Proyecto final

“Cultivo de hongos utilizando como sustrato subproductos del café”

Proyecto II extensión café

Docente: Johana Imbacuan Cárdenas

Carlos Andrés RojasJohana Marcela Salazar Arias

Universidad de CaldasManizales julio 2 de 2012

RESUMEN

La revisión bibliográfica acerca de la asimilación de la cafeína por parte del Pleurotus deja varias dudas sobre su ruta metabólica, despertando el interés por resolver inquietudes, como, si esto se debe a la variedad fisiológica dentro de la misma especie variando de una parte del mundo a otra, habiendo diferentes comportamiento de las cepas, o se puede deber a la concentración de cafeína de los residuos a tratar, conociendo también que los residuo varían en composición, ya que las formas de cultivo cambian de un lugar a otro.

El Pleurotus es un hongo ampliamente tratado y producido en la planta de bioprocesos de la universidad, lo que facilitaría un posible estudio de las características anteriormente nombradas, también estamos en una zona de cultura cafetera, donde los residuos del café, abundan, ya que muy pocas veces encuentran aprovechamiento en sus lugares de producción, terminando tiradas al medio ambiente y ocasionando daños ecológicos.

Aunque se han realizado estudios sobre este fenómeno, los resultados son contradictorios, ya que algunos en sus investigaciones, no encuentran cafeína de la matriz del hongo, como otros aseguran que la cafeína queda en la composición del hongo, cabe destacar que unos han utilizado borra de café que tiene menor contenido de cafeína que la cascarilla o pulpa de café, por lo cual podría ocurrir un fenómeno de saturación por el hongo que no permita procesar o metabolizar ciertas concentraciones de cafeína, dejando en definitiva mucha incertidumbre.

Hallar las características de las cepas de Pleurotus procesadas en la planta de bioprocesos, sería un aporte más para resolver este dilema, ya que de cualquier forma, si los hongos incorporan cafeína a su composición se podría estudiar que otros componentes se podrían adherir a su matriz, y si no habría un antecedente más sobre la metabolización de cafeína, y esta vez en un sustrato con mayor concentración de cafeína como es la pulpa de café, lo que iría acortando la brecha para resolver esta incógnita.

JUSTIFICACION

En el beneficio del café y en la preparación de café como bebida, son muchos los residuos que pueden ser aprovechados para ser reinsertados en la cadena, como fertilizantes o abono, o para producir nuevos productos que sean de valor agregado que se pueden utilizar tanto en la industria farmacéutica o alimentaria, y que ayudan a mejorar la calidad ecológica en los procesos que conlleva el café, ya que muchos de estos residuos no encuentran un mejor uso que ser quemados para producir calor pero ocasionando liberaciones de gases que dañan el medio ambiente o simplemente descomponiéndose al ambiente y acidificando el suelo y ocasionando malos olores.

El uso de pulpa de café puede ser mejor aprovechado como medio de cultivo para la producción de hongos que están bien avaluados en el mercado como el Pleurotus o el Ganoderma, por una parte el pleurotus es muy apetecido como hongo comestible, y el ganoderma por sus propiedades medicinales, ambos son estudiados en el centro de biotecnología de la universidad. En otro caso el estudio de fermentaciones en solido ha mostrado un gran aprovechamiento del tegumento o piel plateada de café que se observa al retirar al pergamino y de los posos de café que es el residuo solido que queda después de realizar la lixiviación del café para la obtención de la bebida, generando compuestos fenolicos que sirven de antioxidantes, a través del uso de hongos que fermentan estos residuos.

El uso de residuo en procesos biotecnológicos puede ser más agradecido que en procesos de enriquecimiento de suelos, ya que los microorganismos no demandan grandes cantidades de nitrógeno como lo requiere el suelo para dar un buen rendimiento, por otra parte estos residuos son ricos en carbohidratos y otros compuestos que son aprovechados por microorganismos, por lo tanto el estudio del uso de estos residuos en procesos de fermentación para generar biomasa u otros compuestos abre una ventana para disminuir la contaminación que conlleva eliminar estos residuos y para generar una fuente de ingresos con valor agregado a través de los productos que se puedan obtener.

Es por esto que surgió la necesidad de buscar una alternativa para disminuir la contaminación de suelos que es alta debido a la gran producción de café ya que del total del café recolectado solo es aprovechado un porcentaje muy bajo comparado con la cantidad desechada, además del problema ambiental que se trataría con esta opción, tenemos la posibilidad de darle un valor agregado a un subproducto de café como lo es la producción de hongos comestibles de alto valor nutricional que pueden ser incluidos en la dieta de las personas.

