microbiologia ambiental
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Instituto Nacional de Ecología (INE-SEMARNAT)Periférico sur 5000. Col. Insurgentes Cuicuilco, C.P. 04530. México, D.F.Internet: www.ine.gob.mx
COORDINACIÓN EDITORIAL Y TIPOGRAFÍA: Raúl Marcó del Pont Lalli
DISEÑO DE LA PORTADA: Álvaro Figueroa
FOTO DE LA PORTADA: Alejandro Martínez
CORRECCIÓN DE ESTILO: Eduardo Chagoya Medina
Foto de la portada: gota de agua con ciliados en bipartición,
euglenas y numerosas bacterias (bacilos). Tomadas en contraste de
fases con filtro azul y ayuda de microflash a 1/2,000 seg. Aumentos 336 x.
ISBN: 968-817-707-5
Impreso y hecho en México
©D.R.
Primera edición: noviembre de 2004
MicrobiologíaMicrobiologíaMicrobiologíaMicrobiologíaMicrobiología ambiental ambiental ambiental ambiental ambiental
SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
INSTITUTO NACIONAL DE ECOLOGÍA
PROGRAMA UNIVERSITARIO DEL MEDIO AMBIENTE-UNAM
Irma Rosas,Alejandro Craviotoy Exequiel Ezcurra(compiladores)
ÍNDICE
AG R A D E C I M I E N T O S 88888
PRÓLOGO 99999José Sarukhán
INTRODUCCIÓN 1313131313Irma Rosas, Alejandro Cravioto y Exequiel Ezcurra
BACTERIAS EN LA ATMÓSFERA 1 51 51 51 51 5Irma Rosas, Eva Salinas, Leticia Martínez,Carlos Eslava y Alejandro Cravioto
Vibrio cholerae: UNA BACTERIA AMBIENTAL
CON DIFERENTES TIPOS DE VIDA 4 74 74 74 74 7Carlos Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado,Maritoña Ramírez, Jorge Villaseca y Alejandro Cravioto
LA ECOLOGÍA DE LAS AMIBAS PATÓGENAS DE VIDA LIBRE 6 76 76 76 76 7EN AMBIENTES ACUÁTICOS
Patricia Bonilla, Elizabeth Ramírez, Ricardo Ortíz yCarlos Eslava
CIANOBACTERIAS, MICROORGANISMOS DEL FITOPLANCTON 8 38 38 38 38 3Y SU RELACIÓN CON LA SALUD HUMANA
Pedro Ramírez, Evaristo Martínez, María Dolores Martínezy Carlos Eslava
LA ECOLO GÍA MICROBIANA: UNA NUEVA CIENCIA 107107107107107PARA UN NUEVO SIGLO
Valeria Souza, Ana Escalante, Ana Noguez, Laura Espinosa-Asuar,René Cerritos y Luis Eguiarte
AGRADECIMIENTOS
Los compiladores de esta obra desean agradecerle la revisión y la asesoría técnica alPrograma Universitario de Medio Ambiente (PUMA) de la Universidad NacionalAutónoma de México (UNAM) y a la Srta. Ángeles Prado.
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SOMOS PRODUCTO DE LA DIVERSIDAD. Todos nosotros. Nuestra especie y las más de un
millón setecientas cincuenta mil que han sido nombradas y depositadas en mu-
seos y herbarios de todo el mundo por taxónomos especialistas en muy diferen-
tes grupos. Nuestras miles de culturas y lenguas diferentes también son producto
de la diversidad, lo mismo que nuestro desarrollo cultural, lo que actualmente
llamamos “nuestra civilización”, con todos sus claroscuros.
A pesar de lo anterior, somos enormemente ignorantes de esa diversidad de
la que provenimos. No solo eso, sino que en ocasiones parece que estamos
empeñados en despreciarla y aun borrarla. Algunos ejemplos para ilustrar lo
anterior: seis millones de hectáreas de zonas áridas se desertifican cada año. Las
selvas tropicales se pierden a una velocidad de 30 hectáreas por minuto. Existen
ya cerca de 50 zonas muertas en los océanos por causa de la eutrofización
originada por el uso ineficiente de fertilizantes. Se introduce más nitrógeno en
los sistemas terrestres por intervención humana que el que se fija naturalmente,
y casi la mitad del mismo se pierde por lixiviación. Más de dos terceras partes de
las pesquerías comerciales están agotadas y 90% de los grandes depredadores
marinos han desaparecido.
No lo hemos hecho mucho mejor en lo que se refiere al conocimiento y la
conservación de las diferencias culturales que se ha desarrollado en cada una de
las regiones de la Tierra. Año con año se pierden, por un complejo de circunstan-
cias derivadas de la forma en que nos hemos desarrollado, cientos de lenguas que
ya no serán habladas nunca más. No será difícil que nuestra era, como otras
geológicas, sea conocida por un epíteto que la distinga: el del Homogeoceno, es
decir, la era de la aniquilación de la diversidad y de la homogeneización biológica
y cultural del planeta producida por las actividades humanas.
PRÓLOGO
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Ese millón setecientas cincuenta mil especies conocidas hasta la fecha repre-
sentan, dependiendo del especialista, entre el 15 y el 5% de todas las especies
que se calcula existen en el mundo. En otras palabras, desconocemos, por lo
menos por un orden de magnitud, la dimensión de la diversidad biológica que
existe en la Tierra y de la que somos producto.
En contraste, hemos mostrado una destreza asombrosa en otras áreas del
conocimiento humano. Por un lado, podemos calcular con precisión apabullante
la trayectoria, composición y edad de objetos celestes que ni siquiera vemos a
simple vista; por otro, hemos penetrado hasta los más reducidos espacios de la
materia al estudiar su estructura, y hemos descifrado los códigos más íntimos de
la regulación de nuestros procesos hereditarios. Paradójicamente, quizá porque
se encuentra situado entre lo ultramicroscópico y las escalas inmensas del uni-
verso, hemos abandonado el esfuerzo por incrementar nuestro conocimiento
del mundo biológico que nos rodea y sin el cual no podemos vivir. No solamente
no sabemos con razonable aproximación cuántas especies conviven con noso-
tros en la Tierra, sino que ignoramos las funciones que desempeñan en la trama
de la vida y ni siquiera para la enorme mayoría de ellas, desde el enfoque más
antropocéntrico y utilitario, sabemos si pueden o no resultar útiles para satisfacer
las múltiples necesidades de las sociedades.
Por ello, resulta muy gratificante atestiguar el nacimiento de obras como la
presente que enfocan su interés en el conocimiento de uno de los grupos biológi-
cos menos estudiados: el de las bacterias y algunos otros microorganismos
unicelulares. Otra vez, con un error de un orden de magnitud, se calcula que existen
en nuestro planeta entre cien mil y un millón de especies de este grupo. Obvia-
mente la dificultad de su observación y el enorme reto que representa la definición
de lo que en este caso es una entidad taxonómica (especie) han contribuido al
lento avance de su conocimiento. Esto es en especial grave debido al enorme
papel que este grupo juega en los procesos vitales de los sistemas ecológicos y
biológicos en la Tierra y a que representan los tabiques biológicos básicos de la
construcción de los sistemas vivos, incluyéndonos a los seres humanos. Su impor-
tancia e interés ciertamente va mucho más allá del común de la gente les asigna en
lo que se refiere a los problemas de salud humana, los cuales, desde luego, no son
de manera alguna nimios. Baste recordar enfermedades tan serias como la tuber-
culosis, el cólera (tratado en un capítulo especialmente por el Dr. Carlos Eslava y
colaboradores) la difteria, las disenterías o el tifo.
No es aventurado afirmar que toda una nueva biología está a la espera de ser
descubierta en estos organismos, que funcionan por rutas metabólicas y mecanis-
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mos ecológicos, fisiológicos, y probablemente evolutivos, que podrían ser harto dife-
rentes de los que conocemos para la mayor parte de los “organismos superiores”.
Como grupo, las bacterias representan los seres vivos más antiguos, habiéndoseles
encontrado en estratos geológicos de hace tres mil quinientos millones de años. El
rango de hábitats en los que pueden vivir es el más amplio de cualquier otro grupo de
organismos (como el artículo de la Dra. Valeria Souza y colaboradores lo ilustra am-
pliamente), desde profundidades de más de 400 m en el hielo de la Antártida hasta
temperaturas cercanas a los 80 °C en géiseres. Su papel en los procesos ecológicos es
en extremo importante (un ejemplo de ello lo constituye el interesante capítulo
sobre cianobacterias del Dr. Pedro Ramírez y colaboradores): como fijadores de CO2
y mantenedores del balance de carbono en la biosfera; como descomponedores de
materia orgánica y el consecuente reciclado de nutrientes, especialmente importan-
te en suelos agrícolas, los cuales pueden contener, en un solo gramo, cerca de 2,500
millones de bacterias; lo anterior como una adición a su fundamental papel como
fijadores de nitrógeno, no solamente en los suelos agrícolas sino en todos los
ecosistemas terrestres.
Hay que felicitar la idea y el esfuerzo de estructurar un libro cuyos capítulos
tocan una variedad de temas relacionados con las bacterias y algunos otros
microorganismos, como es el caso del capítulo escrito por la Dra. Patricia Bonilla
y colaboradores sobre amibas de vida libre. La obra nace en un terreno que no es
particularmente fértil en ejemplos como el presente. Se trata de una iniciativa
muy útil para enriquecer la cultura biológica de nuestro país, dado que está
escrito para un público no necesariamente especialista en los temas, y es en
especial útil para aquellos lectores cuyo acceso a obras en lenguas extranjeras
está limitado. Es de remarcarse que la mayoría de los autores son académicos de
diversas dependencias de la Universidad Nacional Autónoma de México, aspecto
que subraya el papel central de esta institución en la investigación científica y en
la difusión del conocimiento a la sociedad en general. Hay que desear que el
cometido educativo e informativo del libro se logre de la mejor forma; será el
mejor obsequio a los esfuerzos de los autores y editores de este trabajo.
José Sarukhán
INSTITUTO DE ECOLOGÍA, UNAM
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NOS MARAVILLA EL CONOCIMIENTO que hoy tenemos sobre la gran diversidadmicrobiana. Sin embargo, poco se habla de ello, a pesar de su enorme importancia.
El gran espectro metabólico existente entre los distintos microorganismos,los capacita para colonizar cualquier ambiente por inhóspito que parezca, detal forma que su presencia nos asegura que la energía entra al ecosistemal yasea a través de la fotosíntesis o del ciclo del detritus.
Es por ello que cuando hablamos de la evolución del planeta, de las cienciasambientales, de la biotecnología ambiental, de la ecología funcional, del cambioclimático o de la generación de gases de efecto invernadero, invariablemente eltema central son los microorganismos, principalmente los procariontes.
Abordar el tema de la microbiología ambiental resulta largo y complejo, peroseleccionando algunos ejemplos es posible dar una idea clara de la importanciade conocer la interacción entre los parámetros ambientales y los microorganismos.Su presencia en la atmósfera, sin ser esencialmente un hábitat para ellos, implicadispersión a cortas o largas distancias y colonización de sustratos diferentes al desu fuente de origen, en donde pueden actuar en procesos físicos atmosféricos,como fitopatógenos, alergenos, colonizadores primarios, etc.
Su interacción con los parámetros ambientales es de gran importancia ya queestos seleccionarán aquellos microorganismos que presenten ciertas habilidadespara soportar la pérdida de agua y los efectos de la radiación ultravioleta, entreotros.
Al tratarse el tema de Vibrio cholera, una bacteria de vida libre, heterótrofa, degran importancia en ecosistemas acuáticos salobres y marinos, se resalta el hechode ser potencialmente patógena y generalmente la relacionamos solo con dañosa la salud. Olvidamos su gran versatilidad y centramos nuestra atención en losparámetros ambientales que han estado asociados a eventos epidémicos.
Las cianobacterias, organismos extraordinarios que forman parte del plancton,bentos y perifiton, y por lo tanto, de la producción primaria de los sistema acuá-
INTRODUCCIÓN
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tico, llevan a cabo fotosíntesis y fijación de nitrógeno, son capaces de sobreviviren situaciones desfavorables para otros microorganismos llegando a constituirgrandes poblaciones, por lo que la ingestión del agua en estas condiciones re-presenta un riesgo de salud debido a la producción de toxinas.
Entre los protozoarios, que resultan un importante eslabón en la cadenaalimentaria, reguladores de las poblaciones bacterianas, se encuentranmicroorganimos de vida libre que pueden actuar como patógenos oportunis-tas, y cuya interacción con los parámetros ambientales determina en granparte el riesgo que implica su ingestión, contacto o inhalación.
La gran diversidad fenotípica de los microorganismos encuentra su res-puesta en su exploración genómica y en el conocimiento de los distintosmecanismos de recombinación genética. Todo ello nos permite describir laestructura y función de las comunidades microbianas, de gran importanciaen el estudio de los diversos ecosistemas o como agentes etiológicos de diver-sas enfermedades.
Por lo anterior, se considera importante realizar estudios sobre el impactoen la estructura y función de las comunidades microbianas de vida libre por elcontinuo intercambio de microorganismos entre hospedero-ambiente (engran parte propiciado por los seres humanos), todo ello de gran interés tantoecológico como médico.
IRMA ROSAS,ALEJANDRO CRAVIOTO
Y EXEQUIEL EZCURRA
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BACTERIAS EN LA ATMÓSFERA
Irma Rosas, Eva Salinas, Leticia Martínez, Carlos Eslavay Alejandro Cravioto
1. INTRODUCCIÓN
UNA GRAN VARIEDAD de organismos que cambian su localización geográficadurante su ciclo de vida, lo hacen a través de la atmósfera. Por tal motivo, laspartículas biológicas están siempre presentes en dicho ambiente, aunque sunúmero y viabilidad cambien con las horas del día, las condiciones del tiempo,las estaciones del año y su ubicación geográfica. El tamaño de la biota que fluyeen la atmósfera varía desde micrómetros, como en el caso de virus, bacterias,esporas y polen, hasta milímetros, como las semillas y los insectos sin alas. Sepueden encontrar cerca del suelo o a grandes alturas, pero su presencia mas alláde la tropósfera no se ha determinado con precisión.
La aerobiología es una disciplina relativamente nueva, surgida alrededor de1930 y que se encarga de estudiar el aerotransporte pasivo de los microorganismos,su identificación, comportamiento, movimientos y supervivencia, conjuntandolos conocimientos de la microbiología, la meteorología, la física de los aerosolesy la química atmosférica.
