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Actividad anti-gérmenes in vitro de extractos etanólicos de propóleos

obtenido de abejas (Apis mellifera) en tres áreas geográficas de Colombia

Cesar Augusto Talero Urrego

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Bogotá DC, Colombia

2014

Actividad anti-gérmenes in vitro de extractos etanólicos de propóleos

obtenido de abejas (Apis mellifera) en tres áreas geográficas de Colombia

Cesar Augusto Talero Urrego

Tesis de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de

Magíster en Producción Animal

Directora

M. Sc. Judith Figueroa Ramírez

Línea de Investigación:

Microbiología y Epidemiología

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia

Bogotá DC, Colombia

2014

Dedico este documento de investigación a mi

directora de tesis la Dra. Judith Figueroa.

Agradecimientos

Al Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia en el marco del Proyecto

Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y propóleos mediante indicadores

microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N° 2007C3476 111-5832007” y a la

Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, por cofinanciar esta investigación. A las

asociaciones de apicultores (Asoapiboy, Asoapicom, Asoapis) por el aporte de su trabajo

con las abejas. Al Grupo de Investigación AYNI Ciencia y Tecnología Apícola al

Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. A

Victor Solarte por su invaluable apoyo y a todas aquellas personas que de alguna

manera me brindaron su respaldo, colaboración y orientación.

Resumen y Abstract IX

Resumen

Con el objetivo de cualificar la actividad biológica in vitro de propóleos de abejas Apis

mellifera, se buscó correlacionar el origen geográfico y la actividad antimicrobiana, como

un aporte para la denominación de origen del producto apícola. Se estableció el

comportamiento del propóleo en cuanto a su capacidad antibacteriana frente a

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichiae coli, Klebsiella

pneumoniae y Salmonella entérica considerando la Concentración Mínima Inhibitoria

(CMI). Se determinó si los propóleos de las diferentes regiones presentan principios

activos antifungicos en el crecimiento de Trichophyton rubrum. Se valoró si los propóleos

colombianos presentan actividad antiprotozoaria asumiendo como modelo Giardia

lamblia. Se estandarizó una técnica para establecer el potencial antiviral del propóleo in

vitro utilizando el modelo del bacteriófago Lambda. Para las diferentes pruebas de

laboratorio se colectaron varias muestras de propóleo de distintos orígenes geográficos.

Los propóleos llevados a extractos etanólicos con el empleo del disolvente etanol al 70%

y 96% presentaron actividad frente a todas las cepas bacteriana en concentraciones de

3,2 a 0,1 mg/ml, con especial actividad frente a Klebsiella y B. subtilis. Los propóleos

colombianos presentan actividad fungistática y fungicida de acuerdo a las

concentraciones evaluadas y para los orígenes geográficos en estudio. La técnica in vitro

con el fago Lambda presentada en esta investigación es útil para determinar la actividad

antiviral de los extractos etanólicos de propóleos gracias a ser una prueba sencilla,

rápida, económica y sensible.

Palabras clave: Apis mellifera, Extracto Etanólico de Propóleo (EEP), actividad

biológica

X Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones de

Colombia como aporte para la denominación de origen

Abstract

In order to qualify biological activity in vitro of Apis mellifera’s propolis, were correlated

the geographical origin and antimicrobial activity, as a contribution to the denomination of

origin of beekeeping. Propolis performance was established in the antibacterial ability

against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Escherichiae coli,

Klebsiella pneumoniae and Salmonella enteric, considering the Minimum Inhibitory

Concentration (MIC). It was determined whether propolis in different regions had

antifungal actives in the growth of T. rubrum. We evaluated whether the Colombian

propolis have antiprotozoal activity taking Giardia lamblia as a model. It was standardized

a technique for establishing the antiviral potential of propolis in vitro using the

bacteriophage Lambda as a model. Were collected several samples of propolis from

different geographic origins for the laboratory tests. Propolis ethanol extracts with use of

70% and 96% ethanol solvent showed activity against all the bacterial strains in

concentrations of 3.2 to 0.1 mg/ml, with particular activity against Klebsiella and B.

subtilis. Colombian propolises have fungistatic and fungicidal activity according to the

concentrations and studied geographic origins tested. The technique in vitro with

bacteriophage Lambda presented in this research is useful to determine the antiviral

activity of the ethanolic extracts of propolis due to be a simple, rapid, economical and

sensitive test.

Keywords: Apis mellifera, Ethanolic Extract of Propolis (EEP), biological activity

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen IX

Lista de figuras ............................................................................................................. XIII

Lista de tablas ............................................................................................................. XIV

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Actividad biológica de propóleos (Revisión) ......................................................... 7 1.1 El Propóleo ...................................................................................................... 7 1.2 Propiedades Biológicas ................................................................................... 8

1.2.1 Actividad Antibacteriana ........................................................................ 8 1.2.2 Actividad Antifúngica ............................................................................. 9 1.2.3 Actividad Antiviral ................................................................................ 10

1.3 Antecedentes a nivel local ............................................................................. 10

2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de propóleo de Apis mellifera en Colombia ..................................................................... 15

Resumen .................................................................................................................. 15 2.1 Introducción ................................................................................................... 17 2.2 Materiales y Métodos ..................................................................................... 19

2.2.1 Recolección de muestras .................................................................... 20 2.2.2 Control de calidad microbiológico ........................................................ 20 2.2.3 Obtención de extractos etanólicos de propóleos ................................. 20 2.2.4 Análisis de datos ................................................................................. 21

2.3 Resultados ..................................................................................................... 21 2.4 Discusión ....................................................................................................... 24 2.5 Conclusiones ................................................................................................. 25 Referencias .............................................................................................................. 26

3. Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico en Colombia 31 3.1 Introducción ................................................................................................... 31 3.2 Materiales y métodos ..................................................................................... 32

3.2.1 Recolección de muestras .................................................................... 33 3.2.2 Concentración mínima inhibitoria ........................................................ 33

3.3 Resultados ..................................................................................................... 34 3.4 Discusión ....................................................................................................... 35 3.5 Conclusiones ................................................................................................. 39 3.6 Bibliografía ..................................................................................................... 39

XII Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones

de Colombia como aporte para la denominación de origen

4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo en Colombia 43

4.1 INTRODUCCIÓN ...........................................................................................43 4.2 MATERIALES Y MÉTODOS ..........................................................................45

4.2.1 Recolección de muestras .....................................................................45 4.2.2 Activación de la cepa de referencia .....................................................45 4.2.3 Concentración mínima inhibitoria .........................................................46

4.3 Resultados .....................................................................................................46 4.3.1 Crecimiento .........................................................................................46 4.3.2 Inhibición .............................................................................................49 4.3.3 Concentración Mínima Fungicida .........................................................51

4.4 Discusión ........................................................................................................53 4.5 Conclusiones ..................................................................................................53 4.6 Bibliografía .....................................................................................................53

5. Uso del bacteriófago lambda como indicador de actividad antiviral in vitro de propóleos de Colombia .................................................................................................55

5.1 Introducción ....................................................................................................55 5.2 Materiales y Métodos .....................................................................................56

5.2.1 Bacteriofago y celula huésped .............................................................56 5.2.2 Medios de Cultivo ................................................................................57 5.2.3 Muestras de Propóleos ........................................................................57 5.2.4 Procedimiento ......................................................................................57 5.2.5 Plaqueo ...............................................................................................58

5.3 Resultados .....................................................................................................59 5.4 Discusión ........................................................................................................59 5.5 Conclusiones ..................................................................................................61 5.6 Bibliografía .....................................................................................................62

6. Discusión, conclusiones y recomendaciones ......................................................65 6.1 Discusión ........................................................................................................65 6.2 Conclusiones ..................................................................................................65 6.3 Recomendaciones ..........................................................................................66

A. Anexo: Calidad microbiológica de propóleo crudo y sólidos solubles de extractos de propóleos de Apis mellifera en Colombia ..............................................67

B. Anexo: Sólidos solubles totales de EEP ...............................................................69

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág. Figura 3-1: Efecto antibacterial (Bacterias Gram positivas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 70%) de tres origenes geograficos en Colombia . ............................................ 42

Figura 3-2: Efecto antibacterial (Bacterias Gram positivas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 96%) de tres origenes geograficos en Colombia………………………………….42

Figura 3-3: Efecto antibacterial (Bacterias Gram negativas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 70%) de tres origenes geograficos en Colombia………………………………….43

Figura 3-4: Efecto antibacterial (Bacterias Gram negativas) de concentraciones mg/ml de EEP (Et. 96%) de tres origenes geograficos en Colombia………………………………….44

Figura 4-1. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum en el Control…………………53

Figura 4-2. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Santander en Alcohol 70%...........................................................................................53

Figura 4-3. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Santander en Alcohol 96%...........................................................................................54

Figura 4-4. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Cundinamarca en Alcohol 70%....................................................................................54

Figura 4-5. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Cundinamarca en Alcohol 96%....................................................................................55

Figura 4-6. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP en Boyacá en Alcohol 96%................................................................................................55

Figura 4-7. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 70% y en seis niveles de concentración de EEP………………………………………………………..……56

Figura 4-8. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 96% y en seis niveles de concentración de EEP……………………………………………………………..56

Figura 4-9. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes……59

Figura 5-1: Porcentaje de muestras que presentaron conteos visibles de UFP y el efecto de los EEP sobre el fago con respecto al control…………………………………………….68

Contenido XIV

Lista de tablas

Pág. Tabla 1: Microorganismos utilizados en esta investigación. .............................................. 7

Tabla 2-1: Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis mellifera de Colombia colectadas en tres regiones de Colombia durante el periodo 2008-2010……………………………………………………………………………………………….28

Tabla 2-2: Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis mellifera de Colombia según el requisito de las normas internacionales .........................28

Tabla 2-3: Concentración de extracto seco a partir de dos concentraciones de etanol.................................................................................................................................29

Tabla 2-4: Porcentaje de muestras aceptables en rendimiento de extracto seco de propóleos de abejas Apis mellifera en Colombia comparadas con el porcentaje de extracto seco reportado en las normas para propóleo de Brasil, Argentina y Japón………………………….29

Tabla 3-1: Actividad antibacterial de EEP (MIC, mg/ml) diferenciada entre orígenes geográficos en Colombia………………………………………………………………………….…40

Tabla 3-2: Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial según origen geográfico en Colombia……………………………………………………………...41

Tabla 3-3: Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial de muestras extranjeras (Bélgica, Chile, Cuba, Nueva Zelanda) y el origen geográfico en Colombia……………………………………………………………………………………………….41

Tabla 4-1. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro zonas, en etanol 70%........................................................................................................57

Tabla 4-2. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro zonas, en etanol 96%........................................................................................................58

Tabla 4-3. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes……58

Tabla 5-1: Prueba antiviral contra el Fago Lamda de E. coli con exposición a tres concentraciones de EEP de tres orígenes geográficos diferentes…………………………67

Introducción

El propóleo es un producto natural de las abejas Apis mellifera, derivado del metabolismo

de las plantas, desde tiempos inmemorables ha sido utilizado por el hombre para su

salud, actualmente existe una tendencia mundial hacia la demanda de este producto,

registrándose aumentos en la producción mundial.

Colectado como material de refuerzo y estabilización de la colmena, dentro de la

actividad natural de Apis mellifera, juega diferentes funciones en la colmena, como el

fortalecimiento de la estructura, sellamiento de rendijas o aberturas y la prevención de

microorganismos por descomposición de los animales muertos en la colmena (FAO,

2005).

El propóleo viene ganando interés en la comunidad científica internacional, no solo desde

el punto de vista estructural o fisicoquímica, sino principalmente por sus propiedades

biológicas, que resultan importantes en la salud humana (Farré R. et al., 2004). La

literatura muestra una inequívoca actividad de esta resina natural contra una variedad de

patógenos en humanos y animales. Los grupos de investigación alrededor del mundo,

han reportado estudios acerca del origen botánico, la composición química, la actividad

biológica y usos terapéuticos del propóleo.

En los análisis de la composición química han identificado al menos 300 compuestos en

el propóleo (Mani F., 2006) demostrándose la variabilidad y complejidad del producto,

que han dado validez y versatilidad del uso terapéutico. Principalmente incluyen grupos

químicos como los ácidos aromáticos, ácidos ester aromáticos, flavonoides, terpenoides,

ácidos alifáticos entre otros (Marcucci M.C., 1995). Estas sustancias identificadas en los

propóleos también son constituyentes habituales en algunos alimentos, aditivos de

alimentos y/o reconocidos generalmente como sustancias seguras (Burdock G.A., 1998).

