efectos d la proteina bcl2

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PROYECTO DE INVESTIGACIÓN EFECTOS DE LA PROTEÍNA bcl-2 SOBRE LOS PARÁMETROS DE ENVEJECIMIENTO CELULAR EN FIBROBLASTOS DE PULMÓN DE RATONES VIEJOS. ALUMNA: RIVERA MARTÍNEZ LIDIA PAOLA ASESOR: MINA KONIGSBERG FAINSTEIN. 2003-I

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Page 1: Efectos d La Proteina Bcl2

PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

EFECTOS DE LA PROTEÍNA bcl-2 SOBRE LOS PARÁMETROS

DE ENVEJECIMIENTO CELULAR EN FIBROBLASTOS DE

PULMÓN DE RATONES VIEJOS.

ALUMNA: RIVERA MARTÍNEZ LIDIA PAOLA

ASESOR: MINA KONIGSBERG FAINSTEIN.

2003-I

Page 2: Efectos d La Proteina Bcl2

2

INDICE1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………..3

1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR………………………………………………..3

1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA…….…..4

1.3 LA PROTEÍNA Bcl-2…………………………………….……………………….6

1.4 CONTENIDO DE LA PROTEÍNA Bcl-2 EN LOS

ORGANISMOS ENVEJECIDOS……………………………………………….8

2. JUSTIFICACIÓN…………………………………………………………………....9

3. HIPÓTESIS…………………………………………………………………………..9

4. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………..9

4.1OBJETIVOS PARTICULARES…………………………………………………..10

5. METODOLOGÍA………………………………………………..…………………..11

5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO…………………..…………………11

5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTEÍNA Bcl-2………………………………12

5.3 OBTENCION DE LOS PLÁSMIDOS…………………………………………..13

5.4 CO-TRANSFECCIÓN…………………………………………………………….18

5.5 NFECCIÓN…………………………………………………………………………20

6. SEMBRADO DE CÉLULAS PARA LAS DETERMINACIONES

A LO LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO…………………………………….21

7. PARÁMETROS DE ENVEJECIMIENTO……………………………………….23

7.1 PROLIFERACIÓN CELULAR…………………………………………………..23

7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR………………………………………………….23

7.3 CUANTIFICACIÓN DE LA SENESCENCIA EN LAS CÉLULAS

DE CULTIVO PRIMARIO………………………………………………………24

8. RESULTADOS………………………………………………………………………26

9. DISCUSION Y CONCLUSION……………………………………………………33

10. REFERENCIAS……………………………………………………………………36

11. AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………….38

Page 3: Efectos d La Proteina Bcl2

3

Efecto de la proteína Bcl2 sobre los parámetros de

envejecimiento celular en cultivos primarios de fibroblastos

de pulmón de ratones viejos.

1. INTRODUCCIÓN

1.1 ENVEJECIMIENTO CELULAR

El proceso de envejecimiento es un fenómeno biológico complejo e

inevitable, que se relaciona con la pérdida o el decaimiento de varias

funciones bioquímicas, estructurales y fisiológicas del organismo que

conducen a la morbilidad y a la mortalidad. (Kirkwood, 1989).

Existen varias hipótesis que tratan de explicar el envejecimiento, sin

embargo, ninguna de ellas explica todas las causas del fenómeno. Al

parecer el envejecimiento es un proceso multifactorial controlado por una

combinación de factores genéticos y ambientales. Por ejemplo, las

hipótesis moleculares proponen que la duración de la vida de cualquier

especie está gobernada por genes que interactúan con los factores

ambientales. Las hipótesis sistémicas atribuyen el envejecimiento de todo

un organismo, al decremento de la función de un sistema clave, como

puede ser el nervioso, el endócrino o el inmunológico. Las teorías celulares

del envejecimiento, relacionan los cambios en la estructura y en la función

de las células al paso del tiempo, bajo la influencia de factores

ambientales. (Timiras, 1997).

En 1956, Harman propuso la hipótesis del envejecimiento por radicales

libres, basada en el deterioro celular, la cual dice que el envejecimiento

resulta de los efectos nocivos generados por los radicales libres que se

producen en el curso del metabolismo celular normal y que son acumulados

a lo largo de toda la vida de un organismo .

Los radicales libres son moléculas que tienen uno o más electrones

desapareados y se producen continuamente en el metabolismo aeróbico de

Page 4: Efectos d La Proteina Bcl2

4

manera normal, o de manera exógena por la radiación ionizante y

sustancias químicas. Los radicales libres pueden dañar las células a

diferentes niveles (ADN, proteínas, membranas, etc.). Sin embargo, existen

mecanismos de defensa en las células ante el daño que ellos producen.

Tales mecanismos constan de moléculas antioxidantes y/o atrapadores de

radicales libres.

De acuerdo con la hipótesis de Harman, las células que provienen de

animales viejos deben haber acumulado mayor daño al ADN en

comparación con las células provenientes de animales jóvenes. En la

actualidad esta hipótesis es aceptada y apoyada por una gran cantidad de

científicos, ya que explica muchos de los cambios degenerativos asociados

con el envejecimiento (Melov, 2000), y cuenta con evidencia experimental.

(Liu, et. al., 1999).

1.2 PROLIFERACION CELULAR Y SENESCENCIA REPLICATIVA

Hasta la mitad del siglo pasado se pensó que las células en cultivo se

dividían indefinidamente si las condiciones del medio permanecían

optimas (Carrel, 1912). Sin embargo, los experimentos realizados por

Hayfilck y Moorehead en 1961, trabajando con fibroblastos humanos,

demostraron que después de un número finito de divisiones celulares, las

células dejan de dividirse y entran en una fase que se conoce como

senescencia replicativa. En 1995 se tuvo la primera evidencia directa de

la existencia de células senescentes in vivo en dermis de humano,

utilizando un ensayo histoquímico para -galactosidasa (Dimri, et al.

