proyecto de tesis maria
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
PROYECTO DE TESIS
EFECTO ANTIBACTERIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE Citrus reticulata
“MANDARINA” VARIEDAD SATSUMA EN EL CRECIMIENTO DE Pseudomona
aeruginosa Y DE Staphylococcus aureus
AUTOR: Br. MARÍA VICTORIA TRUJILLO LAGUNA
ASESOR: Dr. PEDRO MERCADO MARTÍNEZ
TRUJILLO – PERÚ
2012
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
I.- GENERALIDADES:
1.-Título:
Efecto antibacteriano del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad
Satsuma en el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus.
2.- Autor:
2.1. Nombres y Apellidos : María Victoria Trujillo Laguna
2.2. Facultad : Ciencias Biológicas
2.3. Escuela : Microbiología y Parasitología
2.4. Categoría : Bachiller
2.5. Número matrícula : 051900706
3. Asesor:
3.1. Apellidos y Nombres : Pedro Estuardo Mercado Martínez
3.2. Grado Académico : Doctor en Ciencias Biomédicas.
3.3. Título Académico : Biólogo Microbiólogo.
3.4. Dirección Laboral: Departamento académico de Microbiología y Parasitología
de la Universidad Nacional de Trujillo.
4. Tipo de Investigación:
5.1. De acuerdo al diseño de investigación : Experimental
5.2. De acuerdo al tipo de investigación : Básica
5. Régimen de Investigación:
Libre
6. Lugar: Trujillo
- Institución : Universidad Nacional de Trujillo
Facultad de Ciencias Biológicas.
Escuela de Microbiología y Parasitología
7. Duración: 6 meses
Fecha de inicio : Marzo 2012
Fecha de término : Setiembre 2012
8. Cronograma de Ejecución del Proyecto:
ETAPAS
AÑO 2012
MAR ABR MAY JUN JUL AGO SET
Formulación y sustentación del
proyecto
X
Pruebas experimentales X X X X
Evaluación e interpretación de
resultados
X
Redacción del informe
científico
X X
9. Horas Semanales Dedicadas al Proyecto:
- Horas/Semana : 30
10. Presupuesto:
10.1. Recursos Disponibles:
a) Personal:
Personal técnico del Departamento Técnico de Microbiología y Parasitología.
b) Materiales de laboratorio, reactivos, medios de cultivo y Equipos e
instrumentos
Material de vidrio:
Descripción Cantidad
Matraz de 500 ml “Pyrex” 05 unid
Matraz de 250 ml “Pyrex” 05 unid
Pipetas de 1 ml “Corning” 05 unid
Pipetas de 5 ml “Presicolor” 05 unid
Pipetas de 10 ml “Presicolor” 05 unid
Tubos de ensayo 16 x 125 mm. “Pyrex” 20 unid.
Vasos de precipitación de 400 ml “Pyrex” 05 unid.
Vasos de precipitación de 250 ml “Pyrex” 05 unid.
Frascos de penicilina oscuros 10 unid.
Mechero 01 unid.
Gradillas de metal x 48 tubos 01 unid.
pH metro digital, marca Hanna Instruments
Tubo N°1 del Nefelómetro de Mac Farland
Equipos e instrumentos
Descripción Cantidad
Autoclave “Aschraft” 01 unid
Balanza analítica “Heraeus” 01 unid
Balanza de dos platillos “Ohams” 01 unid.
Cámara fotográfica “Panasonic” 01 unid
Estufa “Heraeus” 01 unid
Horno “Muszeripan” 01 unid.
Refrigeradora “Coldex” 01 unid
Cocina eléctrica “Insegresa” 01 unid.
Termómetro “Heraeus” 01 unid
Equipo de destilación
Materiales Biológicos
Descripción
3 Cultivos de Pseudomona aeruginosa
3 Cultivos de Staphylococcus aureus
10.2. Recursos no Disponibles
5.3.11.30: BIENES DE CONSUMO
ARTÍCULO MARCA CANTIDAD COSTO/UNIDAD
(S/.)