2 Introducción

La actividad en contra de los microorganismos está más relacionada al efecto sinérgico

de los flavonoides (y otros fenoles), que a la acción de cada uno de ellos por separado

(Takaisi Kikuni y Schilcher, 1994). Los mecanismos de acción antibacteriana utilizan

varios mecanismos, tales como la formación de complejos estreptocócicos

pseudomulticelulares, desorganización del citoplasma, de la membrana plasmática y de

la pared celular, bacteriólisis parcial, e inhibición de la síntesis de proteínas. Además se

observó una inhibición de la división celular en presencia de propóleo y este hecho

sugirió que el propóleo podría actuar inhibiendo la replicación del DNA a través de la

RNA polimerasa e indirectamente, afectando la división celular (Havsteen Bent H., 2002).

Por otro lado, la cotización del propóleo diferenciado por su acción terapéutica ha

generado ingresos mayores para los apicultores, explotando con mayor inquietud el

producto; es el caso del propóleo verde del Brasil, que alcanzo en el mercado

internacional un precio entre US$ 100-140/kg en el año 2000 y los márgenes producidos

para el año 2006 en exportaciones habían sido de US$ 43.329 durante los primeros

cuatro meses. En contraste, los propóleos de producción indiferenciada como el de

origen Chino que llegaba a los US$ 35/kg, el de Uruguay a US$ 37-40/kg en el año 2006

o el argentino a US$ 19/kg con 7 toneladas exportadas hasta Junio del 2007 (SENASA,

2007); siendo los principales competidores a nivel mundial.

Orantes Bermejo et al. (2007) señalan que “con un censo de colmenas que supera ya las

500.000 colmenas y un precio muy variable de este producto (entre 35 - 300 euros/kg

dependiendo de su calidad), basta hacer unos simples cálculos para comprobar que se

está perdiendo varios millones de euros de las rentas agrarias de las explotaciones

apícolas andaluzas”.

En Colombia el precio del producto en el mercado nacional es variable (entre $ 40.000 y

$80.000), dependiendo de la calidad y procedencia, con argumentos en algunos casos

subjetivos.

El propóleo de Brasil, es exportado al Japón como materia prima para la elaboración de

productos farmacéuticos, denominado el “propóleo verde” brasileño, es colectado por las

abejas de una especie de arbusto llamado “alecrim-do-campo” (Baccharis dracunculifolia)

que tiene distribución en los estados de Sao Paulo y Minas Gerais y gracias a la

Introducción 3

exhaustiva investigación de su composición y sus características terapéuticas, ha

alcanzado grandes saltos en el valor comercial del producto (Weinstein T. et al., 2005).

Los expertos han determinado que la topografía colombiana con tres cordilleras, dos

océanos, selvas húmedas, llanuras tropicales, páramos e incluso montañas con nieves

perpetuas y su ubicación geográfica posibilitan la existencia de un gran número de

especies y vegetales distribuidas en varios ecosistemas. Uno de los datos más comunes

para determinar la biodiversidad colombiana es aquél que indica que el país ocupa el 0,7

por ciento de la superficie del planeta y posee entre el 10% y el 14% de todas las

especies de plantas y animales de la Tierra. Según datos del Ministerio de Ambiente,

Vivienda y Desarrollo Territorial, Colombia es el segundo país del mundo con mayor

diversidad de plantas: posee 55 mil especies. Una tercera parte de esas especies son

endémicas; es decir que únicamente se encuentran en Colombia. Esas instituciones

señalan que Colombia se encuentra entre los 12 países megadiversos, que poseen el

70% de la biodiversidad total del planeta (Instituto Alexander von Humboldt, 2007).

Esta diversidad botánica y las experiencias terapéuticas de conocimiento popular frente a

patologías en humanos y animales en el país, hacen entrever un potencial alto del

producto como agente antibiótico; de tal manera que esta actividad biológica debe ser

investigada y certificada, influyendo en el valor agregado del producto.

Los diferentes modelos biológicos (bacterias, hongos, protozoarios y virus) empleados en

este estudio van a permitir proponer la hipótesis sobre la correlación de las zonas

fitogeográficas de producción, algunos parámetros de composición química del propóleo

de Apis mellifera y su acción biológica en Colombia, lo que contribuye un aporte

fundamental para alcanzar denominación de origen.

Bibliografía

Burdock G. A. Review of the Biological Properties and Toxicity of Bee Propolis (Propolis)

Food and Chemical Toxicology 36. 347-363. 1998.

FAOSTAT. Banco de datos de FAO. Web Site: http:// faostat.fao.org. 2005

Farré R. et al. Propolis and human health. Ars Pharmaceutica, 45:1; 21-43, 2004.

4 Introducción

Havsteen BH. The biochemistry and medical significance of the flavonoid. Pharmacol

Therapeut;96(2–3):67–202. 2002

Instituto Alexander von Humboldt (www.humboldt.org.co). 2007.

Mani F. et al. Journal of Ethnopharmacology 105 : 95-98, 2006.

Marcucci M. C. Propolis: chemical composition, biological properties and therapeutic

activity. Apidologie. 26, 83-89. 1995.

Orantes Bermejo Fco. J, Torres C., Serra C., J., Kumazawa S. Capacidad antioxidante y

contenido en polifenoles del propóleos en Andalucía. Marzo-Abril, Nº 142 Vida Apícola

/41. 2007.

SENASA. Apicultura sin fronteras - Año II N 16 - Hoja 2 – Agosto 2007.

Takaisi-Kikuni, N.B. and Schilcher, H. Abstract. Electron microscopic and

microcalorimetric investigations of the possible mechanism of the antibacterial action of a

defined propolis provenance. Planta Med. 60, 222–227. 1994

Weinstein T. et al. Plant Origin of Green Propolis: Bee Behavior, Plant Anatomy and Chemistry. eCAM; 2(1)85–92. 2005.

Introducción 5

Objetivos

Objetivo general

Cualificar la actividad biológica in vitro de propóleos de abejas Apis mellifera de las zonas

productivas de los departamentos de Santander, Boyacá y Cundinamarca.

Objetivos específicos

Establecer el comportamiento del propóleo en cuanto a su capacidad antibacteriana

frente a bacterias Gram positivas: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus

subtilis subespecie spizizenii ATCC 6633, Micrococcus luteus kocuria spizizenii ATCC

9341 y Gram negativas: Escherichiae coli ATCC 31617, Klebsiella pneumoniae

subespecie pneumoniae ATCC 700603 y Salmonella entérica subespecie entérica

serovar typhimurium ATCC 14028 considerando la concentración mínima inhibitoria

(CMI).

Determinar si los propóleos de las diferentes regiones son activos en su capacidad

antifúngica en el crecimiento de Trichophyton rubrum ATCC 28188, como modelo

aplicado a hongos dermatofitos.

Estandarizar una técnica que permita establecer el potencial antiviral del propóleo in

vitro.

Comparar si la extracción de propóleo en etanol al 70% y 96% tiene la misma

actividad antibacteriana y antifúngica in vitro.

Correlacionar los hallazgos de la actividad en microorganismos con los extractos

etanólicos de propóleo en las zonas productoras en estudio.

1. Actividad biológica de propóleos (Revisión)

1.1 El Propóleo

El propóleo o própolis, se ha definido por varios autores según su apariencia, fuente y

utilización por las abejas. De esta manera Bankova V. (2005) lo define como una

sustancia resinosa de color pardo rojizo o amarillo verdoso producido por las abejas a

partir de resinas vegetales y que tiende a oscurecerse. Por su parte Farré et al. (2004) lo

describe como una resina cérea, de composición compleja y consistencia viscosa, que

las abejas elaboran y utilizan en la construcción, reparación, aislamiento y protección de

la colmena. Chaillou et al. (2004), como un producto apícola de composición compleja,

que las abejas Apis mellifera obtienen por adición de cera y secreciones salivares al

material resinoso, gomoso ó balsámico que recolectan de diversas plantas.

La abeja cuando encuentra el propóleo en una yema de un árbol, lo desprende

valiéndose de sus mandíbulas y ayuda de su primer par de patas, agregando

secreciones de las glándulas mandibulares. Luego, lo transfiere a la corbícula en el tercer

par de patas. Así al ingresar a la colmena, se dirigen inmediatamente al lugar donde éste

es requerido y permanecen quietas, permitiendo a las abejas “propolizadoras” llamadas

así por la actividad que realizan, tomar algunas partículas de la sustancia, comprimirlas y

agregarles cera para proceder a su ubicación (Asis M, 1991). Una vez propolizada la

colmena el apicultor lo recolecta y emplea como producto de interés comercial, por sus

propiedades terapéuticas.

Marcucci (1995), señala que los compuestos en el propóleo sin procesamiento se

originan de tres fuentes: 1) exudado de plantas colectados por las abejas, 2) productos

metabólicos secretados por el insecto (principalmente β-glucosidasa, ácido 10-hidroxi-2-

decenoico y ácido 9-oxo-2-decenoico) (Bruschi y Lara, 2006) y 3) materiales introducidos

durante la elaboración del producto como el polen.

8 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro regiones


Además de los granos de polen, pueden ser encontrados otros fragmentos vegetales que

son indicativos de las especies visitadas por las abejas para la colecta de resinas, tales

como fragmentos de hojas, pelos glandulares y no glandulares, cristales de oxalato de

calcio y discos secretores (Bastos E. M., 2001).

En las zonas templadas la mayor parte del propóleo procede del exudado de brotes de

chopos o álamos pertenecientes al género Populus spp; en la zona septentrional de

Rusia, de los brotes de abedul (Betula verrucosa) y de P. tremula (Wollenweber E. y

Buchmann SL, 1997); en las regiones mediterráneas, de las choperas y de las hojas de

Cistus spp. (Martos et al., 1997); en Brasil de las hojas de especies de Baccharis

dracunculifolia (Bankova V., 2000); en Venezuela y Cuba de la resina floral del género

Clusia y en zonas más tropicales se obtiene de otros vegetales (Cuesta Rubio et al.,

2002).

La composición química de los propóleos está estrechamente asociada con el origen

botánico. Los propóleos turcos, egipcios, brasileños, de Chile y de Cuba de procedencias

botánicas distintas muestran composiciones variadas, y en algunos casos compuestos

característicos que podrían ser de utilidad para la identificación de su origen (Bastos E.

M., 2001).

1.2 Propiedades Biológicas

1.2.1 Actividad Antibacteriana

Fue una de las primeras propiedades constatadas. Los principales responsables de esta

propiedad son los flavonoides galangina y pinocembrina y derivados de los ácidos

benzoico, ferúlico y cafeico. Farré R. et al., (2004) informa del estudio publicado en

Microbiology Research, donde el ácido cinámico y algunos flavonoides desactivan la

energía de la membrana citoplasmática, inhibiendo la motilidad bacteriana, haciéndolas

más vulnerables al ataque del sistema inmunológico y potenciando los antibióticos.

Mahmoud Lotfy, (2006) menciona la capacidad antimicrobiana de diferentes propóleos

ante el Helicobacter pylori demostrando la capacidad ante esta bacteria, siendo los

1. Revisión general. Actividad biológica de propóleos 9

principales responsables los flavonoides: pinocembrina en primer lugar y luego la

galangina y la crisina.

Los extractos etanólicos de propóleo tienen actividad antimicrobiana contra bacterias

Gram-positivas pero una actividad más baja contra bacterias Gram-negativas y buena

actividad contra las levaduras (Burdock, G.A., 1998). Se ha sugerido que la actividad

antimicrobiana del propóleo depende de sinergismo entre algunos flavonoides, ácidos

fenólicos y otros compuestos en los propóleos (Marcucci, M.C. et al., 2001). El modo de

la actividad antimicrobiana de los compuestos de los propóleos no está claro, pero las

explicaciones posibles son: inhibición de la motilidad bacteriana, afecto del potencial de

la membrana, inhibición de la RNA-polimerasa, desorganización del citoplasma, pared

citoplásmica de la membrana y de la célula, e inhibición de la síntesis de la proteína.

(Mirzoeva, O.K., 1997; Takaisi-Kikuni, N.B. y Schilcher, H., 1994; citados por Pepeljnjak

S., Kosalec I., 2004)

1.2.2 Actividad Antifúngica

Los propóleos centroeuropeos (Alemania, Francia y Austria), con composiciones

cualitativas similares y predominio del ácido trans-p-cumárico, muestran actividad frente

a Candida albicans, mientras que los mediterráneos (Bulgaria, Turquía, Grecia y Argelia),

que contienen flavonoides, ésteres del ácido cafeico y ácidos ferúlicos, presenta menor

actividad antifúngica. Por su parte, el propóleo egipcio de Dakahlia, con dos ésteres de

cafeato y dos triterpenoides, es más activo frente a Candida albicans que el de Ismailia

que no contiene ácidos aromáticos, ni ésteres, ni flavonoides y, estudios sobre la

incidencia de la paracoccidiomicosis en América latina, sugieren que,

independientemente de su origen geográfico, los macrófagos estimulados con propóleo

aumentan su actividad fungicida (Burdock, G.A., 1998).

