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DETERMINACION DE NITROGENO TOTAL Y PROTEINA BRUTA POR EL METODO DE KJELDAHL UNMSM

1. INTRODUCCIÓN

El problema que representa proporcionar proteínas adecuadas a la población del mundo es un tanto secundario en el problema general de alimentación mundial. Además de su significado nutritivo las proteínas juegan un papel importante en las propiedades organolépticas de los alimentos. Las proteínas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos provenientes de fuentes animales. Las proteínas existen en los alimentos en combinación física o química con carbohidratos o lípidos. Las glucoproteínas y las lipoproteínas afectan las propiedades reológicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones técnicas como emulsificantes comestibles.

El analista de alimentos comúnmente desea saber el contenido protéico total de los alimentos, aunque dicho contenido esté conformado por una mezcla compleja de proteínas. El contenido proteínico de los alimentos puede determinarse por medio de diversos métodos. La forma más habitual es su cuantificación de forma indirecta y aproximada, bien a partir del contenido en nitrógeno de la muestra, o bien deduciendo su cantidad a partir del contenido de uno o dos aminoácidos particulares que conforman la proteína, fáciles de identificar y de cuantificar por su reactividad química específica. Este segundo procedimiento conlleva una mayor inexactitud. Desde hace más de 100 años se está utilizando el método Kjeldahl para la determinación del nitrógeno en una amplia gama de muestras (alimentos y bebidas, piensos, forrajes, fertilizantes) para el cálculo del contenido en proteína. También se utiliza el método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno en aguas residuales y suelos. Es un método oficial descrito en múltiples normativas: AOAC, USEPA, ISO, Farmacopeas y distintas Directivas Comunitarias.

Se llevo a cabo la determinación de proteína de coca y sacha inchi a través de este método.

2. OBJETIVOS

Comprender los fundamentos del método Kjeldahl para la determinación del contenido en proteína de un alimento.

Comprender los mecanismos químicos que se dan en la determinación de proteínas por el método de Kjeldahl.

Determinar la cantidad de proteína en la coca y sacha inchi.

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3. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA

3.1. Fundamento del metodo de Kjeldahl.

En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el proceso básico del conocido método actual de análisis de proteínas por el método Kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formado se titulan con HCl estandarizado, lo cual se convierte en el nitrógeno de la muestra. El resultado del análisis representa el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no protéicos. Este método ha sufrido varias modificaciones. Así, Kjeldahl usó originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación, sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó. En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión con ácido sulfúrico añadiendo algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugirió la adición de sulfato de potasio para elevar el punto de ebullición de la mezcla de la digestión para acortar la reacción. Por lo tanto, el procedimiento de esta técnica es más correctamente conocido como Método Kjeldahl-Wilforth-Gunning.

La convención general, sobreentendida, es que la totalidad del nitrógeno de la muestra está en forma proteica, aún cuando la realidad es que, según la naturaleza del producto, una fracción considerable del nitrógeno procede de otros compuestos nitrogenados (bases púricas y pirimidínicas, creatina y creatinina, urea, amoniaco, etc.), por ello se denomina “proteína bruta” o “proteína total” a la obtenida por este método.

3.2. Procedimiento del método de Kjeldahl

El método consta de tres etapas: DIGESTIÓN – DESTILACIÓN – TITULACIÓN.

En la DIGESTIÓN se produce la descomposición del nitrógeno que contienen las muestras orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene haciendo hervir la muestra en una concentración de ácido sulfúrico. El resultado es una solución de sulfato de amonio.

En la etapa de DESTILACIÓN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución con una cantidad conocida de ácido bórico. Inicialmente se realiza una destilación con vapor por el método de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtención del destilado.

Al final, se utiliza la TITULACIÓN para valorar finalmente la cantidad de amonio presente en la muestra destilada.

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3.3. Fuentes de error del método de Kjeldahl:

Las principales fuentes de error según la FAO son:

En el proceso de digestión:

1.- La inclusión de nitrógeno no protéico (aunque la cantidad de este nitrógeno suele ser despreciable comparada con la del nitrógeno protéico).

