1 protocolo dengue master dr. antonio vásquez...

Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo C U R S O DP R O T O C O L O : G e n o t i p i fe n h u e v o s , l a r v a s y h e mC o r r e l a c i ó n s e r o t i p oS a l v a d o r . 2 0 1 1P r e s e n t a d o p o r : DI n t r o d u c c i ó n .A nivel mundial el Paludismo y el Dengue se consideran como una de las

Enfermedades que ha ocupado algún lugar en las diez primeras causas de morbilidad y

mortalidad, de los reportes epidemiológicos del Ministerio de Salud.. Localizado en

muchos países como áreas endémicas y epidémicas con un alto riesgo. De igual forma

se ha reportado en todas las regiones del planeta.

Para septiembre 2011 se tiene sospecha por dengue

San Salvador y San Miguel

380 millones en riesgo de transmisión por

Se hacen esfuerzos mundiales auspiciados o dirigidos por la

controlar y erradicar el vector, pero que hasta el momento ha sido imposible de lograr

resultados prometedores. Se han utilizado diversos métodos de control, en las que se

destaca el uso de químicos en las plantaciones y áreas domiciliares

riesgo de causar intoxicaciones en el ser humano.

Al momento el Dengue

a que se invierten millones de dólares en erradicar el vector y tratar la enfermedad,

derivados del presupuesto nacional asignado a salud.

*1 Hay; Simón. y otros. Un mapa mundial de malaria: Endemicidad de

2007.

Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo D E P C R D E N G U E . E L S A L V A D O R 2 0 1 1f i c a c i ó n p o r R T - P C R / R S S - P C R d e l v i r um b r a s a d u l t a s c o m o d i a g n ó s t i c o p r e lc i r c u l a n t e e n l a z o n a m e t r o p o l i tM a s t e r D r . A n t o n i o V à s q u e z H i d a l g oM i c r o b i ó l o g o M e d i c o S a l u b r i s t aD o c e n t e d e l a F a c u l t a d d e M e d i c i n aU n i v e r s i d a d d e E l S a l v a d o r .nivel mundial el Paludismo y el Dengue se consideran como una de las



áreas endémicas y epidémicas con un alto riesgo. De igual forma

se ha reportado en todas las regiones del planeta. 1

se tiene sospecha por dengue mas de 8000 casos, reportándose

con el mayor número de casos. A nivel mundial se estima 1

380 millones en riesgo de transmisión por M a l a r i a y D e n g u e . * 1

Se hacen esfuerzos mundiales auspiciados o dirigidos por la O M S , O Pcontrolar y erradicar el vector, pero que hasta el momento ha sido imposible de lograr


destaca el uso de químicos en las plantaciones y áreas domiciliares, con el consiguiente

riesgo de causar intoxicaciones en el ser humano. 2el Dengue es un problema de Salud Pública y de gobiernos, debido


esupuesto nacional asignado a salud.

Hay; Simón. y otros. Un mapa mundial de malaria: Endemicidad de Plasmodium falciparum

1

Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo u s d e l d e n g u ei m i n a r v e r s u st a n a d e S a nnivel mundial el Paludismo y el Dengue se consideran como una de las



áreas endémicas y epidémicas con un alto riesgo. De igual forma

casos, reportándose

nivel mundial se estima 1

P S y otros, para

controlar y erradicar el vector, pero que hasta el momento ha sido imposible de lograr


, con el consiguiente

es un problema de Salud Pública y de gobiernos, debido


Plasmodium falciparum en el

Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo

El Salvador no es la excepción, debido a que por su climatología y densidad

poblacional, hace favorable la transmisión palúdica, con predominio en la estación

seca y lluviosa con temperaturas entre 22

tropicales y desplazamiento en alturas menores de 300 mts hacen propicio

condiciones ideales para su estancia y propagación.

J U S T I F I C A C I O N .

Al utilizar el PCR como método de diagnostico de examen de laboratorio

casos de Dengue en la tipificación de huevos, larvas y hembras adultas, puede

contribuir a la comunidad a prevenir el riesgo de cual serotipo esta circulando en la

zona y tomar las medidas correspondientes en el plan de vigilancia y control

epidemiológico.

O B J E T I V O SG E N E R A L :Identificar por medio de RT

y zancudos del serotipo circulante en el país.

E S P E C I F I C O S :1. Utilizar el RT-PCR en la genotipificació

adultas hematófagas.