La actividad in vitro de agentes antifúngicos y antisépticos fueron evaluados frente a

dermatofitos entre los que se encuentra el Trichophyton rubrum, la CMI fue determinada

por el método de dilución en agar, señalando que el propóleo tuvo un comportamiento

similar a los otros medicamentos comerciales (Soares y Cury, 2001).



1.2.3 Actividad Antiviral

En Francia Amoros et al. (1994), confirmaron la acción antiviral frente al herpes tipo 1 y 2,

pero también ante poliovirus. Establecieron que reduce la síntesis del ADN viral y que los

responsables son flavonoides, que actúan en sinergismo con un éster del ácido cafeico y

el ácido ferúlico. Gekker et al. (2005) probaron la acción antiviral del propóleo frente al

virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1) observando la actividad in vitro del

producto natural en linfocitos (CD4+) con una máxima supresión de 66,6 μg/mL de

propóleo. Otra investigación midió la actividad antiviral de una fracción del propóleo

(Et2O) in vitro, inhibiendo significativamente la actividad del virus de la influenza A/Hong

Kong (H3N2) (Serkedjieva et al., 1997).

1.3 Antecedentes a nivel local

Barragán L. y Ortiz J. (1988), recolectaron muestras de propóleo provenientes de

Fusagasugá, Tunja y Neiva con el fin de verificar la actividad biológica del propóleo de

Colombia. Los microorganismos utilizados en la determinación de la concentración

mínima inhibitoria (CMI) provenientes del Laboratorio de Microbiología de la Universidad

Nacional de Colombia, fueron Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis,

Streptococcus piogens, Corynebacterium sp. (2 cepas). Los solventes seleccionados

para establecer un sistema de solubilidad del propóleo óptimo son etanol (96%),

propilenglicol y etanol: propilenglicol en proporciones 1 a 1, 1 a 2 y 2 a 1. En general los

resultados de la CMI están por debajo de 1,0 mg de propóleo por 10 ml de medio de

cultivo. Las muestras de Fusagasugá presentaron los menores valores de CMI y los

extractos de etanol:propilenglicol 1:2 presentaron menores valores de CMI.

Solano y Coronado (2000), seleccionaron tres tipos de propóleo de diferentes regiones

de Colombia (Boyacá, Quindío y Cundinamarca) con el fin de ser analizados por sus

propiedades antimicrobianas y antifúngicas. Los microorganismos de ensayo

seleccionados fueron Bacillus subtillis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus,

Micrococcus luteus, Escherichia coli, Salmonella tiphy, Pseudomona aeruginosa,

Candida albicans, Aspergilus niger, Fusarium oxysporum, Mucor sp. Por medio de los

resultados del método de Perforación y Difusión en gel, se hallaron las Concentraciones

Criticas (CC) de los extractos de propóleo, realizando la grafica de los diámetros de


inhibición al cuadrado (X2) vs. Logaritmo natural de la concentración. Concluyendo que

frente al Bacillus subtilis los propóleos presentaron una actividad antibacteriana elevada

(Concentraciones Criticas: 26, 20 y 17 μg/ml) y frente a S. agalactiae, M. luteus, B.

subtilis, S. aureus una concentración Critica de 5, 13, 17, 21 μg/ml respectivamente.

Martínez T. y Figueroa J. (2003), recolectaron 30 muestras de propóleo provenientes de

cuatro zonas biogeográficas de Colombia, con el objetivo de establecer el espectro

antimicrobiano del propóleo proveniente de apiarios de la zona norte del valle del Cauca

y sur del Quindío y evaluar el rendimiento, en extracto blando del propóleo tratado con

alcohol etílico en dos concentraciones de solvente: al 70% y 96%. Observaron que la

capacidad del propóleo para inhibir los microorganismos mediante la técnica de difusión

radial en doble capa de agar está mediada por el tipo de alcohol utilizado para la

extracción, siendo el más efectivo el extracto etanolico de propóleo de 96% y que la

actividad antimicrobiana se ve influenciada por el tiempo, asociada a la respuesta de la

especie del microorganismo.

Moreno Z., Martinez P. y Figueroa J. (2007), tomaron cuatro muestras de propóleo

argentino, cinco colombianos y uno cubano, buscando establecer el efecto

antimicrobiano in vitro sobre Streptococcus mutans ATCC 25175, principal

microorganismo implicado en el desarrollo de la caries dental. Empleando la prueba de

Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) en concentraciones 15 a 3.75 mg/ml, la totalidad

de las muestras analizadas manifestaron actividad contra S. mutans. Las muestras

colombianas presentaron mayor efecto bactericida (CMB) luego de 48 horas de

exposición al propóleo y el mejor efecto inhibitorio lo presento una muestra colombiana a

un periodo de exposición de 24 horas. A mayor exposición de las bacterias al propóleo,

las muestras colombianas mostraron un efecto superior, las argentinas un efecto

moderado y las demás muestras, permanecieron estables.

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2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de propóleo de Apis mellifera en Colombia

Cesar Talero1, D. Hernández1, J. Figueroa1

1 Grupo de investigación AYNI Ciencia y Tecnología Apícola, Facultad de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia, Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá.

Publicado en: Rev. Med. Vet. Zoot. 59(2), Mayo-Agosto 2012: 109-118 (Anexo A)

Resumen

Se tomaron cincuenta y nueve muestras de propóleo crudo recolectadas en tres orígenes

geográficos de Colombia, a las cuales se les realizó control de la calidad microbiológica,

y se determinó el porcentaje de extracto seco obtenido de las extracciones etanólicas de

propóleo (EEP) al 70 y 96%. Se cuantificaron los grupos indicadores mesófilos aerobios,

coliformes totales, coliformes fecales, Staphylococcus sp., mohos y levaduras, y se

encontraron conteos en promedio de 93x103; 79x102; <1; 94; 10x104 UFC/g,

respectivamente. La detección de patógenos se realizó para Escherichia coli y

Staphylococcus aureus, los cuales estuvieron presentes en el 4 y 2% de las muestras,

respectivamente. Los hallazgos microbiológicos se compararon con normas de calidad

de Japón, Perú y El Salvador; se encontró que el grupo indicador mohos y levaduras fue

el más crítico, donde 92 a 94% de las muestras evaluadas estuvieron por fuera de los

límites exigidos por estas normas. Los resultados indican que las extracciones con etanol

al 70 y 96% de propóleos colombianos, en promedio obtuvieron 93,0 y 175,3 mg/ml de

extracto seco, respectivamente. La concentración de extracto seco se comparó con la

normatividad existente en Brasil, Argentina y Japón. Para la norma más exigente, que

corresponde a la brasileña, se hallaron porcentajes de cumplimiento del 53,4 y 56,1%

para EEP 70 y 96%, respectivamente, y para la norma de Japón se encontraron



aceptables 75,9 y 69,7% de los EEP 70 y 96%, respectivamente. Los resultados están

asociados al origen fitogeográfico y a la producción no especializada de propóleos. En

este estudio se incluyeron muestras de propóleo crudo de países como Bélgica, Chile,

Cuba y Nueva Zelanda.

Palabras clave: propóleos, parámetros, clasificación, normas.

Raw propolis microbiologic quality and soluble solids of Apis mellifera propolis

extracts in Colombia

Abstract

Raw propolis samples from three different geographical origins were submitted to the

microbiological quality tests and to the extraction of the dry matter using two

ethanol extracts (70 and 96%). The aerobic mesophile, total coliforms, fecal coliforms,

Staphylococcus sp., molds and yeasts indicator groups were quantified, finding in

average 93x103; 79x102; <1; 94; 10x104 CFU/g respectively. The pathogen detection

was made for Escherichia coli obtaining 51 samples free of the pathogen and 2 samples

with presence of it, and for Staphylococcus aureus, which were present in 4 and 2% of

the samples respectively. The microbiologic results were compared with the quality

standards of Japan, Peru, and El Salvador, finding that the indicator groups molds and

yeasts was the most critical, where 92 to 94% of the evaluated samples were off limits of

the international standards. These results show that the ethanol extracts made at

concentrations of 70 and 96% of Colombian propolis, obtained in average 93.0 and 175.3

mg/ml of dry extract respectively. The concentration of dry extract was compared with the

standards of Brazil, Argentina and Japan. For the most strict standard, which is the

Brazilian, there were found complying percentages of 53.4 and 56.1% for propolis ethanol

extracts (PEE) of 70 and 96% respectively and for the Japan standard they were found

acceptable 75.9 and 69.7% of the PEE 70% and 96% respectively. The results are linked

to the flora, geographical origins and to the non specialized production methods. This

study included raw propolis samples from countries such as Belgium, Chile, Cuba and

New Zealand.

Key words: propolis, parameters, classification, standards.

2. Calidad microbiológica del propóleo crudo y sólido solubles de extractos de

propóleo de Apis mellifera en Colombia

17

2.1 Introducción

El propóleo o propóleos (propolis, ligamaza, beeglue) se ha definido como una sustancia

resinosa de color generalmente pardo rojizo a amarillo verdoso, que colectan las abejas

del exudado de plantas y la adición de productos metabólicos secretados por el insecto

(Bankova 2005; Chaillou et al. 2004), con inclusión de otros materiales durante la

elaboración del producto, como el polen (Marcucci 1995). El producto colectado por las

abejas (crudo) muestra una alta variabilidad en razón de su estrecha relación con la

región geográfica de producción, que puede llegar a presentar distinta cobertura vegetal,

dependiendo de las condiciones agroecológicas.

Las abejas en colmenas comerciales generalmente utilizan el propóleo para cubrir los

agujeros y las grietas con el fin de reducir la entrada de la colmena (Krell 1996). Se cree

que la utilización de propóleos de esta manera funciona para mantener en mejores

condiciones la homeostasis del medio ambiente dentro de la colmena. Esto podría ser el

resultado de disminuir el crecimiento microbiano en las paredes de la colmena e impedir

el flujo de aire sin control en el nido y las paredes de impermeabilización y la humedad

externa, además de crear algún tipo de protección contra los invasores (Visscher 1980,

citado en Simone-Finstrom y Spivak 2010).

La composición química del propóleo está estrechamente asociada con el origen

botánico (Greenaway et al. 1987, citado en Amoros et al. 1994). En las zonas templadas,

la mayor parte del propóleo procede del exudado de los brotes de chopos o álamos

pertenecientes al género Populus spp; en la zona septentrional de Rusia, de los brotes

de abedul (Betula verrucosa) y de P. tremula (Wollenweber y Buchmann 1997); en las

regiones mediterráneas procede de las choperas y de las hojas de Cistus spp. (Martos et

al. 1997); en las zonas donde los álamos no son plantas nativas, tales como Australia y

las regiones ecuatoriales de América del Sur, las abejas buscan otras plantas que reúnan

las cualidades requeridas para colectar los exudados con el fin de elaborar propóleos

(Park et al. 2002). En Brasil el propóleo procede principalmente de las hojas de especies

de Baccharis dracunculifolia (Bankova 2000); en Venezuela y Cuba, de la resina floral del

género Clusia, y en zonas más tropicales se obtiene de otros vegetales (Cuesta-Rubio et

al. 2002).



En los análisis de la composición química de los propóleos se han identificado al menos

300 compuestos (Mani et al. 2006) y hasta 150 compuestos para una misma muestra

(Greenaway et al. 1990); en la fracción aromática, más de 100 compuestos (Bankova

1987; Greenaway et al. 1987, 1988, citado en Amoros et al. 1994). Los propóleos están

constituidos fundamentalmente por flavonoides, derivados de ésteres y ácidos fenólicos.

Los principales grupos fenólicos identificados son: flavonoides, ácidos aromáticos y sus

ésteres, aldehídos aromáticos, cumarinas, triglicéridos fenólicos (Bedascarrasbure 2000).

Los flavonoides no son los marcadores químicos principales, pero los compuestos

menores también pueden ser involucrados en la actividad biológica (Bankova et al. 1987,

citado en Amoros et al. 1994). Existen otros componentes como los triterpenos (Pérez et

al. 2009); el primer reporte sobre la presencia de este tipo de metabolito secundario fue

la identificación del triterpeno acíclico escualeno, precursor de los triterpenos tetracíclicos

y pentacíclicos (Silva et al. 1992).