La atmósfera en general no se considera un hábitat de los microorganismos,ya que sólo algunos de ellos son capaces de reproducirse allí.1 Durante su trans-porte bajan su tasa metabólica y se recuperan hasta que se impactan sobre unorganismo o un medio con las condiciones óptimas para crecer o infectar. Sinembargo, su presencia en la atmósfera tiene gran relevancia desde el punto devista ecológico, por el grado de dispersión que pueden adquirir y que difícilmen-te lograrían, siendo su hábitat primario terrestre o acuático.2 Considerando lafísica atmosférica, las aerobacterias se asocian con los núcleos de condensación,los núcleos de congelación y con su enriquecimiento por efecto de la niebla.3,4
Los estudios aerobiológicos se iniciaron como resultado de un interésepidemiológico, para tratar patógenos de animales, plantas o del hombre. Re-
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lcientemente este tipo de investigaciones se han incrementado en el área agrícola,incluyendo plaguicidas microbianos, actividades de composteo y daño por hela-das, entre otros. Asimismo, en zonas urbanas se ha registrado la introducción demicroorganismos a la atmósfera asociada a la turbulencia vehicular y a la grandensidad poblacional, lo que ha dado lugar a un campo de estudio específico.Actualmente, en respuesta a la problemática del terrorismo, se ha desarrolladoinfraestructura para la detección y dispersión de armas biológicas.
La mayoría de las bacterias que entran a la atmósfera provienen de fuentesnaturales como la vegetación, el suelo y los cuerpos de agua, y en menor propor-ción de las actividades antropogénicas; su supervivencia y distribución estánmoduladas por factores biológicos, meteorológicos (como el viento, la radiaciónsolar, la temperatura, la humedad relativa) y por la química atmosférica.
Su presencia en la atmósfera ha sido demostrada por su crecimiento en me-dios de cultivo (denominándose cultivables); sin embargo, se considera que estorepresenta sólo una pequeña fracción de la población que llega a la atmósfera, deforma tal que la mayoría podría estar muerta o encontrarse en forma viable nocultivable.
2. LA ATMÓSFERA COMO PARTE DEL HÁBITAT
El continuo intercambio entre agua, aire y suelo nos obliga a incluir a la atmós-fera como parte del hábitat de los organismos y a descubrir en ella diversosfactores que determinan su distribución, en donde la dispersión juega un papelmuy importante. Es un hecho que sólo para ciertos organismos la atmósfera seráeficiente, y para otros resultará un medio hostil en el cual sólo algunos podránsoportar la presión, por lo que se le considera un medio selectivo.
Por las dimensiones de este fluido de gases y partículas que rodea a la super-ficie terrestre, es necesario describir a la atmósfera considerando sus diferentescapas cuya altura esta relacionada con la temperatura, la presión barométrica y ladensidad del aire.
A la tropósfera o atmósfera baja (que comprende los primeros diez kilóme-tros), por su cercanía a los ecosistemas terrestres y acuáticos, llegarán las diversaspartículas biológicas en sus formas esporuladas o vegetativas, por mecanismosactivos o pasivos; se distribuirán vertical y horizontalmente, dependiendo de laenergía disponible (viento, corrientes de convección, remolinos locales, etc.) loque les proporcionará flotación y movimiento.
En esta atmósfera baja encontraremos diversas capas asociadas a las condi-ciones del tiempo, como noches claras, días nublados o soleados. Así la capalímite laminar podrá tener una altura que va de pocos centímetros hasta alcan-zar varios metros; una vez que las partículas biológicas entran a la capa de los
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remolinos locales y a la capa turbulenta, podrán llegar a zonas cuyas barrerasgeográficas no lo permiten.
En las noches la condición isoterma o la inversión térmica determinarán laestabilidad de la atmósfera, de tal forma que las partículas introducidas a latroposfera permanecerán en algunas ocasiones cerca del suelo (figura 1).
Es importante considerar que las dimensiones y la dinámica en cada capaatmosférica dependerán en parte de la orografía, del tipo de suelo y dosel dellugar; es por ello que se habla de lo contrastante entre el comportamiento de unaatmósfera urbana respecto de una rural (figura 2). Para el caso de las concentra-ciones de aerobacterias registradas durante el día se reporta: urbana> bosques>rural> zona costera.
FIGURA. 1. LAS CAPAS DE LA ATMÓSFERA
Y LA DISPERSIÓN DE LAS PARTÍCULAS BIOLÓGICAS
Fuente: 5.
Estratosfera
TroposferaCapa de convección
Capa de mezcla
Capa límite turbulenta
Capa límite laminar
Cumulus
Airecaliente
Noche despejada
Condiciones estables
Capalímite
laminar
Día soleado
Velocidad del vientoen aumento
Día nublado
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lEste enriquecimiento de partículas biológicas en la zona urbana está asocia-
do a diversas fuentes antropogénicas, pero principalmente a la contaminacióndel suelo aunado a la turbulencia, que facilita la introducción de partículas a laatmósfera a diferentes alturas.
3. LAS FUENTES DE LAS AEROBACTERIAS
A la atmósfera se pueden introducir una gran variedad de partículas de origen bioló-gico, como granos de polen, esporas fúngicas, bacterias, algas, protozoarios, insectosy, ocasionalmente, virus. En general, las partículas predominan en las partes bajas dela atmósfera cerca de las fuentes locales de generación. Sin embargo, algunas esporasde hongos y bacterias pigmentadas se han recuperado a 48-77 km de altura.6
Las bacterias constituyen uno de los grupos más abundantes en el ambiente.En condiciones naturales se les encuentra en el suelo, el agua, y las plantas,principalmente como organismos saprobios. Debido a que carecen de mecanis-
FIGURA 2. COMPARACIÓN DE LAS DIVERSAS CAPAS ATMOSFÉRICAS
EN UNA ZONA URBANA Y UNA RURAL
Siglas: CLP (capa límite planetaria), CLU (capa límite urbana), CLR (capa límite rural),CDU (capa del dosel urbano).
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mos activos de liberación, son introducidas a la atmósfera por procesos mecáni-cos, directamente por la acción del viento y la lluvia sobre el suelo, los cuerpos deagua y la superficie de las hojas, e indirectamente por la acción de las olas y laformación de burbujas sobre los sistemas acuáticos.
Las actividades antropogénicas, como el tráfico vehicular, las plantas de trata-miento de aguas residuales, los centros de manejo de desechos sólidos, el movi-miento de los animales en suelos expuestos, las prácticas agrícolas y la manipu-lación de composta7, 8, 9 entre otros, liberan una gran cantidad de bacterias a laatmósfera, produciendo la contaminación de las áreas circundantes (cuadro 1).
Las bacterias suspendidas en la atmósfera generalmente se encuentran aso-ciadas a partículas, por lo que su concentración aumenta durante la época desecas, debido al transporte convectivo de las partículas provenientes de las super-ficies secas. Durante la época de lluvias su número disminuye significativamentedebido al lavado de la atmósfera.10
Las plantas, al ser un hábitat natural de muchos microorganismos (saprobioso patógenos), entre los que se incluyen las bacterias, contribuyen de manera
CUADRO 1. FUENTES NATURALES Y ANTROPOGÉNICAS QUE CONTRIBUYEN
A INCREMENTAR LA CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS A LA ATMÓSFERA
FUENTE CONCENTRACIÓN (UFC M-3)
NaturalesCosta ND – 560Bosques 385 – 1.2x103
Pastizales 127 – 587Matorral desértico 2 – 283
AntropogénicasZona urbana 539 – 7.2x103
Calles transitadas 100 – 13x103
Parques 100 – 2.5x103
Estación de transferencia de basura 350 – 14x103
Planta recicladora de basura 1.1x103 – 2.8x107
Planta de composteo 1x103 – 11x106
Planta de tratamiento de aguas residuales 1x102 – 2x105
Zona rural 202 – 3.4x103
Campo agrícola 46 – 6.5x103
Empacadora de algodón 3.3x106 – 19x106
UFC: Unidades formadoras de colonias. ND: No detectable.
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limportante a incrementar el número de éstas suspendidas en el aire, por laacción del viento y de la lluvia, así como por el roce entre las mismas hojas.11
Durante la época húmeda del año la vegetación puede liberar una mayor cargabacteriana a la atmósfera que el suelo.
La superficie de los vegetales se considera un sistema abierto, en continuointercambio con la atmósfera. Este hábitat aéreo, cercano a la superficie de lasplantas y con el que se mantiene cierta relación, se conoce con el nombre defilosfera, y sus habitantes son llamados epífitos.12 En gran parte el interés por elestudio de la filosfera se deriva de la necesidad de conocer el comportamiento(dispersión, colonización, sobrevivencia y patogenicidad), así como el controlde los fitopatógenos, que son abundantes en este ambiente.
La comunidad bacteriana que compone la filosfera es muy amplia y en realidadse conoce muy poco acerca del número y especies que la integran, debido a quemuchos de sus miembros se encuentran dentro del grupo de organismos no cul-tivables. Recientemente se han desarrollado técnicas moleculares para tratar deconocer la identidad de los miembros que integran a la comunidad de bacteriasepífitas. Entre éstas se presenta una alta tasa de transferencia de plásmidos, a la vezque la abundancia de fagos encontrados sobre las plantas sugiere que la transduccióntambién puede prevalecer. Por otra parte, la superficie de las hojas se consideracomo un medio de colonización hostil para las bacterias, debido a los frecuentescambios en la disponibilidad de agua, incidencia de la radiación y baja disponibi-lidad de nutrimentos, por lo que dichas cepas pueden servir como fuente de genesque codifiquen para tolerar condiciones de estrés. Esto sugiere que la superficie delas hojas puede considerarse un área importante para la diseminación horizontalde genes y por lo tanto un sustento para la diversificación microbiana.12
Por otra parte, los animales y el hombre también constituyen una fuente im-portante de bacterias patógenas. Las bacterias contenidas en la saliva se liberan a laatmósfera al hablar, toser y estornudar; la descamación de la piel y el cabello es unafuente constante de generación de virus, bacterias y hongos; las heces de animalesy humanos pueden contaminar el suelo con microorganismos potencialmentepatógenos, y existe la posibilidad de que sean suspendidos posteriormente en laatmósfera. En diversas muestras de polvo urbano y casero de la Ciudad de México(datos no publicados) se ha aislado la bacteria Escherichia coli, indicadora de conta-minación fecal, y que constituye el 40% del total de bacterias coliformes aisladasen el polvo,13 lo que indica un riesgo potencial de contaminación por ésta y otrasbacterias patógenas, así como por virus o parásitos.
Se reconoce que las bacterias están presentes en la atmósfera de ambientesextramuros, y que su inhalación representa un riesgo para la salud, ya sea en suforma vegetativa o parte de sus compuestos estructurales denominados “com-puestos biogénicos”, como son los lipopolisacáridos de la membrana externa delas bacterias Gram negativas y los ácidos teicoicos de las Gram positivas.
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4. MUESTREADORES
Existen diferentes tipos de muestreadores para colectar las partículas suspendi-das en la atmósfera así como para determinar su distribución por tamaño. Algu-nos se han diseñados para el muestreo de polvo o partículas no viables, mientrasque otros se usan exclusivamente para la colecta de bioaerosoles o microorga-nismos. A continuación se describirán algunos de los muestreadores cuyo uso esmás frecuente en el área de la aerobiología para el aislamiento de bacterias.
IMPACTADORES
El principio de colecta por impactación se basa en la tendencia de una partículaa desviarse del flujo de aire debido a la inercia, cuando la corriente de aire securva al pasar por una superficie sólida o semisólida. Las partículas se separan dela corriente de aire y se impactan sobre la superficie.
Impactador de cascada
Dentro de esta clase de muestreadores el más usado en los estudios aerobiológicoses el impactador para partículas viables Andersen (Graseby, Atlanta, GA.). Esteequipo está constituido por una serie de seis placas de aluminio, cada una con400 orificios cuyo diámetro disminuye sucesivamente, por lo que la velocidaddel aire se incrementa de una etapa a la siguiente. Succiona un flujo de aire de28.3 L min.-1 (1 pie3) por medio de una bomba de vacío. Las partículas que sonacarreadas en la corriente de aire, con un diámetro aerodinámico entre >15 a 1µm, son separadas por su tamaño en seis fracciones al pasar por las placas perfo-radas. Las partículas de una masa mayor son depositadas en la etapa superior,mientras que las partículas más pequeñas, capaces de mantenerse en el flujo deaire a baja velocidad, son transportadas sucesivamente a mayor velocidad y seimpactan sobre la superficie de colecta de las siguientes etapas.14 Bajo cada placase coloca una caja Petri con agar, en cuya superficie se desarrollarán las partícu-las viables (figura 3).
Existe una versión del impactador de cascada Andersen de dos etapas, cadauna con 200 orificios. Al igual que el muestreador anterior, succiona un flujo deaire de 28.3 L min-1 y las partículas son separadas en las fracciones respirable yno-respirable. La etapa superior corresponde a las placas 1 y 2 del muestreador deseis etapas y la inferior a las etapas 3 a 6 (figura 3).
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lFIGURA 3. MUESTREADORES DE CASCADA ANDERSEN DE DOS Y SEIS ETAPAS
Muestreadores de una etapa
Existen diferentes modelos de muestreadores de una etapa. El muestreador portá-til Burkard (Rickmansworth, England) colecta las partículas suspendidas con unflujo de aire de 10 L min.-1 a través de una placa perforada con 100 orificios. Serecomienda el uso de este equipo para la colecta de partículas < 5 µm de diámetro,con una eficiencia > 95%. El muestreador N6-Andersen, el cual es una adaptacióndel equipo de seis etapas, sólo usa la sexta etapa del muestreador. El uso de losimpactadores de una etapa es más económico en términos del número de placasde agar requeridas y del tiempo empleado en el procesamiento de las muestras; sinembargo, presenta la desventaja de no fraccionar la muestra por tamaños.
Impactadores en líquido (Impingers)
En este equipo de muestreo el aire succionado con una bomba de vacío se colectadirectamente sobre un medio líquido. La mayoría de los impingers están hechos devidrio Pyrex, con una sola cámara de colecta y un conducto para la succión del aire,el cual cuenta con un orificio crítico que determina la velocidad del flujo de aire.
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Uno de los modelos es el AGI-30 (all-glass impinger), en el cual el flujo de airellega a 30 mm de la base del muestreador. Esto incrementa la eficiencia delmuestreo de partículas viables, ya que reduce la velocidad a la que son impactadasy disminuye el daño causado por el contacto con la base del muestreador. Esteequipo funciona con un flujo de aire de 12.5 L min-1 y generalmente se usan 20mL de medio de colecta. La ventaja de este muestreador es que se puede realizaruna serie de diluciones del líquido de colecta cuando la concentración demicroorganismos es muy alta.
El empleo de este tipo de equipo no se ha reducido únicamente a la colecta departículas fúngicas y bacterias suspendidas en el aire, se ha empleado exitosamenteen la colecta de algas, amibas de vida libre,15 virus y recientemente se ha utilizadoel líquido de colecta en la detección de diversos microorganismos por medio dela técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).16 El método de PCR esrápido y sensible, por lo que puede ser usado como una alternativa para la eva-luación de la calidad del aire.
