terapia fotodinÁmica antimicrobiana usando azul …
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Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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TERAPIA FOTODINÁMICA
ANTIMICROBIANA USANDO AZUL
DE 1,9-DIMETIL-METILENO COMO
FOTOSENSIBILIZANTE FRENTE A
CANDIDA SPP.
David Royo Diez
Master de investigación en medicina, Facultad de Medicina
Curso 2011/12
Trabajo fin de master
Instituto de Ciencias de la Salud
Hospital Miguel Servet
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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INDICE:
-Título…..…………………………………………………………………………..1
-Indice………………………………………………………………………............2
-Introducción……………………………………………………………………….3
-Objetivos…………………………………………………………………………..7
-Material y Métodos………….……………………………………………... …….8
Cepas de estudio y condiciones de crecimiento…………….……………...8
Reactivos………………………………….………………………....……..8
Instrumentación…………………….………………………………. ……..9
Condiciones de trabajo para la TFDA……………………………………...10
Protocolo de la TFDA……………………………………………………...11
Preparación de la siembra de cada germen……………………….. .11
Preparación de las suspensiones de cada levadura………………....12
Preparación del medio de cultivo…………………………………..12
Preparación de las disoluciones madre del fotosensibilizante……. .12
Preparación de las muestras para la irradiación…………………... .13
Proceso de irradiación……………………………………………...13
Siembra de pocillos en placas SDAC………………………...….....13
Realización de las titulaciones control……………………….…….14
Recuento de unidades formadoras de colonias.……………….……14
Experimentos del estudio…………………….…………………….14
Experimentos de localización intracelular del DMM-B en levaduras……..15
-Resultados………………………………………………………………………....21
Efecto fototóxico del DMM-B en Candida spp. en función del tiempo de
incubación ……………………………………………………………………….. ..21
Efecto fototóxico del DMM-B en Candida spp con curvas de
concentraciones …………………………………………………………………....21
Efecto de los inhibidores de las distintas especies reactivas del oxígeno en el
efecto fototóxico del en Candida spp ……………………………………………..30
Localización celular de DMM-B en Candida spp…………………………35
Discusión…………………………………………………………………………. 37
Conclusiones………………………………………………………………………39
Bibliografía……………………………………………………………………….. 39
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1.-INTRODUCCIÓN:
1.-Infecciones cutáneas: Este tipo de infecciones son muy frecuentes especialmente las
causadas por bacterias y hongos. El uso indiscriminado de antibióticos ha producido el
incremento de aislados bacterianos multi-resistentes, que en nuestro país, para
Staphylococcus aureus resistente a meticilina suponen hasta el 25,3% del total.
( http://ecdc.europa.eu/en/activities/surveillance/EARS-
Net/database/Pages/table_reports.aspx). Las micosis, infecciones producidas por
hongos, causan la mayoría de las infecciones producidas en la piel siendo uno de los
hongos más prevalentes las levaduras. Candida spp son un tipo de levaduras causantes
de infecciones que pueden ser especialmente graves en pacientes inmunodeprimidos.
(VIH, trasplantados, en tratamiento con corticosteroides y pacientes oncológicos).
El número de infecciones fúngicas se está incrementando en las últimas tres décadas, en
realidad presentan un crecimiento exponencial. Esto se debe a una combinación entre un
incremento de personas susceptibles y una escasez de fármacos antifúngicos. Candida
spp, en concreto Candida albicans, causan mayores problemas ya que son habitantes
comunes de la boca, faringe, tracto digestivo, piel y uñas. Estas levaduras necesitan de
algún factor desequilibrante para convertirse en patógenas (1). El mecanismo por el cual
causan lesiones superficiales de la mucosa es afectando a los transportadores de
membrana. Además este tipo de infecciones puede verse asociada a otras dermatosis
como la psoriasis o la dermatitis atópica(2,3).
En la actualidad, existen una gran cantidad de antifúngicos disponibles en el mercado.
El fármaco de elección depende de la especie que provoca la infección; si esta es
producida por C.albicans, es muy susceptible a la mayoría de los agentes antifúngicos.
El patrón de C. tropicalis y C. parasilopsis es bastante similar, con una mayor
concentración inhibitoria mínima (CIM) para el fluconazol mientras que C. krusei es
más resistente al fluconazol y la flucitosina(4).
La etapa conocida como “era antibiótica”, que comenzó hace más de 50 años con la
comercialización de la penicilina, se está agotando debido a que tanto la
comercialización como la investigación de nuevos antimicrobianos se está viendo
ralentizada en las últimas décadas, por lo que es necesario la investigación en terapias
alternativas (5) para combatir a los agentes infecciosos (6); creemos que es necesario
anticiparse para que no ocurra lo mismo con los hongos.
2.-Terapia fotodinámica: La terapia fotodinámica(TFD) es uno de los tratamientos
alternativos en las infecciones sobre el cual se está investigando en mayor profundidad
en los últimos años. Este tratamiento se ha utilizado primeramente frente al cáncer, en
concreto como tratamiento frente a tumores sólidos, y posteriormente se investiga como
terapia contra las infecciones fúngicas.
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La TFD se basa en la utilización de una sustancia conocida como fotosensibilizante (FS)
que al combinarla con luz visible de adecuada longitud de onda y en presencia de
oxígeno se producen especies reactivas de oxígeno (ROS). La especie reactiva de
oxígeno que se forma depende de la vía metabólica por la cual funciona el FS (7). Estas
ROS producen la muerte específica de las células tumorales por diferentes métodos;
apoptosis, necrosis, autofagia o una combinación de ellas(6) preservado los tejidos
sanos circundantes. La producción de una u otra vía de muerte celular depende
fundamentalmente del FS utilizado, de su localización intracelular y de las estructuras
celulares que resulten dañadas(11).
Existen 2 vías principales por las cuáles actúan los FS: la primera de ellas (Tipo 1),
implica la producción del radical superóxido e hidroxilo. La segunda vía (Tipo II) es
aquella que implica la producción del oxígeno singlete el cual es capaz de dañar
directamente al material biológico (6). Estas dos vías provocan diversos efectos como
la inactivación de enzimas y otras proteínas o la peroxidación de lípidos provocando la
lisis de membranas celulares, lisosomas y mitocondrias(8).
En dermatología la TFD se ha demostrado especialmente útil debido a la accesibilidad
de las lesiones cutáneas tanto a la aplicación de FS tópicos como a la administración de
luz. El FS más utilizado ha sido un precursor porfirínico, el ácido aminolevulínico
(ALA) y su derivado el aminolevulinato de metilo (MAL), inductores ambos de la
fotosensibilización endógena de las células mediante el acúmulo intracelular de
protoporfirina IX (PpIX) (9,10). La destrucción celular se puede producir mediante
apoptosis, necrosis o autofagia lo que dependerá, fundamentalmente del FS utilizado, de
su localización intracelular y de las estructuras celulares que resulten dañadas(11).
Además del daño directo celular de la TFD, ésta induce una respuesta vascular,
inmunológica y de la matriz extracelular que intervienen en su efectividad final y en su
excelente resultado cosmético (12). La TFD también se utiliza en la actualidad con éxito
en el acné (13).
La TFD antimicrobiana (TFDA) tiene sus orígenes en los experimentos realizados por
Paul Ehrlich a finales del siglo XIX; este consiguió demostrar la capacidad biocida que
presentaban algunos colorantes especiales como la anilina o el azul de metileno.
Realmente el padre de la TFDA fué Oscar Raab; quien documento el proceso de
fotooxidación biológica sobre paramecios con el naranja de acridina (6).
En la actualidad la TFD se está utilizando también como tratamiento antimicrobiano
debido principalmente al incremento de microorganismos resistentes a los antibióticos
(14) siendo este tema un campo emergente de investigación. Existen diversos estudios
que han ensayado esta terapia frente a infecciones producidas por bacterias, hongos,
virus y parásitos (15,16).
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La TFDA ofrece numerosas ventajas frentes a los tratamientos tradicionales:
1.-Amplio espectro de acción, ya que un FS puede actuar de forma simultánea
frente a bacterias, hongos, virus y parásitos.
2.- Gran eficacia independiente del patrón de resistencia antibiótica lo que hace
que pueda ser útil para cepas patógenas multi-resistentes a antibióticos clásicos.
3.- Este tipo de tratamiento permite la reducción de la población patógena
produciendo un daño muy reducido al tejido huésped.
4.-La inactivación de los microorganismos por medio de los FSs es un
mecanismo multidiana.
5.- Disponibilidad de liberación del FS a la zona infectada de forma específica.
6.-Presenta compatibilidad con cualquier tratamiento de antibióticos que se
utilizan en la actualidad.