Las investigaciones realizadas en las últimas décadas, orientadas a determinar las

propiedades biológicas del propóleo a nivel mundial, han permitido establecer que a los

compuestos fenólicos se les atribuye acción farmacológica, quedando establecidas sus

propiedades antibiótica, fungicida, antiviral y antitumoral, entre otras (Burdock, 1997). Sin

embargo, la presencia de triterpenos pentacíclicos en propóleos brasileños en particular y

en propóleos de países tropicales en general, constituye una característica importante de

su composición química vinculada a su actividad antiinflamatoria, anticancerígena y

antiviral (Pérez et al. 2009).

Los lineamientos de calidad para propóleo son complejos, ya que los propóleos

presentan diferentes colores, olores y composición; los lineamientos también tienen

directa relación con los métodos de extracción, además del cuidado y la higiene, tanto en

el almacenamiento como en la conservación del producto.

Los primeros esfuerzos propuestos en cuanto a estándares oficiales de calidad referidos

al producto “crudo o bruto” y a veces a sus extractos (forma tradicional de extraer

compuestos activos para ser empleados en la industria) iniciaron en los países del Este

europeo. Los límites máximos y mínimos para ciertos grupos químicos están



19

determinados, pero son pocas las pruebas estandarizadas que están disponibles para

establecer la actividad biológica de varios componentes (López y Ubillos 2004).

En la actualidad, las sustancias que determinan la calidad de los propóleos no se unifican

como norma, y cada país o compañía tiene sus propios estándares, incluidos los

términos específicos para los propóleos y sus productos relacionados. Los esfuerzos en

investigación se encaminan entonces hacia la “estandarización internacional de los

propóleos” como una de las propuestas para el Foro Mundial de Ciencias del Propóleos

(WPSF) (Lee y Jo 2011).

Colombia (Sur América) no posee ningún tipo de normatividad o estándar para el

propóleo crudo o sus extractos, aunque se han realizado investigaciones previas

alrededor de los propóleos en caracterización antimicrobiana y fisicoquímica (Moreno et

al. 2007; Palomino et al. 2009; Bastos et al. 2011a; Samara-Ortega et al. 2011; Viloria et

al. 2012). Hoy en día, la calidad de este producto y su valor comercial no tienen relación

directa; el precio es determinado por características como el aspecto, la presentación, el

color, olor y sabor que poseen cierta relación con la “calidad real” del producto, pero es

una valoración subjetiva. Complementar su evaluación mediante la determinación

analítica permitirá obtener valores de composición como parámetros fundamentales de la

calidad de los propóleos y, por tanto, establecer el valor comercial del mismo.

El presente estudio se desarrolló con el objetivo de evaluar la calidad microbiológica y de

porcentaje de extracto seco de propóleos de Apis mellifera en Colombia, y así establecer

parámetros de calidad para su comercialización como materia prima de uso industrial.

2.2 Materiales y Métodos

Este estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, en el

marco del Proyecto Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y propóleos

mediante indicadores microbiológicos.



2.2.1 Recolección de muestras

Se emplearon 59 muestras de propóleo crudo, provenientes de tres orígenes

geográficos, 16 de Boyacá, 16 de Cundinamarca y 27 de Santander, en su mayoría

obtenidas mediante raspado de colmenas comerciales de Apis mellifera entre los años

2008 y 2010. Se incluyó en este estudio una muestra de propóleo crudo de cada uno de

los siguientes países: Bélgica, Chile, Cuba y Nueva Zelanda.

2.2.2 Control de calidad microbiológico

Para evaluar la calidad microbiológica, se siguieron los métodos de recuento en placa y

búsqueda de patógenos descritos en la International Commission on Microbiological

Specifications for Foods (ICMSF 2000). Se detectaron y cuantificaron los grupos

indicadores: mesófilos aerobios, coliformes totales, coliformes fecales, Escherichia coli,

Staphylococcus sp., Staphylococcus aureus, mohos y levaduras, para 53 muestras

procedentes de Colombia.

Los resultados de la calidad microbiológica se compararon con el cumplimiento de la

normatividad internacional existente para este producto de los países de Japón, Perú y El

Salvador (Japan Council of Propolis. 2010; Proyecto de Actualización de la RM N° 615-

2003 SA/DM 2003; Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología 2003).

2.2.3 Obtención de extractos etanólicos de propóleos

A las muestras de propóleo crudo se les retiraron las impurezas mecánicas, y se

trituraron y homogeneizaron separadamente. Cada muestra fue pesada, dividida en dos

partes iguales y extraídas en recipientes de vidrio cerrados, con dos concentraciones

diferentes de disolvente etanólico (70 y 96%), conservando una relación disolvente:soluto

70:30 (Almeida 2003; Bruschi y Lara 2006). Se procedió a obtener principios activos en la

disolución, mediante agitaciones diarias por 1 minuto de los extractos de propóleo crudo

con etanol, durante 30 días, a temperatura promedio de 25°C y en la oscuridad con el fin

de evitar alteraciones en los metabolitos secundarios.

Posterior a los 30 días, la disolución se llevó a refrigeración a 4°C por 12 h para separar

las ceras que se precipitan (Bedascarrasbure et al. 2006) en la mezcla de solventes de



21

extracción. La mezcla se filtró al final del proceso para obtener el Extracto Etanólico de

Propóleo “madre” (EEPm).

El extracto seco (materia seca o sólidos solubles totales) se determinó para los EEPm,

adaptando la metodología de las Normas para propóleos de Brasil, Argentina y Japón

(Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento. Brasil 2001; Comisión Nacional de

Alimentos. Argentina 2008; Japan Council of Propolis. Japón 2010). Un (1) ml del EEPm

se pesó en un recipiente previamente aforado y se sometió a 100 ± 2°C por 60 min en

horno de secado para eliminar completamente el solvente. El conjunto se colocó en un

desecador hasta llegar a temperatura ambiente y se registró el peso; el procedimiento se

repitió con intervalos de 15 min, hasta obtener un peso constante.

2.2.4 Análisis de datos

Para el control de calidad microbiológico de las muestras de propóleo crudo se empleó

un análisis estadístico descriptivo. Los extractos secos de los EEP fueron expresados en

porcentaje (%ES) y se obtuvo la desviación estándar.

2.3 Resultados

La cuantificación de los grupos microbianos indicadores (aerobios mesófilos, coliformes

totales, coliformes fecales, Staphylococcus sp., mohos y levaduras) y la detección de los

microorganismos patógenos Escherichia coli y Staphylococcus aureus, en propóleos

colombianos se muestran en la Tabla 2-1.

El porcentaje de las muestras que cumplen con la normatividad internacional existente en

cuanto al control de calidad microbiológica (cuantificación de los grupos microbianos,

indicadores y detección de los microorganismos patógenos) de propóleos crudos de

Colombia se indica en la Tabla 2-2.

Los hallazgos en la concentración de sólidos solubles en los EEP expresados en mg/ml

de solución se presentan en la Tabla 2-3, según la zona de origen geográfico y la

solución hidroalcohólica empleada para la extracción (Anexo B).



TABLA 2-1. Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis

mellifera de Colombia colectadas en tres regiones de Colombia durante el periodo 2008-

2010

Indicador microbiológico N Promedio* Moda* Mínimo* Máximo*

Coliformes totales 53 79x102 < 1 < 1 29x10

4

Mohos y levaduras 53 10x104 < 1 < 1 16x10

5

Aerobios mesófilos 53 93x103 60 20 24x10

5

Coliformes fecales 53 < 1 < 1 < 1 10

Staphylococcus sp 53 94 < 1 < 1 30x102

Patógenos N Detección

Escherichia coli 51 Ausencia

2 Presencia

Staphylococcus aureus 52 Ausencia

1 Presencia

*Microorganismos por gramo de propóleo crudo (UFC/g)

TABLA 2-2. Control de calidad microbiológico de muestras de propóleo de abejas Apis

mellifera de Colombia según el requisito de las normas internacionales (n = 53)

Resultado por indicador

Indicador microbiológico Aceptables (%) Límites (UFC/g)

Japón Perú El Salvador Japón Perú

El Salvador

Coliformes totales 45 n.r. 23 0 n.r. < 100

Mohos y levaduras 6 8 8 ≤ 30 10-100 1-100

Aerobios mesófilos n.r. 57 57 n.r. 1.000-10.000 <10.000

Coliformes fecales n.r. n.r. 96 n.r. n.r. 0

Staphylococcus sp n.r. n.r. 85 n.r. n.r. < 1

Ausencia (%) Presencia (%)

Escherichiacoli n.r. 96 n.r. n.r. 3-10 n.r.

Staphylococcus aureus n.r. n.r. 98 n.r. n.r. 100

Resultado por norma 6 8 8

UFC/g: Unidades formadoras de colonia por gramo; n.r.: No reporta; ≤ : Menor o igual que;

< : Menor que



23

TABLA 2-3. Concentración de extracto seco a partir de dos concentraciones de etanol

Promedios de extracto seco por región geográfica y concentración del disolvente

Región EEP (Extracto seco mg/ml)

Et. 70% Et. 90%

Boyacá 81,9 ± 41,7 154,4 ± 49,8

Cundinamarca 85,0 ± 37,9 175,2 ± 62,7

Santander 103,3 ± 75,7 187,4 ± 90,4

Promedio 93,0 ± 60,0 175,3 ± 74,2

Chile 96,0 186,0

Nueva Zelanda 121,0 132,0

Cuba 105,0 211,0

Bélgica 146,0 249,0

Et: Concentración del etanol

Más del 50% de los EEP colombianos se consideraron aceptables para las normas de Brasil,

Argentina y Japón (Tabla 2-4).

TABLA 2-4. Porcentaje de muestras aceptables en rendimiento de extracto seco de

propóleos de abejas Apis mellifera en Colombia comparadas con el porcentaje de extracto

seco reportado en las normas para propóleo de Brasil, Argentina y Japón. (n = 118)

Aceptables (%)

Extracto seco (%)

EEP Brasil Argentina Japón Brasil1 Argentina

2 Japón

3

Et. 70% 53,4 58,6 75,9 11 10 8

Et. 96% 56,1 59,1 69,7

1. (Ministerio da Agricultura, Pecuaria e Abastecimento. Brasil 2001); 2. (Comisión Nacional

de Alimentos. Argentina 2008); 3. (Japan Council of Propolis. Japón 2010)



2.4 Discusión

Los principales indicadores del porcentaje de rechazo de las muestras evaluadas, según

la confrontación con las normas internacionales en cuanto a la calidad microbiológica del

producto, son los recuentos de mohos y levaduras. La presencia de hongos se puede

explicar debido a un mal manejo asociado a la humedad de la materia prima.

Adicionalmente, el crecimiento de estos microorganismos se puede dar por la presencia

de trazas de miel y polen en el propóleo crudo obtenido de la colmena.

Los coliformes totales y los aerobios mesófilos son indicadores microbiológicos de

importancia para las muestras de propóleo crudo evaluadas (Tabla 2-2); un porcentaje

alto de muestras superan los límites en las normas internacionales, lo cual indica

probablemente condiciones sanitarias deficientes en el proceso de recolección y

conservación de las muestras.

El 4% de las muestras de propóleo crudo fueron positivas para coliformes fecales (Tabla

2-2), en donde el criterio de aceptación es igual a cero en la norma salvadoreña; lo

anterior sugiere una probable contaminación de fuente fecal humana o animal,

contaminación que pudo producirse durante el proceso de recolección en campo de las

muestras. Para el indicador de E. coli, requisito en la norma peruana, 4% de las muestras

tuvieron presencia de esta bacteria.

El 2% de las muestras de propóleo crudo registraron presencia de S. aureus (Tabla 2-2.).

Esta bacteria es indicadora de condiciones de manejo o deficiencia de proceso; pueden

provenir de la piel, la garganta, la nariz durante la manipulación de la materia prima.

En cuanto a la determinación de materia seca parámetro que cuantifica el porcentaje de

sólidos solubles extraídos de propóleos, en promedio, el 9,3% de las muestras presentó

sólidos solubles entre 81,9 y 103,3 mg/ml, cuando se empleó como solvente etanol al

70%. Un aumento en la concentración de etanol (96%) incrementa el número de

muestras (17,5 en promedio) que muestran valores de sólidos superiores (154,4 – 187,4

mg/ml) al anteriormente mencionado (Tabla 2-3), resultados semejantes a los

anteriormente obtenidos con etanol al 70%, de EEP colombianos que variaron en un



25

rango de 2,72 a 9,17% (Bastos et al. 2011a), de propóleos brasileños (propóleo marrón)

que presentaron valores entre 2,6 a 27,6% (Bastos et al. 2011b) y de propóleos de Chile

(propóleo de producción especializada) 9,6% (Et. 70%) y 18,6 (Et. 96%); Cuba (propóleo

rojo cubano) 10,5 (Et. 70%) y 14,6% (Et. 96%); Nueva Zelanda (propóleo de colmenas en

producción de miel de Manuka) 12,1% (Et. 70%) y 13,2 (Et. 96%); Bélgica 21,1% (Et.