ANTECEDENTES

El estudio que nos concierne es la incorporación de cafeína en el hongo de género Pleurotos utilizando como sustrato cascarilla de café, de allí que se hayan encontrado varios artículos que hablan sobre la degradación o metabolización de la cafeína por algunas cepas de Pleurotus y otros hongos como Rhizopus o Aspergillus a partir de sustratos como pulpa de café o posos de café (residuos de la lixiviación del café), y por otra parte, artículos que hablan de la incorporación de la cafeína sin metabolizar o degradar en la masa fructífera del Pleurotus, lo cual es muy interesante ya que si esto ocurre con la cafeína, tal vez haciendo uso de otros sustratos con un componente de alto valor nutricional, el hongo lo pueda incorporar, sin metabolizarlo.

El primer estudio a revisar es uno de la Universidad Nacional de Colombia, en el cual se estudio la incorporación de cafeína en Pleurotus sajor-caju usando como sustrato pulpa de café, en cual se observo que la cafeína no fue degrada por el hongo sino incorporada en su fructificación, haciendo determinación por espectroscopia infrarroja, HPLC o de masas, se observo un contenido de 7.08%, a comparación de otros metabolitos estudiados, estando esta en gran abundancia a comparación de los demás. Otro estudio que apoya la incorporación de cafeína en los cuerpos fructíferos en vez de su degradación es el de Salmones, Mata y Waliszewski, en el cual estudiaron Pleurotus y utilizaron también pulpa de café como sustrato, y en el cual hallaron concentraciones de cafeína en los cuerpos fructíferos entre 0,17% y 0,22%.

Por otra parte hay estudios que muestran que si hay degradación de cafeína, por ejemplo el de Garcia, et al., en el cual estudian la producción de Lacasa que es una enzima del hongo Pleurotus que sirve para degradar compuestos lignocelulosicos, y en cual utilizaron como sustrato para el hongo pulpa de café, y observaron una remoción de cafeína con respecto a la cafeína inicial del 15% al 24% debiéndose quizá a que la cafeína podría ser un inductor de la producción de Lacas y otras enzimas. Otro estudiado realizado por Job, analizando Pleurotus Ostreatus y utilizando borra o posos de café como sustratos, mostro una degradación de la cafeína disminuyendo la cafeína inicial del sustrato en un 59,6%, atribuyendo este resultado a la variación del comportamiento fisiológico que puede existir al interior de una misma especie.

Estos antecedentes muestran que respecto a la degradación o a la incorporación de cafeína en el genero Pleurotus, podría depender de la cepa utilizada en si, por lo cual seria interesante ver el comportamiento de los hongos producidos en la planta de bioprocesos de la universidad, utilizando cascarilla de café como sustrato, y conocer su comportamiento respecto a la desintoxicación de residuos de café, dando paso también a una comparación con un tratamiento a base de sustrato de posos o borra de café, ya que se sabe que los posos de café tienen menos contenido de cafeína inicial que la cascarilla, dándose un posible fenómeno de saturación en el hongo que predetermine su disposición a incorporar o degradar cafeína dependiendo de la concentración inicial de la misma.

MARCO TEÓRICO

En el proceso de cultivo e industrialización del café, solamente se aprovecha el 5% del peso del fruto fresco en la preparación de la bebida, el 95% restante está representado por residuos. Los principales subproductos que se generan en el proceso de beneficio e industrialización del fruto de café y en los procesos de renovación del cultivo son: la pulpa, el mucílago, el cisco, las pasillas, la borra y los tallos de café. La eliminación de estos residuos constituye un problema ambiental, ya que la pulpa y el mucílago (que se eliminan en mayor proporción) representan casi el total de la contaminación del agua (expresada en términos de Demanda Química de Oxígeno o DQO) al ser desechados con el agua de lavado. De ahí que exista la preocupación por buscar alternativas para una disposición sustentable de los residuos y darles un aprovechamiento, como es el caso de la obtención de biomasa. Este término, también conocido como “proteína unicelular”, se refiere al producto obtenido por bacterias, levaduras, algas y hongos crecidos por procesos fermentativos en desechos orgánicos para el aprovechamiento y valorización de la pulpa de café y evitar su impacto ambiental negativo, se ha investigado la producción de hongos comestibles de los géneros Pleurotus, Lentinula y Ganoderma los cuales son muy apreciados por su gran valor nutritivo y medicinal.