2. Identificar las zonas potenciales de riesgo en la zona metropolitana de San Salvador

3. Correlacionar el tipo de serotipo en relación al ciclo de vida del zancudo del dengue.

H I P O T E S I SH1: La correlación diagnostica entre genotipificació

hematófagas por medio de RT

H0: No existe correlación diagnost

hembras hematófagas por medio de RT




seca y lluviosa con temperaturas entre 220C a 30

0C en zonas costeras o sabanas


condiciones ideales para su estancia y propagación.

el PCR como método de diagnostico de examen de laboratorio

n la tipificación de huevos, larvas y hembras adultas, puede



medio de RT-PCR y RSS-PCR la genotipificación de huevos, larvas

del serotipo circulante en el país.

PCR en la genotipificación de grupos de huevos, larvas y hembras

tificar las zonas potenciales de riesgo en la zona metropolitana de San Salvador

Correlacionar el tipo de serotipo en relación al ciclo de vida del zancudo del dengue.

iagnostica entre genotipificación de grupos de huevos, larvas y hembras

hematófagas por medio de RT-PCR a dengue indica el serotipo del virus del dengue

No existe correlación diagnostica entre genotipificación de grupos de huevos, larvas y

hembras hematófagas por medio de RT-PCR a dengue indica el serotipo del virus del dengue

2




costeras o sabanas


el PCR como método de diagnostico de examen de laboratorio en los

n la tipificación de huevos, larvas y hembras adultas, puede



de huevos, larvas

n de grupos de huevos, larvas y hembras

tificar las zonas potenciales de riesgo en la zona metropolitana de San Salvador

Correlacionar el tipo de serotipo en relación al ciclo de vida del zancudo del dengue.

de grupos de huevos, larvas y hembras

PCR a dengue indica el serotipo del virus del dengue

n de grupos de huevos, larvas y

engue indica el serotipo del virus del dengue


M A R C O T E O R I C OA N T E C E D E N T E SEn El Salvador desde hace varias décadas, se han realizado métodos de vigilancia,

control y erradicación entomológica de los vectores en zonas endémicos ya identificados en las

comunidades urbano marginales y rurales de nuestro país por el MSPAS.

En 1 9 9 3 la OMS tomó el liderazgo en la “Declaración Mundial en la lucha Antipalúdica”

en coordinación con los estados miembros para crear sistemas eficaces de Vigilancia y control

epidemiológico local. E l c i c l o d e v i d a :

H u e v o: la hembra deposita los huevos en partes húmedas o en agua. Cada hembra

puede depositar entre 100 a 500 huevecillos, eclosionando estos entre 24 a 72 hrs a una

temperatura de 21 C. los huevos pueden resistir has


En El Salvador desde hace varias décadas, se han realizado métodos de vigilancia,


comunidades urbano marginales y rurales de nuestro país por el MSPAS.

la OMS tomó el liderazgo en la “Declaración Mundial en la lucha Antipalúdica”


: la hembra deposita los huevos en partes húmedas o en agua. Cada hembra


temperatura de 21 C. los huevos pueden resistir hasta por 450 días.

3


En El Salvador desde hace varias décadas, se han realizado métodos de vigilancia,


la OMS tomó el liderazgo en la “Declaración Mundial en la lucha Antipalúdica”


: la hembra deposita los huevos en partes húmedas o en agua. Cada hembra



L a r v a s :viven debajo de la superficie del agua tomando su alimento. Generalmente

nadan hacia el fondo haciendo un ocho y luego regresan a la superficie para obtener oxigeno.

Las larvas por lo general tienen 4 fases o estadios larvales: L1 es la que eclosional del

los dos días pierde el exoesqueleto y pasa al segundo estadio L2; el tercer y cuarto estadio L3,

L4 se desarrolla entre uno a dos días. La L4 se desarrolla en pupa, la larva cuando posa en agua

lo hace formando un ángulo de 45 grados.