COSTO TOTAL
(S/.)
Guantes Endeglore 1caja 19.00 19.00
Mascarillas s/m 1caja 12.00 12.00
Alcohol Yodado Dropacsa 2 Litros 10.00 20.00
Jabón liquido
desinfectante
s/m 3frascos 1.80 5.40
Lejía clorox 2 1.00 2.00
Ron s/m 5 Litros 1.00 5.00
Mechero s/m 2 10.00 20.00
Agua Destilada s/m 20 L. 1.00 20.00
Caldo BHI Difco 1 lb. 456.00 456.00
Agar Muller-
Hinton
Bolsas plásticas Alfa 3 1.00 3.00
Papel toalla Elite 2 3.50 7.00
Tubos de ensayo Pirex 15 1.50 22.50
Placas Petri Pirex 25 10.00 250.00
Pipetas s/m 10 7.00 70.00
Balones Pirex 2 30.00 60.00
Asa
bacteriológica
s/m 1 11.00 11.00
Asa Drigalsky Pirex 1 12.00 12.00
Discos de
antibiótico
Ciprofloxacina y
Cefalexina
2 frascos 30.00 30.00
Rayador de
acero
1 3.50 3.50
Mandarina 25 Kg. 2.00 50.00
TOTAL S/. 2745.00
5.3.11.32: VIÁTICOS Y ASIGNACIONES
Tipo de servicio Cantidad Costo/día (S/.) Total (S/.)
Movilidad local 1 8.00 1152.00
Viáticos y
asignaciones 1 6.00 864.00
TOTAL S/. 2016.00
5.3.11.39 SERVICIOS DE TERCEROS
TIPO DE SERVICIO CANTIDAD COSTO/UNIDAD
(S/.)
COSTO TOTAL
(S/.)
Impresiones Fotográficas 50 0.50 25.00
Impresión Tipográfica 100 0.20 20.00
Fotocopias 100 0.05 5.00
Anillados 8 2.50 20.00
Empastados 10 15.00 150.00
TOTAL S/. 220.00
5.3.11.42 MATERIAL DE ESCRITORIO
DENOMINACIÓN MARCA CANTIDAD COSTO/UNID
(S/.)
COSTO
TOTAL (S/.)
Papel bond de 80 g. Atlas 1 millar 24.00 24.00
Corrector líquido Faber Castell 2 2.50 5.00
Cartuchos de tinta
para impresora
Lex Marck 2 45.00 90.00
Tinta para
impresora
Arco iris 2 20.00 40.00
Lapicero azul Faber Castell 6 1.00 6.00
Resaltador Faber Castell 6 2.00 12.00
Regla Artesco 2 1.00 2.00
Marcador Faber Castell 2 2.00 4.00
TOTAL S/. 183.00
RESUMEN DE PRESUPUESTO
5.3.11.30: BIENES DE CONSUMO S/. 2745.00
5.3.11.29: MATERIAL BIOLÓGICO S/. 230.00
5.3.11.32: VIÁTICOS Y ASIGNACIONES S/. 162.00
5.3.11.39: SERVICIOS DE TERCEROS S/. 70.00
5.3.11.42: MATERIAL DE ESCRITORIO S/. 188.00
TOTAL S/. 3395.00
11. Financiamiento:
Recursos disponibles
- Laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana. Facultad de Ciencias Biológicas.
Universidad Nacional de Trujillo.
- Departamento Técnico de la Escuela de Microbiología y Parasitología. Facultad de
Ciencias Biológicas. Universidad Nacional de Trujillo.
Recursos no disponibles
- Autofinanciado
II.- PLAN DE INVESTIGACIÓN
1. REALIDAD PROBLEMÁTICA
Actualmente en el mundo moderno la población crece aceleradamente y con
ella también las enfermedades infecciosas producidas por bacterias, virus, hongos,
etc. A pesar que existen muchos antibacterianos para su control o tratamiento, el uso
irracional de éstos viene generando resistencia microbiana y otras secuelas; en tanto
que, la biodiversidad vegetal ofrece alternativas antibacterianas, tal es el caso de
algunas especies con excelentes resultados, debido a sus constituyentes químicos1.