El cultivo de hongos comestibles por fermentación sólida reporta grandes ventajas, por ser la forma más eficiente de conversión de desechos vegetales en alimento humano de alto valor nutricional por el contenido de proteínas que posee; además, el alimento obtenido es considerado una comida agradable debido a su textura y sabor, el residuo producido puede ser utilizado de numerosas formas, tales como producción de biogás, mejoradores de suelo, lombricultura, alimento animal, etcétera, representa un papel vital en la ecología del ciclo del carbono en la naturaleza.

Los materiales elegibles para ser utilizados en la preparación de sustratos para el cultivo de Pleurotus sp. Deben poseer propiedades, tales como buena disponibilidad en cantidad y continuidad, conocimiento de las características fisicoquímicas, regularidad en la composición fisicoquímica, localización fácil y cercana, facilidad de transporte y manejo. El micelio de este hongo puede crecer en una temperatura entre 0 y 35 °C, con temperatura óptima de 30 °C, y en un rango de pH entre 5,5 y 6,5, se ha observado que después de cosechar los cuerpos fructíferos de P. ostreatus en los materiales usados como sustratos las cantidades finales de hemicelulosa, celulosa y lignina se han reducido en un 80% sugiriendo que todos los materiales que contienen estos compuestos, pobres en nitrógeno pueden ser usados como sustratos para Pleurotus spp.

El cultivo de los hongos del género Pleurotus spp., tiene un gran atractivo debido principalmente a:

• Producen proteínas de alta calidad sobre un sustrato que consiste en materiales de desecho de carácter lignocelulosico, materiales producidos en gran cantidad en la actividad agrícola. A pesar de que la calidad de las proteínas de los hongos no es tan alta como la proteína animal, se considera que la producción de ésta es más eficiente en términos de costos, espacio y tiempo.

• El sustrato que queda después de la cosecha del hongo llamado compost agotado, puede ser usado como sustrato para hongos de otros géneros, como forraje para ganado, como acondicionador del suelo o fertilizante y en biorremediación.

• Presencia de componentes medicinales en los hongos.

En cuanto a características alimenticias de los hongos del género Pleurotus spp. se destaca su sabor, altas cantidades de proteína, fibra dietética, carbohidratos, minerales (fósforo, hierro, calcio), vitaminas (riboflavina, tiamina, ácido ascórbico y niacina), ácido linoleico, así como bajas concentraciones de grasas. El contenido de proteína cruda (% en peso seco) de P. ostreatus oscila entre 10,5 a 30,4%, y la calidad biológica de estas proteínas en términos de contribución nutricional para la dieta humana es alta.

OBJETIVOS

Objetivo general

Desarrollar un medio de cultivo para hongos aprovechando los residuos de la cadena de café.

Objetivos específicos

Conocer los requerimientos nutricionales para el cultivo del hongo. Determinar el contenido de cafeína retenida por los hongos utilizando dos

formulaciones diferentes para el medio de cultivo. Analizar el efecto que tienen los diferentes componentes de la formulación

del cultivo en la incorporación de constituyentes del sustrato utilizado (pulpa de café).

Evaluar la eficiencia del sustrato utilizado según la composición nutricional del hongo.

Determinar el rendimiento comparando la cantidad de residuos que pueden ser aprovechados para obtener medios de cultivos con la cantidad desechada.

HIPOTESIS

La incorporación de cafeína en la composición de Pleurotus dependerá de la concentración de cafeína en el sustrato y de la cepa utilizada, suponiendo que habrá incorporación de cafeína, ya que el estudio realizado por la Universidad Nacional de Colombia, mostro este resultado, y que la cepas sean de similar procedencia, además de que el sustrato es el mismo que se utilizo en ese estudio o sea pulpa de café, sin embargo no está demás considerar la variación fisiológica entre cepas del mismo género, por lo cual se podría obtener un resultado adverso, o que la concentración de cafeína en la pulpa utilizada sea muy baja, logrando resultados como el obtenido por Job en donde hubo una metabolización de la cafeína.

METODOLOGÍA

Los residuos que se evaluaran como sustratos para el cultivo se recolectaran de las empresas productoras de café en Caldas que proveen la planta de bioprocesos de la universidad (descafecol, cenicafe)Se emplearan dos formulas para el cultivo del hongo y una formula testigo sin pulpa de café, con las cuales se evaluaran los comportamientos del hongo como la retención de cafeína y la composición nutricional final.