A d u l t o s : es el zancudo que vive en caso o proximal a ella, es de color azul negro,

manchas plateadas a los lados del cuerpo, tiene anillos blancos en las patas, se posa en forma

horizontal.


viven debajo de la superficie del agua tomando su alimento. Generalmente


Las larvas por lo general tienen 4 fases o estadios larvales: L1 es la que eclosional del



lo hace formando un ángulo de 45 grados.

es el zancudo que vive en caso o proximal a ella, es de color azul negro,


4


viven debajo de la superficie del agua tomando su alimento. Generalmente


Las larvas por lo general tienen 4 fases o estadios larvales: L1 es la que eclosional del huevo, a



es el zancudo que vive en caso o proximal a ella, es de color azul negro,



La hembra es hematófaga o antropofilica, pica de día o durante la noche,

veces al día, reposa en la vivienda. Algunas hembras pueden volar hasta 3 km para poner los

huevos otras viven a menos de 50 metros de las casas donde nacieron.P r i n c i p a l e s M é t o d o s d e C o n t rEntre los principales métodos de control u

Método químico. Se han descrito dos: insecticida y herbecida, derivados de organofosforados

y organoclorados, peritroides y otros. Son considerados como métodos temporales. En la

ultima década se han reportado cas

organoclorados y peritroides.

a nuevas generaciones 2 6 , 2. Control físico, 3. Control Patógeno, 4. Control Personal, 5. Control

Cultural, 6. Control Biológico, 7. Control Natural y 8. Control legal. T é c n i c a d e R T - P C R y R S S - P C RE s u n aVariante de la PCR donde inicialmente se realiza una Transcripción reversa a partir de

ARN para sintetizar el ADN complementario que luego es amplificado M A T E R I A L Y M E T O D O S .A.

E n c a d a b l o q u e se agreg

hembras adultas se tapan los recipientes colocando una gasa.

B. M u e s t r a s d e s u e r o en ratones lactantes alimentados con

sospecha de dengue. C . M u e s t r a s d e h u e v o s y l


La hembra es hematófaga o antropofilica, pica de día o durante la noche, puede picar hasta 8


huevos otras viven a menos de 50 metros de las casas donde nacieron. r o l .Entre los principales métodos de control utilizados a nivel mundial,



ultima década se han reportado casos de resistencia especialmente a los organofosforados,

organoclorados y peritroides. 2 2 - 2 5 También se ha encontrado transmisión hereditaria por genes

, 2. Control físico, 3. Control Patógeno, 4. Control Personal, 5. Control

, 6. Control Biológico, 7. Control Natural y 8. Control legal. RVariante de la PCR donde inicialmente se realiza una Transcripción reversa a partir de

ARN para sintetizar el ADN complementario que luego es amplificado mediante una PCR.M E T O D O L O G I A.

se agregan 6 vasijas de 250 ml conteniendo: 100 huevos, 100 larvas

se tapan los recipientes colocando una gasa.

en ratones lactantes alimentados con hembras adultas con l a r v a s por medio de identificación P C R

5


puede picar hasta 8


tilizados a nivel mundial, 1 1 - 2 1 están: 1.



os de resistencia especialmente a los organofosforados,

También se ha encontrado transmisión hereditaria por genes

, 2. Control físico, 3. Control Patógeno, 4. Control Personal, 5. Control

Variante de la PCR donde inicialmente se realiza una Transcripción reversa a partir de

mediante una PCR.

: 100 huevos, 100 larvas, 100

hembras adultas con


D. E x t r a c c i ó n A R N V i r a l

. El ARN viral se extrae utilizando el QIA

según protocolo establecido por el fabricante.

E. U t i l i z a r R S S - P C R

para identificación de genotipo, el análisis se hace por

electroforesis en gel de agarosa 1.5 % del ARN extraído a partir de los serotipos

extraídos.

F. M é t o d o e s t a d í s t i c o

. Se utilizara la Prueba de Fisher, análisis de varianza, tabla de ANOVA

utilizando el método por diseños de bloques al azar.

G. Á r e a d e E s t u d i o . El ensayo se

H. C r i t e r i o s d e s e l e c c i ó n

. Para la selección de la muestra, se utilizara los siguientes d e i n c l u s i ó n: 1. Muestra en estadoA e d e s A e g y p t i

3. Igual número

7. Igual observación a las 24 hrs, e x c l u s i ó n, están: 1. Muestra contaminada. 2. Diferente especie diferente a la descrita en

los recipientes, 3. Mal dilución o concentración

Desigualdad en las observaciones, 6. Tratamiento inadecuado, 9

inadecuadas.