70%) y 24,9% (Et. 6%), evaluados en el presente estudio (Tabla 2-3).

Las extracciones con etanol al 70% mostraron valores promedio de extractos secos

menores a los obtenidos con la extracción con etanol al 96%, lo cual se explica en parte

a la menor solubilidad de resinas y ceras en el agua (Tabla 2-3), justificado en parte por

la menor solubilidad de las resinas y las ceras en el agua, condición que se presentó al

emplear la disolución etanólica (70%) que contiene la mayor proporción de agua. Bastos

et al. (2011b) mencionan que las altas desviaciones estándar de la materia seca de EEP

están influidas por su ubicación geográfica, el origen botánico, el clima y la composición

del suelo, que se refleja en este parámetro fisicoquímico. Los EEP evaluados en este

estudio presentaron una alta fluctuación en cuanto al porcentaje de extracto seco en

cada región. Adicionalmente, en investigaciones anteriores hay evidencias de una mayor

actividad antibacteriana (S. aureus y E. coli) cuando el porcentaje de extracto seco es

más alto (Bastos et al. 2011a; Bastos et al. 2011b).

La normatividad internacional existente en Brasil, Argentina y Japón establecen un

mínimo de 11, 10 y 8%, respectivamente, en el de extracto seco obtenido del EEP (Tabla

2-4).

Las muestras de EEP colombianos que no cumplieron con la concentración exigida por

las normas internacionales se puede explicar por la calidad del propóleo crudo, en

términos de impurezas, y la proporción de cera de abejas en la materia prima.

2.5 Conclusiones

El modelo de obtención de propóleos en campo debe evaluarse en Colombia,

considerando la biodiversidad botánica presente en las distintas regiones y los sistemas

de producción. La normatividad para el control microbiológico y para la estandarización



de rendimiento en extracto seco ha de adoptarse mediante una norma propia, para dar

claridad de la condición de comercio de este producto dentro del territorio nacional.

Colombia ha avanzado en la tipificación en cuanto a actividad biológica de los propóleos

por regiones geográficas, pero se hace necesario un mayor conocimiento sobre la

composición fisicoquímica y la determinación de marcadores químicos que permitan

identificarlos. Adicionalmente, se requiere ampliar las zonas de estudio de tal manera que

se encuentren zonas recomendadas para la producción de propóleos, y apicultores

especializados en producirlo con sistemas productivos eficientes.

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3. Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico en Colombia

3.1 Introducción

El propóleo que elaboran las Apis mellifera en particular y en general las abejas, a partir

de la colecta de resinas de las plantas, han mostrado por sus componentes un gran

potencial bioactivo. Los reportes indican que el propóleo presenta una eficiente actividad

frente a bacterias Gram positivas y limitada acción frente a bacterias Gram negativas

(Sforcin, Fernandes, Lopes, Bankova, & Funari, 2000). La actividad antibacteriana in vitro

ya fue evidenciada frente a varias cepas bacterianas incluyendo bacterias como la

Salmonella de importancia en alimentos y salud humana (Orsi, y otros, 2005), de la

cavidad oral como Streptococcus mutans (Moreno, Martínez, & Figueroa, 2007) y

algunas anaeróbicas (Santos, Bastos, Rodrigues, & et al, 2002) y otras de interés

veterinario (Bastos, Simone, Jorge, & et al, 2008).

La actividad antimicrobiana de los compuestos de los propóleos no está clara. Takaisi-

Kikuni y Schilcher (Takaisi-Kikuni & Schilcher, 1994) proponen que los extractos

etanólicos de propóleo intervienen con la división de Streptococcus agalactiae

promoviendo la desorganización citoplasmática y la inhibición de la síntesis de proteína.

Los principales responsables de estos efectos reportados son alcoholes, aldehídos,

aminoácidos, ácidos alifáticos, ácidos aromáticos, ésteres aromáticos, flavonoides,

ácidos grasos, ácidos p-cumáricos prenilados, ácidos cafeoilquínicos, lignanos, ácidos

diterpénicos, triterpenos, esteroides y azúcares (Marcucci M. , 1995) (Bankova, de

Castro, & Marcucci, 2000). La actividad antimicrobiana de propóleos europeos ha sido

asociada con presencia de flavonoides y derivados de ácido cafeico (Hegazi, Abd-El-

Hady & Abd-Allah, 2000; Prytzyk y otros, 2003), en el caso de muestras tropicales, los

compuestos bioactivos principales son ácidos fenólicos y derivados prenilatados

(Trusheva, y otros, 2004).



La composición química del propóleo varía de acuerdo a la región, la especie de las

abejas recolectoras (Ghisalberti, 1979, citado en Bastos, Galbiati , Loureiro, & Scoaris,

2011), pero sobretodo está estrechamente asociada con el origen botánico (Greenaway

et ál. 1987, citado en Amoros, Lurton, Boustiel, & Girre, 1994), lo que refleja la diversidad

de actividades biológicas que presenta el producto. Encontrándose diferencias entre

muestras de países templados y tropicales e inclusive diferencias entre muestras

tropicales según la flora local en el lugar de colecta (Marcucci & Bankova, 1999; Park,

Alencar, & Aguiar, 2002). Como ejemplos, el propóleo verde brasilero o “propóleo

alecrim” es originario de Baccharis dracunculifolia (Asteraceae) (Park, Paredes-Guzman,

Aguiar, Alencar, & Fujiwara, 2004; Teixeira, Negri, Meira, Message, & Salatino, 2005), el

propóleo rojo cubano de Clusia nemorosa (Clusiaceae) (Hernandez, Fernandez, Cuesta-

Rubio, Piccinelli, & Rastrelli, 2005) y más recientemente el propóleo rojo colectado en la

región norte de Brasil (Trusheva, y otros, 2006).

Colombia (Sur América) como país tropical, tiene una gran diversidad botánica, para la

colecta de propóleos por parte de las abejas, haciendo difícil la determinación de las

especies vegetales que originan la composición química; a diferencia de las zonas

templadas en donde predominan grandes extensiones de especies vegetales específicas

haciendo posible esta correlación.

El presente estudio tiene por objetivo evaluar la concentración mínima inhibitoria

propóleos de las abejas Apis mellifera de diferentes orígenes geográficos extraídos

mediante dos concentraciones diferentes de etanol y su actividad antibacteriana in vitro.

3.2 Materiales y métodos




mediante indicadores microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N° 2007C3476 111-

5832007” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia.

3 Actividad antibacterial de propóleos ligado al origen geográfico de Colombia 33


Se emplearon muestras de propóleo crudo provenientes de tres origenes geográficos, 16

de Boyacá, 20 de Cundinamarca y 34 de Santander, en su mayoría obtenidas mediante

raspado de colmenas comerciales de Apis mellifera entre los años 2008 y 2010. Se

incluyó en este estudio una muestra de propóleo crudo de cada uno de los siguientes

países: Bélgica, Chile, Cuba y Nueva Zelanda.

3.2.2 Concentración mínima inhibitoria

La Concentración Mínima Inhibitoria (MIC, siglas en ingles), fue determinada por medio

del método de microdilución en caldo descrito por el Clinical Laboratory Standards

Institute (CLSI, 2012; Andrews, 2001). Cepas bacterianas de la American Type Culture

Collection (ATCC) fueron empledas tales como Staphylococcus aureus ATCC 6538,

Escherichia coli ATCC 31617, Klebsiella pneumoniae subespecie pneumoniae ATCC

700603, Salmonella entérica subespecie entérica serovar typhimurium ATCC 14028,

Bacillus subtilis subespecie spizizenii ATCC 6633 y Micrococcus luteus kocuria spizizenii

ATCC 9341, La activación de las cepas se realizo de acuerdo a la indicación de la casa

comercial, en caldo BHI (Oxoid Ltd Basingstone, Hampshire, England) e incubación

durante 18h a 37°C. Inoculos bacterianos fueron preparados en Agar Plate Count

(DifcoTM Le Pont de Claix, France) rayando por agotamiento e incubando a 24h a 37°C;

se observo el crecimiento bacterial como control de verificación de la idoneidad de la

bacteria, posteriormente se tomó una colonia aislada para una segunda siembra en Agar

Plate Count; tomando de allí una colonia media para ser ajustada al 0,5 del estándar de

turbidez de McFarland (1 x 108 UFC ml-1) en 10 ml de solución salina. En una placa de

microdilución de 96 pozos fueron colocados 100 µl de caldo Mueller-Hinton y de EEP

obtenidos a partir de etanol al 70 y 96% en un experiemento previo (Talero & Figueroa,

2012), estos fueron llevados en un tubo a una concentración de 6,4 mg/ml y se adicionó

100 µl de cada uno a los primeros pozos, posteriormente se realizaron diluciones

seriadas en base dos hasta completar 6 diluciones (3,2; 1,6; 0,8; 0,4; 0,2; 0,1 mg/ml),

utilizando los restantes pozos para la repetición, de cada placa de microdilución. De esta

manera se consiguieron las diluciones ó concentraciones (mg/ml) de EEP, a probar. De

la suspensión bacterial 10 µl fue adicionada en los pozos que contenían propóleo. Luego

de este proceso, se incubo por 24 h a 37°C. Pasado este lapso de tiempo se realizo un

subcultivo con asa calibrada de 1 µl en placa de Petri en Agar Mueller-Hinton (Oxoid Ltd.,



Basingstone, Hampshire, England) y se llevó nuevamente a incubación bajo las mismas

condiciones anteriores.

Para este estudio se incluyó un control con alcohol etílico al 96% en el mismo volumen

de cada EEP, un control de crecimiento libre de las bacterias y uno de esterilidad del

caldo.

La concentración mínima inhibitoria (MIC) fue definida como la más baja concentración o

la más alta dilución del EEP en que el subcultivo dio negativo o no presentó colonias

visibles.

3.3 Resultados

Los resultados obtenidos fueron analizados a partir de sus medianas y se empleó el

análisis de varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis (H) para determinar las diferencias

significativas, los datos fueron ordenados para establecer los valores de P entre orígenes

geográficos por bacteria en la Tabla 3-1 y los valores de P dentro de cada origen

geográfico para las extracciones de propóleo con etanol al 70 y 96% (Et. 70 y 96%) para

cada bacteria empleada en el estudio (Tabla 3-2).

Los análisis de varianza no paramétricos de MIC de EEP (Et. 70 y 96%) frente a E. coli y

S. aureus de muestras extranjeras (países: Bélgica, Chile, Cuba, Nueva Zelanda) y

colombianas se presentan en la Tabla 3-3.

TABLA 3-1. Actividad antibacterial de EEP (MIC, mg/ml) diferenciada entre orígenes geográficos

en Colombia.

EEP (Et. 70%) E. coli Salmonella Klebsiella Micrococcus S. aureus B. subtilis

MIC

Santander 0,8 H=0,865 P=0,649

0,8 H=2,368 P=0,306

0,1 H=1,793 P=0,408

0,8 H=3,937 P=0,139

0,8 H=0,292 P=0,864

0,1 H=4,168 P=0,124

Boyacá 1,2 1,2 0,1 1,6 0,8 0,1

Cundinamarca 0,8 1,6 0,7 1,6 0,4 0,1

EEP (Et. 96%) E, coli Salmonella Klebsiella Micrococcus S, aureus B, subtilis

MIC

Santander 0,8 H=1,902 P=0,386

0,8 H=2,552 P=0,279

0,1 H=0,289 P=0,865

0,4 H=9,868 P=0,007*

0,3 H=7,184 P=0,027*

0,1 H=1,930 P=0,381

Boyacá 0,8 0,8 0,1 0,8 1,2 0,1

Cundinamarca 0,8 0,8 0,1 0,8 0,4 0,1

H=Kruskal-Wallis; P=Probabilidad; MIC=Concentración minima inhibitoria; EEP= Extracto etanolico de propoleo; Et.=Etanol; * P<0,05.


TABLA 3-2. Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial

según origen geográfico en Colombia.

TABLA 3-3. Efecto de la concentración del etanol de los EEP sobre la actividad antibacterial de

muestras extranjeras (Bélgica, Chile, Cuba, Nueva Zelanda) y el origen geográfico en Colombia.