La mayoría de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), son de
origen bacteriano, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el mundo,
debido a que estas enfermedades se adquieren por el consumo de alimentos y/o agua
contaminados, representan un gran riesgo para la población en general2,3.
Debido a esto, son muchos los trabajos que se han centrado en el uso de las
especies como preservación de alimentos4, pero son pocos los trabajos en relación a
su acción contra microorganismos patógenos y menos contra patógenos
intrahospitalarios, como Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus 5. Estos
microorganismos son oportunistas, y tiene mecanismos de diseminación y
patogenicidad múltiples. Son reducidos los antimicrobianos confiables contra estos
patógenos, incluyendo cefalosporinas y fluoroquinolonas6.
Las infecciones ocasionadas por cepas de S. aureus son un problema de
salud importante en todo el mundo ya que produce una gran variedad de
infecciones incluyendo osteomielitis, endocarditis invasora, artritis séptica y
septicemia; mientras que contaminación de alimentos está asociada con una forma
de gastroenteritis que se manifiesta clínicamente por un cuadro caracterizado por
vómitos (76% de casos) y diarrea (77% de casos). La incidencia es desconocida
pero es probablemente una de las causas de enfermedad trasmitida por alimentos
más frecuentes. Entre los alimentos implicados se encuentran: ensaladas de papas y
huevos, pastelería, jamón, pollo, cremas heladas7-9.
Pseudomonas aeruginosa tiene una distribución mundial, es cosmopolita, Se
aísla de suelos, agua, plantas, animales, incluyendo al hombre, algunas veces es
patógeno para animales y vegetales. Representa un problema importante de salud
en centros hospitalarios, especialmente cuando se trata de pacientes
inmunocomprometidos, con cáncer, quemados o a los internos en terapia intensiva;
ya que puede producir complicaciones graves. Esta situación se ve agravada ya que
esta bacteria presenta una muy alta resistencia natural a distintos antibióticos o
desinfectantes10.
En ambientes acuosos esta bacteria se adhiere a superficies, produciendo una
especie de agregado llamado biopelícula. La formación de estos cúmulus de
bacterias y material extracelular representa un problema en la salud pues contamina
dispositivos que se implantan dentro del cuerpo, como por ejemplo dispositivos
intrauterinos, catéteres o válvulas cardiácas. Así mismo, P. aeruginosa presenta
problemas en la industria alimenticia ya que puede descomponer los alimentos que
se mantienen en refrigeración. Los alimentos implicados son vegetales crudos, agua,
leche no pasteurizada10.11.
Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos así
como en el ambiente intrahospitalario conduce a buscar alternativas de inhibición y
eliminación con una mayor posibilidad de aplicación como pueden ser las sustancias
naturales6.
El Perú es conocido como el tercer país megabiodiverso del mundo, siendo
catalogado por algunos científicos como el segundo o primero, porque posee una
extraordinaria riqueza biológica, fuente natural de moléculas bioactivas. La
diversidad vegetal peruana llega aproximadamente a unas 50 000 especies detec-
tadas, mientras que todo el continente europeo posee 12 000 especies. Razones nos
sobran para maximizar el aprovechamiento sostenible de nuestros recursos na-
turales, previamente validados científica y tecnológicamente con los respectivos
estudios1.
Algunas especies vegetales tales como Citrus reticulata se han reportado
como poseedoras de características antifúngicas, antimicrobianas y fitoterapéuticas,
las cuales le hacen una especie promisoria para su uso en actividades farmacéuticas,
control de plagas en el sector agrícola y la preservación de los alimentos para evitar
la proliferación de microorganismos causantes de enfermedades12,13.
El hombre desde la antigüedad ha usado sustancias naturales extraídas de las
plantas, como los aceites esenciales, para combatir enfermedades y preservar
alimentos. Hoy en día, estas sustancias han perdido su uso debido a la aparición de
sustancias químicas, no obstante, tienen la ventaja de que no representan un peligro
para la vida y salud del hombre14.