Por otro lado, los FSs idóneos para utilizar en la TFDA deben ser fármacos que posean
las siguientes propiedades:
1.- Absorción elevada en la parte roja del espectro lumínico (> 600nm) para
asegurar una mayor penetración de la luz en la piel y así poder tratar infecciones
internas.
2.-Rendimiento cuántico de formación de estado triplete elevado, así como un
tiempo de vida de este estado triplete suficientemente largo para ser capaz de
producir oxígeno singlete o cualquier otra especie reactiva de oxígeno
3.- Energía del estado triplete mayor de 94 kJ/mol.
4.-Elevada especificidad para asociarse a los microorganismos patógenos,
5.-Mínima toxicidad en ausencia de luz.
6.-Rápida eliminación del cuerpo para minimizar posibles efectos secundarios.
7.-Pureza química y de síntesis versátil y económica.
(http://www.psa.es/webesp/projects/solarsafewater/documents/libro/14_Capitul
o_14.pdf)
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Los FSs se pueden clasificar en tres grandes grupos:
1.-Compuestos sintéticos no-porfirínicos, como los colorantes fenotiazínicos,
entre los que se incluye el azul de metileno y derivados como el azul de dimetil-
metileno, el cual va a ser motivo de este estudio.
2.- Moléculas macrocíclicas como las ftalocianinas y las porfirinas.
3.-Fotosensibilizantes naturales, entre los que se encuentra la hipericina, entre
otros (17).
De todos ellos, es el azul de metileno el que por el momento se está desarrollando más
activamente para la TFDA (18). De hecho, ya se ha comercializado un dispositivo con
este FS para el tratamiento de infecciones dentarias (FotoSan). Por dicha razón,
consideramos que debe ser considerado como el FS de referencia a la hora estudiar la
capacidad antimicrobiana de cualquier nuevo FS.
El principal reto de la TFD antimicrobiana es encontrar la ventana terapéutica in vivo
donde las bacterias y los hongos sean destruidos sin efectos citotóxicos en los tejidos
sanos circundantes. En general, se puede conseguir la erradicación de los patógenos en
condiciones de una irradiación menor (40-100 mW/cm2) que la utilizada en los
procesos cancerosos, y lo que es más importante, con tiempos de incubación más cortos.
Esto garantiza una alta selectividad en comparación con los principales tejidos y células
huéspedes de la piel, queratinocitos y fibroblastos, así como en las células de la
respuesta inmunitaria anti-infecciosa, neutrófilos y linfocitos. Sin embargo, los estudios
que han investigado el efecto de la TFDA sobre células cutáneas son escasos (24).
En la actualidad la TFD no tiene ninguna aplicación clínica antimicrobiana aprobada y
su utilización es anecdótica. Así, en los últimos años se han publicado casos aislados de
diversas infecciones dermatológicas tratadas empíricamente mediante TFD con ALA o
MAL con prometedores resultados: onicomicosis, tiñas de piel lampiña (19), candidiasis
(12), úlceras y tumores con sobreinfección bacteriana (20,21), micobacterias (22),
parásitos (23) e incluso ácaros (21). Todo ello apunta a que la TFDA puede tener un
prometedor futuro en el tratamiento de las infecciones de la piel.
Los microorganismos tienen grandes diferencias en cuanto a estructura celular y
organización, lo que obviamente influye en la interacción de los FS añadidos de forma
exógena con los constituyentes celulares, determinando la eficiencia y el mecanismo del
proceso de fotoinactivación (25). Por ello son de gran interés, los estudios comparativos
de eficacia entre diferentes FS en distintos agentes infecciosos (bacterias y hongos) que
ayuden a establecer su uso preferente en unas infecciones cutáneas frente a otras (15).
Es decir, estudios que nos permitan seleccionar qué FS funciona mejor en cada una de
las infecciones de la piel, sean bacterianas o fúngicas.
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3.-Fotosensibilizante:Azul de 1,9-Dimetil-metileno (DMM-B): En este estudio se va a
utilizar como fotosensibilizante el DMM-B; este es un potente FS, derivado del azul de
metileno, que pertenece a una nueva generación de drogas para realizar TFDA. Es un
compuesto aromático heterocíclico con la siguiente formula molecular; C16, H18, N3,
S, Cl. (http://www.sigmaaldrich.com/large/structureimages/59/mfcd19686959.png)
Esta sustancia ha sido utilizada como FS en terapia fotodinámica antimicrobiana contra
algunas bacterias resistentes(26,27,28 ) como por ejemplo Acinetobacter baumanii.
Sus características son:
-Pico de absorción máximo: 649nm.
-Peso molecular: 416,05
-Punto de fusión: 250ºC.
.
(http://www.sigmaaldrich.com/large/structureimages/59/mfcd19686959.png)
2.-OBJETIVOS DEL ESTUDIO:
Objetivo principal: Evaluar la eficacia de la terapia fotodinámica antimicrobiana
(TFDA) in vitro frente a Candida spp, tanto sensibles como resistentes a antifúngicos
utilizando como FS el azul de 1,9-dimetil-metileno (DMM-B).
Objetivos secundarios:
- Determinar los parámetros óptimos, tiempo de incubación , dosis de irradiación
y concentración del DMMB, para obtener un efecto fungicida.
-Evaluar qué ROS intervienen en la muerte de las distintas cepas y especies de
Candida en el proceso de TFD con DMMB.
-Estudio de la localización celular del DMM-B en las Candidas spp.
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3.-MATERIAL Y MÉTODOS:
3.1.-Cepas de estudio y condiciones de crecimiento: Las cepas que se han utilizado en
este estudio son las siguientes:
Cepas no resistentes:
-Candida albicans (ATCC 10231)
-Candida krusei (ATCC 6258) Cepas colección Americana
-Candida parasilopsis (ATCC 22019)
- Candida albicans (CETC 1001) Cepa colección Española
Cepas resistentes:
-Candida albicans (456325H)
-Candida albicans (AZN-9635)
-Candida albicans (AM07/0267)
-Candida glabrata (ANZ16-46)
-Candida glabrata (YFJ002-658)
-Candida rugosa (YFJ002-29)
Todas las cepas del estudio crecen bajo condiciones aeróbias utilizando como medio de
cultivo agar-dextrosa-Sabouraud con cloranfenicol a la temperatura de 35ºC y en
oscuridad.
3.2.-Reactivos:
-Fotosensibilizante:
El fotosenbilizante utilizado en este estudio es el azul de dimetil-metileno (DMM-B)
obtenido de la colección Aldrich (Gillingham UK).
-Inhibidores:
-Azida (NaNO3)(80mM).
-Catalasa (1880U/ml)
-Superóxido Dismutasa (SOD) (2000U/ml)
Cepas resistentes a azoles
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Reactivos secundarios:
-Agua destilada y desionizada.
-Sabouraud dextrose agar (SDA)CM0041 OXOID (Lot. 893003).
-Alcohol etílico a 70º (Lot C046)
-Etanol absoluto EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur (MERK) (Lot
40225360131114).
-Dimetil-sulfoxido (DMSO)(Lot 30H0608).
-Tampón PBS (Lot P31098IT964153).
-Cloranfenicol (Lot 58F-0357).
-Mitotracker green de Invitrogen (Molecular Probes).
-Cell tracker green de Invitrogen (Molecular Probes).
-DAPI de Invitrogen (Molecular Probes).
3.3.-Instrumentación: Los instrumentos utilizados en este estudio son los descritos a
continuación;
-Lámpara roja de emisión 632nm (±10nm) y una potencia de emisión de
1,7mV/cm2. La lámpara debe estar a 5cm de la muestra a irradiar. Para administrar una
fluencia de 18J/cm2 el tiempo de irradiación será de 15 minutos y para una fluencia de
37J/cm2 de 30 minutos. (Imagen 1)
-Espectrofotómetro con escala McFarland (McF) DINKO; una medida de
0,5McF equivale a un millón de bacterias/levaduras por ml y una medida de 4McF
equivale a 10 millones de bacterias/levaduras por ml. (Imagen 5)
-Placas de cultivo STERILIN; donde se realizan las diferentes siembras de
muestras. (Imagen 2)
-Asa de siembra metálica; usada para realizar las siembras. (Imagen 3)
-Campana de flujo laminar Telstar BIO II A; lugar donde se tiene que realizar la
mayor parte del trabajo para evitar contaminaciones. (Imagen 4)
-Microscopio confocal espectral Leica TCS SP2 AOBS; (Imagen 6) usado para
la localización celular y Microscopio confocal compacto Olympus FV10i Oil
Typeambos (Imagen 7) de la Unidad de Microscopia e Imagen del Instituto Aragonés de
Ciencias de la Salud.(para los estudios de localización del FS)
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-Sistema de microscopía multidimensional con control en tiempo real Leica
AF6000 LX de la Unidad de Microscopia e Imagen del Instituto Aragonés de Ciencias
de la Salud (para los estudios de localización del FS).