2.- La pérdida de nitrógeno durante la digestión. El exceso de sulfato de sodio o potasio que se añade al ácido para elevar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno.

3.- La digestión incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reacción o falta de ácido sulfúrico.

Durante la destilación:

1.- Neutralización incompleta de la mezcla digerida. Es necesario añadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de ácido sulfúrico resultante de la digestión así como transformar todo el amonio formado en la digestión en amoníaco.

2.- Perdida de amoníaco por fugas en el circuito de destilación.

3.- Perdida de amoniaco por refrigeración insuficiente en el condensador.

Otros errores:

Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se añaden al ácido (para elevar el punto de ebullición) pueden resultar en una descomposición por calor y la consecuente pérdida de amoníaco. Generalmente se recomiendan temperaturas de digestión de 370-410°C.

3.4. Ventajas y desventajas del método de Kjeldhal (fuente: FAO)

Ventajas:

-Apropiado para varios tipos de productos.-Alta fiabilidad.-Usado como método de referencia.

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Desventajas del método de Kjeldhal

-Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.-Uso de catalizadores tóxicos o caros.-Elección del factor de conversión.

Desventajas del uso del factor de conversión:

-Para efectos de cálculo se considera el contenido de nitrógeno de la proteína principal y no de toda la mezcla.

-La fracción analizada no necesariamente es proteína pura.

-No se realizan correcciones de nitrógeno no proteico.

-Se ha sugerido determinar el factor de conversión de nitrógeno a proteína utilizando la composición de aminoácidos del alimento a analizar, lo que se complica al combinar los alimentos, por lo cual se prefiere continuar con el uso de los factores tradicionales informando a su vez el factor utilizado.

3.5. Contenido de proteína en hoja de coca:

El consumo de la hoja de coca data de por lo menos hace 5.000 años (algunas fuentes dicen 7.000). Hoy se estima que alrededor de 8 millones de personas en la región andina la consumen diariamente. Para muchos de ellos, la hoja de coca es una fuente muy importante de proteínas, minerales y vitaminas. En un estudio realizado por la Universidad de Harvard en 1975 (The Nutritional Values of the Coca Leaf) la hoja de coca se caracteriza como una de las plantas más nutritivas del mundo.

Valor nutritivo de 100 gramos de hojas de coca (Univ. de Harvard, EEUU)

Proteínas 19,9 gr.

Minerales

Fósforo 405 mg Potasio 1110 mg.

Calcio 2191 mg.

Magnesio 911 mg.

Hierro 36 mg.

Zinc 4 mg.

Boro 24 mg.

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Vitaminas

Alfa y beta caroteen 16,6 mg. B1. 0,8 mg.

B3 1,7 mg.

B6 8,6 mg.

C 2 mg.

E 53 mg.

H 0,5 mg.

3.6. Contenido de proteína en hoja de sacha inchi:

Según la estudios realizados en la Universidad de Cornell (USA) indica que la almendra de las semillas de sacha inchi contiene 48,6 % de aceite y 29,0 % de proteína.

Tabla Nº1. Contenido de proteínas y ácidos grasos en sacha inchi y otras oleaginosas

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4. EQUIPOS Y MATERIALES

4.1. Muestras:

- Sacha inchi- Coca

Figura1: Muestras analizadas4.2. Equipos o aparatos:

• Aparato digestor Kjeldahl modelo K-424 B’UCHI’

Figura 2: Equipo digestor de proteínas

• Bomba al vacio

Figura 3: Bomba al vacio

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Aparato destilador.

Figura 4: Aparato de destilación

• Bureta automática • Erlenmeyers de 500 ml. • Balanza analítica de sensibilidad 0.1 mg. • Molino de martillo de laboratorio.

