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Aceite foliar de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.:actividad antimicrobiana y antifúngica

Resumen

Los principales componentes identificados en el aceite esencial de las hojas de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.son: Cariofileno 19,029%, Humuleno 14,323% y Eremofileno 11,407%, aclarándose que éstos sobresalen de untotal de 62 compuestos. La técnica utilizada para la extracción del aceite fue destilación con agua y vapor deagua, empleando un destilador de 250 litros de capacidad. La cantidad de aceite obtenida fue de 3 ml por cada10 kg de hojas frescas. El aceite fue utilizado para un experimento de evaluación de actividad antimicrobiana yantifúngica, siendo el resultado la inhibición del crecimiento de cepas de Staphylococcus epidermidis, Staphylcoccusaureus, Escherichia coli, Candida albicans, Streptococos piogenes y Streptococcus mutans. Los resultados del experi-mento demostraron que el aceite foliar tiene una alta capacidad inhibitoria contra hongos (levaduras) y bacte-rias; así, se recomienda por un lado, continuar con análisis químicos más finos para determinar la naturaleza es-pecífica de los 62 compuestos y, por el otro, realizar ensayos con un número mayor de agentes patógenos.

Palabras clave: Ocotea quixos (Lam.) Kosterm., ishpingo, aceite foliar, antimicrobiano, antifúngico,Amazonía.

Introducción

La identificación química de compuestos activos delaceite de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm., aún está enuna fase inicial, tanto a nivel del Ecuador como enotros países, es así que se convierte en una prioridadpor su actividad biológica iniciar estudios que valorensus propiedades antimicrobianas.

Por lo antes expuesto, es importante aclarar queson escasos los estudios publicados respecto a laspropiedades medicinales de O. quixos, entre los que sedestacan los de Naranjo (1981), Gupta (1995) y Ulloa(2006), quienes mencionan sus usos tradicionales;Bruni y Medici (2003) y Ballabeni et al. (2007), quienesreportan la composición química del aceite del cáliz ysu actividad biológica, y Sacchetti et al. (2006), quienesestudian la composición química del aceite foliar.

Dentro de este contexto, esta investigación sepropuso relacionar las actividades medicinales pro-pias de los aceites esenciales con actividad biológicapara erradicar agentes microbianos. Así, se decidióemplear técnicas modernas de análisis fitoquímicopara evaluar principios activos del aceite extraído delas hojas y probar su actividad biológica contra cepasde bacterias y hongos (levadura) como:Staphylococcusepidermidis, Staphylcoccus aureus, Escherichia coli,Candida albicans, Streptococos piogenes, Streptococcusmutans.

La selección de los árboles que proporcionaronlas hojas de O. quixos para el experimento se realizóen el bosque que circunda la población de Proaño(provincia de Morona Santiago). El material fresco fuetransportado al centro de destilación de la FundaciónChankuap (Macas, provincia de Morona Santiago),

Paco Noriega1 y Cesare Dacarro2

1 Centro de Investigación y Valoración de la Biodiversidad (CIVABI),Universidad Politécnica Salesiana, Quito, Ecuador. E-mail: decano_agro@ups.edu.ec2 Dipartimento di Farmacologia Sperimentale ed Applicata, Laboratorio di Microbiologia,Università di Pavia, Pavia, Italia.

La Granja 7(1): 3-8. 2008.© 2008, Universidad Politécnica Salesiana, Ecuador.

donde se extrajo el aceite, luego éste fue transporta-do a Quito al Centro de Investigación y Valoración dela Biodiversidad (CIVABI, Universidad Politécnica Sa-lesiana) para ser analizado a nivel bioquímico.

La identificación del valor curativo del aceite delas hojas de O. quixos para combatir patógenos es unnuevo aporte para la ciencia, por lo tanto se reco-mienda en los próximos estudios determinar cuál ocuáles de los 62 compuestos hasta el momento regis-trados tiene o tienen la capacidad inhibitoria.