3.4.-Condiciones de trabajo para la TFDA: Para trabajar con las levaduras en la terapia
fotodinámica se necesitan los siguientes requerimientos:
Medio de cultivo utilizado para la siembra: Sabouraud-cloramphenicol
(SDAC).
Temperatura de incubación: 35ºC.
Tiempo de incubación para su utilización: 24h.
Tiempos de irradiación: 15 minutos (18J/cm2) y 30 minutos (37J/cm2)
Tiempo de incubación previo a la irradiación: 0,15,30 y 60 minutos
Fotosensibilizante:
DMM-B
Concentraciones de fotosensibilizante: 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25,
0.625, 0.312 µM.
Inhibidores:
Azida sódica(80mM)
Catalasa(1880U/ml)
Superóxido Dismutasa SOD (2000U/ml)
Imagen 1: lámpara de
irradiación
Imagen 2: placas petri de
cultivo Imagen 3:
asa de
siembra
Imagen 4: campana de
flujo laminar
Imagen 5: espectrofotómetro Imagen 6: Microscopio
Leica TCS SP2 AOBS Imagen 7: Olympus FV10i
Oil Type
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Irradiación:
Lámpara de LEDs de emisión de luz a 632+10 nm. Potencia/unidad superficie: 1,7 mW/cm
2.
Irradiación a 5 cm de la muestra.
Dosis: 37 y 18 J/cm2.
Tras la irradiación:
Siembra de nuevo en placas de SDAC.
Incubación a 35ºC durante al menos 48 horas.
Actividad fungicida:
Mediante el contaje de Unidades formadoras de colonias (UFC)
en placa.
Controles:
Titulaciones del germen sin DMM-B e irradiados.
Titulaciones del germen sin DMM-B no irradiados.
Titulaciones del germen con DMM-B sin irradiar.
3.5.-Protocolo de la TFDA: El protocolo consta de las siguientes etapas:
1.-Preparación de las siembras de cada germen: Este es el primer paso que se
tiene que llevar a cabo en la TFDA; este apartado es importante para obtener una buena
concentración de levadura inicial para llevar a cabo el experimento. Las siembras se
realizan partiendo de cultivos originales que fueron previamente cultivados y archivados
en leche descremada conservándose a una temperatura de -80ºC.
La siembra de las levaduras se lleva a cabo mediante el método de siembra por
agotamiento (imagen 8).
Este método consiste en lo siguiente; con una aguja se pincha el contenido del archivo
vertiendo las gotas que se desprenden en la placa petri y con el asa de siembra se
extiende por la placa mediante el procedimiento por agotamiento. Estas placas
sembradas tienen que crecer durante 24 horas a 35ºC y en oscuridad (imagen 9).
Imagen 8: siembra por
agotamiento.
Imagen 9: Resultado de la siembra tras 24h. de
incubación.
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2.-Preparación de las suspensiones de cada levadura: Para preparar las
suspensiones de levaduras se utiliza un espectrofotómetro con escala McFarland. En
primer lugar se hace el blanco con agua destilada (realización del cero) en un tubo de
vidrio. Una vez realizado el blanco se utiliza un asa de siembra para tomar una pequeña
cantidad de inóculo de la placa de resiembra por agotamiento y se emulsiona en el
diluyente del tubo. Posteriormente se agita el tubo y se mide la turbidez de la
suspensión con respecto al blanco; el valor obtenido puede tener una desviación de ±
0,05McF.
3.- Preparación del medio de cultivo: Las levaduras crecen en medios de cultivo
de agar-Sabouraud; para su preparación se utilizaron polvos comerciales “OXOID
CM0041 SABOURAUD DEXTROSE AGAR” (estos polvos contienen peptona,
glucosa y agar) y una cierta cantidad de antibiótico antibacteriano de cloranfenicol (C-
0378 by SIGMA). Para preparar un litro de este medio de cultivo se necesita disolver
65gr de los polvos comerciales y 0,05gr de cloranfenicol (50mg/ml) en agua
destilada(1litro).
Esta disolución se calienta hasta que hierva el agua manteniendo agitación magnética a
1200rpm. Una vez disuelto se esteriliza en el autoclave durante 15 minutos y una
temperatura de 121ºC.
Al terminar el autoclave el medio se deja enfriar hasta que disminuya la temperatura a
45-50ºC y se comienzan a rellenar las placas petri (STERILIN) con dicho medio hasta
un tercio de su capacidad. Se deja que el medio se solidifique en dichas placas y se
conservan a una temperatura de 4-8ºC.
4.- Preparación de disoluciones madre del FS (DMM-B): El DMM-B se
comercializa en estado sólido y en los experimentos se utiliza en disolución por lo que
habrá que preparar una disolución madre inicial de 1mM.
-Peso molecular: 416,05mg/mmol
-Cantidad de DMM-B de la que se parte: 1mg al 80%----- 0,80mg de DMM-B.
-Disolvente de la disolución madre: DMSO
Se calcula el volumen de DMM-B necesario para preparar la disolución madre (1mM):
M= moles (n)/ volumen (v)
Moles= gramos (gr) / peso molecular (PM)
M= (gr/PM)/ v; v= (gr/PM)/ M es decir
V= (0,80mg/416,06mg/mmol) /1mmol/L= 0.00193l= 1.93ml de DMM-B
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5.-Preparaciones de las muestras para la irradiación: Para la realización el
experimento se utilizan placas microtitter de 96 pocillos (Figura 10); en cada pocillo se
depositan 90µl de la suspensión de levadura (preparado en el apartado 2) añadiéndose
diferentes cantidades de FS y agua destilada dependiendo de la concentración de aquel
que requiera en cada experimento hasta alcanzar un volumen final de 100µl en cada
pocillo. En todos los experimentos se utiliza agua destilada y desionizada como
disolvente excepto en los experimentos con inhibidores en los que se utiliza PBS como
disolvente ya que los inhibidores necesitan de un pH determinado (ácido) y por tanto en
presencia de agua no pueden actuar.
6.-El proceso de irradiación: Una vez preparadas las muestras se lleva a cabo el
proceso de irradiación. La placa es expuesta a una lámpara de diodos utilizando dos
dosis de luz; 18J/cm2 (15 minutos de irradiación) y 37J/cm
2 (30 minutos de irradiación).
Se utiliza un soporte para que la distancia de la lámpara a la placa microtitter sea de
5cm.
7.-Siembra de los pocillos en placas SDAC: Terminada la irradiación de las
muestras se lleva a cabo la siembra de estas en las placas de agar-Sabouraud-
cloranfenicol.
En primer lugar se vierte todo el contenido del pocillo en la superficie de la placa
utilizando para ello una micropipeta; pero en algunas ocasiones es necesario realizar
unas diluciones previas y verter en la placa 10µ de dicha dilución para poder obtener un
número de unidades formadoras de colonias (UFC) contables.
Una vez vertido el contenido se lleva a cabo la siembra usando el asa de siembra y
utilizando el método de 4 campos, proceso muy similar a la siembra por agotamiento.
Imagen 10: placa microtitter 96 pocillos.
Imagen 11: lámpara de irradiación en
funcionamiento
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8.-Realización de titulaciones-controles: Los controles se realizan a partir de las
suspensiones iniciales de levaduras y son de tres tipos:
-Control sin fotosensibilizante y sin irradiar (titulación): Para este control
se adiciona en un pocillo de la placa microtitter 90µl del inóculo inicial y 10µl de agua
destilada, se realizan diluciones 1/100 y 1/1000 cuando el inóculo inicial es de 0,5McF
y diluciones 1/1000 y 1/10000 cuando el inóculo inicial es de 4McF. Se siembran 10µl
de estas diluciones en placa.
-Control sin FS pero irradiado: Para este control se adiciona en un pocillo
90µl del inóculo inicial y 10µl de agua destilada, se irradia el mismo tiempo que las
muestras y se siembra utilizando las mismas diluciones que en el caso anterior.
-Control con fotosensibilizante y sin irradiar: Consiste en añadir en el
pocillo 90µl del inóculo inicial y añadir las cantidades de FS y disolvente necesarias
para alcanzar la concentración fungicida en cada estudio, posteriormente se realizan
diluciones 1/100 y 1/1000 sembrando en placa 10µl de cada dilución sin irradiar las
muestras.