I. S e s g o s

: Carga viral disminuida, mal identificación morfológica, mal uso de la técnica PCR.

j. E x t r a c c i ó n d e A R N v i r a l y s í

"El sobrenadante (125 µL) de cultivos infectados se mezclaraC o r p.) y se incubara a temperatura ambiente por

cloroformo y después de extracción se centrifugó a 12 000 rpm. La fase acuosa recuperada se

mezcla con 250 µL de isopropanol y luego de centrifugación a 12 000 rpm el preci

lavó con 500 µL de etanol 75 % y se seca

en 50 µL de agua tratada con dietil

síntesis de ADN se usaron 5 µL del ARN extraído que se adici

que contenía 200 µM de cada dNTP, 0,5

0,25 U de enzima T t h DNA Polimerasa (

µL. La reacción se llevó a cabo a 90 °C por R S S - P C RVirus de referencia y aislados locales de cada serotipo se

descritos por H a r r i s y otros

5 y

adicionaron a una mezcla de reacción que contenía 2 mM de MgCl

0,35-0,8 µM de los iniciadores, 5 µL de

(P r o m e g a ), 5 µL de b u f f e r

de enzima, en un volumen final de 50 µL. La amplificación se realizó

por 32 ciclos de 94 °C por 1 min, 54 °C por 1 min y 72

°C por 10 min. El ARN de cada cepa fue amplificado por más de una vez para confirmar la

reproducibilidad del resultado.


. El ARN viral se extrae utilizando el QIAamp viral RNA Mini Kit

según protocolo establecido por el fabricante.




método por diseños de bloques al azar. 3 2 - 3 4

El ensayo se realizara en los laboratorios de CENSALUD

. Para la selección de la muestra, se utilizara los siguientes

: 1. Muestra en estado huevo, larva, hembra adulta, 2. Misma especie de

número de huevos, larvas y adultas hembras en cada recipiente, 4.,

7. Igual observación a las 24 hrs, 8. Condición ambiental adecuada. Entre los

, están: 1. Muestra contaminada. 2. Diferente especie diferente a la descrita en

los recipientes, 3. Mal dilución o concentración técnica PCR, 4. Testigo otra especie,

igualdad en las observaciones, 6. Tratamiento inadecuado, 9. Condiciones ambiental

Carga viral disminuida, mal identificación morfológica, mal uso de la técnica PCR.í n t e s i s d e A D N *de cultivos infectados se mezclara con 375 µL de Trizol (

a temperatura ambiente por 5 min. Al término se adicionara


con 250 µL de isopropanol y luego de centrifugación a 12 000 rpm el preci

500 µL de etanol 75 % y se seca a temperatura ambiente. El ARN viral se resuspendió

en 50 µL de agua tratada con dietil-pirocarbonato (DEPC) y luego se almacenó a

síntesis de ADN se usaron 5 µL del ARN extraído que se adicionaron a una mezcla de reacción

que contenía 200 µM de cada dNTP, 0,5-1,0 µM de iniciadores anti-sentido,

DNA Polimerasa (P r o m e g a ), 2,5 µL de b u f f e r

, en un volumen final de 25

µL. La reacción se llevó a cabo a 90 °C por 2 min y luego a 60 °C por 30 min. “

Virus de referencia y aislados locales de cada serotipo se hará uso modificando los protocolos

y M i a g o s t o v i c h y otros. Brevemente, 10 µL de ADN viral copia se

zcla de reacción que contenía 2 mM de MgCl2, 200 µM de cada dNTP,

0,8 µM de los iniciadores, 5 µL de b u f f e r quelante, 0,25 U de T t h


clos de 94 °C por 1 min, 54 °C por 1 min y 72 °C por 2 min con una extensión final a 72


reproducibilidad del resultado.

6


amp viral RNA Mini Kit




. Para la selección de la muestra, se utilizara los siguientes c r i t e r i o s

, 2. Misma especie de

en cada recipiente, 4.,

. Condición ambiental adecuada. Entre los c r i t e r i o s d e

, están: 1. Muestra contaminada. 2. Diferente especie diferente a la descrita en

. Testigo otra especie, 5.