Es importante resaltar que en el futuro el acei-te foliar de O. quixos puede ser una fuente importan-te para el desarrollo de medicamentos de origen or-gánico y que pueden ser promocionados tanto encentros de salud como en el mercado farmacéuticoconvencional.

Métodos empleados para determinar la composición química y la actividad

biológica del aceite esencial de las hojasde Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.

1. Recolección del material vegetal: Las hojasde O. quixos fueron recolectadas a 10,5 km de la ciu-dad de Macas, específicamente en una hacienda loca-lizada en el km 18 de la vía a Riobamba, que pertene-ce a la parroquia San Isidro, cantón Macas, provinciade Morona Santiago. La propiedad está cubierta porvegetación de sucesión secundaria y se encuentra auna altitud de 1.200 msnm entre las coordenadas1,6° latitud N y 79, 6° de longitud S, así presenta: cli-ma subtropical, temperatura promedio anual de24ºC, precipitación media anual de 2.400 mm y hu-medad relativa promedio de 80%.

2. Datos botánicos de Ocotea quixos (Lam.)Kosterm.: La especie Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.pertenece a la familia Lauraceae y es conocida en elEcuador con diferentes nombres vernáculos, entrelos que se destacan: canelón, ishpink, ispingu y/o ish-pingo (Gupta 1995; Rios et al. 2007). El hábitat natu-ral de este árbol es el bosque húmedo tropical de laAmazonía ecuatoriana, encontrándose entre 310 y1.250 msnm de altitud y destacándose por ser endé-mico de este lugar.

Algunas de las características botánicas más im-portantes de la especie O. quixos la distinguen por serun árbol perenne de 2-5 m de altura; lámina de la ho-ja de 14,5-23,5 cm de longitud x 3,5-6 cm de ancho,olor a canela; flor blanco-verdosa; cáliz persistente deseis sépalos y fruto ovalado de 4 cm de longitud. La

especie florece y fructifica cada dos años cuando al-canza mínimo veinte años de madurez (Figura 1).

3. Métodos para determinar la composiciónquímica del aceite foliar de Ocotea quixos(Lam.) Kosterm.: El experimento fue ejecutado dela siguiente manera:a. Preparación de la muestra vegetal: se emplearon10 kg de hojas frescas que fueron colocadas en undestilador de acero inoxidable.b. Obtención del aceite: se obtuvo el aceite me-diante la técnica de destilación con agua y vapor deagua (Sharapin 1999) en un destilador de 250 litrosconstruido por los autores. El rendimiento fue de 30ml por cada 10 kg de material vegetal fresco.c. Identificación de los componentes químicos delaceite foliar: se analizaron 20 µl de aceite esencial di-luidos a 2ml con n-hexano. De esta muestra, se inyec-taron 2 µl en el equipo de cromatografía gaseosa aco-plada a masas marca VARIAN modelo Saturn 2001,siendo las condiciones del análisis una temperaturadel inyector a 250º C, columna factor four VF-5ms(30m x 0,25mm), gas transportador Helio 1ml/min ysplit 200 (Tabla 1).

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Figura 1. Rama con hojas y frutos de “ishpingo” [Ocoteaquixos (Lam.) Kosterm., Lauraceae].

El cromatógrafo de gases acoplado a masas funcionaen conjunto con un espectrómetro de masas que seoperó bajo las siguientes condiciones analíticas: ener-gía de ionización 70 eV, corriente de emisión 40mA,rango de masas 40 – 400 m/z y temperatura ion sour-ce de 220º C.d. Determinación de la concentración mínima inhi-bitoria (MIC): La MIC se evaluó con las siguientes ce-pas de bacterias: Escherichia coli, Staphylcoccus aureus,Staphylococcus epidermidis, Streptococcus mutans yStreptococos piogenes, así como con la levaduraCandida albicans.

