observando una variación de la CMI de 1 a 16 μg/mL.113 A partir de estas
investigaciones, podemos observar que en estos aislados clínicos también se
presentó una variación en cada una de las cepas, es decir, no mostraron un mismo
patrón en las concentraciones mínimas inhibitorias.
La actividad antibacteriana del péptido se evaluó mediante la CMI y la CBM como
medidas que estudian los efectos de un antimicrobiano en un organismo. Esto
proporciona información relevante para predecir posibles acciones terapéuticas.114
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se considera como la concentración más
baja, expresada en µM capaz de inhibir el crecimiento de un microorganismo
teniendo en cuenta condiciones específicas in vitro en un período de tiempo
determinado.115 Por otra parte, la Concentración Bactericida Mínima (CBM) se
define como la concentración más baja de un antimicrobiano expresada en µM, que
en condiciones in vitro producen la reducción en un 99% del número de
microorganismos presentes en un medio de cultivo inoculado determinado en
periodo de tiempo. La reducción se entiende a partir del número de unidades
formadoras de colonias (UFC) vivas.116
113 EBBENSGAARD, Anna; MORDHORST, Hanne; TOFT OVERGAARD, Michael; NIELSEN, Claus
Gyrup; MØLLER AARESTRUP, Frank; and HANSEN, Egon Bech. Comparative Evaluation of the
Antimicrobial Activity of Different Antimicrobial Peptides against a Range of Pathogenic Bacteria. 2015 [En
línea] Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4684357/ 114 ALVO V., Andrés; TÉLLEZ G.; Valentina; SEDANO, Cecilia; FICA C., Alberto. [En línea] Disponible en:
https://scielo.conicyt.cl/pdf/orl/v76n1/art19.pdf 115 SILLEY, P. Susceptibility testing methods, resistance and breakpoints: what do these terms really mean?.
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https://www.unitheque.com/UploadFile/DocumentPDF/L/SUOK-9789290448754.pdf 116 DE LA FUENTE-SALCIDO, Norma Margarita; VILLARREAL-PRIETO, Jesús Ma.; DÍAZ LEÓN, Miguel
Ángel; GARCÍA PÉREZ, Ada Patricia. Evaluación de la actividad de los agentes antimicrobianos ante el
desafío de la resistencia bacteriana. [En línea] Disponible en:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-01952015000200007#B23
65
Para el análisis de estos datos es importante mencionar conceptos de
farmacocinética y farmacodinamia; estas son medidas que se deben tener en
cuenta en la elección de un antimicrobiano para llevar a cabo una terapia eficaz y
un uso racional del compuesto. En la farmacocinética se evalúa desde que el
medicamento llega hasta la localización en la que ejerce sus efectos, y en la
farmacodinámia se describe la relación que se establece in vitro entre el compuesto
antimicrobiano y la bacteria.117
Dentro de los parámetros farmacodinámicos se encuentran la CMI y la CBM los
cuales se estudiaron en el presente trabajo. De forma tradicional se ha considerado
la CMI como el parámetro farmacodinámico más relevante en el momento de definir
el potencial de un antibiótico frente a una bacteria.118 Esta magnitud se encuentra
estrechamente relacionada con la CBM. Habitualmente, la CBM es la misma o como
máximo una o dos diluciones mayores que la CMI.119
En el presente trabajo, el resultado de la relación entre la CMI y CBM del péptido se
observa en la Tabla 2. La CMI tuvo valores entre 0,7 y 12,5 µM, mientras que en la
CBM se presentó en un rango más amplio, a partir de concentraciones de 1,5 hasta
más de 100 µM. En general, en la mayoría de las cepas las CBM fueron más altas
que la CMI, cabe destacar que otros autores amplían este rango proponiendo hasta
cuatro veces la CMI.120 Partiendo de esta información sólo tres de las cepas
estudiadas, la CBM fue cuatro veces mayor. Aun así, en la mayoría las cepas a
excepción de una, se evidenció el efecto bactericida. Teniendo en cuenta la revisión
117 OÑATE-GARZÓN, MANRIQUE-MORENO, PATIÑO GONZALEZ, Óp. Cit. p. 32 118 PARRA-RUIZ; Jorge; HERNÁNDEZ-QUERO, José. Parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos de
las fluoroquinolonas respiratorias. Guía para la selección de la fluoroquinolona más apropiada. [En línea]
Disponible en: http://seq.es/seq/0214-3429/25/4/parra.pdf 119 OÑATE-GARZÓN, MANRIQUE-MORENO, PATIÑO GONZALEZ, Óp. Cit. p. 32 120 MÉNDEZ, Emilde. Actividad bacteriostática y bactericida de antibióticos betalactámicos y glucopéptidos
frente a cepas de Staphylococcus aureus de importancia clínica. Caracterización genotípica de aislamientos
tolerantes. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas. 2012
[En línea] Disponible en: http://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8080/tesis/handle/11185/449
66
en literatura en correlación con los resultados se demuestra la actividad bactericida
del péptido al cual se le atribuye la capacidad que tiene este para inhibir los patotipos
de E. coli y las cepas comensales.
La CBM, permitió evaluar la actividad bactericida del compuesto. Como se mostró
en la tabla de resultados la mayoría de cepas son bactericidas, exceptuando la cepa
ETEC con CBM>100 µM la cual presentó actividad bacteriostática.