EEP (Et. 70%) E. coli S. aureus

Santander

H=0,944 P=0,815

H=5,142 P=0,161

Boyacá

Cundinamarca

Extranjeras

EEP (Et. 96%) E. coli S. aureus

Santander

H=0,905 P=0,824

H=7,077 P=0,069

Boyacá

Cundinamarca

Extranjeras

E. coli

EEP (Et. 70 - 96%) S. aureus

EEP (Et. 70 - 96%)

Extranjeras

MIC EEP (Et. 70%) EEP (Et. 96%)

H=2,734 P=0,098

0,8 0,6

H=0,202 P=0,653

0,1 0,3

H=K-W; P=Probabilidad; MIC=Concentración minima inhibitoria; EEP= Extracto etanolico de propoleo; Et.=Etanol; * P<0,05.

3.4 Discusión

Los propóleos de los tres orígenes geográficos evaluados (Tabla 3-1), presentan una

MIC frente a bacterias Gram positivas estadísticamente similar cuando se empleó

extracción con etanol al 70%, no encontrado diferencias significativas; sin embargo en la

Santander Boyacá Cundinamarca

EEP (Et.)

70% 96% 70% 96% 70% 96%

E. coli

H = 8,739 P = 0,003*

H = 1,244 P = 0,265

H = 4,728 P = 0,029*

Salmonella

H = 0,901

P = 0,343 H = 0,271 P = 0,602

H = 0,493 P = 0,483

Klebsiella

H = 0,193

P = 0,660 H = 1,063 P = 0,302

H = 0,056 P = 0,812

Micrococcus

H = 9,423

P = 0,002* H = 0,516 P = 0,472

H = 3,216 P = 0,073

S. aureus

H = 5,713

P = 0,017* H = 1,560 P = 0,212

H = 0,926 P = 0,336

B. subtilis

H = 9,668

P = 0,002* H = 0,479 P = 0,489

H = 1,736 P = 0,188

H=K-W; P=Probabilidad; EEP= Extracto etanolico de propoleo; Et.=Etanol; * P<0,05.



Figura 3-1, se observa que los EEP de los tres departamentos presentaron mayor

actividad frente a B. subtilis con una MIC de 0,1 mg/ml.

En la Tabla 3-1, los resultados muestran que existe diferencia significativa (P<0,05) entre

los propóleos evaluados en su actividad antibacteriana (Gram positivas) de los tres

orígenes geográficos cuando se empleo extracción con etanol al 96%. Persiste la

susceptibilidad de B. subtilis para los EEP (Et. 96%). En la Figura 3-2 se observa que los

propoleos del departamento de Santander presentaron mayor actividad antibacterial para

las tres bacterias Gram positivas incluidas en el experimento.


En cuanto al modelo de extracción etanólica cuando se empleo etanol al 70 o al 96% y su

actividad antibacteriana en Gram positivas, los propóleos del departamento de Santander

presentaron diferencias significativas (P<0,05) (Tabla 3-2).

La evaluación de MIC de los EEP (Et. 70%) de bacterias Gram negativas no mostraron

diferencias significativas (P>0,05) (Tabla 3-1); sin embargo, Klebsiella presentó mayor

susceptibilidad con medianas en concentraciones de 0,1 mg/ml (Figura 3-3).

Igualmente no se presentaron diferencias significativas (P>0,05) entre los EEP (Et. 96%)

en la actividad antibacteriana de Gram negativas (Tabla 3-1). Las MIC (medianas) para

los EEP de los tres departamentos frente a Klebsiella fueron de 0,1 mg/ml, las MIC frente

a Salmonella y E. coli se comportaron similarmente (Figura 3-4).

En la Tabla 3-2, se observa que en el modelo de extracción etanólica cuando se empleo

etanol al 70 o al 96% y su actividad antibacteriana en Gram negativas, los propóleos del

departamento de Santander y Cundinamarca presentaron diferencias significativas

(P<0,05) únicamente para la bacteria E. coli.

Los resultados de las muestras extranjeras no mostraron diferencias significativas

(P>0,05) con los resultados de las muestras nacionales frente a las bacterias E. coli y S.



aureus, tampoco en el empleo de los dos modelos de EEP con etanol al 70% y al 96%

(Tabla 3).

Cabe notar que de acuerdo con datos de la literatura se afirma que los propóleos son

activos frente a bacterias Gram positivas, pero limitada actividad contra bacterias Gram

negativas (Bankova, y otros, 1999; Sforcin, Fernandes, Lopes, Bankova, & Funari, 2000;

Drago, De Vecchi, Nicola, & Gismondo, 2007). Los propóleos llevados a extractos

etanólicos en este estudio presentaron actividad frente a todas las cepas en

concentraciones de 3,2 a 0,1 mg/ml, con especial actividad frente a Klebsiella (Gram

negativa) y B. subtilis (Gram positiva). Estos mismos autores describen a E. coli, como

una bacteria Gram negativo de gran interés clínico, como una bacteria de baja

susceptibilidad a los propoleos (Bastos, Galbiati , Loureiro, & Scoaris, 2011), también

estudios llevados a cabo por la empresa Apis Flora Industrial e Comercial LTDA

(Ribeir˜ao Preto, SP, Brazil) muestra resistencia de E. coli cuando fue expuesto a

extractos etanolicos de propóleo y extractos acuosos de propoleos (PWE, siglas en

ingles) (Alves Rocha, Pires Bueno, de Oliveira Lima Leite Vaz, & et al,

2013), encontrando en el presente experimento MIC entre 0,8 a 1,2 mg/ml de EEP de

origen geográfico en Colombia para la cepa en estudio.


3.5 Conclusiones

Es necesario realizar muestreos experimentales de propóleos crudos diferenciados en

áreas de alta producción de la materia prima, e incluir análisis de laboratorio de su

procedencia botánica, así como la fotoquímica presente en las muestras. Los resultados

obtenidos son alentadores considerando la bibliografía internacional, se hace necesario

profundizar en ensayos que permitan la estandarización de los EEP por su actividad

biológica y la concentración de sus compuestos activos, que es uno de los pasos que en

la actualidad busca la investigación e industria internacional.

Actualmente existen nuevas metodologías para la obtención de EEP (aceites, agua, etc),

es necesario ahondar en su composición química y la actividad biológica, para propóleos

obtenidos en el país, con una alta oferta de fuentes botánicas, bajo estas metodologías..

El entendimiento de los procesos o “mecanismos de acción del propoleo en celulas

bacterianas es complejo y no puede ser una simple analogia del modo de acción de

cualquier antibiotico clasico” (Takaisi-Kikuni & Schilcher, 1994). Es necesario realizar

para los propoleos investigaciones de biologia celular, por ejemplo en los mecanismos

que afectan la adesión de la bacteria hasta ahora desconocidos (Drago, De Vecchi,

Nicola, & Gismondo, 2007), existen hipótesis para explicar la adherencia disminuida en

Staphylococcus aureus (Scazzocchio, D’Auria, Alessandrini, & F., 2006).

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4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo en Colombia

4.1 INTRODUCCIÓN

El propóleo es un producto natural de las abejas Apis mellifera, derivado del metabolismo

de las plantas, desde tiempos inmemorables ha sido utilizado por el hombre para su

salud, actualmente existe una tendencia mundial hacia la demanda de este producto,

registrándose aumentos en la producción mundial.

Los propóleos se utilizan ampliamente en la preparación de los medicamentos en

diferentes regiones del mundo, en Europa y en algunos países de Sur América como

Brasil y Uruguay se han utilizado como un agente terapéutico durante muchos años

(Azevedo et al. 1999). Su composición puede variar de acuerdo a las plantas que

puedan ser encontradas en cada región. (Sawaya, y otros, 2002) y la temporada de su

colección (Quiroga, Sampietro, Sobero, Sgariglia, & Vattuone, 2005).

Como alternativa a la micosis, se encuentra el propóleo (Silici, Koç, Ayangil, & Çankaya,

2005). La micosis superficial es una enfermedad de la piel y sus apéndices, es causada

por hongos y afecta los tejidos ricos en queratina, Tiene la afinidad para parasitar

queratina tejidos ricos, produciendo respuesta térmica inflamatoria y picazón intensa

además de un aspecto cosméticamente pobre. En este contexto, es necesario a largo

plazo la terapia supresora con agentes antifúngicos, que puede conducir a la selección

de cepas resistentes (Silici & Koc, 2006).

Los flavonoides, ácidos aromáticos, ácidos diterpénicos ácidos y compuestos fenólicos

parecen ser los componentes principales que son responsables de la actividades

biológicas de muestras de propóleos (Silici, Koç, Ayangil, & Çankaya, 2005). Los

flavonoides en el propóleo (principalmente pinocembrina) ha sido considerado



responsable de su efecto inhibitorio sobre la Candida, pero sólo se han encontrado trazas

de estos compuestos en propóleos de origen sudamericano (Sawaya, y otros, 2002).

Los propóleos centroeuropeos (Alemania, Francia y Austria), con composiciones

cualitativas similares y predominio del ácido trans-p-cumárico, muestran actividad frente

a Candida albicans, mientras que los mediterráneos (Bulgaria, Turquía, Grecia y Argelia),

que contienen flavonoides, ésteres del ácido cafeico y ácidos ferúlicos, presenta menor

actividad antifúngica. Por su parte, el propóleo egipcio de Dakahlia, con dos ésteres de

cafeato y dos triterpenoides, es más activo frente a Candida albicans que el de Ismailia

que no contiene ácidos aromáticos, ni ésteres, ni flavonoides. Estudios sobre la

incidencia de la paracoccidiomicosis en América latina, sugieren que,

independientemente de su origen geográfico, los macrófagos estimulados con propóleo

aumentan su actividad fungicida (Burdock G. A., 1998).

Compuestos como la pinocembrina y galangina, aislados de propóleo del noreste de

Argentina demuestran que los extractos etanólicos de propóleo purificados y sus

compuestos aislados tienen actividad antifúngica y pueden ser empleados como

antifúngicos naturales (Quiroga et al. 2005).

En Brasil se correlacionó la composición química de los extractos etanólicos de

propóleos, de dos regiones geográficas, con la actividad antimicrobiana, lo cual demostró

que ácidos como el cumárico son importantes sobre la actividad biológica que presentan

los propóleos brasileros (Salomão, y otros, 2008).

Actividad in vitro de agentes antifúngicos y antisépticos fue evaluada frente a

dermatofitos incluido Trichophyton rubrum, la concentración mínima inhibitoria fue

determinada por el método de dilución en agar, señalando que el propóleo tuvo un

comportamiento similar a los otros medicamentos comerciales (Soares & Cury, 2001). De

la misma manera, en un estudio posterior utilizando además propoleo verde y rojo

brasilero se evaluó para Trichophyton rubrum la actividad fungicida y fungistática

(Siqueira et al. 2008).

4. Actividad antifúngica frente a Trichophyton rubrum de propóleo 45

El objetivo de esta investigación fue evaluar los propóleos colombianos frente a la

actividad antifúngica con Trichophyton rubrum.

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS




mediante indicadores microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N° 2007C3476 111-

5832007 financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia.


Se emplearon muestras de propóleo crudo provenientes de tres orígenes geográficos, 15

de Boyacá, 13 de Cundinamarca y 16 de Santander, en su mayoría obtenidas mediante

raspado de colmenas comerciales de Apis mellifera entre los años 2008 y 2010. Se

incluyó en este estudio una muestra de propóleo crudo de cada uno de los siguientes

países: Chile, Cuba y Nueva Zelanda.

4.2.2 Activación de la cepa de referencia

Se reconstituyó la cepa de referencia, Trichophyton rubrum ATCC 28188 liofilizada, con

0,5 ml de agua estéril hasta lograr una mezcla homogénea, se dejó por dos horas para

que se sedimentara y posteriormente se mezcló la suspensión para inocular en superficie

en 250 ml del medio de cultivo. Se incubó a 30º C y cuando hubo crecimiento

considerable del hongo (fase esporulada), formando un tapete sobre toda la superficie de

la botella, se realizó un lavado con 30 ml de solución salina al 0.86% y perlas de vidrio

estériles para desprender las esporas. Al obtenerse una suspensión densa del hongo se

filtró y homogenizó verificando la concentración de UFC/ml mediante recuento en

Cámara de Neubauer. Posteriormente se realizaron las alícuotas en crioviales plásticos

con agua estéril rotulando el vial con el código correspondiente de la cepa y la fecha de

recolección y se guardaron en el refrigerador a una temperatura de 4 °C (Petrikkou, y

otros, 2001).



4.2.3 Concentración mínima inhibitoria

La determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC, siglas en ingles) de los

extractos etanólicos de propóleo (EEP) colombianos frente a Trichophyton rubrum ATCC

28188, se realizó empleando la técnica de dilución agar en placa (CLSI, 2002; Soares &

Cury, 2001), y se evaluó los EEP obtenidos a partir de etanol al 70 y 96% en un

experiemento previo (Talero, Hernandez, & Figueroa, 2012), haciendo diluciones del

extracto con Agar PDA, para obtener concentraciones entre 0,5 a 16,0 mg/ml del EEP.