Los aceites esenciales cubren un amplio espectro de actividades tales como
efectos farmacológicos, antiinflamatorios, antioxidantes y anticancerígenos. Otros
son biocidas contra una amplia gama de organismos como bacterias, hongos, virus,
protozoos, insectos y plantas14-17.
También se ha estudiado la importancia de estos aceites debido a su
disponibilidad, a los pocos efectos secundarios o a la toxicidad que pueden causa,
así como la mejor biodegradabilidad comparado con antibióticos y preservativos
disponibles12. Por todas estas propiedades, se ha evaluado el control que pueden
ejercer estos compuestos contra microorganismos patógenos en alimentos, y por
tanto la posibilidad de ser utilizados como un método de eliminación16.
Muchas hierbas y especias han sido utilizadas durante siglos para
proporcionar sabores diferentes a los alimentos y éstas pueden presentar también
actividad antimicrobiana18. Los compuestos responsables de esta actividad son a
menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten principalmente en
compuestos fenólicos19, que presentan actividad antimicrobiana20,21, tienen gran
aplicación para el control de crecimiento de patógenos en alimentos por lo que se
utilizan como métodos de preservación. Se ha reportado que la actividad
antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenólicos en los aceites22-24.
Las plantas producen una gran cantidad de compuestos secundarios como
protección contra ataques microbianos e insectos. De hecho muchos de estos
compuestos han sido usados en forma pura o extractos vegetales como alimento o
aplicaciones médicas en humanos25,26.
Los aceites esenciales son líquidos volátiles, casi inmiscibles en disolventes
polares asociados (agua, amoniaco), pero fácilmente solubles en los disolventes
orgánicos comunes como alcohol, éter y aceites vegetales y minerales27-30, se
concentran y se almacenan en tejidos secretores de los órganos vegetales aromáticos
como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes órganos en la
misma planta, frecuentemente su composición es diferente30,31. En recientes estudios
se ha demostrado la actividad antibacteriana de diversos aceites esenciales, los
cuales pueden contener más de 150 componentes32,33.
Poco se sabe acerca de los mecanismos de acción antimicrobiana, de los
compuestos mayoritarios de algunas especias, como la naranja, ya sea de forma
individual o como parte del aceite esencial completo34,35. Los sitios de acción de los
agentes antimicrobiano en la célula microbiana, incluye a la membrana celular,
pared celular, enzimas metabólicas, síntesis de proteínas y el sistema genético21,
todos ellos estratégicos para la supervivencia de los microorganismos y cualquier
acción sobre ellos puede inactivar a la célula microbiana. Weber (1943) menciona
que los compuestos utilizados como antimicrobianos tiene varios sitios de ataque
dentro de las célular microbianas y que dependiendo de las concentraciones
utilizadas en los alimentos, pueden causar inhibición o inactivación de los
microorganismos36.
Conner (1993) sugirió que la actividad antimicrobiana de los aceites
esenciales, se basa en el deterioro de varios sistemas enzimáticos, incluídos aquellos
involucrados en la producción de energía y en la síntesis de componentes
estructurales. Una vez que el compuesto fenólico cruza la membrana celular, puede
interactuar con las enzimas y con las proteínas causando un flujo contrario de
protones a través de ella, afectando así a la actividad celular19,37.
Un método ampliamente utilizado para la evaluación de los antimicrobianos
naturales es el conocido como “zona de inhibición”38. Se trata de un método
sencillo, sin embargo, el efecto inhibitorio del compuesto que se va a evaluar,
dependerá de su habilidad para difundirse en el medio. Este método, cae en la
clasificación de los llamados de punto final y se le conoce como “ensayo de disco”.
Uno de los requisitos para obtener resultados confiables y repetibles es que el
microorganismo a evaluar se desarrolle rápida y uniformemente39,40.
La industria de los cítricos en Perú se encuentra en constante crecimiento
debido principalmente a la demanda de naranja, mandarina y recientemente limón17.