1995). La característica primordial de este estado, es que cesa totalmente

la proliferación celular, aún ante estímulos mitogénicos. Sin embargo, las

células se mantienen metabolitamente activas y detenidas de manera

irreversible en la fase G0 o G1 del ciclo celular (Lunderberg, et al.2000;

Chen, et al. 2000). Las células senescentes muestran cambios selectivos

en la expresión génica. Este cambio les da un fenotipo alterado que es

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5

dependiente del tipo celular (Campisi, 1997). Cabe aclarar que la

senescencia sólo se observa en organismos pluricelulares y en células que

tienen potencial para el recambio (Faragher et al. 2000). Por el aumento de

las células senescentes encontradas al final de la vida de los cultivos,

Hayflick propuso que la senescencia puede contribuir al envejecimiento en

el organismo. Para tratar de explicar la existencia de las células

senescentes, se ha sugerido un mecanismo de antagonismo pleiotrópico

(un efecto que proporciona un beneficio a corto plazo y un daño a más

largo plazo) (Campisi, 1997), que dice que la aparición lenta de estas

células desde el inicio de la vida, protege al organismo de desarrollar un

cáncer u otra alteración. Al incrementarse la edad del organismo, aumenta

la presencia de las células senescentes, esto modifica el microambiente

celular y por tanto la función de las células no senescentes. Este estado

alterado puede contribuir al envejecimiento y al desarrollo del cáncer.

Se ha propuesto que la senescencia replicativa pueda deberse, a que en

cada duplicación celular los telómeros se van acortando y ello da lugar a

que exista una señalización celular que indique el cese en la duplicación

(Hayflick, 1977). Se han estudiado muchos tipos celulares de diferentes

especies de animales y se ha determinado el límite replicativo en cada

caso. Así mismo, se ha reportado que in vivo, el fenómeno de senescencia

replicativa se lleva a cabo de una manera similar a la que se describió para

los cultivos primarios, por lo que se piensa que en un tejido in vivo pueden

convivir células senescentes y presenescentes al mismo tiempo (Campisi,

1997).

Se ha demostrado que algunas enzimas dependientes del ciclo celular,

como por ejemplo las proteínas p21, p16 y p53 entre otras, muestran

actividades disminuidas o sobre reguladas (Chen et al., 2000). Esto podría

estar relacionado con el hecho de que al entrar en senescencia, las células

se quedan detenidas en la fase G1 del ciclo celular (Lundberg et al., 2000).

Se ha sugerido que la senescencia de las células normales puede

contribuir al envejecimiento en el organismo in vivo (Hayflick, 1997),

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6

debido a que el fenómeno de envejecimiento involucra una serie de

procesos que incluyen factores internos y externos que dañan a la célula, y

esta como respuesta a dichos daños puede entrar en senescencia. Esto

último, es un proceso inevitable en los seres vivos, ya que existe una

disminución en las funciones fisiológicas que conducen a la muerte

(Kirkwood, 1989). El hecho de que las células senescentes tengan sus

funciones alteradas conduce a un deterioro gradual que se relaciona con el

envejecimiento.

1.3 LA PROTEÍNA Bcl-2

La proteína Bcl-2, se identifica como una proteína reguladora de la

apoptosis (muerte celular programada). Se ha observado que cuando

forma homodímeros presenta función antiapoptótica, mientras que cuando

forma heterodímeros con la proteína proapoptótica Bax, promueve la

apoptosis (Reed, 1997).

La proteína Bcl-2 fue descubierta en linfomas de células B en folículo

humano, en la translocación intercromosomal t (14 y 18) que yuxtapone el

de gen bcl-2 con el locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina (Ig)

(Warner, et al. 1997), (McDonell, et al. 1989). Tiene un peso molecular de

26 KDa, 205 aminoácidos (Bcl-2b) o 239 aminoácidos (Bcl-2a), y su

extremo amino terminal es hidrofóbico por lo que se encuentra anclada en

la membrana mitocondrial, nuclear y del retículo endoplásmico (Bakhshi

et al. 1985), con orientación hacia el citosol (Hockenbery, 1993).

Además de su papel antiapóptico, se sabe que protege ante el estrés

oxidativo, aunque el mecanismo por el cual lo hace no es bien conocido. Se

ha propuesto que su efecto sea prooxidante, antioxidante y/o de

reparación.

Existen varios investigadores que se han encargado del estudio de esta

proteína, aunque aún hay controversias al respecto. Por mencionar a

Page 7: Efectos d La Proteina Bcl2

7

algunos, tenemos que en el año de 1993, Hockenbery reporto un papel

regulador para Bcl-2 en la vía antioxidante en los sitios donde son

generadas las especies reactivas de oxígeno (ERO) (Hockenbery, 1993). En

ese mismo año, Kane, propuso que el producto del protooncogene bcl-2,

fuera una molécula antiapoptótica, ya que observó una reducción en la

producción de los intermediarios reactivos de oxígeno (Kane, et. al. 1993).

Sin embargo, Steinman en el mismo año, estudiando células B en una

línea murina de cultivos transfectados con bcl-2, encontró que existía

generación de especies reactivas de oxígeno que inducían una respuesta

antioxidante por lo que él propuso que la función de Bcl-2 fuera

prooxidante (Steinman, 1993).

La función antioxidante de Bcl-2 fue apoyada por Myers en 1995, ya que

observó que confería protección a cultivos de células neuronales en

cuanto a la lipoperoxidación membranas plasmáticas (Myers, et. al. 1995).

Un año después, Richter en 1996 propuso, que Bcl-2 podría ser un vínculo

entre el sistema de defensa antioxidante, el Ca2+ y el potencial de

membrana (Richter et. al; 1996). En 1997 Longo publicó datos que

apoyaban la actividad antioxidante de Bcl-2, ya que reportaban un

aumento en la enzima catalasa en Saccharomyces cerevisiae, cuando se

sobreexpresaba bcl-2 (Longo et. al., 1997). En 1998 Hochman, trabajando

con animales knockout de bcl-2 encontró que en el cerebro de este tipo de

ratones, había proteínas oxidadas en mayor proporción que en animales

que podían expresar esta proteína, por lo que sus resultados mostraron

una elevación en el estrés oxidativo y niveles alterados de antioxidantes,

sugiriendo que Bcl-2 incrementa la producción de ERO (Hochman et. al.,

1998). En 1999, se puso en auge la investigación de dicha proteína, por lo

que Degli reportó resultados que sugerían que Bcl-2 incrementa las

defensas antioxidantes y neutraliza la sobreproducción de moléculas que

estimulan la muerte celular como TNF-α o ceramida (Degli, 1999). Por su

parte, Esteve observó que Bcl-2 inhibía la apoptosis en ausencia de

productos reactivos de oxígeno lo que indica multifuncionalidad de esta

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8

molécula (Esteve, et. al; 1999). Por último, Deng reporto que Bcl-2 está

también involucrado en la regulación de la expresión o función de enzimas

de reparación, además que poder evitar rompimientos de las hebras del

ADN (Deng, et. al; 1999).