9.-Recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en placa: Para evaluar el
daño fotodinámico se medirá la capacidad de formar colonias de los gérmenes tras la
TFDA. Se hará un recuento del número de colonias que sobrevivan y se realizará una
comparación con respecto al número obtenido en las placas control (titulación). Dicho
recuento se realiza tras 48 horas de incubación. Cada experimento se realiza por
triplicado y en día diferentes, para comprobar su reproducibilidad. Se determinará que
concentraciones de DMM-B son necesarias para reducir 3 unidades logarítmicas
(>99,9%) partiendo de un inóculo inicial 0,5McF o reducir 6 unidades logarítmicas
(>99,9999%) partiendo de un inóculo inicial 4McF.
10.-Experimentos del estudio: el estudio consta de tres experimentos;
1º.- Se realiza una curva de tiempos de incubación, con el FS y con las
levaduras, para determinar cuál es el tiempo óptimo de incubación antes de la
irradiación. Para ello se utilizó una concentración fija de DMM-B y se realizan varios
experimentos utilizando en cada uno un tiempo de incubación de las levaduras con
DMMB previo a la irradiación diferente (0,15,30 y 60 minutos).
Mediante estos experimentos se podrá determinar el tiempo mínimo que necesita el FS
estar en contacto con las levaduras para conseguir el mayor efecto fotodinámico y con
ello la mayor capacidad fungicida.
2º.-Consiste en realizar una curva de concentraciones de FS para
determinar cuál de ellas es la mínima concentración fungicida de FSs para cada
Candida ssp y para cada dosis de irradiación (18 y 37 J/cm2). ). Además se calcularon
estas dosis para reducir tanto 3 como 6 unidades logarítmicas del germen inicial.
Mediante estos experimentos se determinará la concentración fungicida para cada
condición.
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Los experimentos que se hagan partiendo de un inóculo inicial 0,5McF determinarán la
concentración necesaria para reducir el inóculo inicial en 3 unidades logarítmicas, tanto
con una fluencia de 18J/cm2 como de 37J/cm
2. Y el inóculo inicial de 4McF se utilizará
para los experimentos de reducción de 6 unidades logarítmicas con las dos fluencias; 18
y 37 J/cm2.
3º.-Una vez determinada la concentración fungicida para cada condición
(dosis de luz y reducción logarítmica) y cepa se realiza un último experimento para
estudiar el mecanismo de acción del DMMB en la TFDA. Para ello se realizaron 2 tipos
de experimentos:
- Estudiar la participación de las distintas ROS en la muerte celular por
TFD mediante el uso de distintos inhibidores de las mismas: acida sódica para el
oxígeno singlete, superóxido dismutasa para el anión superóxido y catalasa para el
peróxido de oxígeno. Este experimento se hizo utilizando la mínima concentración de
DMM-B fungicida como fluencia 18J/cm2 y en las condiciones utilizadas para reducir 3
unidades logarítmicas del inóculo inicial. En los pocillos de la placa microtitter se
adiciona 90µl del inóculo inicial, una cantidad definida de los inhibidores dependiendo
de la concentración que se necesita de cada uno, y se incuban durante 15 minutos.
Posteriormente se añaden la cantidad de FS y agua necesaria hasta un volumen final de
100µl llevándose a cabo el mismo protocolo que en los experimentos anteriores.
4º.-Estudio mediante microscopia confocal de fluorescencia de la
localización celular del DMM-B en las distintas Candida spp:
Los experimentos de localización se realizaron en el Hospital Clínico de Zaragoza
utilizando técnicas de microscopia confocal, para estas técnicas se utilizaron el
microscopio confocal espectral Leica TCS SP2 A0BS y microscopio confocal compacto
Olympus FV 10i Oil Type, bajo la supervisión de la Dra. María Royo en la unidad de
oncología del Hospital Clínico de Zaragoza.
El objetivo de este experimento fue comprobar que el DMM-B penetra en el interior de
las células de levaduras mediante estudios de coalescencia con fluoróforos intracelulares
con longitudes de onda de emisión diferentes a la del propio DMM-B. Además se
intentó determinar en qué lugar de la célula se localiza dicho FS mediante el uso de
marcadores mitocondriales y nucleares.
Los fluoróforos utilizados en estos experimentos son:
-Cell tracker green 1000µM (Tinción general del la célula)
-DMM-B (1000µM)
-Mitotracker 1000µM (Tinción de mitocondrias)
-DAPI 1000µM (Tinción de núcleos)
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 16
PROTOCOLO 1: COALESCENCIA DEL DMM-B CON CELL-TRACKER GREEN:
Se realizará en tres tubos eppendorffs diferentes:
1) Cepa D.O.= 0,5 McF + cell tracker green (5 M).
2) Cepa D.O.= 0,5 McF + cell tracker green + DMM-B (ambos a 5 M).
3) Cepa D.O.= 0,5 McF.
Los tres tubos seguirán el mismo procedimiento de actuación (excepto la adición de los
fluoróforos) y todo el proceso se llevará a cabo en la mayor oscuridad posible:
-Tubo 1: Volumen de 500 L donde habrá una concentración de cell tracker
green de 10 M :
1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L de cell tracker green + 495 L del
medio Sabouraud caldo (SC) previamente calentado a 37ºC.
Se utiliza como disolvente el medio SC previamente preparado (4gr de glucosa + 1gr de
peptona bacteriológica en 100ml de agua destilada). Después se filtra por un filtro de
0,22 m de diámetro de poro para su esterilización y se calienta a 37ºC antes de
mezclarlo con el fluoróforo.
Sobre esos 500 l de medio se añaden 500 l de una suspensión de germen 0,5McF de
densidad óptica, con lo que se llega a un volumen final de 1000 l (la suspensión del
germen se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC).
Con esta adición hemos diluido a la mitad la concentración del cell tracker green
obteniendo una concentración final de 5 M.
Tubo 2: Necesitamos una concentración de 5 M de DMM-B y 5 M de
cell tracker green, pero los tiempos de incubación son diferentes, asi que:
1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L (cell tracker green)
Sobre esos 500 l de medio se adicionan 450 l de la suspensión del germen 0,5 McF,
con lo que se llega a un volumen de 950 l (la suspensión de levaduras se prepara con
medio SC y se precalienta a 37ºC).
Con esta adición no hemos diluido exactamente a la mitad la concentración del cell
tracker green a 5 M como deseábamos, pero es debido a que los 50 l que faltan serán
de DMM-B 100 M que serán añadidos después de la incubación:
100 M x V = 1000 l x 5 M => V= 50 l de la disolución original de DMM-B.
Tubo 3: 500 l de la suspensión 0,5McF del germen preparada con SDAC y
500 l de medio SC precalentado a 37ºC.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 17
Incubación:
Los tres tubos se incuban a 35ºC durante 40 minutos.
Al acabar ese tiempo se saca el tubo 2 y se le añaden los 50 l de la disolución 100 M
de DMM-B con lo que se obtienen 1000 l donde las concentraciones de los fluoróforos
se encuentran ya ajustadas como se indicaba.
Se vuelve a meter el tubo 2 a 35ºC y se deja otros 5 min con los tubos 1 y 3 que no se
habían sacado de la estufa.
Cumplidos esos 5 min se sacan los tres tubos y se centrifugan 5 min a 10.000rpm.
Se extrae el sobrenadante y se resuspende el pellet en otros 1000 l de SC precalentado a
37ºC.
Se incuba otros 30 min a 35ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Lavados:
Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado
a 37ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado
a 37ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de SC precalentado a 37ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Se descarta el sobrenadante y nos quedamos con 40 l de pellet.
Toma de muestra y montaje:
Se resuspende el pellet utilizando vortex.
Se toman 10 l del pellet y se depositan en un tubo limpio.
En un porta se extiende una capa de polilisina y se deja secar al aire unos minutos.
Sobre el porta con polilisina se posiciona el tubo con los 10 l del pellet y por medio de
una centrífuga se extiende y se “deposita” la muestra sobre la capa de polilisina.
Se realiza un lavado con suero fisiológico sobre el porta y se vuelve a centrifugar.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 18
Una vez se encuentre seco tomamos un cubre redondo y aplicamos sobre él 5 l de
moviol.
Pegamos el porta con el cubre por el lado donde fue aplicado el moviol (glicerol si no
hay).
Se deja extender 5 minutos.
Se aplica esmalte de uñas por todo el contorno del cubre.
PROTOCOLO 2: LOCALIZACIÓN INTRACELULAR DEL DMM-B CON CELL-
TRACKER GREEN, MITOTRACKER Y DAPI.
Se realizará en dos tubos eppendorffs diferentes:
1) Cepa D.O.= 0,5 McF + mitotracker + DMM-B + DAPI (todos a 5 M).
2) Cepa D.O.= 0,5 McF + cell tracker green + DMM-B + DAPI (todos a 5 M).