Lozano (2005) afirma que en el Perú se cultivan algunas variedades de mandarina,
entre las cuales destacan las variedades, Satsumas (Okitsu, Owari y Clausellina),
Clementinas (Clementina Fina, Oroval, Clemenules, Marisol, Oronules,
Clemenpons, Esbal, Loretina, Hernandina), Tangerinas y Tangelos. Teniendo en
cuenta que en general el flavedo de la mandarina se desecha, existe la posibilidad de
viabilizar de manera comercial la extracción del aceite esencial del mismo mediante
arrastre con vapor de agua41.
Toda la planta contiene aceite esencial y principios amargos (flavonoides),
las hojas maduras pueden contener alcaloides, taninos y monoterpenos. Las flores
contienen además glucósidos y cumarinas. La el flavedo (cáscara) del fruto contiene
α-pineno, β-pineno, mirceno, limoneno, p-cimeno, γ-terpineno, linanol, acetato de
linalilo, α-terpineol, citronelol, acetato de geranilo, N-metil antranilato de metilo,
entre otros componentes42.
En los últimos años se han realizado muchas investigaciones, que han
demostrado el poder antimicrobiano de los aceites esenciales, especialmente los
extraídos de frutas cítricas; en estos estudios se puede mencionar el de Dabbah et
al43, quienes encontraron que los aceites esenciales de mandarina, naranja y toronja
mostraron tener actividad antibacteriana contra cepas bacterianas de:
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa y Salmonella entre otras.
Durante las primeras tres décadas del siglo 20 se establece una metodología
completa para la clasificación de las variedades de mandarina que existían, esta
metodología estableció cuales eran los distintos patrones que se cultivaban a nivel
mundial, dando esto lugar a la caracterización de las variedades de mandarina y a
sus aceites esenciales a nivel mundial44.
Así mismo en el año de 1934, Nelson realizó un estudio de la composición
química del aceite esencial de distintas variedades de mandarina que se cultivaban
en Florida, Estados Unidos. Nelson extrae los aceites esenciales al comprimir el
flavedo (cáscara), su estudio determina que variedades similares de mandarina
poseían aceites esenciales con diferencias en su composición química.
Martínez et al. (2003) estudiaron la actividad antibacteriana y la
concentración mínima inhibitoria (CMI) del aceite esencial de mandarina (Citrus
reticulata Blanco) variedad Dancy. Las cortezas de las frutas fueron prensadas al
frío para la obtención del aceite. Las cepas bacterianas que se utilizaron para
determinar la actividad antibacteriana fueron: Bacillus subtilis, Staphylococcus
aureus ATCC 259923, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Klebsiella
pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, y Escherichia coli ATCC
25922. La actividad antibacteriana se determinó por el método de difusión en agar
utilizando las siguientes concentraciones de aceite: 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90 y 100%. La CMI se determinó por el método de dilución en caldo utilizando 6
concentraciones. El aceite esencial presentó actividad antibacteriana del tipo
bactericida contra B. subtilis, S. aureus y L. monocytogenes a todas la
concentraciones excepto al 1%. La CMI del aceite esencial de mandarina variedad
Dancy para B. subtilis fue de 9%, para S. aureus y L. monocytogenes fue de 7%45.
Mazariegos (2008) investigó la composición química del aceite esencial
extraído de las variedades de mandarina Citrus reshni (Mandarina Cleopatra),
Citrus reticulata (Mandarina común) y Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina
(Mandarina Dancy), variedades de mandarina que se producen en Guatemala. Para
realizar la separación, identificación y cuantificación de los principales
componentes de los aceites esenciales se realizaron análisis mediante cromatografía
de gases acoplada a espectrometría de masas, esta técnica instrumental permitió
establecer que los aceites esenciales poseían al menos 28 componentes, 7 de los
cuales se encontraban presentes en las tres variedades de mandarina investigadas.