4.3. Reactivos

Acido sulfúrico concentrado. Acido borico 4% Acido clorhídrico 0.0845N• Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO45H2O). • Sulfato de potasio • Hidróxido de sodio al 50% (450 g de NaOH en 1 litro de agua). • Papel a prueba de grasa, hojas de aproximadamente 9 x 6 cm. 3.4. Indicadores: • Indicador de fenolftaleína • Indicador de Tashiro

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5. PROCEDIMIENTO5.1. Digestión:

-Se peso por duplicado 2 g de muestra molida (sobre una hoja de papel a prueba de grasa) y se transfirio a cada uno de los tubos Kjeldahl (papel y muestra problema), se agrego aproximadamente 0.05 g de sulfato de cobre, 5 g de sulfato de potasio. Por último se agrego 20 ml de ácido sulfúrico bajo una campana de extracción. Esto se repitió para las dos muestras y el blanco.

Figura 5: Tubos de Kjeldahl con muestras y reactivos

- Se coloco los tubos de Kjeldahl en el digestor, previamente se precalentó por 15 minutos el equipo. Luego se calentara suavemente hasta que cese la formación de espuma y el contenido se haya licuado completamente, para esto se tuvo que colocar el

equipo en la potencia 10 (temperatura de aproximadamente 370°C). Se dejo hervir el contenido del cada uno de los tubos hasta que la solución se torno de color verde esmeralda, se sigue calentando por 45 minutos. El tiempo de digestión total fue aproximadamente de 2 horas.

Figura 6: Tubos de Kjeldahl con muestras luego de la digestión

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- Se dejo enfriar a unos 40 °C y agregar con cuidado aproximadamente 400 ml de agua, mezclar y se vuelve a enfriar hasta 25 °C.

5.2. Destilación de vapor:

- Se coloco 1 frasco Erlenmeyer con 50 ml de ácido bórico y 2 gotas de indicador Tashiro bajo la salida de destilación.

Figura 7: Erlenmeyer con solución de acido bórico e indicador

- Se transfirió el tubo con la muestra digerida al destilador, previamente se le agrego cuatro gotas de fenolftaleína. Se encendió el mechero de Bunsen para calentar el tubo.

-Se añadió aproximadamente 40 ml. aproximadamente de la solución de NaOH a la cámara que se encuentra en la parte superior del equipo. Se dejo caer gota a gota la solución, hasta que la mezcla digerida se torno oscura (azúl-gris o café oscuro). Es decir en cantidad suficiente para volver todo el contenido a fuertemente alcalino.

Figura 8: Cambio de color de la muestra ya digerida por la adición de NaOH

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- El destilado estará listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor, es decir cuando todo el amoníaco haya destilado (más o menos 300 ml).

5.3. Titulación:

-Se titulo la solución remanente en el Erlenmeyer, con una solución valorada de ácido clorhídrico, usando el anaranjado de metilo como indicador, hasta que cambie de color.

Figura 9: Cambio de color de luego de la titulación con HCl

Este procedimiento se repitió para cada uno de los tubos de Kjeldahl, incluyendo el blanco.

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6. RESULTADOS

Tabla N°2: Resultados de % de proteínas experimental y teórico

muestra Sacha inchi

N° 2

Hoja de coca

N°1

Hoja de coca

N°2

%Proteína

experimental

14.4 27.6 28.7

%Proteína

téorico

29 19.9 19.9

Tabla 3: % de error experimental en leche en polvo.

Sacha inchi N°

2

Hoja de coca

N°1

Hoja de coca

N°2

% de error absoluto

50 38 44

7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Observando los valores teóricos de proteínas del sacha inchi según los

reportes de análisis realizados en la Universidad de Cornell (USA) se obtiene

un porcentaje de error muy elevado igualmente ocurrió con los datos obtenidos

con la hoja de coca ya que se comparó con el estudio realizado por la

Universidad de Harvard en 1975 (TheNutritionalValues of the Coca Leaf).

Esta comparación se puede observar en el cuadro N°2.

La fuente de error se debió notablemente en el proceso de destilación ya

que se trató de construir el destilador pero lamentablemente hubo fugas de

amoniaco, este proceso se realiza preferentemente con un destilador

automático que puede operar evitando este tipo de errores y en un menor

tiempo (5 min).