Impingers con fraccionamiento de tamaño
En 1960 May diseñó un muestreador que combina las ventajas de colectar laspartículas suspendidas dentro de un medio líquido, con la de fraccionar laspartículas por su tamaño.17 Este muestreador es conocido como MSLI (multistageall glass liquid impinger) y se presenta en tres tamaños que colectan 55, 20 y 10L min-1 por medio de una bomba de vacío. Las partículas suspendidas en lacorriente de aire se separan en tres fracciones, que corresponden por su tamaño,a la depositación en la región extra-torácica, bronquial y alveolar del tracto res-piratorio (figura 4).
Una alternativa al uso del MSLI, es el impactador en líquido Burkard, el cualal igual que el muestreador anterior separa las partículas en tres fracciones (>10µm; 10-4 µm; <4 µm) con base en su diámetro aerodinámico (DA). La ventaja deeste equipo es que está fabricado en aluminio, por lo que su diseño es másexacto, y existe un riesgo menor durante los muestreos ya que es menos frágil(figura 4).
Muestreadores de centrífuga
La colecta de microorganismos por centrifugación permite la creación de untorbellino que produce que las partículas suspendidas en el aire se impactensobre la superficie de colecta. El muestreador más común de este tipo es elBiotest RCS (Reuter Centrifugal Air Sampler, Alemania). El aire es succionado
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lFIGURA. 4. MUESTREADORES EN FASE LÍQUIDA CON FRACCIONAMIENTO DE TAMAÑO
por el rotor del muestreador, que al girar crea una fuerza centrífuga y ocasionala impactación de las partículas. Sobre las paredes de la cámara se coloca unatira plástica con agar en la que se desarrollarán las colonias de microorganismos,después de ser retirada del equipo e incubada a la temperatura adecuada. Elmotor funciona con baterías y succiona un flujo de aire de 40 L min-1 (figura5). Es un equipo pequeño y de fácil manejo, por lo que su uso se ha populari-zado especialmente en la evaluación de la calidad microbiológica de ambien-tes hospitalarios.18 Sin embargo, no es un equipo recomendado para el muestreode ambientes ocupacionales ya que la superficie de las tiras de agar se saturanfácilmente.
5. DISTRIBUCIÓN TEMPORAL Y ESPACIAL DE LAS AEROBACTERIAS
Las bacterias son menos numerosas en la atmósfera que los hongos, aunquealgunas veces pueden encontrarse en la atmósfera como células independientes,generalmente lo hacen asociadas a partículas que varían en tamaño de <0.65 a>7.0 µm DA, excepto en zonas costeras donde los aerosoles bacterianos son demenor tamaño. En esta área más del 84% de las partículas transportadoras debacteria tienen un tamaño promedio de 3.6 µm DA. La razón de este tamaño se
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FIGURA 5. MUESTREADOR DE CENTRÍFUGA BIOTEST
debe a que las bacterias se asocian a materiales amorfos de plantas, a escamacionesdérmicas, suelos, hongos, aerosoles marinos, núcleos de condensación o bienpueden ser introducidas a la atmósfera en conglomerados bacterianos, protegi-dos por solutos o sustancias mucosas.19 La figura 6 muestra la distribución de lasaerobacterias por tamaño, en muestreos realizados en la Ciudad de México a las10:00 h. durante la época de secas.10
Estas partículas se encuentran en una compleja dinámica establecida entrela atmósfera, el suelo, los cuerpos de agua y el dosel que forman los edificios o losdiferentes tipos de vegetación, influenciada por procesos de depositación húme-da y seca, viento y corrientes de convección por mencionar algunos. Estos facto-res serán de gran importancia para la distribución de las aerobacterias cerca delsuelo o a grandes distancias, en una zona costera, en los polos, en una zona ruralo una urbana. Por esta complejidad es natural esperar que la concentración delas aerobacterias presente una gran variabilidad, tanto diurna como estacional.Los resultados obtenidos sobre la cuantificación de aerobacterias en un vallelocalizado entre dos montañas, sujeto a condiciones meteorológicas locales y demesoescalas, se comportaron bajo el siguiente patrón diurno: en la noche seregistró la mínima concentración y al amanecer la máxima, debido probable-mente a la dispersión de lo acumulado cerca del suelo del día anterior; duranteel día el calentamiento promueve el flujo de bacterias a grandes alturas y confor-
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lFIGURA 6. DISTRIBUCIÓN DE LAS AEROBACTERIAS ASOCIADAS
A PARTÍCULAS DE DIFERENTES TAMAÑOS
<0.65 1.1 2.1 3.3 4.5 ≥7.0
100
80
60
40
20
0
PO
RC
ENTA
JE
TAMAÑO DE PARTÍCULAS (µM)
me se va estabilizando la atmósfera éstas se acumulan nuevamente cerca de lasuperficie del suelo.
Durante la tarde la entrada de aire y la brisa limpian el valle, y finalmente enla noche, el aire que baja por la pendiente de las montañas termina por desplazarlo acumulado durante el día.19 Se considera que el proceso de las primeras horasde la mañana (dilución) y el de la tarde (acumulación) se da en diversas locali-dades (bosque, urbano y rural), mientras que los otros procesos dependen de lacercanía a océanos o montañas (figura 7).
Se cuenta con poca información acerca de la variación estacional de lasaerobacterias; sin embargo, en algunos lugares de Europa, Estados Unidos yCanadá se han encontrado altas concentraciones de éstas en verano y bajas eninvierno, asociadas con períodos polvosos de sequía durante la primera tempo-rada, mientras que en primavera e invierno la lluvia y la nieve permiten ladisminución de la concentración de aerobacterias.
Se tiene información de que el tipo de aerobacterias varía con las horasdel día. En la noche las Gram positivas esporuladas presentan su concentra-ción mínima (17%) y las Gram negativas su máxima (22%); durante el díase invierte el proceso con 35% y 12%, respectivamente. También se ha eva-luado la proporción de bacterias pigmentadas: durante el día disminuye laproporción de bacterias no pigmentadas debido a su sensibilidad a la radia-
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FIGURA.7 DISTRIBUCIÓN HORARIA DE LAS AEROBACTERIAS
DURANTE LA ÉPOCA DE SECAS
Fuente: 19.
0 5 10 15 20
400
350
300
250
200
150
100
50
0BA
CT
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IAS T
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LES (
UFC
M-3
)
HORA DEL DÍA
ción solar, por lo que se registra una mayor proporción de aerobacteriaspigmentadas.20
La distribución espacial de las aerobacterias es dependiente de los flujos y lamodulación meteorológica. El flujo es definido como el número de bacteriasque pasan a través de una unidad de área por una unidad de tiempo (UFC m3 s-1) yesto a su vez, está determinado por la dinámica atmosférica. Sin embargo, setienen pocos datos al respecto. En un matorral desértico,21, 22 se han encontrado4.7 UFC m3 s-1, 75 UFC m3 s-1por encima de campos de trigo, y 543 UFC m3 s-1
en campos de alfalfa.23, 24 Diferentes observaciones señalan que estos flujosvarían durante el día a pesar de que se considera que la tasa de crecimiento delas bacterias epífitas se mantiene constante. En general puede mencionarseque:
· Las aerobacterias decrecen con la altura (la capa de inversión representa unabarrera para la dispersión de las bacterias).
· La concentración de aerobacterias cambia dependiendo de las característicasde la superficie por la que atraviesa la masa de aire.
· Los sistemas climáticos frontales con vientos en ráfaga pueden incrementarla concentración, mientras que disminuyen con la lluvia.
· Las actividades en zonas urbanas y rurales pueden aumentar la entrada debacterias a la atmósfera.
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l· El efecto de la contaminación atmosférica puede afectar su viabilidad y por lo
tanto su distribución espacial.
Algunas bacterias pueden viajar grandes distancias y otras pueden afectarsolamente a nivel local y su supervivencia es por corto tiempo.
Las aerobacterias son más numerosas en las ciudades (4000 UFCm-3, prome-dio 850) que en áreas rurales (3400 UFCm-3, promedio 99).25, 26, 27
Hasta este momento, utilizando el mismo muestreador y las mismas condi-ciones de cultivo, se obtuvieron los siguientes datos: las bacterias Gram positivas(73-90%) son el grupo predominante entre las aerobacterias, siendo abundanteslas Micrococaceas y los Staphylococcus; las formas esporuladas registran altas con-centraciones en los bosques, entre intermedias y altas en zonas rurales, y bajasproporciones en zonas costeras.21 No ha sido posible identificar aproximada-mente 21% de las Gram positivas cultivables.
Las Gram negativas representan una baja proporción de la población de lasaerobacterias, donde los grupos representativos son las Pseudomonas (5.5-10.7%),principalmente en zonas rurales, y las Xanthomonas (0-7.6%) en zonas costeras(cuadro 2).
En la atmósfera de zonas marinas se han registrado concentraciones deaerobacterias de 1-32 UFC m-3, incluyendo Micrococcus, Sarcina, Bacillus,Corynebacterium, bacilos pleomórficos, Gram positivos y formas esporuladas.En la estratosfera (18–27 km), no se ha determinado cuál es la mejor técnica parahacer un muestreo, sin embargo, se han logrado aislar micrococos, bacilos Grampositivos, negativos y bacterias difteroides.28
6. VIABILIDAD DE LAS AEROBACTERIAS
Cuando los organismos son estresados por aerosolización, frío, calor, congela-ción, radiación, contaminación química o choque osmótico, pueden morir o serdañados, aunque otros pueden permanecer aparentemente sin resentir sus efec-tos. Las bacterias dañadas son importantes ya que no son capaces de crecer enmedios de cultivo (viables no cultivables) como lo harían las especies no daña-das; sin embargo, éstas se podrían reproducir al encontrar un ambiente adecua-do, obteniendo suplementos metabólicos que les permitirían reparar el dañosufrido y así poderse reproducir.
De tal forma que la supervivencia de una bacteria al ser estresada, dependeráde su capacidad de reparar sus funciones biológicas afectadas y podría mencio-narse de manera general que lo realizan a través de dos tipos de procesos:
1) Físico-químicos2) Enzimático (dependiente de energía)
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MICROORGANISMO UBICACIÓN PORCENTAJE
DEL TOTAL
Bacillus Oregon, EE.UU. 16.92Arthrobacter (Bosque, costa, urbano, rural) 1.22Clavibacter 1.92Curtobacteruim 8.06Rhodococcus 0.84Micrococcus 1.46Pseudomonas 2.46Xanthomonas 2.24
Staphylococcus Beijing, China 30.5Micrococcus 7.15Corynebacterium 12.85Brevibacterium 10.9Listeria 30.3Bacillius 51.3
Escherichia coli Ciudad de México 4.9Serratia (zona urbana) 2.1Enterobacter 46.4Aeromonas 5.5Klebsiella 1.0No fermentadoras 32.0
CUADRO 2. BACTERIAS CULTIVABLES AISLADAS DE LA ATMÓSFERA
DE AMBIENTES EXTRAMUROS
Debe mencionarse que las diferentes estructuras y compuestos de las bacteriasno presentan la misma estabilidad termodinámica, siendo menos estables las mem-branas que los ácidos nucleicos; consecuentemente la molécula dañada depende-rá de la energía del factor estresante. Tal es el caso de la desecación que cuenta conmenos energía que la radiación ultravioleta (UV), por lo que la primera afectarámás fácilmente a las membranas.29 En el cuadro 3 se presentan las moléculasblanco asociadas con los factores estresantes, lo que resulta importante porque nosda idea del tipo de proceso que se deberá llevar a cabo durante la reparación.
La reparación de estructuras superficiales es necesaria ante el estrés por des-hidratación o rehidratación, los cuales producen daño a estas estructuras y a lasmembranas; una forma en que este daño se expresa es a través de la afectación deenzimas hidrolíticas; metales como el Mg, Fe, o Zn son importantes en los me-
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lcanismos de reparación, pero se ha observado que una completa reparacióntiene lugar sólo en presencia de fuentes de carbón. La congelación y la desconge-lación producen este mismo tipo de daño y se ha registrado una recuperaciónfavorable con péptidos.
La reparación del transporte activo es un proceso que llevan a cabo algunasbacterias afectadas por deshidratación. El mecanismo de reparación se debe enparte por un incremento del α-metil glucósido, aunque el mecanismo comple-to de reparación aún no se conoce.
El oxígeno, el ozono, los diferentes contaminantes ambientales y la radiaciónexacerban la desecación de las bacterias debido a la formación de radicales libres, loscuales oxidarán principalmente a los lípidos, afectando la fluidez de la membrana.
La reparación del daño por radiación UV induce en el ácido desoxirribonucleico(ADN) un dímero ciclobutano pirimidina, cercano a las uniones citosina o timina,formando un anillo ciclobutano. Muchas bacterias poseen una enzima muy espe-cífica capaz de separar este dímero, restaurando así la secuencia de bases; estaenzima tiene requerimientos estrictos de luz. La reparación también puede ser porcorte del dímero de la pirimidina, completándose el espacio por la acción de laADN-polimerasa usando la banda complementaria de ADN como molde.
Se conoce que el gen rulAB, presente en plásmidos de bacterias que habitanen la filosfera, y el gen umuDC, presente en cromosoma de bacterias entéricas,están involucrados en la reparación del ADN después de la exposición a radia-ción ultravioleta.30
De lo anteriormente descrito, se desprende que los microorganismos quecuentan con grandes reservas de adenosin trifosfato (ATP) y trehalosa, entre otros,serán capaces de reparar los daños causados por el estrés de la aerosolización.
CUADRO 3. MOLÉCULAS BLANCO AFECTADAS
POR FACTORES AMBIENTALES ESTRESANTES
FACTOR ESTRESANTE MOLÉCULA BLANCO
Humead relativa y temperatura Fosfolípidos de membrana, proteínasOxígeno Fosfolípidos, proteínasOzono Fosfolípidos, proteínasFactor aire libre (ozono+olefins) Fosfolípidos, proteínas y ácidos nucléicosRayos γ, rayos X y UV Fosfolípidos, proteínas y ácidos nucléicos
Fuente: 29.
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7. RELACIÓN DE LAS AEROBACTERIAS CON LAS FASES DE TRANSICIÓN
EN LA ATMÓSFERA
Las partículas solubles e insolubles, orgánicas e inorgánicas, naturales o antropo-génicas, participan en las fases de transición vapor-líquido, vapor-sólido (hielo)y líquido-sólido.
Está bien documentado el hecho de que las aeropartículas actúan como nú-cleos de condensación en la formación de nubes. Sin embargo, la mayoría deellas requieren de temperaturas de aproximadamente –10oC. La peculiaridad dealgunas partículas biológicas, principalmente bacterias, es que tienen la capaci-dad de inducir congelación a temperaturas de –2oC, aunque la mayoría lo hacena – 4oC. Esto significa que si el agua que las rodea está fría, el proceso de forma-ción de la nube puede ser inducido por estas partículas biológicas como núcleosactivos de congelación.