Las tres variedades de mandarina presentaron altas concentraciones relativas del
hidrocarburo monoterpénico limoneno seguido del γ-terpinoleno y en menor
concentración relativa, el α-terpineol y β-pineno. La cromatografía de gases
acoplada a la espectrometría de masas permitió establecer también los tiempos de
retención, así como la concentración relativa para cada uno de los componentes y
más importante aún, esta técnica instrumental permitió identificar a cada uno de los
componentes principales presentes en cada variedad, incluso los que se encontraban
a niveles traza, tal es el caso del acetato 9-decenílico, el sabineno, el α-terpineno,
el 1-octanol, el Z-citral y el (+)-2-careno.
Cáceres (1996) y Bergonzelli et al. (2003) extrajeron aceite esencial del
flavedo de la mandarina Citrus reticulata Blanco o Citrus tangerina (Mandarina
Dancy) para efectuar pruebas fitofarmacéuticas, comprobando que este aceite
esencial presentaba capacidad inhibitoria hacia el crecimiento de bacterias tales
como: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas
aeruginosa, Helycobacter pilori y Salmonella sp. que resultan ser patógenas para el
hombre42,46.
Estos resultados hacen relevante el estudio de los aceites esenciales
especialmente de cítricos debido a la gran importancia que tienen para la industria
farmacéutica y de alimentos. Se sabe que los aceites esenciales, utilizados como
aditivos en los alimentos tienen efecto antimicrobiano y actúan al mismo tiempo
como saborizante27.
Por lo anterior y debido a que el aceite esencial de Citrus reticulata es
utilizada en Perú como en muchos países como saborizantes o en combinación con
otros aceites esenciales, en extractos o jugos de fruta, para dar sabor a diversos
alimentos como son refrescos, productos horneados, dulces, quesos, tabaco,
condimentos, aderezos para ensaladas, jarabes, etc.19 , podría utilizarse como
antimicrobiano en la industria de los alimentos para este caso contra S. aureus;
además de usar P. aeruginosa como modelo para evaluar el efecto del aceite
esencial de mandarina, podrá sugerir su uso como sanitizante o desinfectante
natural.
2.- JUSTIFICACIÓN.
Los alimentos pueden ser un vehículo de transmisión de microrganismos
patógenos y por tanto tienen gran trascendencia en la salud de los consumidores. La
adquisición de enfermedades por el consumo de alimentos contaminados con
microorganismos como S. aureus o sobre infecciones por P. aeruginosa producto de
infección intrahospitalaria, ha hecho que cada vez más países reconozcan la
necesidad de someter estos productos a ciertas pruebas o estudios enfocados en
evaluar su inocuidad y su calidad. Actualmente se conocen muchas técnicas para el
control e inhibición de microorganismos con el fin de preservar los alimentos, una
de éstas es la adición de sustancias de origen natural que le provean al alimento
calidad microbiológica y al mismo tiempo permitan sustituír los aditivos químicos.
Además; son pocos los trabajos en relación al efecto que tienen los aceites
esenciales acción contra microorganismos patógenos intrahospitalarios, como
Pseudomonas aeruginosa y son reducidos los antimicrobianos confiables contra esta
bacteria, incluyendo cefalosporinas y fluoroquinolonas.
Teniendo en cuenta que la industria de los cítricos en el Perú se encuentra
en constante crecimiento debido principalmente a la demanda de limón, naranja,
toronja y recientemente de mandarina. En el Perú se cultivan principalmente la
variedad de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma y, por lo general el
flavedo de la mandarina se desecha, se pretende llevar a cabo la obtención del aceite
esencial de mandarina por medio de una técnica de destilación, para su posterior
evaluación mediante un protocolo donde se evaluará el aceite en una prueba in Vitro
determinando la actividad antimicrobiana frente a microorganismos causantes de
enfermedades transmitidas por alimentos como por infección intrahospitalaria como
S. aureus y P. aeruginosa.
3. OBJETIVOS
- Determinar las concentraciones del aceite esencial de mandarina (Citrus
reticulata) variedad Satsuma que presente mayor actividad antibacteriana tanto
para Pseudomona aeruginosa como para Staphylococcus aureus.
- Demostrar si existe diferencia significativa entre la actividad antibacteriana del
aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma y los
antibióticos empleados actualmente frente a P. aeruginosa y S.aureus.