Se determinó la actividad fungistática y fungicida de los propóleos observando el

crecimiento radial del hongo, haciendo una medición en centímetros (cm) tanto del

control como de las muestras corridas, determinando el porcentaje de inhibición del

crecimiento (Reyes et al. 1997). La medición se realizó cada 72 horas en un periodo de

15 días.

Para este estudio se incluye un control con alcohol etílico al 96% en el mismo volumen

de cada EEP y un control del crecimiento libre del hongo.

La actividad fungicida se define como la más baja concentración o la más alta dilución del

EEP en que el subcultivo da negativo o no presente colonias visibles y la actividad

fungistática será definida como la más baja concentración o la más alta dilución del EEP

en que el subcultivo presenta disminución del diámetro con respecto al control.

4.3 Resultados

4.3.1 Crecimiento

Se midió el crecimiento del hongo Trichophyton rubrum ATCC 28188 sometido a seis

niveles de concentración de Extracto Etanólico de Propóleo (EEP).

El crecimiento se determinó midiendo el diámetro (cm) y se transformó a unidades de

área (cm2). Durante el desarrollo del experimento se realizaron 24 controles con los que

se construyó la curva de crecimiento del hongo (Figura 4-1).


En la Figuras 4-3 se muestran las curvas de crecimiento de Trichophyton rubrum de las

muestras de los departamentos de Santander, Cundinamarca y Boyacá, con dos

concentraciones de alcohol. No se construyeron las curvas de crecimiento para los

propóleos de Boyacá (70%) y extranjeros (70 y 96%) porque no hubo crecimiento en los

seis niveles de concentración del EEP.

Donde está la tasa de crecimiento del control de solventes?

Figura 4-1. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum en el Control. La curva se

ajusta a un modelo logístico que corresponde a con s = 0.437, r2 =

0.996

Donde está la tasa de crecimiento del control de solventes?



70% 96%

Sa

nta

nd

er

Cu

nd

ina

ma

rca

Bo

ya

cá

Figura 4-3. Curva de crecimiento de Trichophyton rubrum a diferentes diluciones de EEP

en Santander, Cundinamarca y Boyacá, en Alcohol 70% y 96%

( , mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml, mg/ml)

En los tres departamentos, a diferentes diluciones del EEP, tanto en alcohol a 96% como

a 70%, el crecimiento de Trichophyton rubrum (medido en cm2) estuvo por debajo del

crecimiento en el control. De especial interés resultan las diluciones de 8 mg/ml de EEP

en alcohol al 70% y 96% en los departamentos de Santander y Cundinamarca en los que

el crecimiento del hongo fue totalmente inhibido.

100% de inhibición


4.3.2 Inhibición

El crecimiento del hongo fue inhibido en el 100 % en las diluciones de EEP del 16mg/ml.

En el departamento de Boyacá la inhibición fue mucho mayor que en Santander y

Cundinamarca (Figuras 4-7 y 4-8). Las muestras señaladas como ‘Extranjeras’ (1 de

Nueva Zelanda, 1 de Chile y 1 de Cuba) presentaron el mayor porcentaje de inhibición

del hongo en todas las concentraciones. Es importante advertir que las desviaciones

estándar (1 DE) tienden a ser mayores en la medida que las diluciones de EEP son

menores (Tablas 4-1 y 4-2).

Figura 4-7. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los

departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 70% y en seis

niveles de concentración de EEP



Figura 4-8. Porcentaje de inhibición del crecimiento de Trichophyton rubrum en los

departamentos de Boyacá, Santander y Cundinamarca, en alcohol al 96% y en seis

niveles de concentración de EEP

Desde la perspectiva estadística, no se presentaron diferencias estadísticas entre

concentraciones de etanol al 70% y 96% (F=0.000042, p=0.9948), pero sí fueron muy

altamente significativas entre departamentos (F=28.69, p<0.0001). Efectivamente, el

comportamiento de los promedios de inhibición de las concentraciones de etanol al 70%

y 96% fueron bastante similares (Figuras 4-7 y 4-8), mientras que los promedios de

inhibición entre Cundinamarca y Santander con Boyacá y Extranjeras fueron muy

diferentes (32% y 41%, 96% y 100%, respectivamente); la acción inhibidora de los EEP

en alcohol al 70% y 96% de Boyacá son muy similares a las muestras ‘Extranjeras’.

Tabla 4-1. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro

zonas, en etanol 70%

EEP (70%)

ZONA 16,00 8,00 4,00 2,00 1,00 0,50

Boyacá Promedio 100 100 100 100 100 98.7

DE - - - - - 5.2

Cundinamarca Promedio 100 100 93.6 71.3 49.2 33.9

DE - - 15.7 29.5 32.7 35.3

Santander Promedio 100 98.4 85.2 61.4 49.5 37.0

DE - 5.3 26.3 39.5 40.9 40.2


Extranjeras Promedio 100 100 100 100 100 100

DE - - - - - -

DE: Desviación Estándar

4.3.3 Concentración Mínima Fungicida

Las Concentraciones Mínimas Fungicidas (CMF) fueron estimadas según las frecuencias

relativas en cada una de las diluciones, en las cuatro zonas, en etanol al 70% y 96%. En

Boyacá y en las muestras ‘Extranjeras’, las CMF son las correspondientes a las

diluciones al 0,5 mg/ml, tanto para etanol al 70% como al 96%; en Cundinamarca y

Santander, las CMF son las correspondientes a las diluciones al 4 mg/ml (si se tiene en

cuenta únicamente la mediana de cada muestra), aunque porcentualmente hubo más

muestras con diluciones al 8% en Santander, tanto para etanol al 70% como al 96%

(Tabla 4-3, Figura 4-9).

Tabla 4-2. Frecuencias relativas de la inhibición de las seis diluciones de EEP, en cuatro

zonas, en etanol 96%

EEP (96%)

ZONA 16,00 8,00 4,00 2,00 1,00 0,50

Boyacá

Promedio 100 100 100 100 97.2 93.1

DE - - - - 7.5 14.7

Cundinamarca

Promedio 100 97.4 84.2 63.0 39.7 30.5

DE - 7.1 20.9 32.5 28.3 34.6

Santander

Promedio 100 100 88.7 67.4 53.5 44.9

DE - - 20.9 33.4 39.6 44.6

Extranjeras

Promedio 100 100 100 100 100 100

DE - - - - - -

DE: Desviación Estándar



Tabla 4-3. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida

en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes

Diluciones EEP Mediana

16,0 8,0 4,0 2,0 1,0 0,5

Boyacá 70% 6,7 93,3 0,5

96% 13,3 6,7 80 0,5

Cundinamarca 70% 25 33,3 25 0 16,7 4,0

96% 14,3 28,6 28,6 21,4 7,1 4,0

Santander 70% 7,1 28,6 21,4 7,1 7,1 28,6 4,0

96% 6,3 37,5 18,8 6,3 31,3 4,0

Extranjeras 70% 100 0,5

96% 100 0,5

Figura 4-9. Frecuencias relativas (%) para estimar las Concentración Mínima Fungicida

en las seis diluciones de EEP, en etanol al 70% y 96%, en cuatro zonas diferentes


4.4 Discusión

Los EEP en estudio mostraron actividad fungistatica cuando la concentración inicia en

0,5 mg/ml en T. rubrum y son fungicidas cuando la concentración se incrementa hasta

16,0 mg/ml, la zona que presentó mayor actividad antifúngica frente a T. rubrum es el

origen geográfico de Boyacá en comparación con Cundinamarca y Santander.

Los extractos con etanol al 70% de los tres orígenes geográficos presentaron mayor

actividad antifungica en comparación a los extractos que se obtuvieron con etanol al 96%

proponiendo que el modelo de extracción hidroalcoholico para estos propóleos en

Colombia, podría generar mejores actividades biológicas frente a hongos.

Los EEP (Et. 70 y 96%) de los tres orígenes geográficos son activos en las

concentraciones de 0,5 a 16,0 mg/ml, comparable con las muestras extranjeras incluidas

en el estudio y con los trabajos previos (Silici, Koç, Ayangil, & Çankaya, 2005; Soares &

Cury, 2001; Siqueira, y otros, 2008).

4.5 Conclusiones

De acuerdo con los resultados obtenidos en el presente trabajo es posible concluir que el

EEP demostró una actividad antifúngica más eficiente al extraerse con etanol al 70% y

para la zona de Boyacá. La cepa de T. rubrum demostró ser sensible a la actividad

antifúngica de los extractos alcohólicos.

Se sugieren estudios en el futuro con aplicaciones como tratamiento alternativo contra T.

rubrum, T. tonsurans y T. mentagrophytes spp.

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5. Uso del bacteriófago lambda como indicador de actividad antiviral in vitro de propóleos de Colombia

5.1 Introducción

Propóleos es el nombre genérico para una sustancia resinosa fuertemente adhesiva

colectada por las abejas Apis mellifera de los árboles y los brotes de las hojas (Gekker,

Hu, Spivak, Lokensgard, & Peterson, 2005). En la última década, ha ganado popularidad

como un componente de los alimentos y bebidas para mejorar la salud humana (Popova,

y otros, 2011).

Se han analizado los efectos biológicos de varios propóleos y sus fracciones en

diferentes investigaciones (Serkedjieva & Manolova, 1992) en bacteriófagos (Maskova,

Albert, & Simuth, 1990); virus de plantas, virus vaccinia, virus Aujeszky, virus de la

estomatitis vesicular y virus de la influenza descritos por Serkedjieva y Manolova (1992);

así mismo virus de las hepatitis B, virus herpes aviar y virus herpes simplex descritos por

Amoros et al. (Amoros, Lurton, Boustiel, & Girre, 1994)(1994); Reo virus (El Hady &

Hegazi, 2002), HIV-1 (Gekker, Hu, Spivak, Lokensgard, & Peterson, 2005), IBDV y virus

de la enfermedad de Newcastle (ElHady, Hegazi, & Wollenweber, 1997).

La actividad antiviral del propóleos es variada según la composición química,

dependiendo del origen fitogeográfico, diferencia considerable en las actividades

biológicas (Kujumgiev, Tsvetkova, Serkedjieva, Bankova, Christov, & Popov, 1999).

Ciertas estructuras de flavonoides (acacetin, kaempferol, chrysina, quercetina y

galangina) y triterpenos pentacíclicos (ácidos betulínico, ácido morónico, ácido betulónico

y las meliferonas) presentan una importante capacidad antiviral ( (Debiaggi, Tateo,

Pagani, Luini, & Romero, 1990); (Geetha & Varalaxmi, 1998); (Ito, y otros, 2001)). Este

tipo de estudios, en la mayoría de los casos requiere técnicas dispendiosas, costosas o

muy demoradas, lo cual limita su uso, especialmente para ser empleadas rutinariamente.

56 Título de la tesis o trabajo de investigación

Adicionalmente en Colombia hasta el momento no se han llevado a cabo estudios sobre

la actividad antiviral de propóleos producidos en el país, por tal razón el objetivo de este

estudio fue implementar una técnica sencilla, rápida y económica in vitro, para evaluar la

capacidad antiviral de propóleos de tres regiones de Colombia, mediante el uso del

bacteriófago lambda.

5.2 Materiales y Métodos

La investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina

Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá D.C.,

como parte del Proyecto “Cualificación de productos de las abejas: miel, polen y

propóleos mediante indicadores microbiológicos, convenio N° 057/07, contrato N°

2007C3476 111-5832007” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural

de Colombia.

5.2.1 Bacteriofago y celula huésped

Se emplearon en este estudio una bacteria huésped Escherichia coli LE392 ATCC 33572

(sensible al fago lambda). La cepa huésped fue suspendida en viales de 5 ml con caldo

LB en tubos de vidrio estériles y puesta a incubación (overnight) a 37°C con agitación

lenta. Una vez se comprobó el crecimiento bacteriano mediante observación de la

turbidez del tubo, fueron centrifugados a 3000 rpm por 5 minutos y desechado el

sobrenadante obtenido. El pellet bacteriano formado fue resuspendido en 2 ml de MgSO4

10mM y conservado a 4°C. Para cada caja de Petri para plaqueo se emplearon 100 µl de

suspensión bacteriana (Sambrook, Fritsch, & Maniatis, 1989).