Algunos organismo han desarrollado mecanismos mediante los cuales mi-nimizan el daño debido a la congelación, mediante la formación de hieloextracelular. Específicamente las bacterias sintetizan proteínas con diferentesfunciones:31
· Proteínas núcleo de hielo, actúan como soporte para formar hielo.· Proteínas anti-núcleo, inhiben la formación del núcleo de hielo, por medio
de una partícula extraña en la gota de agua.· Proteínas anticongelantes, disminuyen las temperaturas de congelación, mo-
difican o inhiben el crecimiento de los cristales de hielo y su recristalización,y protegen a la membrana celular de los daños inducidos por el frío.
Los genes involucrados en la formación de núcleos de congelación han sidosecuenciados para Erwinia ananas (inaA) y para varias especies de Pseudomonas(inaW, inaZ); la alta homología y su posible ancestro común aún es tema dediscusión.32
Se conoce poco del papel de las partículas biológicas en la formación denúcleos de condensación de nubes, aunque se especula que ciertas partículascon gran afinidad por el agua podrían tener un papel activo. Datos experimenta-les señalan que los granos de polen presentan propiedades higroscópicas, ya queadquieren agua de la atmósfera a una humedad relativa menor al 100%.33
Por otro lado, es importante mencionar que se considera que la niebla actúacomo una fuente generadora de bioaerosoles secundarios, ya que algunasaerobacterias se duplican durante los eventos con niebla.4
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l8. AEROBACTERIAS PATÓGENAS
FITOPATÓGENOS
Para los microorganismos la dispersión es una oportunidad para que muchos desus propágulos se distribuyan amplia y azarosamente entre áreas y hospederos,principalmente inhóspitos. Uno de los mecanismos utilizados en la dispersiónconsiste en la formación de propágulos resistentes y la liberación de cantidadesconsiderables de esporas, situación que incrementa notablemente la colonizaciónde un hábitat. Tal es el caso de numerosos hongos fitopatógenos transportados porel aire. Puccinia graminis es capaz de liberar millones de esporas por m3 en uncampo de trigo, su liberación puede realizarse en períodos cortos o hasta por seismeses y no requiere de ningún otro vehículo o vector para su diseminación.34 Enel caso de las bacterias, muchas de éstas provienen de la filosfera35 y su dispersión seve favorecida durante las primeras horas de la mañana de días soleados, cuando lashojas están secas y la velocidad del viento supera 1 ms-1, lo que permite que seefectúe el transporte de alrededor de 100 UFCm3s-1; sin embargo, esta concentra-ción puede ser muy variable.23 La inmigración y emigración de fitopatógenos tam-bién puede ocurrir durante la lluvia, la irrigación de los cultivos y su cosecha, através de aerosoles generados y transportados por el viento o cuando las gotas delluvia golpean la superficie de hojas infectadas.36 Sin embargo, este mecanismotambién puede reducir rápidamente las poblaciones de bacterias, debido al efectode lavado que ejerce sobre ellas. Finalmente los patógenos son depositados en elsuelo, el cual constituye una fuente de microorganismos que pueden ser nueva-mente suspendidos en la atmósfera, siempre que la velocidad del viento sea mayora 0.2 ms-1, y el suelo se encuentre lo suficientemente seco.23, 37 Otro mecanismo dedispersión se presenta a través de vectores, como algunos insectos y aves, los cualestransportan hongos y bacterias epífitas en sus extremidades.38, 39
El transporte aéreo es extremadamente deletéreo, ya que las células son ex-puestas a radiación UV, desecación y altas temperaturas; no obstante, algunasbacterias pueden tolerar dichas condiciones. La dispersión de los fitopatógenospuede ser local, si se realiza dentro del mismo cultivo, o de forma global, comoocurre durante las tormentas de polvo. Un ejemplo de transporte a grandes dis-tancias lo representa Puccinia graminis, el cual fue transportado del norte deMéxico y el sur de Texas al norte de los Estados Unidos de América y Canadádurante la primavera, haciendo un recorrido similar en sentido contrario du-rante el verano y otoño. Se han registrado transportes a través de los océanos defitopatógenos que van de Australia a Sudáfrica, de Angola a Brasil y de África alCaribe y América.40, 41, 42 Se requiere del diseño de modelos donde los eventos de
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liberación, dispersión y depositación en el hospedero estén interconectados conlos fenómenos de turbulencia atmosférica y de esta forma poder predecir cómo,cuándo y dónde serán transportados los fitopatógenos.43
EFECTO DE LOS MICROORGANISMOS EN LAS PLANTAS
Las plantas superiores sirven como un ambiente donde pueden desarrollarsepoblaciones y comunidades microbianas, que incluyen bacterias, levaduras yhongos. Las bacterias constituyen uno de los colonizadores más numerosos,registrando concentraciones de 107 bacterias cm-2.12, 44 Las actividades de las plantas,la nutrición y los componentes celulares proveen una fuente de nutrimentospara dichos microorganismos, estos a su vez, son la causa de respuestasmorfológicas, bioquímicas o patológicas en el individuo con el cuál están aso-ciados. Esta relación entre macro y microorganismos es altamente interdepen-diente, debido a la proximidad física tan estrecha que presentan.34 Las relacionesmicrobianas pueden ocurrir en la rizósfera, en la filosfera o en el suelo, a unadistancia cercana de la planta. El interés por dichas relaciones, se debe al impactoeconómico de los fitopatógenos en la producción agrícola, con una clara necesi-dad de entender su comportamiento y control.
Estudios sobre la diversidad de bacterias realizados con las secuencias delácido ribonucleico ribosomal (ARNr) del 16S revelan comunidades más com-plejas a las reportadas con anterioridad.45 En el cuadro 4 se enlistan algunas delas especies fitopatógenas frecuentemente aisladas en hospederos con importan-cia económica. Las bacterias pueden afectar el desarrollo y la productividad deuna planta por diferentes mecanismos: disminuyendo la eficiencia del procesofotosintético, como patógenos, actuando como núcleos de congelación y por laproducción de fitohormonas. Sin embargo, poco se conoce sobre el papel decolonizadores no patógenos; Pseudomonas fluorescens y Pantoea agglomerans sondos especies epífitas que inhiben la colonización de fitopatógenos y actualmenteson explotadas comercialmente.12, 46, 47 Los factores que participan en la relaciónplanta-bacteria son la distribución geográfica y clima, la fenología y edad de laplanta, y la genética de las bacterias.
Dentro de las características de los fitopatógenos se encuentra la abundanciade formas pigmentadas, como Erwinia herbicola, que confieren ventajas selecti-vas para colonizar ambientes expuestos a radiación solar intensa.48 Otro de loshabitantes comunes en las hojas es Pseudomonas syringae, cuyo éxito en la colo-nización se debe a su capacidad para utilizar como fuente de energía y carbonocompuestos como el metanol y metilaminas, los cuales se encuentran disponi-bles en la superficie de las hojas y constituyen una de las principales fuentes deemisión de metanol a la atmósfera.49 Esta característica le permite a la bacteria
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lparasitar más de 80 especies de plantas, causando lesiones necróticas. Otro me-canismo de daño es su participación como núcleo de congelación.50
CUADRO 4. BACTERIAS AISLADAS DE LA FILOSFERA
DE ESPECIES DE IMPORTANCIA ECONÓMICA
HHHHHOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDERO: : : : : CENTENOCENTENOCENTENOCENTENOCENTENO HHHHHOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDERO: : : : : OLIVOOLIVOOLIVOOLIVOOLIVO
Pseudomonas fluorescent Pseudomonas syringaeXanthomonas campestris Xanthomonas campestrisFlexibacter spp. Erwinia herbicolaListeria spp. Acinetobacter acetiStaphylococcus saprophyticus Gluconobacter oxydansKlebsiella spp. Pseudomonas fluorescensAcinetobacter spp. Bacillus megateriumErwinia herbicola Leuconostoc mesenteroidesPseudomonas spp. Lactobacillus plantarumStaphylococcus spp. Curtobacterium plantarumBacillus spp. Micrococcus luteusMicrococcus luteus Arthobacter globiformisAislados no identificados Klebsiella planticola
Streptococcus faeciumHHHHHOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDERO: : : : : PERAPERAPERAPERAPERA YYYYY MANZANOMANZANOMANZANOMANZANOMANZANO Clavibacter sp.Erwinia amylovora Micrococcus sp.Pseudomonas fluorescens Serratia marcescensPantoea agglomerans Bacillus subtilis
Cellulomonas flavigenaHHHHHOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDERO: : : : : OLMOOLMOOLMOOLMOOLMO Erwinia sp.Bacillus megaterium Zymomonas mobilis
Bacillus sp.HHHHHOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDERO: : : : : FRIJOLFRIJOLFRIJOLFRIJOLFRIJOL Alcaligenes faecalisCurtobacterium citreum Erwinia carotovora
Pseudomona aeruginosaHHHHHOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDEROOSPEDERO: : : : : ARROZARROZARROZARROZARROZ
Curtobacterium albidum HHHHHOSPOSPOSPOSPOSPEDEREDEREDEREDEREDEROOOOO::::: DIVERSASDIVERSASDIVERSASDIVERSASDIVERSAS PLPLPLPLPLANTANTANTANTANTASASASASAS
Sphingomonas pruni
BARRERAS PARA LA COLONIZACIÓN
La filosfera puede ejercer una acción selectiva sobre los fitopatógenos. Las condi-ciones químicas, físicas y biológicas determinan cuáles células sobrevivirán,
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proliferarán o morirán, y aunque existen diversas especies con distribución glo-bal, algunas pueden ser excluidas debido a una o más propiedades del hábitatpotencial. La condición que evita la presencia de otras especies es consideradauna barrera, aunque no necesariamente debe ser un obstáculo físico, ya quepueden ser sustancias u organismos los que pueden evitar la colonizaciónmicrobiana. En el caso específico de las plantas, éstas poseen cubiertas que pro-tegen los sitios potenciales de colonización y reducen la difusión de nutrimentos,limitando el crecimiento bacteriano. Tal es el caso de la cutícula externa de losfrutos, la cera de las hojas, los exudados de resina, gomas y taninos.51 Existentambién compuestos fenólicos y glucósidos fungistáticos, y la presencia de dife-rentes enzimas como la peroxidasa, involucrada en la resistencia contra hongospatógenos.34 Estos microorganismos también están sujetos a condiciones extre-mas de desecación, radiación UV, cambios de temperatura, humedad relativa,velocidad del viento, y lluvia ácida, características por las que se considera a lafilosfera como un ambiente estrés.46
GENES ASOCIADOS CON LA PATOGENICIDAD
Se han identificado numerosos genes que capacitan a una bacteriafitopatógena en el proceso de colonización. Durante el contacto entre unaplanta y un microorganismo patógeno se produce una cascada de eventos,dentro de los cuales se distinguen dos tipos de respuesta. La primera requierede un receptor que interactúe con alguna proteína de la bacteria, desarro-llando una reacción protectora inmediata de la planta; en esta situación, labacteria es denominada avirulenta para un genotipo específico.52, 53 En elotro tipo de respuesta existen proteínas virulentas que afectan a la plantaproduciendo radicales libres en el sitio de penetración del patógeno, gene-rando la muerte de las células infectadas.
En ambos casos se requiere de la transcripción de genes que confieran carac-terísticas de resistencia a las bacterias. Tal es el caso del incremento de polisacáridosextracelulares que fortalecen las paredes, la producción de pigmentos como lamelanina y la expresión de genes rulAB, responsables de mecanismos de repara-ción de ADN, características que les permiten a las bacterias resistir condicionesde desecación y tolerar la radiación UV.
La utilización de diferentes compuestos orgánicos como sustratos, moti-lidad, osmotolerancia y la capacidad para adherirse a superficies, son tambiénadaptaciones de fitopatógenos. Algunas de estas características las codificangenes comunes, y otras genes patógenos, como es el caso del gen gae que codi-fica un pili tipo IV que participa en la adherencia de las bacterias.54 El modelomejor estudiado es hrp (reacción de hipersensibilidad y patogenicidad) de
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lPseudomonas syringae, presente en la mayoría de las bacterias fitopatógenasGram negativas y responsable de la necrosis de células vegetales. Algunos genessimilares a hrp han sido identificados de especies no patógenas, en donde fun-cionan como promotores de crecimiento en la rizósfera. Dentro de las funcio-nes de las proteínas codificadas por los genes hrp se encuentran la regulaciónde la transcripción, la síntesis de los componentes de una vía de secreción y lasíntesis de proteínas de secreción de esta vía, lo que conforma un sistema desecreción tipo III, similar al que utilizan los patógenos de animales comoYersinia, Shigella y Salmonella spp.55, 56, 57
En otros fitopatógenos se han caracterizado nueve genes que muestran gransimilitud con las secuencias de hrp altamente conservados, denominados hrc.
Otro grupo de genes requeridos en la formación de lesiones y producciónde toxinas es gacS (activador global del sensor cinasa) y gacA. En este sistemalas proteínas cinasas codificadas por gacS sirven como un sensor de estímu-los ambientales, en donde la señal es transmitida por fosforilación de unregulador citoplásmico, que induce cambios en la transcripción del gen gacAresponsable de la producción de numerosos metabolitos que contribuyen albiocontrol de hongos de la rizósfera; ambos genes también influyen en laproducción de proteasas extracelulares.58 El gen ice presente en cepas dePseudomonas syringae es el responsable del daño por congelación, ya quemuestra una correlación positiva entre la temperatura de congelación y eltamaño de la población de cepas ice +. Actualmente una estrategia de controlde daño es la utilización de cepas recombinantes ice –.12 Los genes asociados aprocesos fitopatógenos continúan siendo estudiados en otras especies, con lafinalidad de esclarecer el comportamiento de la microbiota presente en lafilosfera.