Los patógenos fueron escogidos porque son res-ponsables de varias infecciones severas, mencionán-dose las principales a continuación:• Escherichia coli causa infecciones intestinales.• Staphylcoccus aureus provoca infecciones de lapiel, neumonía, sepsis con o sin metástasis (osteítis,artritis, endocarditis, abscesos localizados y gastroen-teritis).• Staphylococcus epidermidis produce infeccionestanto en mucosas como en membranas animales yhumanas.• Streptococcus mutans origina infecciones en la ca-vidad bucal, siendo la más conocida la caries dental.• Streptococcus pyogenes ocasiona la fiebre reumá-tica e infecciones de la garganta (Brooke 1999).• Cándida albicans induce infecciones superficialesque afectan a la piel, uñas y mucosas, así como la infec-ción vaginal conocida como candidiasis (Brooke 1999).e. Screening antibacteriano y antifúngico: se prepa-raron de forma independiente las suspensiones debacterias y levadura a una concentración de 108

ufc/ml. Se adicionó 100 µl de aceite esencial a 2 ml deagar Mueller Hinton Broth con tween 20 al 0,5% entubos de ensayo por duplicado. Se toma una alícuota

de 1 ml de la disolución preparada, se transfiere a untubo que tiene un ml de Mueller Hinton Broth yTween, se siembran las bacterias, se adiciona 1 ml dela concentración de 108 ufc/ml a 10 ml de MuellerHinton Broth y se obtiene un inóculo de 1,107 ufc/mlque será 0.5.107 ufc/ml en la disolución; así, sucesiva-mente hasta alcanzar la dilución número 10 y hastaobtener concentraciones de aceite de: 50, 25, 12,5,6,25, 3,12, 1,56, 0,78, 0,39, 0,19, y 0,097 µl /ml.

A cada uno de los tubos se sometió al siguienteprocedimiento: se agitó en el vórtice, se adicionó 1mlde suspensión bacteriana a cada dilución, se controlóel crecimiento del stock en una muestra control conel tween sin aceite, se incubó por 24 horas para me-dir el crecimiento de bacterias.

El cultivo obtenido se sembró en cajas petri quetenían Mueller Hinton Agar para observar la MIC enuna probeta. En caso de que el aceite impida la obser-vación se debe colocar una alícuota de 50 µl en unportaobjeto para ver en el microscopio si existe cre-cimiento, esto indicó si la concentración fue bacteri-cida o bacteriostática.

Composición química del aceite foliarde Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.

El porcentaje de identificación de compuestos delaceite extraído de las hojas de Ocotea quixos (Lam.)Kosterm. fue de 83,89%, siendo los principales com-ponentes identificados Cariofileno 19,029%, Humule-no 14,323% y Eremofileno 11, 407%, aclarándose queestos sobresalen de un total de 62 (Tabla 2) y de 30que fueron identificados comparándose con la basede datos de la NIST/02.

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Tabla 1. Condiciones de la columna del cromatógrafo de gases acoplado a masas para el análisis del aceite fo-liar de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.

Temperatura (°C) Velocidad (°C/min) Permanencia (min) Total (min)

50 0 2 2100 20 0 4,5220 5 1,5 30

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Tabla 2. Composición química del aceite foliar de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.

Compuesto Método de Tiempo Identificado Noidentificación de retención RA % Identificado

(min) RA%

1. NI2. NI3. NI4. Canfeno5. Benzaldehido6. 1R _α pineno7. 1R _β pineno8. NI9. Terpinolen10. Cimeno11. 3,3 dimetil-2 metileno canfeno12. p Címeno13. Mosleno14. NI15. linalol 16. hidroxicinemaldehido17. Bornil alcohol18. 4 terpineol19. α terpineol20. Cinemaldehido21. Acetol22. NI23. α cubebeno24. NI 25. Ciclosativeno26. α Copaeno27. Cinamato de metil28. NI29. NI30. NI31. NI32. Cariofileno33. NI34. NI35. Cinamato de etilo36. NI37. Humuleno38. NI39. NI40. NI41. α cumemeno42. NI43. NI44. Eremofileno45. NI46. NI47. NI48. NI49. α cadineno50. NI51. NI52. NI53. α Calcoreno54. NI55. NI56. Espatulenol57. Óxido de cariofileno58. NI59. 1,5,5,8- tetrametil- 1,2