Todo lo anterior demuestra que aún no se tiene claro el mecanismo de

acción de Bcl-2, por lo que es importante entender la relación entre

envejecimiento y apoptosis. El conocer los mecanismos del daño oxidativo

al ADN y la participación antioxidativa de Bcl-2, son críticos para la

comprensión de los mecanismos involucrados en las enfermedades

asociadas con el envejecimiento celular, como son las enfermedades

neurodegenerativas de Parkinson, Huntintong, esclerosis lateral,

Alzheimer, enfermedades cardiovasculares como la ateroesclerosis,

disminución del sistema inmune (por la muerte de linfocitos T), cáncer,

etc. (Warner, et al, 1997). Por lo que es importante encontrar un

tratamiento para tales enfermedades, debido a que son poco conocidos los

mecanismos por los cuales la proteína Bcl-2 protege al ADN y su relación

con el envejecimiento celular.

1.4 CONTENIDO DE LA PROTEÍNA Bcl-2 EN LOS ORGANISMOS

ENVEJECIDOS

Se han realizado pocos estudios para determinar la presencia de la

proteína Bcl-2 en tejidos de mamíferos. En 1994 Migheli y colaboradores

reportaron un aumento en la expresión de la proteína Bcl-2 en cerebros

envejecidos de rata, y propusieron que el incremento puede ser el reflejo de

un mecanismo de protección contra las ERO. (Migheli, 1994)

En otros estudios, se compararon linfocitos humanos de individuos

jóvenes (menos de 35 años) y de individuos viejos (más de 60 años) y se

encontró una correlación entre el aumento en la expresión de Bcl-2 y la

edad avanzada del paciente (Schindowski et al. 2000).

Page 9: Efectos d La Proteina Bcl2

9

En trabajos previos del laboratorio se ha encontrado que Bcl-2 aumenta

con la edad en pulmón de ratón de la cepa CD1.

2. JUSTIFICACIÓN

El poder emplear el modelo in vitro de cultivo primario de fibroblastos de

ratón proporciona una herramienta útil que permite obtener información

valiosa permitiendo tener conocimiento sobre los mecanismos del

envejecimiento y la relación de este con la senescencia celular así como el

comportamiento de los mismos mediante la sobreexpresión de la proteína

Bcl-2. Estos conocimientos permitirán una mejor comprensión para

desarrollar tratamientos específicos en las enfermedades relacionadas al

envejecimiento e incluso el cáncer, debido a que el fenómeno de

senescencia es considerado como un mecanismo para la supresión de

tumores (Campisi, 1997).

3. HIPÓTESIS

Si la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 retrasa la entrada a la

senescencia en las células de cultivo primario, se espera encontrar

un aumento en la funcionalidad y proliferación de dichas células en

comparación con las que no sobreexpresen Bcl-2.

4. Objetivo General.

v Determinar el efecto de la sobre-expresión de la proteína Bcl2 sobre

los parámetros de envejecimiento celular en fibroblastos de pulmón

de ratones viejos.

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4.1 Objetivos Particulares.

v Realizar cultivos primarios de pulmones de ratones viejos de la cepa

CD1.

v Preparar partículas que contengan la información para

sobreexpresar bcl2, mediante la técnica de cotransfección de fosfato

de Ca2+ de los plásmidos PCLNRX-GFPN, PCLNRX-GFPN-Bcl2 y pcl-

Eco a células empaquetadoras 293 T.

v Infectar los cultivos primarios con las partículas virales para que

sobre-expresen bcl2.

v Determinar microscópicamente la presencia del plásmido infectado,

gracias a la fluorescencia de la proteína reportera GFP.

v Cuantificar la presencia de la enzima -galacatosidasa como

parámetro de senescencia.

v Cuantificar la funcionalidad mitocondrial de las células infectadas y

control, mediante la técnica de MTT.

v Medir la proliferación de las células infectadas y control.

Page 11: Efectos d La Proteina Bcl2

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5. METODOLOGÍA

5.1 OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO

Para este estudio, se utilizó como modelo experimental el cultivo primario

de fibroblastos de pulmón de ratón, que se ha reportado como un modelo

adecuado para el estudio de dicho fenómeno (Campisi, 2000).

Primeramente se establecieron los cultivos primarios, para lo cual se

utilizaron ratones hembras de pie de cría provenientes de la cepa CD-1 de

12 meses de edad. Los animales mostraban un fenotipo envejecido como lo

es la falta de tono muscular, caída de pelo, acumulación de grasa y en

alguno de ellos, la aparición de tumores.

1. Todos los ratones fueron sacrificados mediante dislocación médulo-

encefálica.

2. Los pulmones se extrajeron mediante incisión toráxica.

3. El de pulmón se colocó en cajas Petri estériles que contenían 25ml

de PBS que es una solución amortiguadora libre de fosfatos

(Sigma), con 1% de antibiótico antimicótico (Gibco).

4. El tejido se lavó 2 veces con la solución anterior, aspirando el PBS

con una jeringa para evitar la perdida del tejido. Se disgregó el

tejido con un bisturí y unas pinzas, lo más finamente posible.

5. Se quito el PBS y se agregaron 5ml de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma)

y se metió a la incubadora por 10min, a 37° C.

6. La tripsina fue aspirada con una jeringa. Se lavó 2 veces más el

tejido con la solución de PBS y aspirando el PBS con una jeringa,

para evitar la perdida de tejido.

7. Los fragmentos del tejido se transfirieron a tubos Falcon que

contenían 7ml de colagenasa 1.A (Sigma) al 0.03% en Medio

Esencial Mínimo modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma) sin

suero fetal bovino (SFB).

8. Los tubos se colocaron en la incubadora a 37° C durante 60 min.

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12

9. Pasado ese tiempo, se le agregó a cada tubo 30ml de DMEM

suplementado con 15% de suero fetal bovino inactivado (SFB)

(Hyclone).

10. La suspensión se homogenizó vigorosamente utilizando una pipeta

de vidrio.

11. La suspensión celular se distribuyó homogéneamente en cajas

Petri de 60mm de diámetro.