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Otra fuente de error según la FAO, se pudo deber a la pérdida de nitrógeno

durante la digestión o al exceso de sulfato de potasio que se añade al ácido

para elevar el punto de ebullición, lo que pudo producir una descomposición por

calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. Por otro lado, el exceso de catalizador

(de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno

También durante la digestión hubo formación de espumas lo que puede

haber conllevado en una pérdida de muestra por lo cual se recomienda

aumentar la intensidad de calor gradualmente y no someter bruscamente a la

temperatura requerida (Glenn H. Brown, Eugene M. Sallee). Es decir no

colocar la muestras directo en grado 10 sino aumentar paulatinamente de grado

de temperatura.

Según la FAO, el contenido porcentual promedio de N en proteínas de

diversos alimentos es de 16 %., por eso el factor para convertir N en proteínas

sería entonces 100/16 = 6,25. Este factor general de conversión no es sin

embargo exacto, ya que las proteínas de origen animal contienen generalmente

menos nitrógeno y las de origen vegetal más.

En la digestión un tratamiento con ácido sulfúrico concentrado, en presencia

de un catalizador y ebullición convierte el nitrógeno orgánico en ión amonio,

según la FAO la mezcla alcalina de salicilato de sodio, nitroprusiato de sodio e

hipoclorito de sodio da la coloración verde esmeralda brillante con amonio

característico.

Según la FAO, el método de Kjeldahl es aapropiado para varios tipos de

productos, por su alta fiabilidad; sin embargo la interferencia de compuestos

nitrogenados no proteicos y el uso de catalizadores tóxicos hace que se usen

otros métodos para la determinación de proteína, tales como el método de

Dumas.

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Según Eva Garcia Martinez citada en la bibliografia, en el proceso de

destilación se adiciona una cantidad suficiente de hidróxido de sodio en la

muestra digerida, para alcalinizar fuertemente el medio y así desplazar el

amoniaco de las sales amónicas. De esta manera el amoniaco es liberado y

arrastrado por el vapor de agua inyectado en el contenido del tubo durante la

destilación, y se recoge sobre una disolución de ácido bórico.

Según Eva Garcia Martinez utilizando una solución receptora a base de

ácido bórico no se necesita dosificar con precisión, ya que la titulación mide

exactamente la cantidad de amoniaco neutralizando a 1:1 el complejo formado

por el amoniaco y el ácido bórico. También indica que es necesario calentar la

solución receptora como mínimo a 45ºC para evitar la pérdida de amoniaco.

8. CONCLUSIONES

El método de Kjeldahl se digieren las proteínas y otros compuestos

orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de

catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte en sulfato de amonio

mediante la digestión. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se

destila. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones de

borato así formado se titulan con HCL estandarizado para determinar el

nitrógeno contenido en la muestra.

En general, el método Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar

mediante equipos no muy sofisticados y puede ser realizado por técnicos poco

experimentados, sin embargo en esta práctica no se dieron resultados

experimentales aproximados a los resultados teóricos. Además según la FAO

se puede utilizar otros métodos tales como el de Dumas para obtener

resultados mas satisfactorios comparado con el método de Kjeldahl.

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9. BIBLIOGRAFIALibros

1- Métodos de análisis para la determinación de nitrógeno y constituyentes nitrogenados en alimentos. Capitulo 15. Manual of food quality control. FAO

2- Química cuantitativa. Glenn H.Brown. Editorial Reverte. pagina 221

Paginas web

3- García Martínez, Eva. Determinación de proteínas de un alimento por el método Kjeldahl. Valoración con un ácido fuerte. Universidad Politècnica de València. Disponible en: http://riunet.upv.es/

4- Francisco Santiago. Engineering Department J.P Selecta.. Determinación de proteínas de un alimento por el método Kjeldah. Disponible en: http://www.grupo-selecta.com/

5- Los efectos terapéuticos del consumo de la hoja de coca. Joep Oomen. 2012.Disponible en /www.amigoshojadecoca.org

6- Cultivo de sacha inchi. Instituto nacional de investigación y extensión agraria.Autor:Ing. Emma Manco Céspedes. 2006. Disponible en: http://www.incainchi.es/pdf/1358.pdf

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