Este comportamiento se presentó en el trabajo de Flórez, en el cual se evaluó la
CMI y la CBM en una cepa comensal de Escherichia coli K12, con el péptido Ib-
AMP4, los valores de CMI y CBM fueron superiores a 100 µM, lo cual indica una
mejor actividad del péptido análogo del presente trabajo. Flórez además demostró
que el péptido análogo Ib-M6, tiene buena actividad antimicrobiana. Esta actividad
se explica a partir de las modificaciones estructurales que surgen al reemplazar un
residuo de Cisteína (Cys) por Triptófano (Trp), permitiendo la inserción del péptido
en la región interfacial de la membrana lipídica.121 Los datos obtenidos en CMI50 y
CMB del péptido análogo fueron 1 µM y 5 µM respectivamente. Precisamente el
análogo Ib-M6 fue el suministrado para el desarrollo del presente trabajo, debido al
gran potencial observado en el estudio desarrollado previamente.
Fengjiao Hu y colaboradores en su trabajo aislaron los péptidos antimicrobianos de
hemoglobina de pollo, junto a esto se evaluó la actividad antimicrobiana utilizando
CMI, ensayos de inhibición dependientes del tiempo, ensayos bactericidas cómo la
CBM y ensayo bactericida dependiente del tiempo, utilizando cepas estándar y
cepas multirresistentes. La CMI tuvo valores entre 1,56 μg/mL hasta 6, 25 μg/mL,
mientras tanto en la CBM la mayoría de las bacterias fueron eliminadas a
concentraciones que oscilaron entre 5 μg/mL y 80 μg/mL. Sin embargo, siete cepas
121 FLÓREZ CASTILLO, Óp. Cit. p. 31
67
no mostraron un efecto bactericida pues no eliminaron los microorganismos a la
concentración máxima evaluada en este trabajo la cual fue de 160 μg/mL.122
Esto permitió concluir que tanto los resultados de los ensayos de inhibición como
los ensayos de actividad bactericida permitieron demostrar que el péptido era capaz
de tener un buen potencial antimicrobiano, debido a las bajas concentraciones de
CMI obtenidas y por el efecto bactericida que tiene sobre las cepas, lo que implica
una mayor utilidad en el tratamiento de agentes infecciosos.
Finalmente, no se encuentra información suficiente que permita interpretar la CMI o
los puntos de corte para péptidos cómo el Ib. Todo esto lleva a plantear la necesidad
de realizar estudios correlacionando todos los parámetros farmacodinámicos para
establecer puntos de corte en péptidos antimicrobianos, es decir, medidas
estandarizadas que permitan la interpretación de la sensibilidad al péptido dado que
una sola medición no permite concluir el efecto final de un compuesto como
potencial terapéutico.
122 FENGJIAO, Hu; QIAOXING, Wu; SHUANG, Song, RUIPING, She, YUE, Zhao; YIFEI, Yang; MEIKUN,
Zhang; FANG, Du; MAJID, Hussain Soomro; and RUIHAN, Shi. Antimicrobial activity and safety evaluation
of peptides isolated from the hemoglobin of chickens. [En línea] Disponible
en:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5139128/
68
9. CONCLUSIONES
Se demostró el potencial inhibitorio del péptido análogo del Ib-AMP4 sobre los
patotipos de Escherichia coli y comensales, con valores de CMI entre 0,7 y 12,5 µM.
Esta medida se complementó con la CBM, cuyo propósito fue establecer el efecto
bactericida o bacteriostático; en la mayoría de cepas la acción fue bactericida,
excepto la cepa ETEC cuya CBM tuvo valores mayores a 100 µM por lo que fue
considerada bacteriostática.
Los resultados de la CMI y CBM mostraron que el péptido posee actividad
antimicrobiana tanto en cepas comensales, como en los patotipos incluidos. Se
esperaría que la actividad antibacteriana fuese mayor en las cepas comensales
debido a la posible ausencia de factores de virulencia o genes que dificulten la
actividad de la molécula antimicrobiana; Claramente, los resultados del presente
trabajo tuvieron este comportamiento, pues se obtuvieron concentraciones bajas de
1,5, 1,5 y 3,1µM en las 3 cepas comensales empleadas, y estas en general, fueron
menores que las encontradas en los patotipos.
Los resultados demostraron que la actividad antimicrobiana fue variable en cada
una de las cepas; en cepas del mismo patotipo, la CMI presentó diferencias del
doble o más entre cada una de ellas.
En general, el presente trabajo propone que en próximos estudios deberían incluirse
un panel de diferentes cepas que incluyan todos los patotipos. Esta afirmación se
fundamenta porque: primero, la concentración inhibitoria de las patógenas parece
ser muy distinta que las comensales y en ese sentido, se le da un enfoque diferente
al compuesto evaluado; y segundo, porque cada cepa tiene comportamientos
diferentes y por ello se hace necesario evaluar un número representativo de
diferentes patotipos para llegar a una conclusión certera.
69
10. RECOMENDACIONES
Los resultados en este trabajo proponen que para poder definir algún efecto
antimicrobiano en Escherichia coli, se deberían incluir cepas de diferentes patotipos
con un mayor número de cepas.
Deben realizarse futuros estudios donde se puedan establecer puntos de corte en
la evaluación de la actividad antimicrobiana de los péptidos debido a que en la
literatura no se encuentra un estándar o rango de concentraciones que se
consideren óptimas en la evaluación de moléculas antimicrobianas in vitro.
Se recomienda complementar el estudio de la actividad antimicrobiana a partir de
otros parámetros farmacodinámicos, que incluyan, curvas de cinética de muerte,
entre otras. Además para obtener un resultado certero debe existir la relación con
las medidas farmacocinéticas. Derivando variables a considerar como la Cmáx
sobre la MIC o el tiempo durante el cual el fármaco permanece por encima de esta
MIC (T > MIC) también expresado en porcentaje de tiempo con relación al intervalo
de administración. Estos podrán dar una mejor dimensión del potencial terapéutico
de los péptidos cómo sustancias prometedoras para enfrentar el fenómeno de
farmacorresistencia.
70
BIBLIOGRAFÍA
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