- Demostrar si existe diferencia significativa entre la sensibilidad de P.
aeruginosa y S. aureus frente al aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata)
variedad Satsuma.
4. PROBLEMA
¿Cuál es el efecto de las concentraciones de 0, 20, 40, 60, 80 y 100% del aceite
esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma sobre el crecimiento de
Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus?
5. HIPÓTESIS
Implícita
6.[5.] MATERIAL Y MÉTODOS
5.1. Material Biológico
- Tres cultivos de Pseudomona aeruginosa (FGB-001, FGB-002,
FGB-003), proporcionados por el Laboratorio de Fisiología y
Genética Bacteriana.
- Tres cultivos de Staphylococcus aureus (ST-001, ST-002, ST-
003), proporcionados por el Laboratorio Referencial de la ciudad
de Trujillo.
- Mandarinas (Citrus reticulata) variedad Satsuma, obtenidos en el
mercado “La Hermelinda” de Trujillo.
5.2. Metodología
1.- Obtención del extracto de aceite esencial de mandarina
1.1. Obtención de frutos de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma
Se adquirirá 20 kg de los frutos de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma
en el marcado “La Hermelinda” de Trujillo, en completo estado de madurez
fisiológica, se trasladarán al laboratorio. A los frutos se les retirará las cortezas y se
refrigerarán, para su posterior procesamiento en un lapso no mayor de 2 días.
1.2. Obtención del aceite esencial
1.2.1. Selección
Sólo serán utilizadas aquellas mandarinas que no presentasen magulladuras, cortes o
demás lesiones en su flavedo que indiquen que no están aptas para entrar al proceso
de extracción.
1.2.2. Lavado
Se realizará con el propósito de eliminar restos de partículas extrañas, suciedad y
restos de tierra y pesticidas que puedan estar adheridos a la materia prima.
1.2.3. Rallado
Para esta etapa se utilizará un rallador de acero inoxidable, extrayéndole solo el
flavedo de las mandarinas, para aumentar el área de contacto con el vapor de agua.
1.2.4. Extracción
Se realizará en los equipos de extracción por arrastre con vapor e hidrodestilación
simple, en donde se colocarán 150 g del flavedo en un balón de 1000 ml, el cual
será calentado en una cocina hasta alcanzar la temperatura de ebullición del agua lo
cual generará la salida de los aceites esenciales36.
El tiempo de extracción dependerá del equipo utilizado para cada uno de los
ensayos. En el equipo de arrastre con vapor la duración de la extracción estará en el
rango de 20 a 80 min, contándose desde el instante en el que caía la primera gota en
la pera de decantación, mientras que la extracción en el hidrodestilador simple
estuvo en el rango de 30 a 110min. La temperatura del agua de enfriamiento fue un
parámetro que se mantuvo en todo momento en un rango de 15°C a 18C°, logrando
así la fase de condensación36.
1.2.5. Decantación
La fracción de aceite esencial extraída se centrifugará a 6000 rpm durante 15 min,
con el fin de separar la fase acuosa de la oleosa.
La separación de la menor porción de agua podrá ser separada por congelación o
por adición de sales deshidratantes, o con una jeringa.
1.2.6. Envasado
El aceite será envasado en frascos ámbar de 12 ml de capacidad, debido a que son
inestables fotoquímicamente.
1.2.7. Almacenamiento
El aceite esencial será envasado en frascos color ámbar y conservado en
refrigeración a 4 ºC para los análisis posteriores.
2.- Preparación de los inóculos bacterianos
2.1. Obtención de los Cultivos bacterianos
Los seis cultivos bacterianos que se utilizarán para comprobar la actividad
antibacteriana del aceite esencial serán: S. aureus, P. aeruginosa que serán
proporcionados por el laboratorio Referencial de la ciudad de Trujillo y por el
Laboratorio de Fisiología y Genética Bacteriana de la Universidad Nacional de
Trujillo, respectivamente.