La figura 8 nos muestra cómo un fitopatógeno (Pseudomonas syringae)puede ser dispersado a partir de una semilla infectada y llegar hasta la super-ficie de la hoja; su desarrollo depende de la susceptibilidad y estado vegetativode la planta, la intensidad de la lluvia y del establecimiento de poblacionesnumerosas. En caso contrario, si las condiciones que prevalecen son de dese-cación y calor, aunado al arribo a una planta desfavorable, solamente sobre-vivirá el fitopatógeno. Durante la colonización es necesaria la expresión tan-to de genes ordinarios como de genes patógenos (gac, hrp, ice), los cualesfavorecen el incremento de la población. En esta etapa las bacterias puedenproducir lesiones, que constituyen espacios donde el organismo patógenopuede sobrevivir durante condiciones climáticas desfavorables. Después deeste evento el patógeno está preparado para la emigración y dispersión de laenfermedad. Si la planta llega a un estado maduro y logra producir semillas,el patógeno puede permanecer en ellas hasta que sean sembradas y así iniciarun nuevo ciclo.46
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FIGURA 8. COMPORTAMIENTO DE UN FITOPATÓGENO
Genespatógenos
Ordinarioshrpgac
↓
↓↓
Comunidadbacteriana
Baja probabilidad
ice Emigración
Susceptibilidad de la planta ↓InmigraciónResistencia ↓Viento ↓
gacSsalA
↓
Inmigración
Formación de semillas
Plantaenferma
Nueva planta contaminada por bacterias
Semillas conbacterias
PATÓGENOS DE HUMANOS
La presencia de las bacterias en la atmósfera ha sido investigada principalmentepor su potencial patógeno en plantas y animales, incluyendo al hombre, ya quetanto las estructuras aéreas vegetales como el tracto respiratorio se consideransistemas abiertos, en continuo intercambio con la atmósfera.
En general puede mencionarse que la concentración de bioaerosoles en ex-tramuros es mayor que la existente en intramuros; a pesar de ello la posibilidadde infección para la población general en los ambientes externos es menor. Sinembargo, la entrada de bioaerosoles a los ambientes intramuros59 representa unpeligro importante principalmente en los hospitales, en los que los pacientes conproblemas inmunes pueden ser afectados tanto por los microorganismospatógenos como por los oportunistas presentes en estos.
Recientemente se ha investigado la diseminación de patógenos a través de losocéanos, analizando la dispersión de nubes de polvo de los desiertos africanos.
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lDependiendo de los vientos y la época del año, las nubes de polvo pueden llegaral norte de Europa, América del Norte, Sudamérica, América Central y el Cari-be. Aunque durante mucho tiempo se consideró que la transmisión de microor-ganismos patógenos por esta vía era poco factible, principalmente por el tiempoque tienen que permanecer expuestos a la luz ultravioleta durante el viaje (5-7días para cruzar el Atlántico y 7-9 días para el Pacífico), se ha mostrado quediferentes microorganismos, incluidos algunos patógenos para humanos, pue-den realizar este recorrido y sobrevivir.42
Se cuenta con información42 que señala que existen billones de microorga-nismos por tonelada de polvo; sin embargo, el mismo estudio refiere que con losmétodos de cultivo tradicionales se puede aislar únicamente el 1% de losmicroorganismos asociados a muestras de polvo. Por otro lado, dicho trabajoconsidera que la concentración de patógenos es muy baja para causar infecciónen humanos, aunque es importante tomar en cuenta que un individuo conrespuesta inmune deficiente puede infectarse inclusive con dosis bajas y consti-tuirse en una posible fuente de transmisión en ambientes cerrados.
Las principales fuentes de bacterias en el aire son originadas por el hombre,siendo las más importantes las aguas negras y los desechos de origen animal. Ladegradación y digestión de los desechos produce aerosoles que contienen bacte-rias, algunas de las cuales pueden ser patógenas como es el caso de losestreptococos y las coliformes fecales. El viento y las corrientes turbulentas deaire tienen enorme influencia sobre la distancia que recorren las partículasdespués de ser liberadas. Un estudio realizado en la ciudad de Marsella60 mostróque el número de bacterias se incrementaba con la temperatura y la velocidaddel viento. La identificación de las bacterias mostró que la localización geográfi-ca tenía influencia cualitativa y cuantitativa sobre la biota del aire, observándoseun incremento global de los microorganismos, en particular de las bacteriasGram negativas, sobre todo en el área urbana.
Las bacterias pueden producir endosporas que le confieren resistenciacontra los cambios ambientales, la temperatura y la congelación. Aunque lamayoría de las bacterias esporuladas son anaerobios estrictos (Clostridium),las hay facultativas como en el caso de Bacillus. Las esporas pueden ser trans-portadas a grandes distancias y dispersadas por el viento, por lo que en losúltimos años han adquirido gran relevancia ante la inminencia de atentadosbioterroristas.
Los virus, al igual que las bacterias, normalmente son introducidos a la at-mósfera a través de desechos de origen humano y animal. Sin embargo, su pre-sencia como partículas individuales en el aire es rara. Su detección e identifica-ción en muestras de aire es complicada, por lo que la evidencia de su presenciaen bioaerosoles se ha establecido mediante estudios epidemiológicos en veteri-naria. No obstante, existen reportes de la presencia del virus de la rabia en grutas
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habitadas por murciélagos, y de grupos de enterovirus como: echovirus, poliovirusy coxsackievirus provenientes de muestras de aire obtenidas en sitios de riegocon aguas negras.
El efecto más importante en la población humana (desde el punto de vistaeconómico y por el número de personas afectadas), atribuido a los aerosoles deorigen extramuros, son los problemas de hipersensibilidad, en particular la rinitisalérgica, el asma, así como algunas infecciones. Un ejemplo al respecto lo cons-tituye la legionelosis, padecimiento cuyo agente etiológico es Legionellapneumophila. Se ha descrito que el principal mecanismo de infección en estecaso es la transmisión directa del medio ambiente por la inhalación de gotas deagua aerosolizadas o partículas que contienen Legionella viable; la bacteria sedeposita posteriormente en los alvéolos de los pulmones ocasionando una en-fermedad respiratoria severa.
COMPONENTES DE LAS BACTERIAS IMPLICADOS EN EL DAÑO A HUMANOS
La presencia en los bioaerosoles de componentes de la pared celular de bacterias,como es el caso de la endotoxina de las Gram negativas y los ácidos lipoteicoicosde las Gram positivas, representa un problema de salud. La inhalación de estoscompuestos causa reacciones febriles y una respuesta inflamatoria intensa enlos individuos expuestos.61
Uno de los componentes principales, responsable de dicho efecto son lasendotoxinas, término empleado para describir el lipopolisacárido (LPS) de lamembrana externa de las bacterias Gram negativas, el cual produce un efectotóxico. El lípido A del LPS es químicamente distinto de otros lípidos de las mem-branas biológicas y es el responsable de la actividad tóxica de la molécula.62
Las endotoxinas son ubicuas, dada la naturaleza cosmopolita de las bacteriasGram negativas. En ambientes extramuros se ha encontrado un patrón estacionalen la concentración de endotoxinas presentes en el aire, siendo superior duranteel verano.63 Sin embargo, las concentraciones más altas en la atmósfera (2-7 µgm-3) se han obtenido en ambientes ocupacionales, como son las fábricas dondese procesan fibras vegetales (como el algodón), plantas de tratamiento de aguasresiduales y bioterios, entre otros.64, 65, 66
La respuesta inflamatoria inducida por la endotoxina provoca la liberaciónde citocinas a través de un receptor de membrana denominado CD14 y unaproteína de unión al LPS (LBP) presente en el suero. Aunque se creía que CD14era un receptor específico para la endotoxina, ahora se sabe que también lospeptidoglucanos y los ácidos lipoteicoicos de la pared celular de las bacteriasGram positivas son capaces de estimular macrófagos alveolares, a través de unmecanismo dependiente de CD14.67 Sin embargo, CD14 no es un receptor que
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Las partículas actúan como transportadores de compuestos biogénicos asícomo de microorganismos y alergenos. Diversos estudios epidemiológicos handemostrado que el incremento de aeropartículas menores a 10 µm (PM
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sideradas como partículas inhalables, afecta la salud de niños y adultos. Estasituación se ve reflejada en un aumento en las ausencias escolares por infeccio-nes respiratorias como la bronquitis, la exacerbación asmática, etc. Tal situaciónincrementa las visitas a hospitales e incluso la tasa de mortalidad.68, 69, 70
Las evidencias epidemiológicas antes mencionadas sólo comprometen eltamaño y la concentración de las partículas; sin embargo, la composición delas mismas tiene un papel muy importante en el tipo de respuesta desarrolla-da. Alfaro-Moreno et al.71 demuestran que las partículas ambientales de ori-gen industrial con concentraciones elevadas de metales de transición, colec-tadas en la zona norte de la Ciudad de México, son capaces de inducirapoptosis y daño al ADN en macrófagos y fibroblastos. En cambio, partículascolectadas en la zona centro, un área donde se combina el tráfico vehicular yla contaminación biológica, son responsables de una respuesta inflamatoriamás significativa.
Otros investigadores, como Soukup y Becker72 y Becker et al.73 han demostradoque bacterias ambientales, como Pseudomonas sp. y Staphylococcus lentus, asociadasa las aeropartículas, son las responsables de la producción de citocinas en macrófagosy células CHO transfectadas con CD14, ya que su producción puede ser reducidahasta en un 50% cuando se utilizan inhibidores de endotoxina como la polimixinaB o bloqueando el receptor CD14. Este tipo de respuesta es tres veces más alto conbacterias Gram negativas; sin embargo, éstas se presentan en menor concentra-ción en la atmósfera. Osornio-Vargas et al.74 reportaron resultados similares endonde la producción de citocinas se ve disminuida por la proteína neutralizante deendotoxina (PNEr); sin embargo, no se observa una completa inhibición, lo quesugiere la participación de otros componentes presentes en las partículas durantela respuesta inflamatoria. El aire de ambientes urbanos registra concentracionesrelativamente altas de bacterias y endotoxina asociadas a partículas, por lo que suinhalación constituye un riesgo para la salud.
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Vibrio cholerae: UNA BACTERIA AMBIENTAL
CON DIFERENTES TIPOS DE VIDA
Carlos Eslava, Irma Rosas, Martha Solano, Gabriela Delgado,Maritoña Ramírez, Jorge Villaseca y Alejandro Cravioto
1. INTRODUCCIÓN
EN 1965, VÉRON propuso crear la familia Vibrionaceae para agrupar aquellosgéneros cuyas especies fueran oxidasa positiva y móviles por un flagelo polar. Lafamilia está constituida por los géneros Vibrio, Photobacterium, Aeromonas yPlesiomonas. El género Vibrio incluye 35 especies de las cuales 26 se han identi-ficado como agentes etiológicos de enfermedad en humanos, de éstas, Vibriocholerae es una de las especies con mayor importancia clínica y epidemiológica.1
Los vibrios son proteobacterias-gama, heterótrofas, cuyo hábitat primarioson los ecosistemas acuáticos salobres y marinos, en donde ocupan una grandiversidad de nichos. Están presentes en la columna de agua y en el sedimento,por lo que se les puede encontrar como bacterias de vida libre, comensales,saprobias o parásitas.2 Las bacterias de este género son bacilos curvos o rectos,Gram negativos, anaerobios facultativos, móviles por flagelos polares y noesporulados. Para estimular el crecimiento de Vibrio spp. se requiere de 5 a 15mM de NaCl. Sin embargo, V. cholerae puede crecer sin la adición de NaCl almedio y en un pH alcalino (10-6.0); con menor de 6.0 su crecimiento se inhibe.3
2. EL COMPORTAMIENTO DE VIBRIO EN ESTADO DE VIDA LIBRE
Cuando los vibrios se encuentran en su forma de estado libre (planctónica)queda claro que las condiciones en este hábitat son extremas, ya que el materialsuspendido en la columna de agua, así como el contenido de nutrimentos engeneral, es bajo.4 En tal situación adopta una condición morfológica diferente ala que se conoce, disminuye su tamaño (pueden pasar filtros de hasta 0.2 mm),por lo que en este estado se denominan microvibrios.5
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en los sistemas salobres y marinos, ya que forma parte del exoesqueleto decrustáceos como la jaiba y el camarón, por lo que representa una fuente muyrica de carbono y nitrógeno.
3. Vibrio: MICROORGANISMO PATÓGENO EN SU HÁBITAT
Es importante analizar los casos en que los vibrios pueden actuar como patógenosde organismos acuáticos de importancia comercial, o bien que estos organis-mos puedan ser un vector de patógenos para el hombre. Al respecto se ha estu-diado la relación entre Vibrio y los copépodos; por un lado, la bacteria utiliza laquitina de estos últimos como sustrato y por otro, dado que uno de los sitios decolonización es el saco ovígero, cuando el copépodo libera los huevos fertiliza-dos al ambiente estos se convierten en un vehículo para la diseminación de losvibrios.7
Con respecto a su participación como patógeno, se ha reportado que V.anguillarum, V. alginoliticus y V. splendidus son responsables de ocasionar lamuerte de larvas de ostión. El estudio del posible mecanismo mediante el cualcolonizan y producen la muerte de dichas larvas, señala que un estado de estrésdel hospedero da lugar a una respuesta neuroendócrina que incrementa losniveles de noradrenalina induciendo la liberación de hierro, elemento impor-tante para la reproducción de los vibrios.10 Se ha establecido que ciertos factoresambientales afectan el comportamiento de la bacteria. Por ejemplo diversosestudios muestran cómo el incremento de la temperatura influye en el com-portamiento patógeno de diferentes especies de Vibrio sobre ciertos organismosacuáticos.11
• V. coralliilyticus: Pocillopora damicornis
• V. splendidus: larvas Crassostrea gigas
• V. carcharine: Haliotus tuberculata
• V. vullneficus: Angulla anguilla• V. peneaicid: camaron• V. parahaemolyticus: peces
4. TRANSMISIÓN DE Vibrio A LOS A SERES HUMANOS
Los organismos acuáticos, principalmente los bentónicos filtradores que seconsumen crudos, pueden ser vectores de vibrios patógenos para el hombre. Enlas costas del Golfo de México V. vulnificus alcanza concentraciones de hasta 105
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(basados en las diferencias de los componentes del polisacárido del antígenosomático) designadas como Ogawa, Inaba e Hikojima según su formulaantigénica AB, AC y ABC, respectivamente. Además Vibrio cholerae O1 se divideen dos biotipos: Clásico y El Tor, que difieren entre sí por pruebas de hemoaglu-tinación de eritrocitos de pollo, hemólisis de eritrocitos de carnero, sensibilidada los bacteriófagos IV (Clásico) y (V) El Tor, la reacción de Voges–Proskauer(VP) y susceptibilidad a la polimixina B.3
Los Vibrios que no aglutinan con el suero anti O1 se denominan genérica-mente como no-O1 o no aglutinables (NAG). En 1994 el esquema de tipificaciónpor serología reconocía hasta el serogrupo O140, incluyendo dos particular-mente importantes, O139 Bengal, causante de una epidemia parecida al cóleraen el sureste asiático a finales de 1992, y el serogrupo O140 o Hakata, que poseesolamente el factor antigénico C (presente en serotipo Inaba), pero carece delfactor A, el cual es específico para el Vibrio cholerae O1, el esquema actualincluye aproximadamente 200 diferentes variedades antigénicas.13
La diseminación de la enfermedad en India y Bangladesh, causada por elserotipo O139 o Bengal, marcó por primera vez que una cepa de Vibrio choleraeno-O1 haya sido asociada a grandes epidemias,14 aunque continúa estando con-finada al Sur-Este Asiático. Vibrio cholerae O139 es responsable de aproximada-mente el 15% de los casos de cólera confirmados en uno de los países endémi-cos de Asia.15, 16
6. Vibrio cholerae, BACTERIA ADAPTADA PARA SOBREVIVIR EN
DISTINTOS HÁBITATS
El comportamiento epidémico de V. cholera, en su estadio de patógeno de sereshumanos, se ha asociado con los florecimientos de plancton, componente bióticodel ambiente acuático que le permite mantenerse y reproducirse. Durante suestancia en su habitat primario, la bacteria presentan gran capacidad para res-ponder a cambios ambientales como la temperatura y la salinidad, variacionescualitativas y cuantitativas de nutrimentos, presencia de depredadores y/o com-petidores, así como a la existencia de tóxicos tanto antropogénicos comobiogénicos. La propiedad que ha desarrollado el género Vibrio para detectar yresponder ante situaciones emergentes es de gran importancia para su supervi-vencia y transmisión. Diferentes estudios han conducido a la identificación dealgunos mecanismos con los cuales la bacteria puede sobrevivir en situacionesextremas.17,18
Cambios morfológicos ante la disminución de nutrimentos. El proceso que adop-tan las bacterias ante la falta de un sustrato generador de energía se denomina
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presencia como organismo autóctono en áreas endémicas durante periodoslibres de cólera, su existencia en periodos inter-epidémicos, los factores am-bientales que contribuyeron a su re-emergencia en América Latina,24 así comoa los componentes ambientales que contribuyen a su permanencia en regionesendémicas de cólera.
