PROTEINAS

AMINOÁCIDOS (a.a.)

aa

NO POLARES

CON GRUPO BÁSICO

ALIFÁTICOS

AROMÁTICOS

POLARES SIN CARGA

CON GRUPOS ÁCIDOS

POLARES CON CARGA

Clasificación

NO POLARES ALIFÁTICOS

H2N CH C

H

OH

O

H2N CH C

CH3

OH

O

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH3

H2N CH C

CH2

OH

O

CH CH3

CH3

GLICINA Gli

ALANINA Ala VALINA Val

LEUCINA Leu

H2N CH C

CH

OH

O

CH3

CH2

CH3

ISOLEUCINA Ile

HN

C OH

O

PROLINA Pro

NO POLARES AROMÁTICOS

H2N CH C

CH2

OH

O

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

H2N CH C OH

O

FENILALANINA Phe

TIROSINA Tyr

TRIPTOFANO Trp

CH2

HN

POLARES CON CARGA

• BÁSICOS (O CARGADOS +) ÁCIDOS (O CARGADOS -)

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

CH2

NH2

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

CH2

NH

C

NH2

NH

H2N CH C

CH2

OH

O

N

NH

LISINA Lis ARGININA

Arg

HISTIDINA Hys

H2N CH C

CH2

OH

O

C

OH

O

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

OH

O

ACIDO GLUTÁMICO Glu

ÁCIDO ASPÁRTICO Asp

Ac glutámicoGlu

Ac aspárticoAsp

POLARES SIN CARGA

H2N CH C

CH2

OH

O

OH

H2N CH C

CH

OH

O

OH

CH3

H2N CH C

CH2

OH

O

SH

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

C

NH2

O

H2N CH C

CH2

OH

O

C

NH2

O

SERINA Ser

TREONINA Tre

CISTEÍNA Cys

GLUTAMINA Gln

ASPARRAGINA Asn

H2N CH C

CH2

OH

O

CH2

S

CH3

METIONINA Met

Propiedades de los a.a.

• Sólidos cristalinos incoloros • Elevado punto de fusión (habitualmente por

encima de los 200 ºC)• Solubles en agua dependiente de la cadena

lateral.• Casi todos los aminoácidos naturales tienen

configuración (L), con estereoquímica parecida a la del L-(-)-gliceraldehído, por lo que se denominan L-aminoácidos. Excepto la glicina, todos los α aminoácidos son quirales. El centro quiral es el átomo de carbono asimétrico α.

Propiedades de los a.a.

• La actividad óptica se manifiesta por la capacidad de desviar el plano de luz polarizada que atraviesa una disolución de aminoácidos. Esta propiedad hace clasificar a los aminoácidos en Dextrógiros (+) si desvían el plano de luz polarizada hacia la derecha, y Levógiros (-) si lo desvían hacia la izquierda

Propiedades de los a.a.

Curva de valoración de la glicina

para un aa no polar:

pI = pK1+pK2

2

La solubilidad en agua de un aminoácido es mínima en su punto isoeléctrico

Propiedades de los a.a.

• Formación de enlaces DISULFURO:

H2N CH

C

H2C

OH

O

SH2

H2N CH

C

CH2

OH

O

SH2

+H2N CH

C

CH2

OH

O

S

H2N CH

C

H2C

OH

O

S

CistinaCisteína Cisteína

Propiedades de los a.a.

• Formación de enlaces PEPTÍDICOS:

PÉPTIDOS

• Péptido: Polímero de aminoácidos de PM menor a 6000 daltons ( <50 aa)

• Proteína: Polímero de aminoácidos de mas de 6000 daltons (aa>50)

• Se nombran desde el extremo N-terminal al C-terminal, usando la terminación il, excepto para el último aa.

Estructura de las proteínas

ESTRUCTURA PRIMARIA

•Hace referencia a:•La identidad de aminoácidos.•La secuencia de aminoácidos.•La cantidad de aminoácidos.

•La variación en un solo aa hace que cambie su función biológica.•Los aa se unen por UNIONES PEPTÍDICAS.

ESTRUCTURA SECUNDARIA

HELICE ALFA HOJA PLEGADA BETA

ESTRUCTURA TERCIARIA

• Esta estructura se mantiene estable gracias a la existencia de enlaces entre los radicales R de los aminoácidos.

hidrogeno

ESTRUCTURA CUATERNARIA

• Surge de la asociación de varias cadenas con estructuras terciarias.

• Intervienen las mismas interacciones que en la estructura terciaria.