Los seis cultivos bacterianos serán reactivados, cultivándolos en caldo infusión
cerebro corazón (BHI) por 18 horas a 37 °C y conservados a 5°C, hasta el momento
de su uso.
2.2. Estandarización de los inóculos bacterianos
Se tomará una pequeña cantidad de colonias, para luego ser suspendidas en
Solución salina fisiológica estéril hasta alcanzar la turbidez equivalente al tubo N°1
del Nefelómetro de Mac Farland (3x108 ufc/mL).
3.- Preparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial
A partir del aceite esencial obtenido (100%) se prepararán concentraciones del
aceite a 0, 20, 40, 60, 80 y 100%, utilizando, como solvente, etanol al 99.9%.
Las muestras serán protegidas de la luz, envolviendo los balones en papel de
aluminio.
4.- Prueba de Sensibilidad
La actividad antibacteriana del aceite esencial de mandarina se determinará
utilizando los cultivos bacterianos, siguiendo la técnica de difusión en agar en
placas12, por triplicado.
Las placas contendrán de 22 a 25 ml de agar Mueller-Hinton temperado a 45°C
inoculado con una suspensión de cultivo joven bacteriano a la concentración de 106
ufc/mL (previamente estandarizado). A cada placa se le hará 4 orificios de 4mm de
diámetro cada uno utilizando un sacabocado estéril. A estos orificios se le añadirá
10 uL de cada una de las concentraciones de aceite esencial y las placas se
incubarán a 37°C por 24 horas.
La actividad antibacteriana del aceite esencial se determinará midiendo el halo de
inhibición alrededor de cada orificio (la distancia desde el borde del orificio hasta
donde termina el halo), el tamaño de esta zona de inhibición indica si las bacterias
objeto de análisis tienen una sensibilidad alta, intermedia o baja frente a las
soluciones del aceite esencial. Se considera inhibitorio un valor de 2 mm2,3,13,14.
También se realizará tres placas control:
- Para Staphylococcus aureus se utilizará el antibiótico Cefalexina.
- Para Pseudomona aeruginosa se utilizará el antibiótico Ciprofloxacina.
- Para determinar el efecto del etanol se realizará un control con etanol a las
mismas concentraciones empleadas para el aceite.
6.- Análisis Estadístico
El procesamiento y análisis de los resultados obtenidos para la actividad
antibacteriana del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad
Satsuma sobre el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus
se efectuará mediante el programa SPSS versión 18.0. Para realizar los análisis se
tendrá en cuenta los valores promedio de inhibición de cada concentración del aceite
esencial evaluado; ya que se realizará tres repeticiones por tratamiento Se realizará
el análisis de varianza, específicamente un ANAVA unifactorial, a los datos
obtenidos para determinar si hay diferencias significativas en la actividad
antibacteriana entre los dos grupos de bacterias así como con los antibióticos
utilizados (controles). La significancia se reportará con un nivel de confianza del
95%47.
III. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CARTA DE COMPROMISO
El que suscribe Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez, Profesor de la Facultad de Ciencias
Biológicas, se compromete a asesorar a la señorita María Victoria Trujillo Laguna,
identificado con el número de matrícula 051900706 de la Escuela Académico Profesional
de Microbiología y Parasitología, en la ejecución de su tesis, titulada: Efecto antibacteriano
del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata) variedad Satsuma en el crecimiento de
Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus aureus.
Trujillo, 23 de Marzo del 2012
………………………………………………...
Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez
CARTA DE COMPROMISO
El que suscribe Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez, Profesor de la Facultad de Ciencias
Biológicas, se compromete a asesorar a la señorita Sandra Elisa Vidal Eustaquio,
identificado con el número de matrícula 051902406 de la Escuela Académico Profesional
de Microbiología y Parasitología, en la ejecución de su tesis, titulada: Determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria del aceite esencial de mandarina (Citrus reticulata)
variedad Satsuma en el crecimiento de Pseudomona aeruginosa y de Staphylococcus
aureus.
Trujillo, 23 de Marzo del 2012
………………………………………………...
Dr. Pedro Estuardo Mercado Martínez