Formulación 1:2% de CaCO320% salvado de maíz23.4% pulpa de café54.6% bagazo de caña

Formulación 2:2% CaCO320% salvado de maíz23.4% bagazo de caña54.6% pulpa de café

Formulación testigo2% CaCO320% salvado de maíz78% bagazo de caña

A continuación se detallan cada una de las etapas involucradas en el proceso de producción:

1. Producción de blanco o semillaLa semilla del hongo se obtiene a partir de cultivos puros que se mantienen crio conservados en agar y nitrógeno liquido. De estos cultivos se transfiere el micelio a tubos de ensayo que contiene agares nutritivos, y de allí a cajas de petri o botellas planas que contienen agar como sustrato, para incrementar el micelio. Luego se prepara la semilla utilizando granos de cereales (en este caso maíz). El procedimiento consiste en hidratar mediante calor el grano del cereal hasta un humedad del 45%. Seguidamente se llenan bolsas de polipropileno de calibre 2 (de 15.5 cm x 23 cm) que son resistentes al calor, con 500g del cereal hidratado y se someten a esterilización durante 20 minutos a 121ºC. el material se deja enfriar y luego se siembra el micelio multiplicado en el agar. En la parte superior de la bolsa se coloca un pedazo de algodón amarrado con fibra, para permitir el intercambio de aire y facilitar el crecimiento del micelio. Esta etapa tiene una duración de aproximadamente 3 semanas. Al final de este tiempo el cereal queda cubierto con el micelio del hongo (coloración blanca) y listo para ser utilizado.

2. Adecuación del sustrato La pulpa de café utilizada para el cultivo debe estar fresca ( máximo 72 horas de despulpado) la pulpa de café proveniente del beneficio ecológico presente un alto

contenido de azucares que deben ser retirados, ya que interfieren el desarrollo micelial del hongo que favorecen establecimiento de otros microorganismos (bacterias y levaduras); por tanto, se hace necesaria una adecuación del sustrato.Lo más recomendado, desde el punto de vista técnico y económico, es utilizar el sistema anaerobio. Para ello se empaca la pulpa fresca en costales de fibra a razón de 25 kg/costal y se prensa, con el fin de retirar azucares por vía mecánica y evitar la utilización de agua que incrementaría los residuos líquidos por tratar. El prensado se realiza con una prensa manual y hasta que se recolecten unos 8 litros de drenado, lo que se busca con esto es obtener en la pulpa una humedad final del 80%, quedando el sustrato listo para la inoculación con la semilla del hongo.

3. InoculaciónConsiste en adicionar la semilla del hongo al sustrato ya preparado. Se debe realizar en un sitio cerrado, sobre un mesón previamente desinfectado con alcohol para evitar que se presente contaminación en la fase de establecimiento micelial. La pulpa se retira de los costales y se extiende sobre el mesón y se le adiciona la semilla en una relación del 2% (2 kg de semilla por cada 100 kg de sustrato de siembra), el bagazo de caña y CaCO3 según los porcentajes para cada formulación. Se realiza la mezcla manual y se empacan aproximadamente 2 kg en bolsas de polietileno de calibre 2, de 30cm x 40 cm, teniendo cuidado de que el material quede bien compactado. Luego se amarra con fibra y se hacen perforaciones bien distribuidas alrededor de la bolsa (aproximadamente 60) utilizando una lezna. De esta forma se proporciona al micelio condiciones físicas y de intercambio gaseoso que le asegure su buen desarrollo.

4. IncubaciónEn esta fase se consigue que el micelio invada totalmente el sustrato. Se debe realizar en un cuarto cerrado, seco y oscuro. Las bolsas pueden acomodarse en estanterías metálicas, de madera, o colocarlas en el suelo.Se recomienda espolvorear carbonato de calcio (CaCO3) sobre las superficies de incubación para prevenir el asentamiento de hongos competidores y la presencia de insectos indeseados. Además, instalar una escotilla de ventilación que permita un cambio natural de aire. La duración de esta etapa oscila entre 3 y 4 semanas, tiempo en el cual el sustrato se torna blanco.