Los dos tubos seguirán el mismo procedimiento de actuación y todo el proceso tendrá
lugar en la mayor oscuridad posible.
Tubo 1: 500 L donde tendremos una concentración de mitotracker de 10 M:
La disolución original de mitotracker es de 1000 M:
1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L de mitotracker
Se dispone asimismo de sendas disoluciones de DMM-B y de DAPI 1000 M, con lo
que se realizará el mismo paso para su dilución con lo cual, se utilizan 5 L de cada una
de ellas; los 500 L se completan con 485 L de disolución de análisis.
5 L mitotracker 1000 M + 5 L DAPI 1000 M + 5 L DMM-B 1000 M + 485 L
disolución para análisis = 500 L
La disolución para el análisis utilizada resulta ser medio SC previamente preparado (4gr
de glucosa + 1gr de peptona bacteriológica en 100ml de agua destilada. Después se
filtra por un filtro de 0,22 m de diámetro de poro para su esterilización y se calienta a
37ºC antes de mezclarlo con el fluoróforo).
Se observa que el primer paso es la dilución de los fluoróforos hasta 10 M teniendo en
cuenta que la otra mitad de la disolución de análisis será, precisamente la suspensión de
germen preparada.
Sobre esos 500 L de medio se vierten otros 500 L de una suspensión de germen
0,5McF de densidad óptica, con lo que se llega a un volumen de 1000 l (la suspensión
del germen se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC).
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 19
Con esta adición hemos diluido a la mitad la concentración del cell tracker green
obteniendo una concentración final de 5 M.
Tubo 2: se dispondrá de un volumen de 500 L donde tendremos una
concentración de cell tracker green de 10 M:
La disolución original de celltracker green es de 1000 M:
1000 M x V = 500 L x 10 M => V= 5 L de cell tracker green
Se dispone asimismo de sendas disoluciones de DMM-B y de DAPI 1000 M, con lo
que se realizará el mismo paso para su dilución con lo cual, se utilizan 5 L de cada una
de ellas; los 500 L se completan con 485 L de disolución de análisis.
5 L mitotracker 1000 M + 5 L DAPI 1000 M + 5 L DMM-B 1000 M + 485 L
disolución para análisis = 500 L
La disolución de análisis utilizada resulta ser medio SC previamente preparado (4gr de
glucosa + 1gr de peptona bacteriológica en 100ml de agua destilada. Después se filtra
por un filtro de 0,22 m de diámetro de poro para su esterilización y se calienta a 37ºC
antes de mezclarlo con el fluoróforo).
Se observa que el primer paso es la dilución de los fluoróforos hasta 10 M teniendo en
cuenta que la otra mitad de la disolución de análisis será, precisamente la suspensión de
germen preparada.
Sobre esos 500 L de medio se vierten otros 500 L de una suspensión de germen
0,5McF de densidad óptica, con lo que se llega a un volumen de 1000 l (la suspensión
del germen se prepara con medio SC y se precalienta a 37ºC).
Con esta adición hemos diluido a la mitad la concentración del cell tracker green
obteniendo una concentración final de 5 M.
Incubación:
Los tres tubos se incuban a 35ºC durante 40 minutos.
Al acabar ese tiempo se saca el tubo nº2 y se le añaden los 50 l de la disolución
100 M de DMM-B con lo que se obtienen 1000 l donde las concentraciones de los
fluoróforos se encuentran ya ajustadas como se indicaba.
Se vuelve a meter el tubo nº2 a 35ºC y se deja otros 5 min con los tubos 1 y 3 que no se
habían sacado de la estufa.
Cumplidos esos 5 min se sacan los tres tubos y se centrifugan 5 min a 10.000rpm.
Se extrae el sobrenadante y se resuspende el pellet en otros 1000 l de SC precalentado a
37ºC.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 20
Se incuba otros 30 min a 35ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Lavados:
Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado
a 37ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de suero fisiológico precalentado
a 37ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Se descarta el sobrenadante y se resuspende en 1000 l de SC precalentado a 37ºC.
Se centrifuga 5 min a 10.000rpm.
Se descarta el sobrenadante y nos quedamos con 40 l de pellet.
Toma de muestra y montaje:
Se resuspende el pellet utilizando vortex.
Se toman 10 l del pellet y se depositan en un tubo limpio.
En un porta se extiende una capa de polilisina y se deja secar al aire unos minutos.
Sobre el porta con polilisina se posiciona el tubo con los 10 l del pellet y por medio de
una centrífuga se extiende y se “deposita” la muestra sobre la capa de polilisina.
Se realiza un lavado con suero fisiológico sobre el porta y se vuelve a centrifugar.
Una vez se encuentre seco tomamos un cubre redondo y aplicamos sobre él 5 l de
moviol.
Pegamos el porta con el cubre por el lado donde fue aplicado el moviol (glicerol si no
hay) y se deja extender 5 minutos.
Se aplica esmalte de uñas por todo el contorno del cubre.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 21
4.-RESULTADOS:
1º.-Efecto fototóxico del DMMB en Candida spp. en función del tiempo de
incubación: de los resultados de la curva de tiempos de incubación se puede determinar
que el tiempo mínimo que necesita el FS (DMM-B) para penetrar en el interior de las
lavaduras es de 15 minutos. Se han realizado experimentos en los que se utiliza una
levadura en concreto (C.albicans (ATCC 10231)), una concentración fija de FS
(1,25µM), unas condiciones determinadas (18 J/cm2 y capacidad de reducir 3 unidades
logarítmicas) y 4 tiempos de incubación (0,15,30 y 60 minutos) observando que la TFD
es más eficaz cuando el tiempo de incubación previo a la irradiación es de al menos 15
minutos; es decir, comparando las CFU/ml en el experimento con un tiempo de
incubación igual a 0 minutos y el experimento con un tiempo de incubación igual a 15
minutos se observa como existe menor número de CFU/ml con un tiempo de incubación
igual a t=15minutos y a tiempos superiores (30 y 60 minutos) no mejoran este resultado.
En los experimentos posteriores siempre se utilizará 15 minutos como tiempo de
incubación óptimo del DMM-B previo a la irradiación.
2º.- Efecto fototóxico del DMMB en Candida spp con curvas de concentraciones: En
los experimentos realizados con las curvas de concentraciones de DMM-B se
obtuvieron los siguientes resultados ( hay que tener en cuenta que NF es no fungicida y
F es fungicida):
-Sobre C.albicans ATCC 10231; para una fluencia de 18 J/cm2 se necesita una
concentración de 2,5 deDMM-B para reducir 3 unidades logarítmicas con respecto
al inóculo inicial y una concentración de 20µM para reducir 6 unidades logarítmicas.
Para una fluencia de 37 J/cm2 se precisa de una concentración de FS de 1,25µM para
reducir 3 unidades logarítmicas y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
37J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9920% 4.02 NF
5 100% 7.2 F
18J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0,3125 99.2% 1,97 NF
0,625 99.7% 2,42 NF
1,25 99.8% 2,64 NF
2,5 99.9% 3,95 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 22
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
C.albicans ATCC (3und. log.)
0 1 2 30
2
4
6
818 J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g10
(CFU
/ml)
C.albicnas ATCC (6und. log.)
0 5 10 15 20 250
2
4
6
818 J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g10
(CF
U/m
l)
-Respecto a la cepa de C.albicans CETC 1001; para un fluencia de 18 J/cm2 y
reducir 3 unid. Log. se necesita una concentración de DMM-B de 1,25 y para reducir
6 und. Log el inóculo inicial se precisa de una concentración de 20µM de DMM-B. Para
una fluencia de 37J/cm2 y reducir 3 unidades logarítmicas se necesita 1,25µM de
DMM-B y para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial se precisa 5µM de
DMM-B.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
10 99.9997% 5.95 NF
20 100% 7.2 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc
Log
(final
CFU/ml
fungicidad
0,625 99.7% 2.54 NF
1,25 99.9% 3.78 F
2,5 100% 6.19 F
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0,3125 99.4% 2.19 NF
0,625 99.7% 2.48 NF
1,25 99.9% 3.71 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.625 99.8% 2.89 NF
1.25 99.9% 5.23 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 23
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
C.albicans CETC (3 und. log.)
0.5 1.0 1.5
-2
0
2
4
6
818
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C. albicans CETC (6 und. log.)
5 10 15 20 25-2
0
2
4
6
8
1018J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a la cepa de C.parasilopsis ATCC 22019: para una fluencia de
18J/cm2
se necesita de una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 und.