En años recientes se encontró que el genoma de V. cholerae y otros integran-tes del mismo género, presenta 4,033,460 pares de bases (pb), constituido pordos cromosomas circulares,25 de 2,961,146 pb (cromosoma 1) y 1,072,314 pb(cromosoma 2). En conjunto ambos codifican para 3,885 marcos de lecturaabierta. La mayoría de los genes que son esenciales para las funciones básicas dela bacteria (replicación, transcripción y traducción del ADN y biosíntesis de lapared celular), así como de patogenicidad (toxinas y adhesinas), se localizan enel cromosoma mayor. Por otro lado, el cromosoma pequeño contiene 59% degenes hipotéticos, mientras que en el mayor el 42% de estos no tiene una fun-ción conocida. La mayoría de los genes requeridos para el crecimiento y laviabilidad de la bacteria están ubicados en el cromosoma 1 aunque también, ysolo presentes en el cromosoma 2, hay genes que pueden ser esenciales para elfuncionamiento normal de la célula (dsdA, thrS, genes que codifican para lasproteínas ribosomales L20 y L35 y otros que codifican para diferentes interme-diarios de rutas metabólicas).
La secuencia del genoma de V. cholerae permitió confirmar la presencia deun sistema de captura de genes (isla de integración) localizado en el cromosoma2 (125.3 kbp). Entre los genes presentes en esta isla se encuentran tres quecodifican para productos involucrados en la resistencia a los antimicrobianos(cloramfenicol acetiltransferasa, proteína para resistencia a la fosfomiocina y laglutation transferasa), varias enzimas del metabolismo del ADN (MutT,transposasa y una integrasa), genes de virulencia (hemaglutininas ylipoproteinas) así como tres genes que codifican para productos similares a lasproteínas de adicción del hospedero (higA, higB y doc), utilizados por losplásmidos para la selección y el mantenimiento en las células del hospedero.
El análisis de la secuencia del genoma de V. cholerae mostró que la mayoríade los genes presentaban gran similitud con los de E. coli (1,454 MLA (marcosde lectura abierta)). También se encontró que 499 (12.8%) de los MLA teníanalta similitud con otros genes, lo cual sugiere la existencia de duplicacionesrecientes. La mayoría de los MLA duplicados codifican para productosinvolucrados en funciones de regulación, quimiotaxis, transportes y adheren-cia, transposición y patogenicidad. De un total de aproximadamente 105duplicaciones, por lo menos un MLA se encuentra en cada cromosoma, lo quesugiere que se han presentado entrecruzamientos recientes entre ambos. Laextensa duplicación de genes involucrados principalmente en mantener lahomeostasis de la bacteria (quimiotaxis y transporte de solutos), apoya la im-
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En el ambiente acuático, la quitina representa una fuente de carbono y nitró-geno. Esta fuente de energía es importante para V. cholerae cuando está asociadocon el zooplancton, el cual tiene un exoesqueleto quitinoso.27,28 Para el transportede molibdeno, fosfato y sulfato existen genes en uno o ambos cromosomas. Losinvolucrados en el transporte del molibdeno se localizan en el cromosoma pe-queño, y los encargados del transporte del sulfato se alojan en el cromosomamayor. Sin embargo, en ambos cromosomas existen copias de los genes para lostransportadores del fosfato, los cuales son diferentes en cada cromosoma, lo queindica que no son consecuencia de una duplicación reciente.
9. REGULACIÓN INTERCROMOSOMAL
Las vías de regulación activadas en respuesta a señales ambientales y patogénicasse codifican entre los dos cromosomas. Lo anterior incluye procesos para la super-vivencia durante periodos de inanición, censado por mayoría (quórum sensing) yexpresión de la hemolisina (HlyA). En los periodos de carencia de nutrimentos, V.cholerae y otras bacterias Gramnegativas entran inicialmente en una fase estacio-naria y posteriormente al estado VBNC. El factor sigma j38 (rpoS) es importantepara la supervivencia de V. cholerae pero no para su patogenicidad, lo que sugiereque dicho factor tiene una función muy importante en la iniciación del estadoVBNC. Existe una copia de rpoS, localizada en el cromosoma 1, cerca de oriCRpoS que regula la expresión de proteínas como la catalasa, ciclopropano-graso-acil-fosfolípido sintetasa y HA/proteasa, las cuales se encuentran en amboscromosomas. Los genes implicados en quorum sensing, una regulación depen-diente de la densidad celular, se encuentran también sobre ambos cromosomas.El conocimiento de la secuencia del genóma de V. cholerae está permitiendo en-tender, de manera más clara, cómo una bacteria de vida libre emerge como pató-geno de enormes consecuencias para los seres humanos.
10. GENES IMPLICADOS EN LA VIRULENCIA DE V. cholerae
El proceso infeccioso causado por V. cholerae es bastante complejo e involucraun gran número de factores; este patógeno se ayuda de ellos para establecerse ycolonizar el epitelio intestinal, para lo cual expresa diversos factores de coloni-zación así como varias enterotoxinas potentes. Los genes cuyos productos ac-túan como factores de virulencia se encuentran formando parte de agrupa-mientos (clusters). Anteriormente se creía que estos genes formaban parte delcromosoma bacteriano de las cepas toxigénicas, pero hoy se sabe que son partedel genoma de fagos de tipo filamentoso.29,30
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La liberación de CTXF, al igual que en otros fagos filamentosos, puedeinducirse con luz ultravioleta o con mitomicina C.34 Una característica observa-da en este fago es que pude insertarse a una secuencia de 18 pb denominadaattRS (sitio de ligamiento), presente en el cromosoma de algunas cepas de V.cholerae, o bien no integrarse y comportarse como un plásmido.
La parte central (core) se encuentra flanqueada por una o más copias de laregión llamada RS; esta es una secuencia de repetidos que se ha dividido en RS1y RS2 de 2.7 y 2.4 kb, respectivamente. Esta región codifica para un sistema deintegración sitio específico, presentando por lo menos 4 MLA. Se ha observadoduplicación en tándem del RS y en algunas de todo el elemento CTX. Kimsey ycolaboradores35 encontraron que RS1 y RS2 presentan diferencias en sus se-cuencias, lo que conlleva a diferencias funcionales entre los profagos encontra-dos en las cepas Clásica y El Tor. En las cepas de V. cholerae O1 del biotipo Clásicohay una copia del profago CTX en cada uno de los dos cromosomas, mientrasque en las cepas del biotipo El Tor el profago está arreglado en tándem en los doscromosomas. En las cepas El Tor el genoma del fago a menudo se encuentraflanqueado por una copia adicional de RS1, la cual contiene genes adicionales aRS2.34,35
13. VPI : CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES
Para la introducción de CTX en las cepas de V. cholerae es necesaria la presencia deTCP que, como ya se mencionó, es un componente necesario para la coloniza-ción intestinal. Recientemente se ha propuesto que TCP también es codificadopor un fago filamentoso denominado VPI.30 El fago filamentoso VPI codifica paraTCP (figura 4), el cual es un importante factor de virulencia así como receptor delfago CTX. Al igual que CTX , VPI posee ADN de cadena sencilla y positiva, y elgenoma de este fago contiene los clusters TCP y ACF, los cuales contienen genescuyos productos actúan como importantes factores de virulencia.
FIGURA 3. REPRESENTACIÓN GRÁFICA DEL FAGO CTX
RS1 RS2
cap orfU
acectxBctxA
zot
RS1
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mas de regulación en V. cholerae conducen a una variación en la expresión de losgenes de virulencia optimizando su permanencia en diferentes ambientes talescomo el intestino humano y el hábitat marino.
15. EVENTOS INVOLUCRADOS EN LA GENERACIÓN DE CEPAS EPIDÉMICAS
Los mecanismos involucrados en la emergencia de nuevas clonas no han sidoexplicados, auque se considera que la combinación entre cambios genéticos y laselección natural causada por factores ambientales no identificados, así como elestado inmune de la población, influyen de manera importante en este proceso.Además de determinar la importancia de los factores ambientales dentro de laecología de V. cholerae, se requiere conocer más con respecto a los mecanismosutilizados por los fagos filamentosos (CTX y VPI ) en la transferencia de genes devirulencia. La existencia de epidemias ocasionadas por V. cholerae O139, de bro-tes debidos a cepas O37, así como el hallazgo de los genes ctxA, tcpA y toxR encepas no O1 ambientales, apoya la hipótesis de que la transferencia horizontalde CTX puede presentarse entre cepas O1 ctxA¯ tcpA+ o ctxA+ tcpA¯ y no-O1ctxA+ or tcpA+, las cuales coexisten en el ambiente acuático.40,41,42
Se ha mencionado que la infección de V. cholerae por CTX, requiere la presen-cia de TCP, por lo que se propuso un sistema secuencial de dos pasos para laevolución de cepas epidémicas. Lo anterior sugiere que las bacterias inicialmentetienen que adquirir TCP a través de la infección por VPI , para posteriormente serinfectadas por CTX . Se sabe que los cultivos de V. cholerae que contienen al fago encualquiera de sus formas (lisógenos o plásmidos) producen altos títulos del fagoen sus sobrenadantes, por lo que la propagación del CTX puede estar asociada aeventos de transferencia horizontal dando lugar a nuevas cepas toxigénicas.42
Estudios en nuestro laboratorio (datos no publicados) permitieron observarcómo el sobrenadante del cultivo de la cepa epidémica O37 ctxAB+ tcpA+ toxR+(aislada en Sudan en 1969), expuesto a la luz solar durante varios minutos,liberaba partículas de CTX. Por otro lado, al incubar una cepa O1 El Tor (2740-80) ctxAB¯ tcpA+ att+ con estos sobrenadantes, se permitió encontrar que serecuperaban lisógenos 2740-80 ctx+. Estos resultados sugieren que cepas de V.cholerae no-O1 ctxA+ pueden ser inducidas naturalmente para liberar virionesCTXΦ, y de la misma manera lisogenizar cepas O1 no toxigénicas. Gracias a estetipo de mecanismos las propiedades de virulencia pueden evolucionar a gran-des pasos a través de la transferencia horizontal de grandes bloques de materialgenético más que a la acumulación de mutaciones de nucleótidos. Estos even-tos de transferencia horizontal de genes probablemente se presentan en la natu-raleza y es así como contribuyen de manera importante al mantenimiento delas áreas endémicas de cólera.
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origen de la cepa que ocasionó el nuevo brote de cólera en América es unmisterio rodeado de especulaciones. Se ha propuesto que el microorganismofue importado por viajeros procedentes de áreas donde el cólera es endémico,pero, por otro lado también se sugiere que la bacteria era un microorganismo devida libre nativo de las costas de Perú, el cual emergió por efecto de algún factorambiental como un patógeno infeccioso con alto potencial epidémico.
En contraste con lo reportado anteriormente sobre las cepas de Vibrio choleraeO1, las cepas de Vibrio cholerae no-O1 no presentaban importancia médica oepidemiológica ya que se creía que eran responsables únicamente de casos es-porádicos de diarrea en humanos. En octubre de 1992 un importante brote de unaenfermedad parecida al cólera, causada por un serogrupo de Vibrio cholerae no-O1, apareció en India y Bangladesh y rápidamente se diseminó a Pakistán, Nepal,Tailandia, Malasia y China.14,15 Estudios serológicos identificaron a estas cepascon el serogrupo O139 con el sinónimo Bengal (lo que indicó el lugar de aisla-miento de las primeras cepas, las ciudades costeras de la bahía de Bengala). Estascepas producían cantidades similares de toxina colérica a las observadas con V.cholerae O1, por otro lado, también hibridizaban con sondas específicas para losgenes ctxA y ctxB y las características clínicas de la enfermedad causada por estaseran indistinguibles del cólera.16,45,46 Ensayos con el método de enzimas multilocusdemostraron que diferentes cepas de V. cholerae O139 aisladas en el Sureste Asiá-tico mostraban un perfil electroforético idéntico al del Vibrio cholerae O1 Ogawabiotipo El Tor aislado en México durante la epidemia.47
Resultados similares se obtuvieron al analizar cepas representativas delserogrupo O139, aisladas en diferentes lugares del mundo desde su aparición en1992, y al compararlas con las de una colección de V. cholerae O1, no-O1 y no-O139, aisladas entre 1969 y 1999. Lo anterior permitió sugerir que V. choleraeO139 incluye cepas epidémicas y no epidémicas que evolucionaron de diferenteslinajes y derivan de V.cholerae O1 o no-O1 respectivamente. El análisis de 397aislados de V. cholerae O1, O139 y otros serogrupos no O1, mostró, por un lado, ladiversidad genética de la bacteria y por otro la relación genética entre las clonasepidémicas O1 y O139 y serogrupos no O1, así como su estructura poblacional.48
Los resultados mostraron además que las cepas O1 y O139, pandémicasjunto con una clona del serogrupo O37 (que en la década de 1960 demostrótener potencial epidémico), conforman un grupo relacionado genéticamente,sugiriendo que estas clonas aparecen por modificación del linaje que ya eraepidémico o muy relacionado genéticamente al de las clonas epidémicas. Lainferencia, por lo menos en este grupo de cepas, es que la tasa de transferenciahorizontal y/o eventos de recombinación de genes del metabolismo básico sonsuficientemente altas para prevenir el desarrollo y el mantenimiento a largoplazo de alelos distintivos. Aún así los linajes clonales que se observaron pue-den persistir durante periodos largos (hasta décadas). Los ejemplos más obvios
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LA ECOLOGÍA DE LAS AMIBAS
PATÓGENAS DE VIDA LIBRE EN
AMBIENTES ACUÁTICOS
Patricia Bonilla, Elizabeth Ramírez, Ricardo Ortízy Carlos Eslava
1. INTRODUCCIÓN
LAS AMIBAS DE VIDA LIBRE (AVL) son protozoos cosmopolitas que habitan am-bientes húmedos como el suelo y el agua, aunque también se pueden encontraren el aire, vehículo que utilizan como medio de dispersión. En los ecosistemasacuáticos desempeñan un papel muy importante en el mantenimiento del flu-jo de energía y el reciclado de los nutrimentos. Su eficiencia en el uso de losrecursos los convierte en un enlace fundamental entre los organismos desintegra-dores y aquellos pertenecientes a niveles tróficos superiores.