12. El establecimiento de las primeras células (cuando éstas

permanecieron viables y adheridas al sustrato), fue entre 4 y 6 días

después de la obtención del cultivo.

13. Los cultivos se mantuvieron en una atmósfera con 5% de CO2 y

90% de humedad a 37° C de temperatura.

14. El medio se cambió cada 3 o 4 días, durante el tiempo de vida del

cultivo.

5.2 SOBREEXPRESION DE LA PROTEÍNA Bcl-2

Para lograr la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 en los cultivos primarios

de fibroblastos de pulmón de ratón, se utilizó un vector retroviral, se

introdujo un gen no viral (bcl-2) y el gen de una proteína fluorescente (gfp),

que permite observar la inserción del gen en nuestros cultivos.

Para ello, primero se amplificaron los plásmidos de interés, posteriormente

se realizó una cotransfección de dichos plásmidos en las células

empaquetadoras 293T. A partir de las cuales se obtuvieron las partículas

virales para infectar a los cultivos primarios.

Page 13: Efectos d La Proteina Bcl2

13

5.3 OBTENCION DE LOS PLÁSMIDOS

Se amplificaron 3 plásmidos: PCLNRX-GFPN, que contiene la información

para la proteína verde fluorescente (GFP); PCLNRX-GFPN-Bcl2, que

además de contener a la proteína GFP, también contenía el gen que

codifica para la proteína Bcl-2; y el plásmido pclEco que contiene la

información estructural para la cápside del virus.

1. Transformación:

Se transformaron bacterias E.coli de la cepa Mn522 y DH5 con los

plásmidos antes mencionados.

La inserción del plásmido en las bacterias se logró a través de choque

térmico.

1. Para ello se prendió el baño a 42° C.

2. Se prepararon 2 tubos falcon de 15ml estériles con 20 µl de agua

estéril, se agregó 1 l de plásmido.

3. Las bacterias fueron resuspendidas con cuidado y se agregó 100µl

de bacterias a cada tubo y se resuspendió todo, esta mezcla fue

incubada en hielo por 10 minutos.

4. Posteriormente se mantuvieron a 42° C de 30 a 60 segundos.

5. Pasado ese tiempo se adiciono 1ml de medio LB sin bactoagar (medio

LB: 1L de agua, 10g de triptona, 5g de NaCl, 5g de extracto de

levadura y 1ml de NaOH 1N), para hacer crecer las bacterias, en

agitación a 37° C durante 1 o 2 horas.

6. Se prepararon dos placas de medio LB con bactoagar, (medio LB con

bactoagar: 1L de agua, 15g de bactoagar, 10g de triptona, 5g de

NaCl, 5g de extracto de levadura y 1ml de NaOH 1N una que

contenía ampicilina (200-250 µg/ml) y otra con las mismas

características pero sin ampicilina que nos sirvió como control, ya

Page 14: Efectos d La Proteina Bcl2

14

que las bacterias que introducen el plásmido adquieren resistencia

a la ampicilina.

7. Una vez solidificado el bactoagar, en esterilidad con un mechero,

fueron sembradas las bacterias en una dilución 1:100, en LB sin

bactoagar de manera que se generaran colonias discretas. Para ello

se dejaron incubar por 12 horas a 37° C y posteriormente se

pasaron a refrigeración.

8. Ya obtenidas las colonias, se inoculo una colonia bacteriana

transformada en 3ml de medio LB suplementado con ampicilina

(100µl/ml).

9. Se dejó crecer el cultivo durante toda la noche a 37° C en agitación

constante.

A partir de aquí se prosiguió a realizar la técnica de lisis alcalina para

obtener el plásmido.

2. Purificación del ADN plasmídico por lisis alcalina con SDS:

Se utilizo la técnica de lisis alcalina en combinación con el detergente SDS,

para aislar el ADN plasmídico de E.coli (Sambrook, 2001). Se expuso la

suspensión bacteriana a un detergente aniónico con un pH alto que abre

la pared celular, desnaturalizando el ADN cromosomal y las proteínas,

permitiendo la salida del ADN plasmídico hacia el sobrenadante. La

solución alcalina rompe completamente la unión entre los pares de bases

del ADN genómico, sin embargo, las hebras del ADN plasmídico por ser

circular no se alteran ya que estas se encuentran topológicamente

entrelazadas.

Soluciones:

2ml de la solución GTE: 50mM glucosa, 25mM Tris-HCl, pH 8.0, 10mM

EDTA, pH 8.0

10ml de solución TE: 10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA, pH 8.0

Page 15: Efectos d La Proteina Bcl2

15

2ml de solución NaOH/SDS: 0.2N NaOH, 1% SDS

1. Se tomaron 1.5ml del cultivo bacteriano en un tubo Eppendorf

estéril de 1.5ml.

2. Se centrifugó a 14,000rpm por 20 seg. en una microcentrífuga

marca eppendorf a temperatura ambiente.

3. El sobrenadante se decanto y el pellet se resuspendió en 100µl de

la solución GTE.

4. Se agregaron 200µl de una solución recién preparada de

NaOH/SDS y se mezclo por inversión.

5. Se paso a hielo frape durante 5 minutos y se agregaron 200µl de

acetato de sodio 5M, pH 8.0, manteniéndolo en hielo 5 minutos,

formándose un precipitado denso.

6. Se agito en vortex 2 segundos y se regreso al hielo 5 minutos.

7. El tubo fue centrifugado a 14,000 rpm durante 3 minutos a TA.

8. El sobrenadante fue recuperado en un tubo nuevo y se agregaron

0.8ml de etanol absoluto, agitándolo por inversión.

9. Se mantuvo a -70° C por 10 minutos.

10. Se centrifugó a 14,000 rpm por 10 minutos a TA.

11. El sobrenadante se decanto y el pellet fue lavado con 1ml de etanol

al 70%.

12. Se centrifugó a 14,000 rpm por 5 minutos a TA.

13. El sobrenadante se decanto y se resuspendió el pellet en 30µl de

TE, pH 8.0

14. Se cuantificó la concentración de ADN obtenido por

espectrofotometría (absorbancia 260-280nm), utilizando 2µl del

plásmido y 298 µl de H2O.