5. FructificaciónUna vez el sustrato es invadido por el micelio del hongo es necesario cambiar las condiciones del cultivo, aumentando la humedad relativa y las condiciones de luminosidad para inducir la formación de los cuerpos fructíferos (hongos). La bolsa se abre (retirando la fibra) y se humedece al igual que el piso del cuarto, para con ello asegurar una humedad relativa superior al 90%. Debe permitirse la entrada de luz diurna. En esta etapa se recomienda hacer cambios de aire a razón de 350 m3 por tonelada de sustrato. Aproximadamente a la semana de proporcionar estas condiciones aparecen las primeras estructuras del hongo y en este momento se retira la bolsa por completo.

6. Cosecha

Los primeros hongos se cosechan aproximadamente al mes de haberse realizado la inoculación. Se pueden recolectar entre 4 y 5 cosechas en la etapa de producción, que tiene una duración aproximada de 45 días.Luego de recolectado el hongo este es deshidratado (secado) y molido para su posterior análisis y comercialización.

El rendimiento del cultivo se mide en términos de eficiencia biológica, que se define como el peso en gramos de hongos frescos cosechados por cada 100 gramos de sustrato seco.

Para de determinación de cafeína se utilizara el método de espectroscopia UV- vis:

Espectro de absorción UV-VisEl espectro de absorción de una molécula en solución es la representación gráfica de la probabilidad de absorción de radiación luminosa por sus cromóforos con respeto a la longitud de onda. Constituye una característica propia de la molécula que depende de sus propiedades estructurales y del disolvente.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDADTIEMPO EN SEMANAS AÑO: 2012-2

AGOSTO SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

Formulación de producto, costos de la materia prima. X X

Análisis de la cantidad de producto q se va a producir

X

Instalación del Montaje X

Iniciación de proyecto: preparación de sustrato

X X X

Inoculación e incubación X X X XFructificación X

Primera Cosecha XSegunda cosecha X

Secado XMolido X

Determinación de cafeína y análisis bromatológico

X

RESULTADOS O PRODUCTOS ESPERADOS

Debido a que la finalidad del proyecto planteado es obtener a partir de un subproducto de café como lo es la cascarilla, un medio de cultivo ideal para el crecimiento de hongos del genero pleurotus, se espera que el hongo pueda crecer en este medio y de este modo llevar a cabo los análisis respectivos con respecto al contenido de cafeína en sus estructuras y de esta manera evaluar si es posible que el hongo pueda incorporar o no otros compuestos, así mismo la expectativa es evaluar la cantidad de cafeína que puede ser retenida por el hongo según las variaciones en la formulación del medio en el cual será inoculado. Se espera de igual forma obtener un buen rendimiento en el cultivo de hongos y que pueda ser aprovechado lo suficientemente el sustrato para así ofrecer un porcentaje bajo de contaminación del medio ambiente y poder utilizar los desechos de este cultivo como piensos para animales y o en compostaje lo que se pretende es realizar un estudio en hongos para explorar nuevas formas de cultivo, reducir la contaminación y aprovechar los residuos.

POTENCIALES BENEFICIADOS

El hongo del genero Pleurotos es ampliamente utilizado en la actualidad como una fuente nutricional por sus cualidades, de las cuales cabe destacar el alto contenido en proteínas (entre 23% y 30%) y vitaminas (destacando las vitaminas constituyentes del complejo B), y antioxidantes, lo cual lo hace una fuente integral de nutrientes para al organismo, la cual podría ser una posible respuesta a los problemas de desnutrición que se generan por no poseer alimentos que cumplan en gran medida con las exigencias del cuerpo, además de la demanda de residuos osea bajos costos en los nutrientes a disponer en su desarrollo.

Por otro parte los residuos agroindustriales generados en la industria del café, muchas veces no pueden ser reutilizados en piensos, y su desecho al medio ambiente causa gran contaminación, por sus componentes anti fisiológicos como la cafeína o los taninos, que resultan contraproducentes al medio, también por esta razón es que no se pueden utilizar los residuos de café como sustrato para otros cultivos microbiológicos, ya que la cafeína puede resultar toxica para otros microorganismos, por esto es que resulta la necesidad de utilizar los hongos de pudrición blanca como el Pleurotos, que degradan estos compuestos a niveles mínimos en esta clase de residuos, y los hacen procesables para la alimentación de animales, o para un descargue al medioambiente más amable, siendo un gran atractivo el procesos de desintoxicación de residuo, no solo para una mejor biodegradación al medioambiente, sino para los productores de piensos para animales.