A mediados del siglo XX se descubrió que algunas amibas pequeñas delsuelo y del agua, que hasta entonces se consideraban inocuas, podían invadira los seres humanos así como a otros animales, pudiendo causarles la muerteo un daño cerebral irreversible. Debido a su habilidad para vivir como orga-nismos de vida libre y como endoparásitos, a las amibas se les conoce tambiéncomo organismos anfizoicos. Algunas son patógenas por sí mismas pero tam-bién pueden actuar como vectores de bacterias patógenas como Legionellapneumophila y Vibrio spp.
Las AVL patógenas son más frecuentes en cuerpos de agua con temperaturapor arriba de los 25 ºC y aguas naturales de los trópicos y subtrópicos. A la fechase han descrito las especies Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris y algunasdel género Acanthamoeba. Naegleria fowleri es capaz de producir en el hombremeningoencefalitis amibiana primaria (MEAP), enfermedad fulminante y mor-tal. Balamuthia mandrillaris y varias especies del género Acanthamoeba puedenprovocar encefalitis amibiana granulomatosa (EAG). Acanthamoeba spp. tam-bién puede provocar infecciones severas en pulmón, oídos, nariz y queratitisamibiana (QA) en ojos. En comparación con otras enfermedades causadas porprotozoos, las infecciones causadas por AVL destacan por su amplia distribu-
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lción, extrema virulencia y falta de tratamiento efectivo. El primer caso clínicoproducido por AVL fue descrito en Australia en 1965 y a partir de entonces sehan registrado casos en todo el mundo, lo que demuestra su amplia dispersióny sugiere la posibilidad de que muchos casos hayan pasado inadvertidos por lafalta de conocimiento acerca de este grupo de organismos.
2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
El trofozoíto de Naegleria presenta una forma alargada característica, por loque se le conoce como amiba limax, mide entre 15 y 25 µm, su locomociónes por medio de lobópodos y se reproduce por fisión nuclear (promitosis).El quiste es esférico, mide de 8 a 12 µm de diámetro, cuenta con una pareddoble lisa y con uno o dos poros planos. Las amibas de este género presentanuna forma flagelada piriforme, que es fácilmente reversible a la etapa detrofozoíto.1, 2, 3
El trofozoíto de Acanthamoeba es más grande que el de Naegleria (entre 24 y56 µm), se caracteriza por presentar seudópodos finos llamados acantópodos, sedivide por fisión binaria por medio de una mitosis típica. El quiste es ornamen-tado, mide entre 11 y 25.3 µm de diámetro, presenta una pared doble y poros enla unión del ectoquiste y el endoquiste.....1, 2, 3
El trofozoíto de Balamuthia mandrillaris es el más grande de los tres génerospatógenos, mide entre 12 y 60 µm, tiene forma irregular, algunas veces presentala forma limax y en otras adopta una forma de araña con seudópodos noramificados. El quiste mide entre 6 y 30 µm, su pared densa está compuesta portres capas y no presenta poros.4
FIGURA 1. Naegleria: A) TROFOZOÍTO LIMAX CON LOBÓPODO ANCHO Y UROIDE; B)ETAPA DE TRANSICIÓN ENTRE AMIBA Y FORMA FLAGELADA CON 2 FLAGELOS Y LOBÓPODO;
C) QUISTE CIRCULAR CON DOBLE PARED LISA. CONTRASTE DE FASES. 400 ×.
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FIGURA 2. Acanthamoeba: A) TROFOZOÍTO CON ACANTÓPODOS. CONTRASTE DIFEREN-CIAL DE INTERFERENCIA; B) QUISTE CON ENDOQUISTE ESTRELLADO; C) QUISTE CON
ENDOQUISTE POLIGONAL Y D) QUISTE CON ENDOQUISTE SEMICIRCULAR. CONTRASTE DE
FASES. 400 ×. a: ACANTÓPODOS: n: NÚCLEO; nu: NUCLÉOLO; pa: PARED; po: PORO;ec: ECTOQUISTE; en: ENDOQUISTE
FIGURA 3. Balamuthia: A) TROFOZOÍTO ALARGADO (LIMAX) Y B) QUISTE CON PARED
DENSA. CONTRASTE DE FASES. 400 ×. pa: PARED; l: LOBÓPODO; u: UROIDE
AAAAA BBBBB
CCCCC DDDDD
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AAAAA BBBBB
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3. HÁBITAT
Como ya se hizo referencia, las AVL presentan en general una distribucióncosmopolita y son ubicuas en la naturaleza. Las especies patógenas sontermotolerantes, aunque no todas las termotolerantes son patógenas.5 Su hábitatprincipal es el suelo y desde ahí pueden llegar a los cuerpos de agua arrastradaspor escurrimientos o a través del aire.6, 7 En el agua desempeñan un papel fun-damental en el flujo energético y en el reciclado de los nutrimentos. Su creci-miento rápido, el uso eficiente de los recursos comparado con formas superio-res de vida, así como el hecho de ser un enlace fundamental entre desintegradoresy niveles tróficos superiores, los convierten en un eslabón importante en lascadenas alimentarias acuáticas.8 Las AVL se encuentran en mayor proporciónen la microcapa superficial, debido a la abundancia de nutrimentos y al estable-cimiento de quistes aéreos, y se hallan en menor proporción en los sedimentos.9
El análisis por género nos muestra que Naegleria vive principalmente en elsuelo y ambientes acuáticos calentados natural o artificialmente,10 aunque tam-bién se puede establecer en estanques, cascadas, manantiales, lagos y ríos contemperaturas menores.1, 11 Naegleria se ha aislado de agua de grifo, piscinas,aguas termales, aguas de desecho, canales de riego, tinas de hidroterapia, lagosartificiales y efluentes calientes de plantas termoeléctricas.12, 13
Las especies patógenas se observan con mayor frecuencia en cuerpos de aguacon temperaturas por encima de los 30 ºC y aguas naturales de los trópicos ysubtrópicos. En países templados y fríos las amibas patógenas proliferan mejordurante los meses más cálidos, lo que lleva a pensar en un patrón estacional.5,1
Algunos investigadores han propuesto que el incremento brusco de temperatu-ra, más que una temperatura elevada constante, es lo que realmente favorece lapredominancia de las naeglerias patógenas.14
Los factores ambientales favorables para el desarrollo de este género de amibasson intervalos de temperatura entre 30 °C y 45 °C, niveles óptimos de oxígeno,pH cercano a la neutralidad, alimento suficiente (bacterias y materia orgánica)y un mínimo de humedad; sin embargo, pueden soportar variaciones amplias.En piscinas, la presencia de cloro libre residual en concentraciones de 2 mg L-1
puede inhibir su presencia.2
Acanthamoeba se encuentra distribuida en todos los ambientes,1, 10 y proba-blemente es la amiba con mayor distribución en la naturaleza, debido a la granresistencia de sus quistes.15 Como consecuencia de su distribución cosmopolitael contacto con el ser humano es constante y probablemente es la razón de lapresencia de anticuerpos de Acanthamoeba y de Naegleria en suero humano.10
Acanthamoeba se ha aislado de diversos tipos de agua: natural superficial (estan-ques, lagos y ríos), subterránea, marina, de grifo, piscinas, aguas termales, agua
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mineral embotellada, agua de desecho, canales de riego, tinas de hidroterapia,lagos artificiales, efluentes calientes de plantas termoeléctricas e incluso de aguacongelada.13, 11, 16, 17 También se ha aislado de diferentes tipos de suelo, sedimentooceánico, sedimento de lagos, lodos resultantes del tratamiento del agua dedesecho, polvo de casas-habitación y de composta.1, 2, 18
De las AVL potencialmente patógenas Acanthamoeba es la única que se haaislado de muestras de aire extra e intramuros, así como de conductos de aireacondicionado. Se considera que debido a las condiciones extremas en ese am-biente, el aire solo les sirve como medio de dispersión. 1, 6, 18 Dos fuentes dedonde aisló Acanthamoeba, el agua de grifo y lentes de contacto, están muyrelacionadas con la incidencia de la queratitis amibiana. Algunas especies tam-bién se han aislado de recipientes para lavado de ojos.10, 2
Debido a que Balamuthia mandrillaris solo se puede desarrollar en cultivosde tejido y en un medio axénico muy específico, su búsqueda en el ambiente seha restringido y no se conoce exactamente su hábitat. Se aisló por primera vez deun mandril y posteriormente de pacientes con EAG,4 aunque recientemente sereportó lo que se considera el primer aislamiento ambiental (suelo).19
Por otro lado, se ha demostrado que Acanthamoeba y Naegleria, entre otrasAVL, participan como vectores de diferentes especies bacterianas.20 Legionellapneumophila es capaz de multiplicarse dentro de la célula amibiana, causar lisisy liberarse nuevamente en el ambiente. V. cholerae sobrevive dentro de los quis-tes de Naegleria y puede recuperarse después de que la amiba exquista. En estecaso las AVL, ayudan a mantener a V. cholerae en aguas naturales en partes delmundo donde no hay asociación evidente con casos de cólera clínico. Tambiénalgunas bacterias coliformes y Mycobacterium avium sobreviven dentro de lasamibas aunque sin multiplicarse. De esta manera, el quiste amibiano no soloofrece a las bacterias un mecanismo de protección para evadir ambientes hosti-les, sino también les proporciona un medio para transportarse y colonizar nue-vos hábitats aprovechando los mecanismos de dispersión de las AVL.
4. CICLO DE VIDA
El ciclo de vida de las AVL (figura 4) comprende una fase activa, llamada trofozoítoy una forma quística en latencia, presentándose además en Naegleria, una for-ma flagelada.2, 10 Naegleria presenta tres fases en su ciclo de vida: trofozoíto,quiste y flagelado (figuras 1 y 4). La forma de quiste es la fase de resistencia en lacual la amiba se mantiene en latencia y puede resistir largos períodos en condi-ciones adversas como la desecación, bajas concentraciones de oxígeno, escasezde alimento, etc.2 En los cultivos de laboratorio se ha observado que el quiste deNaegleria es menos resistente que el de Acanthamoeba.
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lEn el ciclo de vida de Naegleria se destaca su capacidad para cambiar a la
forma flagelada, la cual se presenta cuando la amiba se encuentra en un mediosin nutrimentos. En el laboratorio se induce la forma flagelada incubando laamiba en agua destilada o en una solución búffer. En forma transitoria, el orga-nismo no se alimenta ni se divide y después de un tiempo, cuando la amibaencuentra nuevamente un ambiente adecuado, regresa a su forma amibiana.2
Este proceso se realiza en cuestión de minutos; en el laboratorio es posibleobservar por unos segundos a la amiba presentando al mismo tiempo seudópodosy flagelos (figura 1b).
Las diversas especies de Acanthamoeba y la única especie de Balamuthia (B.mandrillaris) presentan solamente dos etapas en su ciclo de vida, la etapa detrofozoíto y la forma quística (figuras 2, 3, 4). La etapa de trofozoíto, igual queNaegleria, es la forma en la que la amiba realiza todas sus funciones. La forma dequiste es la estructura de resistencia, la cual regresa a su forma vegetativa cuan-do las condiciones son favorables.
En el laboratorio se ha observado que el trofozoíto de Acanthamoeba puedepermanecer algún tiempo sin enquistarse aunque las condiciones no sean tan favo-rables y en medio líquido se redondea y presenta prolongaciones citoplasmáticassimilares a la forma flotante de otras amibas pequeñas de vida libre (por ejemplo,Vannella y Platyamoeba). El quiste de Acanthamoeba es muy resistente y puedepermanecer viable en los cultivos por meses e incluso años; probablemente a esto sedebe su amplia distribución y alta incidencia en el ambiente.15
5. LA IMPORTANCIA MÉDICA DE AVL
Naegleria fowleri causa una infección aguda que afecta al sistema nervioso cen-tral (SNC) llamada Meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP))))) o naegle-riosis. El mayor número de casos se presenta en niños y jóvenes previamentesanos con antecedente de haber nadado durante el verano en cuerpos de aguanaturales contaminados o artificiales inadecuadamente clorados. La ruta deinvasión de N. fowleri es a través de la aspiración por las fosas nasales del aguacontaminada (figura 4); los trofozoítos invaden la mucosa olfatoria, atraviesanel nervio olfatorio, la lámina cribiforme y llegan al espacio subaracnoideo.
Las amibas producen edema y necrosis hemorrágica en el tejido cerebralmediante la producción de hidrolasas lisosomales y fosfolipasas que degradan lamielina y provocan daños graves e irreversibles en el individuo infectado. Tam-bién se han descrito otras enzimas como aminopeptidasas, hidrolasas, esterasas,fosfatasas ácidas y alcalinas, que directa o indirectamente dañan al SNC.2, 3, 21 Laenfermedad se caracteriza por cefalea intensa, fotofobia, fiebre, náusea, vómitoen proyectil y rigidez de cuello; coma, convulsiones y finalmente la muerte. La
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FIGURA 4. CICLO DE VIDA DE Naegleria fowleri Y Acanthamoeba SPP.
Fuente: 3.
mayoría de los individuos mueren en la primera o segunda semana después dela manifestación de los primeros síntomas, dependiendo del manejo y resisten-cia del paciente, así como de la virulencia de las amibas.3
↓
↓
Naegleria fowleri
Trofozoíto
Agua destilada
Formaflagelada
Esquistamiento
Quiste
MEAPQuistes en
verano
Trofozoíto
Formas flageladas
Individuos sanosy jóvenes
Natación oinhalación
Neuroepitelio olfatorio
Cerebro (MEAP)
45 °C
Aire
Polvo ambiental
Suelo y agua
↓
Acanthamoeba spp.