15. El plásmido se guardó a -20° C.

Otra forma de cuantificar el plásmido fue corriendo una electroforesis en

un gel de agrosa al 0.8% y 2µl de bromuro de etidio, esto es también para

Page 16: Efectos d La Proteina Bcl2

16

asegurar que fuera el plásmido de nuestro interés. Para ello se digirió el

plásmido con las enzimas de restricción con que fue manipulado

anteriormente.

1. Se preparó una cámara de electroforesis con un gel de agarosa al

0.8%, en donde se pusieron 0.2gr de agarosa y se le adicionaron

25ml de TBE 0.5X (para un litro de TBE 5X: 0.5 M ácido bórico

30.9g/l, PM 61.8; 0.5M Tris base 60.5g/l, PM 121.1 y 10mM EDTA

3.73g/l, PM 372.2).

2. Se disolvió la agarosa calentando en un horno de microondas

aproximadamente 40 segundos, y se le agregaron 2µl de bromuro

de etidio, se dejo enfriar la agarosa hasta que se soporto la

temperatura al toque con la palma de la mano y se vació en el

contenedor del gel.

3. Se agregó la solución de TBE 0.5X a la cámara, en suficiente

cantidad hasta que se cubrió el gel.

4. En seguida se prepararon las muestras de los plásmidos de la

siguiente manera.

5. Para Bcl-2 en el tubo 1(plásmido digerido): se tomaron 2µl del

plásmido de Bcl-2, se agregó 1µl de la enzima EcoRI, 1µl de buffer

H y 6µl de agua, para llevarlo a 10 µl.

6. El tubo 2 (plásmido sin digerir): se agregó 2 µl del plásmido de Bcl-

2, se agregó 1µl de buffer H y 7µl de agua, para llevarlo a 10 µl.

7. EL tubo 3 (plásmido sin digerir): se agregó 2 µl del plásmido de Bcl-

2 y 8µl de agua, para llevarlo a 10µl.

8. Para GFP en el tubo 1(plásmido digerido I): se agregó 2µl del

plásmido de Gfp, con 1µl de la enzima Cla-I, 1µl de buffer 1 y 6µl de

agua.

Page 17: Efectos d La Proteina Bcl2

17

9. Para el tubo 2 (plásmido digerido II): se agregó 2µl del plásmido de

Gfp, con 1µl de la enzima Xho-I, 1µl de buffer 2 y 6µl de agua.

10. Para el tubo 3 (plásmido digerido): se agregó 2µl del plásmido de

Gfp, con 1µl de la enzima Cla-I, 1µl de buffer 1, 1µl de la enzima

Xho-I, y 5µl de agua.

11. Para el tubo 4 (plásmido sin digerir): se agregó 2µl del plásmido de

Gfp y 8µl de agua.

12. Para pclEco en el tubo 1 (plásmido digerido): se agregó 2µl del

plásmido de pclEco, con 1µl de la enzima XBa-I, 1µl de buffer H y

6µl de agua.

13. Para el tubo 2 (plásmido sin digerir): se agregó 2µl del plásmido de

pclEco, 1µl de buffer H y 7µl de agua.

14. Para el tubo 3 (plásmido sin digerir): se agregó 2µl del plásmido de

pclEco y 8µl de agua.

15. Se usó un marcador de peso molecular llamado λ Hind III

agregando 3µl de este más 3µl de agua y 1µl de LB-ADN que es la

solución de carga para ADN (para 10ml de 6X LB-ADN: 0.25% azul

de bromofenol, PM 691.9; 0.25% xilen cianol FF, PM 538.6 y

glicerol PM 92.09; densidad 92.09).

16. Ya preparado cada tubo de los plásmidos se incubaron a 37° C por

1 hora, esto es para activar la enzima, posteriormente para detener

la reacción se calentaron a 95° C por 5 minutos, en seguida se

metió a enfriar a 4° C por 5 minutos, para desactivar la enzima.

17. Posteriormente se tomaron 5µl de cada tubo y se le agregó 1µl de

LB-DNA, cada muestra se deposito en el gel y se corrió a 100V

aproximadamente 45 min.

Page 18: Efectos d La Proteina Bcl2

18

18. Hecha la cuantificación se purificó el plásmido a través de filtros

estériles de 0.22 m de la marca Milliport y entonces se obtuvo el

plásmido puro y estéril para continuar con la transfección del

mismo.

5.4 CO-TRANSFECCIÓN

Los plásmidos fueron introducidos en células empaquetadoras (293-T) a

través de la técnica de fosfato de calcio. Esta técnica permite que la

permeabilidad de la membrana cambie y así se introduzca el plásmido.

Cabe mencionar que fueron insertados dos plásmidos en las células 293 T,

gfp-bcl-2 y el plásmido pclEco. Como control se hizo otro tipo de

cotransfección en la que se usó el plásmido gfp sin bcl-2 y pclEco.

1. Un día antes se sembraron 10 pozos en placas de 6 con 400,000

células de 293T en cada uno.

2. 4 horas antes de la co-transfección se cambio el medio a las células

por medio nuevo sin antibac (DMEM más 15% de SFB).

3. Se preparo solución del kit Calcium phosphate transfection system

(GIBCO BRL) de la técnica de fosfato de calcio para 10 pozos, los

cuales se hicieron para 4 pozos de gfp, 4 pozos para bcl-2 y 2 pozos

control.

4. La solución se hizo con 880µl de agua, 100µl de HSB 10 X y se

vortexeo, más 15 µl de NaOH dando vortex, más 20µl de fosfatos,

volviendo a dar vortex.

5. Ya lista la solución se prepararon 3 tubos 1, de los cuales un tubo

fue para bcl-2 con 400µl de la solución, otro fue para gfp con 400µl

de la solución y el último tubo para el control con 200µl de la

solución.

6. En seguida se prepararon 3 tubos 2, de los cuales uno era para bcl-

2 al que se le agregó 343.2µl de agua, 0.4µl de ADN acarreador,

Page 19: Efectos d La Proteina Bcl2

19

40µl de ADN plasmídico de bcl-2 y 57.12µl de pclEco. (que

corresponde a 5ng de ADN plasmídico para cada uno).

7. Para el tubo 2 de gfp, se agregó 343.2µl de agua, 0.4µl de ADN

acarreador, 57.12µl de ADN plasmídico de gfp y 57.12µl de pclEco.

(que corresponde a 5ng de ADN plasmídico para cada uno).