El título del bacteriófago (1 x 107 UFP/ml) se confirmó antes de su uso, utilizando la

técnica estándar de agar de recubrimiento, a través de diluciones en serie del stock y el

cálculo de unidades formadoras de placas (UFP/ml) (Fankhauser, 2010). De este stock

se realizaron diluciones en base 10 en Solución Tampón SM (Tris Base 0.121%, MgSO4

0.12%, gelatina 0.01%) para obtener una dilución que generará un número mayor a 1000

UFP en cada caja de petri, en este caso la dilución óptima fue 1:10.000 (1 x 103 UFP/ml).

http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx

Capítulo (…) 57

5.2.2 Medios de Cultivo

Se prepararon tres medios de cultivo, Agar Luria-Bertani (LB) duro (Triptona 1%, extracto

de levadura 0,5%, NaCl 1%, agar o agarosa 1,5%), Agar LB suave (Triptona 1%, extracto

de levadura 0,5%, NaCl 1%, agar ó agarosa 0,7%) y caldo LB (Triptona 1%, extracto de

levadura 0,5%, NaCl 1%).

5.2.3 Muestras de Propóleos

Doce extractos etanolicos de propóleo (EEP) obtenidos en una extracción con etanol al

70% (Almeida, 2003; Bruschi, y otros, 2006), fueron seleccionados según el origen

geográfico en Colombia (4 de Cundinamarca, 4 de Boyacá y 4 de Santander) y llevados

por separado a una solución stock a 2 mg/ml de extracto seco. Se realizaron diluciones

en base dos en viales, iniciando con 200 µl del EEP solución stock en 100 µl de solución

tampón SM (Buffer SM: Tris Base 0.121%, MgSO4 0.12%, gelatina 0.01%) y 100 µl de

caldo LB (volumen total 400 µl) para obtener concentraciones finales de 1,00; 0,50 y 0,25

mg/ml; estas 3 diluciones fueron sometidas a la prueba de actividad antiviral por

duplicado.

Los EEP en el actual estudio presentaron en promedio concentraciones mínimas

bactericidas (MIC) in vitro con valores de 1,2 mg/ml frente a Escherichia coli, en ensayos

llevados anteriormente por este grupo de investigación. De tal forma que las diluciones

de EEP finales para evaluar la actividad antiviral permite el crecimiento de la cepa de E.

coli hospedadora.

5.2.4 Procedimiento

Los títulos de la bacteria fue ajustada mediante la dilución con MHB antes de su uso.

De cada una de las diluciones de EEP (1,00; 0,50 y 0,25 mg/ml) se tomaron 200 µl en

viales mezclándolos con 20 µl de la dilución de fago elegida 1:10.000 y con 200 µl de la

solución que contenía la bacteria (volumen total 420 µl); se emplearon 210 µl para cada

caja de petri. Todas las mezclas se realizaron en tubos eppendorff, con agitación lenta.


Para el control positivo del plaqueo se emplearon 20 µl de la dilución de fago elegida y se

mezclaron con 100 µl de solución tampón SM, más 100 µl de caldo LB. (Total 220 µl).

Estos 220 µl, alcanzaron para dos cajas de petri (duplicado), empleando 110 µl, para

mezclar con 100 µl de la solución que contiene la bacteria por caja (Total 210 µl por

caja).

Para el control negativo se emplearon 20 µl de agua destilada estéril y se mezclaron con

100 µl de solución tampón SM, más 100 µl de caldo LB. (Total 220 µl). 110 µl se

mezclaron con 100 µl de la solución que contiene la bacteria por caja por duplicado.

Cada tubo eppendorff que contenía los controles positivos, negativos y las pruebas de los

propóleos, se incubaron a 37°C por 20 minutos, para permitir que los fagos infectaran a

las bacterias.

5.2.5 Plaqueo

Una vez terminado los 20 minutos de incubación de los viales, fueron llevados a la cabina

de flujo laminar y se tomaron 210 µl de cada uno de los viales, depositándolos en tubos

con 3 ml de agar LB suave cada uno, que previamente se había fundió, calentándolo en

horno microondas a fin de poderlo alicuotar. Los tubos fueron mezclados manualmente y

mantenidos en un beaker con agua a 47°C; se incluyó en este procedimiento los

controles.

Posteriormente se depositó el contenido de los tubos sobre la capa de agar duro de la

caja de Petri (previamente atemperadas, sin condensación en las tapas), moviéndola en

forma circular para que se forme una sobrecapa homogénea, sin grumos y que cubra

toda la superficie. Se dejó solidificar el agar blando por un espacio de 20 minutos, luego

se invirtieron las cajas y se depositaron en la incubadora a 37°C, permitiendo el

crecimiento hasta el siguiente día (overnight).

Al día siguiente se comprobó si hubo crecimiento bacteriano en la caja de control

negativo, se realizó el conteo respectivo de Unidades Formadoras de Placa en las cajas

del control positivo y en las cajas de prueba de los propoleos. Comparando el número de

UFP del control positivo frente a las cajas de prueba de los propoleos.

Capítulo (…) 59

5.3 Resultados

Los hallazgos en las pruebas microbiológicas realizadas son reportados en la Tabla 5-1,

se puede apreciar que los extractos etanólicos de propóleo inhibieron (actividad antiviral)

al fago a las 24 horas de incubación.

TABLA 5-1. Prueba antiviral contra el Fago Lamda de E. coli con exposición a tres

concentraciones de EEP de tres orígenes geográficos diferentes.

Muestra / Origen Geográfico

EEP

Control 1,00 mg/ml 0,50 mg/ml 0,25 mg/ml

105/Cundinamarca - + - - 192/Cundinamarca - + + + 362/Cundinamarca - + + - 456/Cundinamarca - - - - 091/Boyacá - + + - 102/Boyacá - + + - 137/Boyacá - + + + 146/Boyacá - + - - 092/Santander - + - - 093/Santander - + - - 101/Santander - + + - 103/Santander - - - - EEP: Concentración del extracto etanólico de propóleo; +: UFP entre 0 y 500 (Actividad antiviral positiva); - : UFP incontables (Actividad antiviral negativa).

En la Figura 5-2 se puede observar el efecto de los EEP sobre las UFP y el porcentaje de

muestras que presentaron efecto inhibitorio sobre el fago o ningún efecto visible,

encontrando incontables UFP.

5.4 Discusión

El control positivo, generó incontables Unidades Formadoras de Placas de lisis en cada

caja de Petri. El control negativo presentó el crecimiento adecuado de la cepa de E. coli,

sin la presencia de UFP.

De los 12 propóleos ensayados, 10 presentaron actividad antiviral con EEP en la

concentración 1 mg/ml; los valores más bajos (mejor actividad antiviral) fueron de cero

(0) UFP, para 4 propóleos (2 de Boyacá, 1 de Cundinamarca y 1 de Santander); los

siguientes valores variaron entre 4 y 500 UFC.


FIGURA 5-1. Porcentaje de muestras que presentaron conteos visibles de UFP y el

efecto de los EEP sobre el fago con respecto al control.

a. Porcentaje de muestras que se encontraron dentro de los rangos visibles para conteo de UFP;

b. Porcentaje de muestras que se consideraron como inhibición del fago con respecto al control.

De los EEP con concentración de 0,5 mg/ml seis (6) propóleos presentaron actividad

antiviral, aunque como era de esperarse, el número de UFP aumentó, pero aun

manteniéndose bajo con respecto al control positivo.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Control EEP 1,00 mg/ml

EEP 0,50 mg/ml

EEP 0,25 mg/ml

a.

Incontables

251-500

1-250

0

Capítulo (…) 61

La concentración más baja de los EEP correspondiente a 0,25 mg/ml, presento dos

propóleos que mantuvieron actividad antiviral, mientras que los 10 restantes perdieron su

actividad antiviral en esa dilución, pues se produjeron incontables UFP.

Las unidades formadoras de placa se reducen en función de la concentración de

propóleo; el efecto puede ser explicado según Maskova (1990) probablemente por el

lugar de intervención en el sistema de transcripción de la proteína, inhibiendo el fago en

la bacteria, pudiendo ser usado para la estandarización de propóleos y para la búsqueda

de sustancias purificadas originarias del propóleo con efecto antiviral.

Los resultados obtenidos permiten concluir que esta técnica in vitro con el fago Lambda,

es útil para determinar la actividad antiviral de los extractos etanólicos de propóleos

gracias a ser una prueba sencilla, rápida, económica y sensible. El modelo estudiado es

comparable con modelos en virus humanos (Maillard, 1996).

Es necesario realizar más experimentos con un número mayor de muestras de propóleo.

5.5 Conclusiones

El empleo del bacteriófago Lambda y de su célula huésped, resultó ser un método

sencillo, económico y reproducible para estimar la capacidad antiviral presente en los

EEP al 70%.

Esta prueba podría ser empleada como tamiz que permita seleccionar propóleos con

capacidad antiviral y permite además hacer un acercamiento del mayor o menor grado

de capacidad antiviral de los propóleos analizados. Se sugiere posteriores estudios que

permitan establecer correlaciones entre esta técnica rápida y otras de mayor

especificidad descritas para agentes virales particulares.

La técnica descrita contribuirá a futuro en la estandarización de los extractos etanólicos

de propóleos a nivel comercial que por su diversidad geográfica y seguramente botánica

presenta una alta variabilidad de sus componentes y por ende de su bioactividad y uso

terapéutico. Proporcionando una condición, en este caso actividad antiviral, para la

estandarización.


5.6 Bibliografía

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Capítulo (…) 63

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6. Discusión, conclusiones y recomendaciones

6.1 Discusión

La investigación general contemplo la estandarización de protocolos de laboratorio para

la obtención de sólidos solubles totales de propóleos crudos, las concentraciones

mínimas inhibitorias para bacterias y hongos, de lisis parasitaria y de unidades

formadoras de placa para el modelo antiviral, que tuvieron en cuenta protocolos

internacionales y soporte de literatura científica.

Los resultados obtenidos corroboran la información reportada por países europeos y de

Sur América. Colombia ha venido avanzando en la investigación con propóleos desde

diferentes áreas del conocimiento reforzando los resultados de la presente investigación.

Se debe destacar que los sólidos solubles totales obtenidos de los propóleos crudos con

etanol al 96% presentaron una mayor concentración, los extractos etanólicos de propóleo

obtenidos presentaron una alta actividad antibacterial frente a B. subtilis y Klebsiela y la

actividad antifúngica frente a T. rubrum; por otro lado el bacteriófago en estudio presento

susceptibilidad a los propóleos evaluados.

6.2 Conclusiones

El estudio que se emprendió con el objetivo de dar aportes a la acción antibiótica de

propóleos como parámetros de evidencia para procesos de sellos de calidad, es de tipo

innovador en nuestro país desde el punto de vista de la cualificación microbiológica de

propóleos crudos y sus extractos, de zonas agroecológicas diferentes. Estudios alrededor

del mundo ya hace varios años han demostrado la eficiencia in vitro e in vivo, del



producto de las abejas y con manifestaciones claras de comercio mundial en

aplicaciones terapéuticas.

Las metodologías empleadas en los ensayos experimentales son un aporte a la

estandarización de técnicas de laboratorio para la evaluación de este producto y

potencial servicio de extensión a la cadena productiva de las abejas y la apicultura en

Colombia; también permite realizar comparaciones con resultados en laboratorios de

instituciones de investigación fuera del país.

Correlacionar el efecto de los propóleos en los modelos biológicos incluidos en este

experimento (Bacterias, Hongos, Parasitos y Virus) permite concluir que la metodología

empleada para la extracción de propóleos es útil para la recuperación de compuestos

activos.

La estructura general del estudio permite en su ejecución la adquisición de competencias

de investigación en campo y laboratorio que permite a futuro el abordaje de propuestas

de investigación a futuro en este campo de conocimiento.

6.3 Recomendaciones

Existen para el país un número importante de publicaciones frente a la composición

fisicoquímica y actividad microbiológica de propóleos que permitiría realizar un análisis

estadístico multivariante, que permitiría establecer una base médica confiable de este

producto.

Se hace necesario para la apicultura colombina un estudio zonificado de producción de

propóleo crudo de calidad, la definición del origen botánico y de la composición química.

Que integre el eslabón primario, la industria y la investigación.

Los aportes de las investigaciones internacionales y nacionales permitirían proponer una

norma técnica para la obtención, extracción y estandarización de propóleos colombianos.

A. Anexo: Calidad microbiológica de propóleo crudo y sólidos solubles de extractos de propóleos de Apis mellifera en Colombia

B. Anexo: Sólidos solubles totales de EEP

70 Actividad antimicrobiana de propóleo de abeja Apis mellifera de cuatro

regiones de Colombia como aporte para la denominación de origen

By: Boyaca, Cu: Cundinamarca, Sr: Santander.

actividad anti-gérmenes in vitro de extractos etanólicos ... · ... se buscó correlacionar el...

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