• El número de peptidos varía desde dos como en la hexoquinasa, cuatro como en la hemoglobina, o 60 como la cápsida del virus de la poliomielitis

CLASIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Se clasifican en : • HOLOPROTEÍNAS

Formadas solamente por aminoácidos

• HETEROPROTEÍNASFormadas por una fracción proteínica y por un grupo no proteínico, que se denomina "grupo prostético

HOLOPROTEÍNAS

Globulares

•Prolaminas: Zeína (maíz), Gliadina (trigo), Hordeína (cebada) •Gluteninas: Glutenina (trigo), Orizanina (arroz). •Albúminas:Seroalbúmina (sangre), Ovoalbúmina (huevo), Lactoalbúmina (leche) •Hormonas: Insulina, Hormona del crecimiento, Prolactina, Tirotropina •Enzimas: Hidrolasas, Oxidasas, Ligasas, Liasas, Transferasas...etc.

Fibrosas

•Colágenos: En tejidos conjuntivos, cartilaginosos •Queratinas: En formaciones epidérmicas: pelos, uñas, plumas, cuernos. •Elastinas: En tendones y vasos sanguineos •Fibroínas: En hilos de seda, (arañas, insectos)

HETEROPROTEÍNAS

Glucoproteínas

•Ribonucleasa •Mucoproteínas •Anticuerpos •Hormona luteinizante

Lipoproteínas •De alta, baja y muy baja densidad, que transportan lípidos en la sangre.

Nucleoproteínas •Nucleosomas de la cromatina •Ribosomas

Cromoproteínas

•Hemoglobina, hemocianina, mioglobina, que transportan oxígeno •Citocromos, que transportan electrones

Desnaturalización de proteínas

“Proceso generalmente irreversible mediante el cuál la proteína pierde su estructura 2º, 3º y 4º”

• Agentes: Físicos: Químicos:

Calor solventes orgánicos

Radiaciones soluc. de urea conc. Grandes presiones sales

Métodos de determinación de proteínas

Método de kjeldahl

Digestión materia + H2SO4(c) + Catalizadores CO2 + H2O+ (NH4)2SO4

Neutralización (NH4)2SO4+ 2NaOH → 2(NH4)OH+Na2SO4(color marrón)

(NH4)OH+calorNH3+H2O

•K2SO4 •CuSO4 5H2O•TiO2

Métodos de determinación de proteínas

• Método de kjeldahl

Destilación NH3+ H3BO3 +indicador → NH4

+ + H2BO3- (color turqueza)

(ácido bórico) (ión borato)

Titulación H2BO3

- + HCl → H3BO3 (color violeta)

Indicador: rojo de metilo + verde de bromocresol

Método de kjeldahl

Moles de HCl = moles de NH3 = moles de N en la muestra

%N = N(HCl) x G de ácido x meq del N x100 W de muestraSe utiliza un factor de conversión de % de N a % de proteína

cruda.

%PROTEÍNA=%N X F

Método de kjeldahl

Alimento %N2 (proteína) factorcarne, leguminosas 16 6.25 Leche 15.7 6.38Trigo 18 5.7Soya 17.51 5.71Avena 17.15 5.83

Método de kjeldahl

• Ventajas del método de kjeldahl• Aplicable a todo tipo de alimentos• Relativamente simple• Barato• Es el método oficial para medir el contenido de proteína cruda

• Desventajas del método de kjeldahl• Mide el nitrógeno orgánico total, no sólo el nitrógeno protéico• Consume mucho tiempo (al menos 2 horas para completarse)• Precisión más pobre que el método de biuret• Usa reactivos corrosivos

Método de absorción en ultravioleta a 280nm

Las proteínas muestran un fuerte grado de absorción a 280nm en UV, principalmente debido a los residuos de triptofano y tirosina de las proteínas ya que las concentraciones de estos aminoácidos en las proteínas se considera constante se puede utilizar la absorbancia a 280nm para estimar la concentración de proteínas usando la ley de beer

A = ε·c·l Donde: A = absorbancia = Coeficiente de absorción molar l = longitud de la celdaC=concentración molar

: medida de la cantidad de luz absorbida por mol de sustancia

Método de absorción en ultravioleta a 280nm

Curva estándar de concentración vs absorbancia utilizando albúmina de suero de bovino (bsa)

Método de absorción en ultravioleta a 280nm• Ventajas del método de absorción en uv (280nm)• Método rápido y relativamente sensible (varias veces más sensible que

el método de biuret)• No existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer• Método no destructivo• Utilizado en detección post-columna de las proteínas• Desventajas del método de absorción en uv (280nm)• Los ácidos nucléicos también absorben en la región de 260nm • El contenido de aminoácidos aromáticos difiere considerablemente en

varias proteínas.• La solución debe ser clara e incolora. • Se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este método.