8. Para el tubo 2 del control, se agregó 2µl de Ca2+ resuspendiendo 5

veces, agregándole 10µl de Ca2+ resuspendiendo nuevamente.

9. Al tubo 2 de bcl-2 se le agregaron 4µl de Ca2+, resuspendiendo 5

veces, mas 20µl de Ca2+, resuspendiendo nuevamente.

10. Al tubo 2 de gfp se le agregaron 4µl de Ca2+, resuspendiendo 5

veces, mas 20µl de Ca2+, resuspendiendo nuevamente.

11. Después cada tubo 1 fue burbujeado con una pipeta pasteur y

goteando con su respectivo tubo 2 lentamente.

12. Para que precipitara se dejo 20 minutos a temperatura ambiente.

13. A 4 pozos se le agrego 185µl de bcl-2, a otros 4 pozos se le agregó

185µl de gfp y a un pozo 185µl de control.

14. Al día siguiente se cambio el medio de cada pozo.

15. A las 48 horas se recogieron las partículas, tomando el

sobrenadante el cual fue centrifugado a 3,000rpm por 5 min. A

temperatura ambiente, de ahí se congelo el sobrenadante a -70° C.

Con ello se obtuvieron en el medio de cultivo los retrovirus conteniendo

los genes de interés, el cual fue recolectado y almacenado a una

temperatura de –70° C para su uso posterior en el cultivo primario.

Page 20: Efectos d La Proteina Bcl2

20

5.5 INFECCIÓN

Una vez establecido el cultivo primario de fibroblastos de pulmón de ratón,

se procedió a realizar la infección de estas células con las partículas virales

obtenidas. Para tener mejores resultados en cuanto a la inserción del

plásmido fue necesario cambiar el medio de cultivo de los pozos 24 hrs.,

antes de realizar la infección.

Se seleccionaron los pozos correspondientes para cada tratamiento, Bcl-2,

GFP y control. Se consideró un volumen total de 1ml para cada pozo, por

lo que se adicionaron 500µl de medio con Polibrent en una concentración

de 2µl/ml de medio y 500µl de partículas virales para las células que

sobreexpresarían la proteína Bcl-2, de igual forma para las células

específicas de GFP (500 µl de medio con polibrent y 500 µl de partículas

virales con el plásmido para la proteína verde fluorescente) y por último a

las células control se les adicionaron 500µl de medio con polibrent y 500µl

de medio. Cabe señalar que el medio utilizado no contenía antibiótico para

asegurar la infección y no estresar más a las células.

Una vez realizada la infección, las células fueron incubadas durante 24

hrs. Pasado este tiempo se retiró el tratamiento y se adicionó nuevamente

medio de cultivo con todos los requerimientos (DMEM más suero fetal

bovino 15%, aminoácidos no esenciales y antibac). Se dejaron incubar

durante 5 días en las mismas condiciones para poder asegurar la

expresión de los genes introducidos en las células. Una vez transcurrido

ese tiempo se prosiguió a realizar los ensayos para determinar los

parámetros de envejecimiento de los fibroblastos tales como: proliferación

celular, senescencia asociada a la enzima β-galactosidasa (SA-β-gal) y

funcionalidad celular.

Para corroborar que el plásmido que contenía los genes bcl-2 y gfp se

encontraban dentro de las células, fueron sembradas 40,000 células de

cada uno de los tratamientos (control, gfp y bcl-2) en laminillas que fueron

Page 21: Efectos d La Proteina Bcl2

21

observadas al microscopio de fluorescencia debido a que las células

infectadas debían fluorescer por la presencia de la proteína GFP, en

comparación con las células control tratadas únicamente con polibrent.

6. SEMBRADO DE CÉLULAS PARA LAS DETERMINACIONES A LO

LARGO DEL TIEMPO DE CULTIVO.

Para los ensayos de proliferación celular, funcionalidad celular y SA- -

galactosidasa, se sembraron aproximadamente 5000 células/pozo en

placas de 48 pozos. Todos los experimentos se realizaron por triplicado y

en al menos 3 experimentos independientes.

1. Después de 5 ó 6 días de realizados los cultivos primarios, las

células se lavaron cuidadosamente con PBS.

2. Se despegaron agregando 0.3ml de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma)

para cada caja petri.

3. Las células se contaron utilizando un hemocitómetro.

4. Se repartieron aproximadamente 5000cels/pozo en placas de 48

pozos para todos los días del experimento.

5. Se realizaron las determinaciones correspondientes cada tercer día.

Page 22: Efectos d La Proteina Bcl2

22

Células control 40 x

Células GFP 40 x EPIFLUORESCENCIA

Células BCL-2 40 x EIPIFLUORESCENCIA

Page 23: Efectos d La Proteina Bcl2

23

7. PARÁMETROS DE ENVEJECIMIENTO.

7.1 PROLIFERACIÓN CELULAR

La proliferación celular se determinó contando células vivas a lo largo del

tiempo de vida de los cultivos, utilizando azul tripano que es un colorante

vital que es excluido activamente de las células vivas. En las células

muertas, el colorante difunde fácilmente hacia el citoplasma (Doyle, et al;

1994). Esta técnica evita contar falsos positivos.

Técnica para determinar la proliferación y la viabilidad celular

1. Las células se lavaron con PBS una vez y se despegaron con 200 l

de tripsina-EDTA 0.25% (Sigma).

2. Para inactivar la enzima se agregaron 200 l de DMEM + Suero de

ternera al 10%.

3. Se tomó una alícuota de 20 l de suspensión celular y 20 l de azul

tripano y se homogenizaron.

4. De esta suspensión se tomaron 10 l y se contaron las células

utilizando un hemocitómetro y un microscopio óptico.

5. El resultado de x de los campos contados se multiplico por 2

(dilución) y ese resultado se multiplico por 1 x 104 células/ml.

7.2 FUNCIONALIDAD CELULAR

Para evaluar la funcionalidad celular, se cuantificó la actividad de la

enzima succinato deshidrogenasa mitocondrial mediante la técnica del 3-

(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil bromuro de tetrazolio (MTT) (Sigma).

Esta enzima participa en la transferencia de electrones en la cadena

respiratoria mitocondrial, reduciendo a la ubiquinona (Konigsberg, 1992).

La enzima que se encuentra en las células funcionales reduce el sustrato

MTT y como resultado se produce formazán de color azul, que se mide

espectrofotométricamente a 570nm (Mosman, 1983).