Log. y 20µM para reducir 6 unidades logarítmicas del inóculo inicial. Para una fluencia
de 37 J/cm2 se necesita una concentración de FS de 0,625µM para reducir 3 unidades
logarítmicas y 10µM para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.9610% 3.4 NF
2.5 99.9867% 5.94 NF
5 99.9999% 7.16 F
18J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml
Fungicidad
0 0 0 NF
10 99.9998% 5.85 NF
20 100% 7.22 F
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0,3125 99.1% 1.93 NF
0,625 99.8% 2.27 NF
1,25 99.9% 3.34 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0,3125 99.8% 2.46 NF
0,625 99.9% 3.49 F
1,25 100% 6.06 F
37J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9976% 4.63 NF
5 99.9989% 5.24 NF
10 100% 7.01 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
10 99.9610% 4.85 NF
20 100% 7.01 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 24
C.parasilopsis ATCC (6 und. log.)
0 5 10 15 20 250
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a C.krusei ATCC 6258; para una fluencia de 18J/cm2 se necesita una
concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 80µM
para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial. Para una fluencia de 37J/cm2 se
necesita una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3unidades logarítmicas
y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas del inóculo inicial.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.625 99.3% 2.808 NF
1.25 99.7% 3.198 F
2.5 99.9% 4.268 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0.625 99.8% 2.798 NF
1.25 99.9% 4.378 F
2.5 99.9% 6.955 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
20 99.9870% 4.12 NF
40 99.9989% 5.52 NF
80 100% 6.99 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9843% 3.35 NF
5 99.9999% 6.12 F
10 100% 6.99 F
C. parasilopsis ATCC (3 und. log.)
0.0 0.5 1.0 1.50
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 25
C.krusei ATCC (6 und. log.)
0 20 40 60 80 1000
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a C.albicans 456325H; para una fluencia de 18J/cm2 se necesita una
concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 5µM para
reducir 6 unidades logarítmicas el incúlo inicial. Para una fluencia de 37J/cm2 se
necesita una concentración de DMM-B de 0,625µM para reducir 3 unidades
logarítmicas y 1,25 para reducir 6 unidades logarítmicas del inóculo inicial.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
C.albicans 456325H (6 und. log.)
0 5 10 15 20 250
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.625 99.7% 2.73 NF
1.25 99.9% 4.19 F
2.5 99.9% 5.48 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0.16 99.7% 2.85 NF
0.3125 99.7% 2.94 NF
0.625 99.9% 3.36 F
1.25 100% 6.48 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9934% 4.66 NF
5 99.9999% 6.01 F
10 100% 7.34 F
20 100% 7.34 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0.3125 99.9600% 3.51 NF
0.625 99.9700% 3.52 NF
1.25 99.9999% 6.08 F
C.krusei ATCC (3 und. log.)
1 2 3
-2
0
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C. albicans 456325H (3 und. log.)
0 1 2 30
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 26
-Respecto a C.albicans AZN-9635; para una fluencia de 18J/cm2 se
necesita una concentración de DMM-B de 1,25 µM para reducir 3 unidades logarítmicas
y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas, usando una fluencia de 37 J/cm2 0,625µM
para reducir unidades logarítmicas y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas usando
una fluencia de 37J/cm2.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
C.albicans AZN-9635 ( 3 und. log.)
0.5 1.0 1.5
-2
0
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C.albicans AZN-9635 (6 und. log.)
2 4 6-2
0
2
4
6
8
1018J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a C. albicans AM07/0267;Para una fluencia de 18J/cm2 se necesita
una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 2,5µM
para reducir 6 unidades logarítmicas, la misma concentración que se necesita para
reducer 6 unidades logarítmicas.Usando una fluencia de 37 J/cm2, y 0,625 µM para
reducir 3 unidades logarítmicas usando la fluencia de 37 J/cm2.
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0.16 99.6% 2.51 NF
0.3125 99.8% 2.86 NF
0.625 99.9% 3.32 F
1.25 99.9% 5.21 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.3125 99.4% 2.43 NF
0.625 99.7% 2.47 NF
1.25 99.9% 5.37 F
18J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.9860% 5.21 NF
2.5 99.9989% 5.98 NF
5 99.9999% 7.32 F
10 100% 7.58 F
37J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9929% 5.54 NF
5 100% 7.58 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 27
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
C.albicans AM07/0267 (3 und. log.)
0.5 1.0 1.5
-2
0
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C. albicans AM07/0267 (6 und. log.)
5 10 15-2
0
2
4
6
8
1018J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a cepa C. glabrata AZN16-46; para una fluencia de 18 J/cm2 se
precisa una concentración de 2,5µM de DMM-B para reducir 3 unidades logarítmicas y
10µM para reducir 6 unidades logarítmicas Con una fluencia de 37 J/cm2 se necesita
una concentración de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 5µM de DMM-B
para reducir 6 unidades logarítmicas el inóculo inicial. Para reducir 3 unidades
logarítmicas:
18J/cm2
[DMM-B+
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.3125 99.7% 2.22 NF
0.625 99.8% 2.44 NF
1.25 99.9% 5.73 F
37J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.16 99.8% 2.89 NF
0.3125 99.7% 2.92 NF
0.625 99.9% 3.82 F
1.25 99.99% 4.86 F
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.9969% 5.94 NF
2.5 99.9999% 7.31 F
5 99.9999% 7.58 F
10 100% 7.58 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0,625 99.9963% 4.64
NF
1.25 99.9998% 5.86 NF
2.5 100% 7.58 F
5 100% 7.58 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.7% 2.55 NF
2.5 99.9% 4.78 F
5 100% 6.38 F
37J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
0.625 99.8% 2.65 NF
1.25 99.9% 4.12 F
2.5 99.9% 5.08 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 28
Parar reducer 6 und. Log.:
C. glabrata AZN16-46( 3 und. log.)
0 1 2 30
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C. glabrata AZN16-46( 6 und. log.)
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
1018J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a la levadura C. glabrata YFJ00-658: Para una fluencia de 18 J/cm2
se
necesita una concentración de DMM-B de 2,5µM para reducir 3 unidades logarítmicas y
20µM para reducir 6 unidades logarítmicas. Usando una fluencia de 37 J/cm2 se precisa
de una concentración 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas y 10µM para reducir
6 unidades logarítmicas.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 unidades logarítmicas:
18J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
5 99.9910% 4.17 NF
10 99.9999% 6.64 F
20 100% 7.61 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.9600% 3.79 NF
2.5 99.9993% 4.77 NF
5 100% 6.45 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.8% 2.67 NF
2.5 99.9% 3.48 F
5 99.9% 5.1 F
37J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.625 99.6% 2.49 NF
1.25 99.9% 3.49 F
2.5 99.9% 4.46 F
18J/cm2
[DMM-B]
(µM)
% inhibición
Reducc. log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
5 99.9940% 4.11 NF
10 99.9990% 5.14 NF
20 99.9996% 6.35 F
40 100% 7.61 F
37J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9931% 4.09 NF
5 99.9970% 4.82 NF
10 100% 7.61 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 29
C.glabrata YFJ00-658 ( 3 und. log.)
2 4 6
-2
0
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C. glabrata YFJ00-658 ( 6und. log.)
10 20 30 40 50-2
0
2
4
6
8
1018J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
-Respecto a cepa C. rugosa YFJ002-29: Para una fluencia de 18 J/cm2 se
necesita una concentración de DMM-B de 1,25µM para reducir 3 unidades logarítmicas
y 5µM para reducir 6 unidades logarítmicas. Para una fluencia de 37 J/cm2 se precisa de
una concentración de 1, 25µM de DMM-B.
Para reducir 3 unidades logarítmicas:
Para reducir 6 und. Log.:
C. rugosa YFJ002-29 (3 und. log.)
0.5 1.0 1.5
-2
0
2
4
6
818J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
C.rugosa YFJ002-29 ( 6 und. log.)
5 10 15-2
0
2
4
6
8
1018J/cm2
37 J/cm2
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.3125 99.8% 2.47 NF
0.625 99.8% 2.58 NF
1.25 99.9% 3.89 F
37J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
0.3125 99.5% 2.47 NF
0.625 99.7% 2.51 NF
1.25 99.9% 5.09 F
18J/cm2
[DMM-
B]
(µM)
%
inhibición
Reducc.
log.
(CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
2.5 99.9960% 4.97 NF
5 99.9999% 6.32 F
10 100% 7.59 F
37J/cm2
[DMM-
B] (µM)
%
inhibición
Reducc.
log. (CFU/ml Fungicidad
0 0 0 NF
1.25 99.9970% 4.68 NF
2.5 99.9999% 6.43 F
5 99.9999% 6.59 F
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 30
Los resultados obtenidos se engloban en la siguiente tabla, en la que se muestran las
concentraciones fungicidas de DMM-B para cada condición:
Cepa 18J/cm2
y
3unidades
logarítmicas
18J/cm2
y 6
undidades
logarítmicas
37J/cm2
y
3unidades
logarítmicas
37J/cm2
y
6unidades
logarítmicas
C.albicans
ATCC 10231
2,5µM 20 µM 5 µM 1,25 µM
C.albicans
CETC 1001
1,25 µM 20 µM 1,25 µM 5 µM
C.parasilopsis
ATCC 22019
1,25 µM 20 µM 0,625 µM 10 µM
C.krusei ATCC
6258
1,25 µM 80 µM 1,25 µM 5 µM
C.albicans
456325H
1,25 µM 5 µM 0,625 µM 1,25 µM
C.albicans
AZN-9635
1,25 µM 5 µM 0,625 µM 5 µM
C. albicans
AM07/0267
1,25 µM 5 µM 0,625 µM 5 µM
C. glabrata
AZN16-46
1,25 µM 10 µM 1,25 µM 5 µM
C. glabrata
YFJ00-658 2,5 µM 20 µM 1,25 µM 10 µM
C. rugosa
YFJ002-29
1,25 µM 5 µM 1,25 µM 2,5 µM
Una vez obtenidos estos resultados se realizó una comparación entre cepas sensibles por
un lado y otra comparación de las cepas resistentes; mostrándose las gráficas
comparativas a continuación:
18J/cm2 y 6 log
0 50 100-2
0
2
4
6
8
10candida albicans(ATCC)
Candida albicans(CETC)
candida parasilopsis(ATCC)
candia krusei(ATCC)
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
18J/cm2 y 3 log
0 1 2 3
2
4
6
8candida albicans(ATCC)
Candida albicans(CETC)
C.krusei(ATCC)
Candida parasilopsis(ATCC)
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
37J/cm2 y 6 log
0,00
00
0,16
00
0,31
25
0,62
50
1,25
00
2,50
00
5,00
00-2
0
2
4
6
8
10candida albicans (ATCC)
candida albicans (CETC)
candida parasilopsis(ATCC)
candida krusei(ATCC)
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
37J/cm2 y 3 log.
0
0.16
0.3125
0.625
1.25
2.5
-2
0
2
4
6
8candida albicans(ATCC)
C. Albicans(CETC)
Candida krusei
candida parasilopsis(ATCC)
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/m
l)
18J/cm2 y 3 log
2 4 6
-2
0
2
4
6
8C.albicans (456325H)
C. albicans (AZN9635)
C.albicans (AM07/0267)
C.glabrata (AZN16-46)
C.glabrata (YFJ002-658)
C.rugosa (YFJ002-29)
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
18 J/cm2 y 6 und. log.
10 20 30 40 50-2
0
2
4
6
8
10C.albicans (456325H)
C. albicans (AZN9635)
C.albicans (AM07/0267)
C.glabrata (AZN16-46)
C.glabrata (YFJ002-658)
C.rugosa (YFJ002-29)
[DMM-B]
37J/cm2 y 3 log.
0.5 1.0 1.5
-2
0
2
4
6
8C.albicans (456325H)
C. albicans (AZN9635)
C.albicans (AM07/0267)
C.glabrata (AZN16-46)
C.glabrata (YFJ002-658)
C.rugosa (YFJ002-29)
[DMM-B]
Lo
g1
0(C
FU
/ml)
37J/cm2 y 6 log
5 10 15-2
0
2
4
6
8
10C.albicans (456325H)
C. albicans (AZN9635)
C.albicans (AM07/0267)
C.glabrata (AZN16-46)
C.glabrata (YFJ002-658)
C.rugosa (YFJ002-29)
[DMM-B]
Como se observa en las gráficas comparativas de las cepas sensibles (gráficas de la fila
superior) no existe gran diferencia entre las cepas; la única se que parece diferir un poco
es C.krusei, la cual se comporta de forma independiente.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 31
En cuanto a las gráficas comparativas de las cepas resistentes (gráficas de la fila
inferior) no existe gran diferencia entre las cepas aunque C. glabrata (YFJ002-658) se
comporta de forma diferente, siendo menos sensible que el resto de cepas.
3º.- Efecto de los inhibidores de las distintas especies reactivas del oxígeno en el
efecto fototóxico del en Candida spp: una vez determinadas las concentraciones
fungicidas para todas las Candida spp y para cada condición se muestran a continuación
los resultados del último experimento en el que se utilizan inhibidores y se usan
exclusivamente las condiciones de fluencia 18J/cm2 y reducción de 3 unidades
logarítmicas.
Las concentraciones fungicidas varían dependiendo del disolvente utilizado; en
los experimentos con inhibidores se necesita utilizar PBS como disolvente ya que los
inhibidores utilizados son enzimas que precisan de un determinado pH ácido
proporcionado por este disolvente. A continuación se muestran la inhibición del efecto
fungicida ejercida por los inhibidores de las distintas ROS:
CEPA [DMM-B]
fung. (µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.albicans(ATCC) 2.5 Catalasa 0,49%
C.albicans(ATCC) 2.5 SOD 0,12%
C.albicans(ATCC) 2.5 Azida sódica 37,98%
C. albicans (ATCC)
CATALASASOD
AZIDA SODICA0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
20
40
60
80
100
Inhibidores
%Sup
ervivi
encia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.albicans(CETC) 5 Catalasa 0,19%
C.albicans( CETC) 5 SOD 0,05%
C.albicans(CETC) 5 Azida sódica 89,03%
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 32
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C. parasilopsis (ATCC) 1.25 Catalasa 0,12%
C.parasilopsis (ATCC) 1.25 SOD 0,17%
C.parasilopsis (ATCC) 1.25 Azida sódica 40,27%
C. parasilopsis (ATCC)
CATALASASOD
AZIDA SODICA0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
20
40
60
80
100
Inhibidores
%Sup
erviv
iencia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C. krusei (ATCC) 5 Catalasa 0,26%
C. krusei (ATCC) 5 SOD 0%
C. krusei (ATCC) 5 Azida sódica 2,12%
C. albicans (CETC)
CATALASASOD
AZIDA S
ODICA
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
20
40
60
80
100
Inhibidores
%Su
perv
ivien
cia
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 33
C. krusei (ATCC)
CATALASASOD
AZIDA SODICA0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Inhibidores
%Sup
erviv
iencia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C. albicans (456325H) 2.5 Catalasa 2,85%
C. albicans (456325H) 2.5 SOD 1,49%
C. albicans (456325H) 2.5 Azida sódica 66,88%
C. albicans (456325H)
CATALASASOD
AZIDA SODIC
A0
2
4
6
8
10
40
60
80
100
Inhibidores
%Su
perv
ivien
cia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.albicans(AZN9635) 2.5 Catalasa 1,91%
C.albicans(AZN9635) 2.5 SOD 0,47%
C.albicans(AZN9635) 2.5 Azida sódica 59,06%
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 34
C. albicans (AZN-9635)
CATALASASOD
AZIDA S
ODICA
0
1
2
3
4
530405060708090
100
Inhibidores
%Su
perv
ivie
ncia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.albicans(AM0710267) 1.25 Catalasa 0,08%
C.albicans(AM0710267) 1.25 SOD 0,25%
C.albicans(AM0710267) 1.25 Azida sódica 66,92%
C. albicans (AM071-0267)
CATALASASOD
AZIDA SODIC
A0
130405060708090
100
Inhibidores
%Su
perv
ivien
cia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.glabrata(AZN16-56) 5 Catalasa 0,25%
C.glabrata(AZN16-56) 5 SOD 0,89%
C.glabrata(AZN16-56) 5 Azida sódica 40,15%
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
Página 35
C.glabrata (AZN16-56)
CATALASASOD
AZIDA SODIC
A0
1
2
3
20
40
60
80
100
Inhibidores
%Su
perv
ivien
cia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.glabrata(YFJ002-658) 10 Catalasa 2,27%
C.glabrata(YFJ002-658) 10 SOD 0,01%
C.glabrata(YFJ002-658) 10 Azida sódica 70,04%
C.glabrata (YFJ002-658)
CATALASASOD
AZIDA SODICA0
1
2
3
4
5
20
40
60
80
100
Inhibidores
%Sup
ervivi
encia
CEPA [DMM-B]
fung.(µM)
INHIBIDOR % SUPERVIVENCIA
C.rugosa(YFJ002-29) 2,5 Catalasa 0,09%
C.rugosa(YFJ002-29) 2,5 SOD 0,06%
C.rugosa(YFJ002-29) 2,5 Azida sódica 78,41%
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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C.rugosa (YFJ002-29)
CATALASASOD
AZIDA SODIC
A0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
20
40
60
80
100
Inhibidores
%Su
perv
ivien
cia
A partir de las gráficas y tablas obtenidas de los experimentos con inhibidores se
observa como el oxígeno singlete es la especie reactiva que más contribuye a la
mortalidad inducida por la TF con DMM-B en todas las especies de Candida excepto
para C.krusei que no conoce cual es el mecanismo por el que funciona.