MÉTODO DE BIURET

Reactivo: KOH + CuSO4.5H2O+ tartrato de Na y K (KNaC4O6·4H2O).

• 5 mL de reactivo de biuret se mezcla con 1ml de solución protéica (1-10 mg de proteína/ml).

• Después de reposo a temperatura ambiente durante 30 minutos, se lee la absorbancia a 540nm contra un blanco con sólo reactivo

• La intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido proteico de la muestra.

MÉTODO DE BIURET• Ventajas del método de biuret • Menos caro que el método de kjeldahl• Rápido (se puede completar en menos de 30 minutos)• No es frecuente encontrar derivaciones de color• Pocas substancias no protéicas interfieren con la reacción de biuret• No detecta N de fuentes no protéicas o no peptídicas

• Desventajas del método de biuret • Las concentraciones altas de sales de amonio interfieren con la reacción. • Puede ocurrir opalescencia en la solución final si están presentes altas

concentraciones de lípidos o carbohidratos• Varios pigmentos absorben la luz a 540 nm.

Método de Lowry Combina la reacción de biuret con la reducción del reactivo de folin

(ácido fosfomolíbdico-fosfowolfrámico) por los residuos de tirosina y triptofano de las proteínas. El color azul desarrollado es leído a 750nm (alta sensibilidad para una concentración protéica baja) o a 500nm (baja sensibilidad para una concentración protéica alta)

Método de Lowry

• Ventajas del método de lowry • Muy sensible• Menos afectado por la turbidez de la muestra • Más específico que la mayoría de los otros métodos• Se puede completar en 1 a 1.5 horas

• Desventajas del método de lowry • El color varía con diferentes proteínas (más que el método de

biuret)• La sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y

hexoaminas interfieren con la reacción

Método de bradford

El azúl brillante coomassie (G-250) se adhiere a la proteína, el colorante se torna de rojizo a azulado y el máximo de absorción del colorante cambia de 465 a 595nm. El cambio en la absorbancia a 595nm es proporcional a la concentración de proteína en la muestra.

Método de bradford• Ventajas del método de bradford • Método rápido (la reacción se puede completar en 2 minutos)• Sensible (mucho más que el método de lowry)• No existe interferencia de cationes como K+, Na+, y Mg+

• No existe interferencia del sulfato de amonio• No existe interferencia de los polifenoles ni carbohidratos como la

sacarosa• Mide proteína o péptidos con una masa molecular aproximadamente

igual o mayor de 4 000 daltons

• Desventajas del método de bradford • El complejo proteína-colorante formado puede unirse a las celdas de

cuarzo.• El color varía con diferentes tipos de proteínas. • Interferencia con detergentes.

Método del ácido Bicincónico (BCA)

• Se basa en el principio de que las proteínas reducen los iones cúpricos a iones cuprosos bajo condiciones alcalinas.

• Los iones cuprosos reaccionan con el BCA (verdoso) para formar un color purpura.

• El color formado es proporcional al contenido protéico de la muestra.

• Lectura a 562 nm.

OH-Proteína + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA complejo púrpura BCA- Cu1+

Método del ácido Bicincónico (bca)• Ventajas del método del ácido Bicincónico (bca)• Sensibilidad superior a la del método de lowry (0.5μg a 10 μ g)• La mezcla en un paso es más fácil que en el método de lowry• El reactivo es más estable que el reactivo de lowry• Las sales de buffer y detergente no iónico no interfieren con la reacción

• Desventajas del método del ácido Bicincónico (bca)• El color no es estable con el tiempo. Se necesita controlar

cuidadosamente el tiempo entre el análisis y la lectura en absorbancia.• Los azúcares reductores interfieren con la reacción.• Altas concentraciones de sulfato de amonio interfieren con la reacción.

Separación electroforética

• Separación electroforética de la Ala, lis y Asp a pH = 6.

• La lis atraída hacia el cátodo, el Asp es atraído hacia el ánodo y la Ala se encuentra en su punto isoeléctrico, por lo que no se mueve

Método de separación cromatográfica.

• En el analizador de aminoácidos, el hidrolizado pasa a través de una columna de intercambio iónico. La solución que emerge de la columna se trata con ninhidrina y su absorbancia se registra en función del tiempo. Cada aminoácido se identifica por el tiempo de retención necesario para pasar a través de la columna.

• Lectura a 570 nm.