Page 24: Efectos d La Proteina Bcl2

24

Técnica de la funcionalidad celular (MTT)

1. A las células se les retiró el medio y se lavaron cuidadosamente con

PBS.

2. Se retiró el PBS y se agregó 1ml de solución MTT (Sigma) (0.5mg de

MTT/ml PBS) pH 7.5.

3. Las células se incubaron durante 3 horas a 37° C.

4. Se retiró el MTT y se lavaron las células cuidadosamente con PBS

una vez.

5. Se agregaron 800 l de solución de extracción (HCl 0.04 M en

isopropanol) a cada pozo.

6. Las placas de cultivo se colocaron sobre un plato de agitación

(Thermolyne AROS 160) durante 15 min. a temperatura ambiente

para disolver el formazán.

7. El contenido de cada pozo se depositó en celdas de vidrio para su

lectura a 570nm utilizando un espectrofotómetro (Beckman DU

640).

8. La funcionalidad se determinó normalizando los datos por célula (el

valor de MTT/número de células de la proliferación de ese día).

7.3 CUANTIFICACIÓN DE LA SENESCENCIA EN LAS CÉLULAS DE

CULTIVO PRIMARIO

Como marcador de senescencia se usó el ensayo de -galactosidasa

asociada a la senescencia (SA- -gal). La técnica consiste en la hidrólisis

del reactivo x-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactósido) por la

enzima -galactosidasa cuya presencia se encuentra considerablemente

aumentada en las células envejecidas o con senescencia replicativa. Tras

la reacción se produce un precipitado verde-azul (Dimri, 1995) que se

cuantifica contando las células teñidas con la ayuda de un microscopio

óptico.

Page 25: Efectos d La Proteina Bcl2

25

Técnica de ensayo SA- -gal

1. Se agregaron 300 l de solución fijadora (paraformaldehído 2%,

MgCl2 2mM, EGTA 1.35mM y Buffer piperazina-N, N’-bis (2-etanol-

ácido sulfónico)(PIPES) 0.1M provenientes de soluciones stock a pH

6.9 y pH 8, respectivamente) a cada pozo.

2. Las células se incubaron 1 hora a temperatura ambiente.

3. Pasado ese tiempo se retiró la solución y se lavaron 3 veces con

PBS.

4. Se agregaron 300 l de solución X-gal que contenía 5mM de

K3Fe(CN)6, 5mM de K3Fe(CN)63H2O, 2mM MgCl2 y 1mg/ml de X-gal

(PROMEGA) el pH ajustado a 6.

5. Las células se mantuvieron en incubación a 37°C durante toda la

noche.

6. Al siguiente día se contaron las células teñidas con ayuda de un

microscopio óptico.

Page 26: Efectos d La Proteina Bcl2

26

8. RESULTADOS

OBTENCION DEL CULTIVO PRIMARIO

La obtención de fibroblastos fue básica para la elaboración de la presente

investigación.

SOBREEXPRESION DE LA PROTEÍNA Bcl-2

En primer lugar, cabe aclarar que los plásmidos fueron donados por la

Dra. María del Carmen Aguayo del laboratorio del Dr. Luis Covarrubias.

Para aumentar la cantidad de los mismos fue necesario realizar su

amplificación, utilizando la técnica de lisis alcalina. Una vez aislados los

plásmidos se tomó una muestra de cada uno de ellos y se digirió con las

enzimas correspondientes para saber si el plásmido obtenido era el de

nuestro interés y así mismo cuantificarlo. Para ello se hizo una

electroforesis en gel de agrosa al 0.8 % como se muestra en la figura 1. En

el carril 1 se observa el marcador de peso molecular (λ Hind III); en el carril

3 se encuentra pclEco sin digerir, que es todo el plásmido, en el carril 4 se

muestra pclEco digerido con Xba, que es la enzima que ha cortado el

plásmido para poder identificar el peso molecular para el gen pclEco. El

carril 7 se muestra a gfp cortado con la enzima Xba I y Cla I para

identificar el peso molecular del gen gfp, por último en el carril 8 se

muestra el plásmido gfp sin digerir, por lo cual se puede observar todo el

ADN plasmídico.

Page 27: Efectos d La Proteina Bcl2

27

1 2 3 4 5 6 7 8

Fig. 1

Electroforesis en agarosa al 0.8 % para evidenciar a los plásmidos digeridos con diferentes enzimas

de restricción como aparece en el texto.

PARAMETROS DE ENVEJECIMIENTO

PROLIFERACIÓN CELULAR

En cuanto a la proliferación, en la gráfica 1 podemos observar que la curva

del cultivo control, presenta un periodo de establecimiento a partir del día

7 al 15, después de este y hasta el día 18 comienza a tener un crecimiento

exponencial, después se observa en el día 21 que las células entran en

senescencia y muerte, la que puede apreciarse al presentarse una fase

estacionaria, indicando el cese de la proliferación.

En la misma gráfica se muestra la curva del cultivo infectado con bcl-2,

donde se observa que del día 15 al 21 de cultivo las células presentan un

comportamiento de retardo de crecimiento en comparación con el control,

Page 28: Efectos d La Proteina Bcl2

28

para el día 21 entran en crecimiento exponencial hasta el día 23, para el

día 25 se ve una caída en la proliferación, en la cual las células han

entrado en senescencia.

Mientras para las células gfp que son el control de infección, se puede

observar que a partir del día 15 tienen una proliferación menor que las

infectadas con bcl-2 y a partir del día 21 entran en senescencia.

En cuanto a diferencias estadísticas para el día 15 no hubo diferencia en

cuanto a la proliferación entre el control, gfp y bcl-2. Para el día 18 se

muestra que si hubo diferencia del control con gfp, pero no se mostró

ninguna diferencia con bcl-2 esto indica que la diferencia que se observa

con el control está dada únicamente por la infección. Para el día 21, se

mostró una diferencia entre bcl-2 y gfp con el control, pero no hubo alguna

diferencia entre ellos.

En el día 24 el control muestra una diferencia de proliferación con el grupo

gfp, pero no así con el de bcl-2, aunque si hay diferencia estadística entre

las células infectadas.

En el día 28 tanto las infectadas con bcl-2 como con gfp presentan

diferencia estadística con el control y así mismo se muestra diferencia

entre ellos.