. Condiciones ambientales

Carga viral disminuida, mal identificación morfológica, mal uso de la técnica PCR.

con 375 µL de Trizol (I n v i t r o g e n5 min. Al término se adicionaran 100 µL de


con 250 µL de isopropanol y luego de centrifugación a 12 000 rpm el precipitado se

a temperatura ambiente. El ARN viral se resuspendió

pirocarbonato (DEPC) y luego se almacenó a - 70 °C. Para

onaron a una mezcla de reacción

, 1 mM de MnCl2,

, en un volumen final de 25

uso modificando los protocolos

y otros. Brevemente, 10 µL de ADN viral copia se

, 200 µM de cada dNTP,

DNA Polimerasa


°C por 2 min con una extensión final a 72


Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo S u b t i p o R S S - P C RLos productos de la amplifica

disuelto en tampón trisborato

y usando un estándar de tamaños de 100

colocaron 15-20 µL tanto de los amplificados obtenidos con virus locales como con los de

referencia del mismo serotipo. Para determinar el subtipo se comparó el patrón

electroforético (tamaño y número de fragmentos) generado por la cepa local

prototipo. T R A N S C R I P C I Ó N R E V E R S A Y AR T - P C R

Se utilizara el procedimiento por Harris et al, por la técnica multiplex RT

transcripción reversa y amplificación del ARN viral utilizando set según fabricante.

______________________________

� � � � � � � � � � � � Subtypes of dengue virus serotypes 2, 3 and 4 isolated in Santander District, Colombia.

A C T I V I D A D E S E N ED e f i n i c i ó n d e lt e m a d ei n v e s t i g a c i ó n X X XR e v i s i ó n d el i t e r a t u r a X X XE l a b o r a c i ó n d ea n t e p r o y e c t o X X XR e v i s i ó n d ea s e s o r e s XP r e s e n t a c i ó n yd e f e n s a XP r u e b a s e nl a b o r a t o r i oF a s e d e c a m p o /T o m a d e


Los productos de la amplificación se analizaran mediante electroforesis en gel de agarosa 2 %

disuelto en tampón trisborato-EDTA (Tris-HCl 89 mM pH 8, ácido bórico 89 mM, EDTA 2,5 mM)

y usando un estándar de tamaños de 100-pb (D N A l a d d e r . P r o m e g a ). En un mismo gel se

L tanto de los amplificados obtenidos con virus locales como con los de


electroforético (tamaño y número de fragmentos) generado por la cepa local A M P L I F I C A C I Ó N P O RSe utilizara el procedimiento por Harris et al, por la técnica multiplex RT-PCR para la


____________________________________________________

Subtypes of dengue virus serotypes 2, 3 and 4 isolated in

Santander District, Colombia. 2007

C r o n o g r a m a 2 0 1 2F E B M A R A B R I M A Y J U N X X X X X X X X X X X X

7


ción se analizaran mediante electroforesis en gel de agarosa 2 %

HCl 89 mM pH 8, ácido bórico 89 mM, EDTA 2,5 mM)

). En un mismo gel se

L tanto de los amplificados obtenidos con virus locales como con los de


electroforético (tamaño y número de fragmentos) generado por la cepa local v e r s u s

la

PCR para la


Subtypes of dengue virus serotypes 2, 3 and 4 isolated in

J U L A G

Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo m u e s t r a sF a s e d el a b o r a t o r i o /A n á l i s i s d em u e s t r a sA n á l i s i se s t a d í s t i c o d ed a t o sD i s c u s i ó n d er e s u l t a d o sE n t r e g a d ed o c u m e n t o f i n a lp a r a r e v i s i ó nP r e s e n t a c i ó nd e l t r a b a j o f i n a lE n t r e g a d ed o c u m e n t o f i n a l PM a t e r i a l y e q u i p o sT e r m o r e c i c l a d o rC e n t r i f u g a P C RT u b o s c ó n i c o sM i c r o p i p e t a sG r a d i l l a sR e a c t i v o sA l c o h o l e t í l i c oC l o r u r o d e m a g n e s i ob u f f e rK i t R T - P C RO T R O S I M P R E V I S T O ST O T A L

Protocolo dengue Master Dr. Antonio Vásquez Hidalgo X X XX X XX X X X X XX X XX X X X

P r e s u p u e s t o ( B O R R A D O R E S T I M A D O )U n i d a d C o s t o U n i t a r i o1 5 0 01 6 0 01 0 0 52 5 02 3 03 0 01 9 0 0

8


X X XC o s t o t o t a l5 0 06 0 05 0 01 0 06 03 0 09 0 0$ 5 0 0 0 A P R O X .


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