4º.- Localización celular de DMMB en Candida spp: Por último, los
experimentos de localización celular del DMM-B mediante microscopía confocal de
fluorescencia para las diferentes especies de Candida spp:
1.-Unión de DMM-B a C.krusei ATCC 6258:
Se observa en la primera foto la levaduras por microscopía óptica y en las otras dos
imágenes la levadura al añadir el DMM-B observándose como el FS penetra en el
interior de las levaduras.
2.-Demostración de la entrada del DMM-B en C. krusei ATCC 6258 por
coalescencia con cell-tracker green:
Microscopía
óptica
CK + DMM-B CK+ DMM-B
CK en
microscopía
optica
CK + DMM-
B
CK + DMM-B + CTG
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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En la primera imagen se observa la levadura en microscopía óptica, la segunda
imagen es la levadura con el FS y la última es la levadura con el FS y el marcador del
citoplasma observándose como el FS se encuentra en el interior del citoplasma de las
levduras.
3.-Desmostración de la no entrada del DMM-B en el interior del núcleo de las
levaduras por la no co-localización con DAPI:
La primera imagen es la levadura con el FS y el marcador citoplasmático, la segunda
imagen se muestra la levadura con el FS y el marcador nuclear observándose como el
FS no se encuentra en el interior del núcleo y en la tercera imagen se observa la
levadura con el FS y los dos marcadores observándose como el FS se localiza en el
citoplasma pero no parece penetrar en el interior del núcleo.
Mediante estas fotos se observa como el DMM-B penetra en el interior de las levaduras
(C.krusei en este caso pero es igual para todas especies de Candida) aunque parece no
colocalizarse con DAPI, marcador del núcleo.
DISCUSIÓN:
La TFDA utilizando DMM-B como FS, tiene un efecto fungicida para todas las cepas
de Candida, utilizando una incubación previa a la irradiación de tan solo 15 minutos,
aunque cada una de ellas necesita una concentración determinada de FS. No obstante
cabe destacar los siguientes aspectos:
-Respecto a las fluencias, cabe destacar que se necesita una menor cantidad de
FS cuando se irradia con la mayor fluencia utilizada, 37 J/cm2. Aunque existen algunas
excepciones como es el caso de la C.krusei que para reducir 3 unidades logarítmicas
necesita la misma concentración de DMM-B para 18 y 37J/cm2. Estas diferencias se
pueden deber a las diferencias entre cepas en los procesos de
captación/unión/metabolización del DMM-B.
CK + CTG + DMM-
B CK + DMM-B + DAPI CK+DMMB+DAPI+C
TG
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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- El presente estudio demuestra que la concentración de FS utilizada depende de
la densidad de germen; cuanto mayor sea el número de levaduras que se quieran
eliminar mayor será la cantidad de FS que se necesite para ello.
-Respecto a la comparación entre cepas sensibles y resistentes cabe decir que no
existe grandes diferencias entre ambos tipos de cepas, incluso necesitan menor cantidad
de FS las cepas resistentes en la mayoría de los casos. De esto se deduce el potencial de
la TFDA con DMM-B en el tratamiento de las candidiasis resistentes. No obstante, en
algunos estudios se ha demostrado que C.glabrata presenta una menor sensibilidad a la
fotoinactivación que C.albicans (5). Esto se atribuye al fenómeno de co-adhesión, lo
que puede limitar el área de contacto entre células de C.glabrata y el DMM-B. Aunque
existen otros estudios en los que se considera C.albicans la cepa más sensible (4). Otro
factor que hay que tener en cuenta es el estado fisiológico de las cepas ya que puede
influir en la respuesta de las levaduras a la TFD (6).
En cuanto a la comparación entre diferentes FSs, cabe destacar que el DMM-B es más
eficaz que otros como la hipericina por lo parece tener mejores cualidades para ser
usado como fotosensibilizante en la TFDA (1). Se observa como para BAM-SIPC es
necesario 5-15 minutos (12), para el azul de toluidina O se necesita 5 minutos (13), 3h.
para el ALA (12) y 15 minutos cuando se utiliza el DMM-B
Otro factor muy importante a considerar en esta terapia es el tiempo de incubación. En
este estudio además de demostrar que el DMM-B es eficaz como tratamiento fungicida,
observamos que se adhiere rápidamente a la levadura, siendo el tiempo de incubación
fundamental para la TFDA, dependiendo principalmente de la estructura del FS.
Nuestro trabajo demuestra que la especie reactiva de oxígeno que más contribuye a la
muerte de Candida spp por la TFDA con DMM-B es el oxígeno singlete, siendo este
radical libre el más comunicado como responsable de la muerte fotodinámica(7). Por lo
que lo más probable es que sea la reacción tipo II la predominante en el proceso
fotodinámica de daño directo del material biológico(6).
En cuanto a la localización celular, con los experimentos realizados se puede observar
como el DMM-B penetra en las levaduras aunque no podamos precisar en qué
orgánulos se localiza; solo se puede demostrar que no penetra en el núcleo ya que no es
capaz de atravesar la membrana nuclear; a partir de estos experimentos y técnicas
utilizadas de localización celular solo se puede decir que el DMM-B sufre una
diseminación intraceluar salvo en el núcleo lo que hace que exista una doble ventaja:
-La TFDA con DMM-B podría tener múltiples dianas celulares, ya que se
localiza de una forma difusa en el interior de la célula, lo que minimiza la posibilidad de
aparición de resistencias.
-El DMM-B no penetra en el núcleo por lo que se evitan las mutaciones en el
DNA.,lo que también contribuye a impedir el desarrollo de resistencias.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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Una de las limitaciones de nuestro estudio con microscopía de fluorescencia es que los
fluoróforos utilizados son válidos para células eucariotas animales. Las levaduras son
células eucariotas pero poseen una complejidad menor con respecto a las células
animales. Todos estos marcadores funcionaron satisfactoriamente excepto el
mitotracker, que en la mayoría de los casos no solo se encontró en las mitocondrias,
sino que se diseminó por todo el citoplasma celular.
En cuanto a los estudios futuros de localización celular, se debería intentar determinar
exactamente donde se localiza la mayoría del FS en función del tipo de germen y cepa
estudiada y en función del tiempo de contacto con el FS. Estos estudios serán realizados
por medio del uso de otros fluoróforos diferentes que sean capaces de marcar otras
estructuras celulares, así como de los ya utilizados pero optimizando su concentración
para que se aumente su selectividad en los orgánulos a estudiar.
Si bien nuestro trabajo demuestra la eficacia in vitro de la TFD con DMMB en Candida
spp aporta información nueva interesante, quedan muchas variables por modificar, las
cuales pueden hacer la TFD más eficaz y eficiente. Por ejemplo, modificar la
temperatura, ya que el calor puede potenciar el efecto de la TFD, modificar el vehículo
del DMM-B, controlar los cambios en el pH entre otros. Otro aspecto importante para el
futuro es trasladar la TF in vitro a in-vivo. Por ello, nuestro grupo, en colaboración con
la Unidad de Valoración Funcional del Instituto de Ciencias de la Salud (ICS) y la Prof.
Maite Verde de la Facultad de Veterinaria, está preparando el protocolo para testar éste
y otros FSs en infecciones cutáneas inducidas en animales de experimentación
infectados.
En nuestro proyecto futuro, está realizar experimentos de sinergias, es decir, buscar
procedimientos para potenciar la TFD, como la combinación de dos FSs de diferente
naturaleza de forma simultánea. De esta forma, se podría mejorar la TFDA haciéndola
más eficaz.
CONCLUSIONES:
1.-La terapia fotodinámica antimicrobiana con DMMB es eficaz y fungicida in
vitro frente a levaduras del tipo Candida spp, causantes de diferentes infecciones
cutáneas y mucosas.
2.-El tiempo óptimo de incubación previo a la irradiación debe ser al menos de
15 minutos.
3. Las cepas y especies de Candidaresistentes a azoles son susceptibles in vitro a
la TFD con DMMB sin diferencias respecto a las cepas sensibles a azoles.
Terapia fotodinámica antimicrobiana con DMM-B “in vitro”
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4.- El oxígeno singlete es la especie reactiva que más contribuye al efecto
fototóxico fungicida del DMMB en las distintas especies de Candida.
5.- El FS azul de 1,9-dimetilmetileno (DMM-B) es capaz de penetrar en las
células de levaduras y difundir por su interior pero sin atravesar la membrana nuclear.
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