Por otra parte la gran discusión es si el Pleurotos incorpora o degrada la cafeína, por cualquiera de los dos lados hay beneficiados, ya que la cafeína como se vio podría ser un inductor de Lacasa que es una enzima de interés por su capacidad de degradar compuestos lignocelulosicos, y si la cafeína se degrada como forma de inducir Lacasa, habría un gran interés por los residuos del café, para las personas que producen esta enzima. O por otra parte si en vez de degradar la cafeína el Pleurotus la incorporara a sus cuerpos fructíferos, se abrirían muchas

posibilidades sobre que otros compuestos sería capaz de incorporar a su estructura el hongo dependiendo del sustrato utilizado, dándole un valor agregado a su composición que de por si es realmente nutritiva.

En fin son muchos los beneficiados del procesos de producción de Pleurotus a partir de sustratos hechos con residuos del café, como lo son el medio ambiente, productores de Lacasa, personas interesada en aislar e incorporar otros compuestos al mismo hongo, y una respuesta a producir una fuente de alto valor nutricional a partir de los desperdicios que generan la diversas industrias, aprovechando no solo los residuos sólidos sino líquidos, lo que hace que el Pleurotus sea manipulable tanto con fermentación sumergida como con fermentación en estado sólido.

BIBLIOGRAFIA

Nelson Rodríguez Valencia. Cultivo de hongos comestibles y medicinales sobre residuos agrícolas de la zona cafetera colombiana. Centro Nacional de Investigaciones de Café.

Nelson Rodríguez Valencia, Fernando A. Gómez cruz. Cultive hongos comestibles en pulpa de café. Avances técnicos Cenicafe. Marzo de 2001.

Ercília M.S. Machado, Rosa M. Rodriguez-Jasso, José A. Teixeira, Solange I. Mussatto, Growth of fungal strains on coffee industry residues with removal of polyphenolic compounds, Biochemical Engineering Journal, Volume 60, 15 January 2012, Pages 87-90. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X11002841

María Luisa Carrillo Inungaray, Diana Zavala Cuevas, Brenda Alvarado Sánchez Kidia Sarahí Morales Reyes, Pascasio Bautista Brígido. Obtención de biomasa a partir de cáscara de café. Disponible en:

http://www.eumed.net/rev/tlatemoani/06/icsrb.htm

Rosa Catalina Bermúdez Savón, Nora García Oduardo, Ariadne Mourlot López Fermentación sólida para la producción de pleurotus sp. sobre mezclas de pulpa de café y viruta de cedro. Disponible en: http://ojs.uo.edu.cu/index.php/tq/article/viewFile/2423/1954

Juan Pablo Garzón Gómez, Jairo Leonardo Cuervo Andrade. Producción de Pleurotus ostreatus sobre residuos sólidos lignocelulósicos de diferente procedencia. Disponible en: http://www.unicolmayor.edu.co/invest_nova/NOVA/NOVA10_ARTORIG2_pleur.pdf

Nieto, I., Chegwin, C., Osorio, H., Incorporación de cafeína en el hongo Pleurotus sajor-caju cultivado sobre pulpa de café. Revista Iberoamericana de Micología, 2009 (24): p. 72-74. Disponible en: http://www.reviberoammicol.com/2007-24/072074.pdf

Garcia, e.a., Producción de lacasa extracelular, remoción de fenoles y cafeína por pleurotus spp. cultivado en pulpa de café. Tecnologia química, 2007 (3): p. 83-91. Disponible en: http://ojs.uo.edu.cu/index.php/tq/article/viewFile/2444/1975

Job, D., La utilización de la borra del café como substrato de base para el cultivo de Pleurotus ostreatus. Revista Iberoamericana de Micología, 2004 (21): p. 195-197. Disponible en: http://www.reviberoammicol.com/2004-21/195197.pdf

Dulce Salmones, Gerardo Mata, Krzysztof N. Waliszewski, Comparative culturing of Pleurotus spp. on coffee pulp and wheat straw: biomass production and substrate biodegradation, Bioresource Technology, Volume 96, Issue 5, March 2005, Pages 537-544. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852404002433

Ashok Pandey, Carlos R. Soccol, Poonam Nigam, Debora Brand, Radjiskumar Mohan, Sevastianos Roussos, Biotechnological potential of coffee pulp and coffee husk for bioprocesses, Biochemical Engineering Journal, Volume 6, Issue 2, October 2000, Pages 153-162. Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1369703X0000084X