oxabiciclo 1.9.1.01.dodeca-3,7-dieno

60. NI61. NI62. NI

Total

CG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MS

CG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MSCG-MS

CG-MSCG-MSCG-MS

5,2435,5435,7756,0306,2116,3036,4186,7986,9557,0797,154

7,2467,6138,1018,2748,6299,89310,01410,29912,05912,27013,29413,62614,20714,25014,35314,56414,82415,06615,14415,24115,43815,59915,70415.91316,06916,27016,37416,59016,61616,69916,83216,90917,05317,18817,31517,47217,54617,62417,76617,98618,04718,21518,67319,01719,09119,24119,48619,871

20,36520,45821,154

0,2500,8860,7482,194

0,1970,0620,708

2,9510,291

0,9520,1130,0530,3320,2653,4250,055

0,304

0,0887,0007,214

19,029

4,733

14,323

0,172

11,407

0,763

0,099

0,2803,831

1,165

83,89

0,0380,1281,590

0,057

0,087

0,056

0,099

0,1310,1260,0690,067

0,0780,054

0,533

0,0240,2860,310

0,1480,610

6,0161,0920,1370,054

3,2430,1330,196

0,1960,124

0,081

0,1020,0630,183

16,111

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Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)del aceite foliar de

Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.

El estudio de la actividad biológica comprobó que elaceite foliar de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. (Figura2) tiene una alta capacidad de inhibición en el creci-miento de las cepas tanto de bacterias Staphylococcusepidermidis, Staphylcoccus aureus, Escherichia coli,Streptococos piogenes y Streptococcus mutans, como delhongo (levadura) Candida albicans (Tablas 2 y 3).

Tabla 2. Capacidad de inhibición del aceite foliar de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. contra el crecimiento de lascepas de bacterias y de un hongo (levadura).

Cepas de hongo Crecimiento como concentración en µl /ml y bacterias 50 25 12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0,097

Candida albicans - - - + + + + + + +Escherichia coli - - - + + + + + + +Staphylococcus epidermidis - - - - + + + + + +Staphylcoccus aureus - - - - - + + + + +Streptococcus piogenes - - - - - - - - + +Streptococcus mutans - - - - - - - - - -

Tabla 3. Concentración Mínima Inhibitoria (MIC) del aceite foliar de Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. contra elcrecimiento de las cepas de bacterias y de un hongo (levadura).

Cepas de hongo y bacterias Concentración Mínima Inhibitoria (MIC)

Candida albicans 12,50 µl/mlEscherichia coli 12,50 µl/mlStaphylococcus epidermidis 6,25 µl/mlStaphylcoccus aureus 3,12 µl/mlStreptococcus piogenes 0,39 µl/ml Streptococcus mutans Menor a 0,10 µl/ml

Figura 2. Aceite foliar de “ishpingo” [Ocotea quixos (Lam.)Kosterm., Lauraceae].

Literatura citada

Ballabeni, V.; M. Tognolini; S. Bertoni; R. Bruni; A.Guerrini; G. Moreno Rueda y E. Barocelli 2007.Antiplatelet and antithrombotic activities of essential oil from wild Ocotea quixos (Lam.) Kosterm. (Lauraceae) calices from AmazonianEcuador. Pharmacological Research 55(1):23-30.

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El aceite foliar de “canelón” o “ishpingo”[Ocotea quixos (Lam.) Kosterm.,Lauraceae] tiene una alta capacidad de in-hibir el crecimiento de cepas tanto debacterias como de hongos (levaduras).

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