Page 29: Efectos d La Proteina Bcl2

29

PROLIFERACIÓN CELULAR

control

bcl2

gfp

*Diferencia estadística con las células que sobreexpresan gfpp<0.05

Diferencia estadística con el control

0

1

2

3

4

5

6

0 20

40Días de cultivo

Núm.decélulasx10 5

**

**

** **

**

{

{

{

Gráfica 1.

Page 30: Efectos d La Proteina Bcl2

30

FUNCIONALIDAD CELULAR

En la gráfica 2 se muestra la funcionalidad de las células. Estos datos

representan la absorbancia a 570nm por número de célula, además se

normalizaron con el control tomando al día 15 (inicio del experimento)

como el valor de 1.0.

No se observa una mejoría estadística en la funcionalidad de las células

que sobreexpresan bcl-2, pero tampoco un detrimento. Lo mismo ocurre

para las infectadas con gfp.

FUNCIONALIDAD CELULAR

00.5

11.5

22.5

33.5

4

0 5 10 15 20 25 30

Control

bcl2

gfp

Días de cultivo

NormalizadoDO/célula Gráfica 2. Funcionalidad celular por el ensayo

MTT.

Page 31: Efectos d La Proteina Bcl2

31

SENESCENCIA CELULAR

En la gráfica 3 se puede observar que para las células control el número

de células positivas a β-galactosidasa aumenta e manera constante a lo

largo del cultivo. Mientras que para las células infectadas con bcl-2 y gfp

se observa que a los mismos tiempos hay un mayor número de células

positivas a -galactosidasa. Esto es: para el día 15 ambos cultivos

infectados tienen 20% mas de células senescentes que el control para el

mismo día y para el día 18 las células que sobreexpresan gfp tienen 12%

más de células senescentes que el control y las que sobreexpresan bcl-2

tienen 32% mas células senescentes que el control, esta diferencia se

mantiene más o menos estable a lo largo del cultivo, sin embargo, para el

día 28 no hay diferencia con las control.

Al hacer la comparación estadística, se observa que en el día 15 hay una

diferencia significativa de p=0.08 entre las células senescentes que

sobreexpresan bcl-2 y gfp con el control. Mientras que para el día 18 solo

hay diferencia significativa de las que sobreexpresan bcl-2 con el control,

pero no de las que sobreexpresan gfp con el control. Para los días

siguientes no se presenta alguna diferencia entre el control y las células

infectadas.

Page 32: Efectos d La Proteina Bcl2

32

SENESCENCIA ASOCIADA A LA β-GALACTOSIDASA80

control

bcl2

gfp

*{ Diferencia estadística con las células que sobreexpresan gfp

p<0.05

Diferencia estadística con el control

010

203040

5060

70

0 10 20 30Días de cultivo

%decélulassenescente

**

*

*

Gráfica 3.

Page 33: Efectos d La Proteina Bcl2

33

9. DISCUSION Y CONCLUSION

Para iniciarla discusión me gustaría aclarar que el trabajar con ratones

viejos es difícil, puesto que en primer lugar hay que esperar a que

envejezcan. En segundo lugar, los cultivos de fibroblastos de pulmón de

ratón que se obtienen cuentan con pocas células, ya que están muy

dañadas y se mueren, además de que son muy susceptibles a

contaminarse.

Con respecto al manejo de los plásmidos y su amplificación, se obtuvieron

con éxito los plásmidos aislados para poder formar las partículas virales y

sebreexpresar las proteínas en los cultivos primarios.

En la gráfica 4 podemos apreciar el comportamiento que tienen las células

controles de cultivos primarios de fibroblastos de ratones viejos como de

jóvenes. En ella se puede observar la diferencia de proliferación entre una

población y otra. Las células jóvenes presentan una mayor proliferación en

comparación con las células viejas. Además, en esta misma gráfica se

observa disminuida la proliferación en el cultivo de las células infectadas

en comparación con el control. Al comparar bcl-2 con su control de

infección gfp se puede apreciar una ligera protección que es mínima sí se

compara con las células sin infectar.

Los cultivos de fibroblastos de ratones viejos tienen un deterioro mayor,

además que al momento de realizar la infección las células se dañan aún

más, provocando que muchas células no resistan. Las que resistieron se

Page 34: Efectos d La Proteina Bcl2

34

mantuvieron más o menos estables, por lo que se puede decir que bcl-2

trató de proteger a las células pero no revirtió el daño que ya tienen.

Analizando lo obtenido para las células control en proliferación,

funcionalidad y senescencia celular, se observa que efectivamente cuando

las células entran en senescencia son alteradas sus funciones fisiológicas

y su capacidad proliferativa cesa, como algunos investigadores han

propuesto (Campisi, 2000; Lundberg et al., 2000).

En cuanto al comportamiento de las células infectadas, podemos decir que

hay un impacto en las células, provocándoles un daño mayor. Pero a pesar

de eso, pudimos observar que en la proliferación al sobreexpresar la

proteína bcl-2 se tiene un pequeño efecto de protección, pero que después

decae. Por lo que se puede decir, que bcl-2 no retarda la entrada a la

senescencia, ya que esta proteína se presenta a lo largo del cultivo de una

manera constante, por lo cual no se encontró un aumento en la

funcionalidad.

Como se mostró en las gráficas anteriores, las células infectadas con bcl2

trataron de proliferar, pero debido a la infección las células sufrieron un

daño y estrés por lo que ya no crecieron lo necesario, así que bcl2

proporciono un pequeño efecto protector por un tiempo, pero después

decayó.

Page 35: Efectos d La Proteina Bcl2

35

7 9 13 15

Días de cultivo

1711 19 21 2523 27

0

1

2

3No.decélulas x105

29 31

bcl2

gfp

Gráfica 4. Control de cultivo control de viejas y jóvenes se puede observar el comportamiento de lascélulas jóvenes y las células viejas sin infectar.

jóvenes

viejas

Page 36: Efectos d La Proteina Bcl2

36

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11. AGRADECIMIENTOS

v A mis padres por su gran apoyo.

v A mi esposo.

v M. en C. Mina Konigsberg Faisntein.

v M. En B.E. Norma Edith Guerrero-Díaz López.

v Biol. Exp. Ma. Cristina Aguilar Calles.

v Dr. Pablo Damian Matsumura.

v M.V.Z. Rocio Vieria.

v CONACYT 400200-5-J34194-M