Exquistamiento
Vía neuroepitelio olfatorio
Trofozoíto
QuisteE A G
subaguda o crónica
Dispersión víasanguínea
Úlceras en la piel
E A G (huésped inmunocomprometido)
Queratitis
Neumonitis
Dermatitis
Quistes todo el año
25-30 °C
Trozofoito/quisteTraumatismo en córnea
Uso de lentes de contacto
Soluciones contaminadas polvo-agua
QueratitisIndividuos
inmunocomprometidos
Pulmones
Cerebro EAG
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lEl diagnóstico se realiza observando preparaciones de líquido cefalorraquídeo
(LCR) en vivo o teñidas con Wright, Giemsa o Hematoxilina y Eosina.22 Sinembargo, uno de los principales problemas para identificar a las amibas es quepueden confundirse con macrófagos, células epiteliales o pasar inadvertidascomo simples partículas de sedimento del LCR. En las muestras clínicas, eldiagnóstico se confirma con el aislamiento de trofozoítos (nunca quistes, niflagelados) en agar no nutritivo (NNE) con bacterias.15 La MEAP es muy seme-jante a la meningitis bacteriana y los resultados de laboratorio son muy simila-res, pero los cultivos para bacterias son negativos. El único fármaco contra N.fowleri es la Anfotericina B, pero solamente es efectivo cuando se administra alinicio de la infección.3
Balamuthia mandrillaris y Acanthamoeba spp son organismos oportunistas ca-paces de producir encefalitis amibiana granulomatosa (EAG) o acantamoebosis, unaenfermedad subaguda o crónica. Se presenta en individuos inmunosuprimidos oinmunodeficientes, como alcohólicos crónicos, embarazadas, VIH positivos, enfer-mos con SIDA, con lupus eritematoso sistémico o cáncer.3 También se han descritocasos de EAG sin ninguna predisposición. La puerta de entrada al torrente sanguí-neo puede ser a través de los pulmones vía neuroepitelio olfativo y lesiones de la piel.Las lesiones que produce Acanthamoeba son granulomatosas, encontrándose enellas trofozoítos y quistes. Los datos clínicos comparados con los que provoca Naegleriason menos intensos y de un curso más lento. Las principales manifestaciones clíni-cas son dolor de cabeza, cambios de personalidad, fiebre leve, convulsiones,hemiparesia, nivel deprimido de la conciencia y coma.
El cuadro clínico puede confundirse con tuberculosis cerebral, encefalitisviral, cáncer y con un absceso cerebral. El diagnóstico clínico es difícil; de he-cho, la mayoría de los casos han sido diagnosticados post mortem. No obstante, esposible realizar un diagnóstico rápido buscando trofozoítos en el LCR otrofozoítos y quistes del tejido cerebral. Acanthamoeba también puede cultivar-se en medio NNE con bacterias. En estudios in vitro el ketoconazol y clotrimazolhan mostrado cierta efectividad, aunque no se ha confirmado su efectividad enhumanos. En casos clínicos se han utilizado con cierto éxito itraconazol,miconazol, sulfametazina, pentamidina y gluconato de cloroexidina.2
Un cuadro muy similar al descrito para Acanthamoeba es producido por B.mandrillaris. Sin embargo, no está claro si Balamuthia se comporta como organis-mo oportunista o si es un patógeno primario letal, que no depende del estado delhospedero. La información al respecto es escasa y los cuadros observados se hanpresentado principalmente en individuos inmunocompetentes. B. mandrillaristiene requerimientos muy especiales para su cultivo. Crece en cultivos de célulasVero (riñón de mono verde africano) y en el medio axénico BM.3, 4, 19
Otra infección importante causada por Acanthamoeba spp. es la Queratitisamebiana (QA). Esta es una inflamación crónica en la córnea que puede
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causar la pérdida del ojo. Las amibas invaden el estroma corneal por unasolución de continuidad del epitelio, debido a un traumatismo menor oabrasión de la córnea. Se caracteriza por severo dolor ocular asociado confotofobia, generalmente unilateral, visión borrosa y congestión de la con-juntiva. Existe un anillo de infiltrado estromal y lesión de la córnea. Losprincipales factores de riesgo son el uso de lentes de contacto suaves, uso desoluciones salinas caseras, exposición a agua contaminada y traumatismosmenores del ojo.3, 23 Otros factores que favorecen el establecimiento de la QAson la producción de lágrimas con baja actividad microbiana y la contami-nación bacteriana secundaria.3, 23
La QA se confunde frecuentemente con queratitis causada por hongos o porHerpes simplex. Se puede realizar un diagnóstico rápido usando un raspado de lacórnea y tiñendo el material con Giemsa tricrómica, Wright, Hemacolor y exa-minando con microscopía óptica de luz. También se puede usar la tinciónblanco de Calcofluor y anticuerpos fluorescentes en raspados y secciones detejido de la córnea.2 Acanthamoeba puede ser cultivada, colocando parte delraspado corneal en medio NNE.23 El tratamiento no es sencillo debido a laresistencia de estos organismos a la mayoría de los fármacos usados contrabacterias, hongos, protozoos y virus. No obstante algunos pacientes han sidotratados con éxito usando ketoconazol, miconazol, isotionato de propamidina ybiguamida de poliexametileno.3
El conocimiento de los mecanismos que utilizan las AVL patógenas paraevadir la respuesta inmune es muy escaso, no obstante, se sabe que en esteproceso participan las células fagocíticas, especialmente los glóbulos blancos, laproducción de enzimas que sintetizan células del sistema inmunológico(linfocitos) y la producción de enzimas que destruyen las amibas.3, 21 Por otrolado, se ha demostrado la presencia de anticuerpos en suero humano normalcontra Acanthamoeba y Naegleria. Adicionalmente, es posible que la exposicióna otro grupo de amibas genere alguna protección contra las AVL patógenas, yaque se ha demostrado que existe reacción cruzada con antígenos de Entamoebahistolytica.24
Prevención. Para evitar la naegleriosis se recomienda la educación al público,difundir el conocimiento entre la comunidad biomédica, la limpieza y lacloración del agua de albercas (concentraciones de cloro libre residual de 1.0 a2.0 mg L-1 de agua y a 26° C) y el mantenimiento adecuado de abastecimientospúblicos de agua. Para prevenir la QA se deben seguir las recomendaciones delfabricante de lentes de contacto y no usarlos durante la práctica de deportesacuáticos. En el caso de la EAG, es más difícil prevenirla debido a que Acantha-moeba es oportunista, por lo que la única recomendación es evitar los factoresde riesgo, especialmente si se sabe que se está inmunosuprimido o inmuno-comprometido.
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6. EPIDEMIOLOGÍA
Hasta la fecha, a nivel mundial, se tiene conocimiento de 196 casos de MEAP,125 de EAG por Acanthamoeba, 93 de EAG por B. mandrillaris y más de 1,350 deQA.3, 25 Estas cifras seguramente están subestimadas, ya que en muchos países larealización de autopsias es mínima o no se lleva a cabo y porque el médicogeneral y el personal de laboratorio no están entrenados para diferenciar unameningoencefalitis viral o bacteriana de una infección por AVL.
Aunque las infecciones producidas por las AVL son consideradas raras, sehan registrado casos en diferentes partes. La mayoría procede de países desarro-llados como Australia, Estados Unidos de América y Gran Bretaña.3, 7 En Méxicose han registrado en total 29 casos de MEAP: 23 en Mexicali, B. C., tres en Sono-ra; uno en Monterrey, N. L., uno en Huetámo, Mich. y uno en de Tamaulipas.
De 12 casos de EAG causados por B. mandrillaris, cuatro son del DistritoFederal, cuatro de Jalisco, dos de Guanajauato, uno del Edo. de México y uno dePuebla.25 Existe registro de un caso de EAG por Acanthamoeba spp., que sobrevi-vió.26 Otro de una infección cerebral mixta que involucró a Acanthamoeba sp. yAspergillus sp.27 y tres casos de QA por Acanthamoeba.23 Además, se han detecta-do Naegleria, Acanthamoeba y Hartmannella en pacientes asintomáticos; N.lovaniensis no patógena en un infante; en pacientes con quemaduras infectadasy rinitis;13 Hartmannella asociada a un caso de meningoencefalitis28 y amibas dela familia Leptomyxidae vinculada a un caso de anemia aplástica grave.29 Elimpacto de las infecciones causadas por las AVL en la salud humana no deberíasubestimarse, no solo por su potencial patógeno, sino también porque puedeninteractuar con especies bacterianas y por su capacidad para servir como vectorespara otros patógenos humanos.
7. CARACTERIZACIÓN DE LAS AMIBAS DE VIDA LIBRE
Cultivo monoxénico. Las muestras de agua o LCR colectadas se centrifugan a2,500 rpm durante 10 min. El concentrado se distribuye en medio NNE.15 Laobservación de las placas de NNE se realiza en un microscopio invertido a 10x y20x para verificar el crecimiento amibiano. En las placas con amibas se marca lazona de mayor abundancia y se corta un trozo de agar de aproximadamente uncm2, y se transfiere a otra placa con medio NNE fresco y se incuba a la tempera-tura a la cual fue aislada durante 48 horas.
Cultivo axénico. De los cultivos monoxénicos se selecciona una zona concrecimiento amibiano en estado de trofozoíto y se transfieren trozos de agar alos medios PBSGM30 y BC5 y se incuban a 30 º C.
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Después de obtener cultivos axénicos, se realiza la identificación morfológica,la prueba de patogenicidad en ratones, análisis de isoenzimas30 y/o técnicasinmunológicas.22
Identificación morfológica. Se realizan preparaciones in vivo de cultivosaxénicos de los trofozoítos y quistes en diferentes fases de maduración y usandolas claves taxonómicas de Pussard y Pons31 y Page.15
Tolerancia a la temperatura. Esta prueba se realiza para determinar la tempe-ratura máxima y óptima de las amibas, ya que se ha demostrado que las AVLpatógenas son termotolerantes. Los aislamientos se siembran por cuadriplicadoen medio axénico o monoxénico y se incuban a temperatura ambiente, 37 °C,42 °C y 45 °C. Se observan durante una semana para verificar la temperaturaóptima de crecimiento.
Prueba de patogenicidad. La prueba se lleva a cabo por vía intracerebral (IC) ypor instilación nasal (IN) en grupos de ratones machos, de tres semanas de edad apartir de cultivos axénicos.32 Los trofozoítos en crecimiento exponencial, se ajus-tan a una cuenta de 1x104 – 1x106 por ml. De este concentrado se inoculan 0.02ml a través de la articulación interparietal. Para la IN, se aplica la misma dosis através de los orificios nasales y como control, se inocula un grupo de ratones conmedio de cultivo sin amibas. Y se mantienen bajo observación 21 días. A losanimales que mueren durante dicho período, se les extrae el cerebro, el hígado, lospulmones y los riñones, y se colocan en placas con medio NNE y para incubarlos30º C durante 24 - 48 h. Los animales que sobreviven los 21 días y el grupo controlse sacrifican y se sigue el mismo procedimiento que los anteriores.
Técnicas inmunológicas. Las pruebas serológicas no han sido útiles en el diag-nóstico de N. fowleri, debido a que la mayoría de los pacientes mueren demasia-do rápido para producir anticuerpos y las infecciones por Acanthamoeba gene-ralmente se han diagnosticado post mortem usando técnicas de inmunofluo-rescencia indirecta y de inmunoperoxidasa.22
Análisis de isoenzimas y proteínas totales. Para realizar este análisis se usa latécnica de isoelectroenfoque (IEF), que consiste en la separación de los compo-nentes de una enzima, presentes en el extracto crudo de cada amiba, sobre unsustrato de agarosa con un anfolito. El análisis se lleva a cabo por comparaciónde los zimogramas de las amibas a identificar contra cepas de referencia.33
Identificación por el ADN. En los últimos años se han desarrollado diferentesmétodos moleculares como la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa oPCR (por sus siglas en inglés). Ésta es una herramienta muy útil, rápida y precisa,siempre y cuando se haya descrito previamente la secuencia específica del organis-mo a determinar. En el caso de las AVL, se ha utilizado principalmente para identi-ficar amibas patógenas de muestras clínicas y muy pocos trabajos se han enfocado amuestras ambientales.34, 35 En el caso de agua, recientemente se ha implementado latécnica de PCR para identificar Acanthamoeba en este ambiente.36 Las muestras de
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lagua se filtran con una membrana Millipore. La membrana se coloca en un tuboestéril y se adiciona solución SET (sacarosa EDTA), se resuspende, se retira la mem-brana y se congela la suspensión a -20° C, hasta que se realiza la extracción del ADNmediante los métodos descritos por Vodkin et al.34, 35, 37
8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El interés en las AVL se ha incrementado en los últimos años, sin embargo, lamayor parte de los estudios se han enfocado principalmente al grupo de las espe-cies patógenas para el hombre. El estudio de las AVL (patógenas y no patógenas)desde el punto de vista ecológico es sumamente escaso, ya que aunque se conocede manera general su distribución en el ambiente y las condiciones ambientalesque las pueden afectar, es necesario realizar más estudios para identificar aspectosdetallados de su relación con los factores bióticos y abióticos en el ambiente.
La carencia de formas fijas en su morfología causa confusión en el estudiode estos protozoos, por lo que se ha recurrido al uso de técnicas y herramientasespecíficas como la microscopía electrónica y de barrido, así como de técnicasinmunoenzimáticas, entre otras.
La aplicación de técnicas de biología molecular en el estudio de las AVL hapermitido identificar nuevas especies relacionadas con los géneros Naegleria yAcanthamoeba, así como identificar nuevas especies patógenas para el ser hu-mano. Las preguntas que surgen a este respecto son ¿las nuevas amibas detecta-das son nuevas especies o solo variedades?, ¿cuál va a ser el límite para determi-nar si cada amiba aislada es una nueva especie?
En el aspecto epidemiológico hay todavía preguntas que resolver: por ejem-plo, ¿por qué a pesar de la amplia distribución de estas amibas en el ambiente ysu constante contacto con los seres humanos, el número de casos es relativa-mente bajo, si se compara con otros organismos patógenos? y ¿el contacto conamibas no patógenas o con amibas de baja virulencia confieren a los humanoscierta inmunidad?
Otro problema importante que se tiene que resolver es la carencia de fármacoseficientes para tratar las infecciones producidas por este grupo de amibas, espe-cialmente en el caso de la EAG, causada por algunas especies de Acanthamoebay la especie Balamuthia mandrillaris.
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CIANOBACTERIAS, MICROORGANISMOS
DEL FITOPLANCTON Y SU RELACIÓN
CON LA SALUD HUMANA
Pedro Ramírez, Evaristo Martínez ,María Dolores Martínez y Carlos Eslava
1. INTRODUCCIÓN
MUCHOS CUERPOS DE AGUA experimentan actualmente la denominada eutro-fización antrópica (como resultado de la actividad humana) por el aumentopoblacional la urbanización, la agricultura, la minería y el aporte de aguasresiduales y desechos de la industria alimentaria. Uno de los fenómenos másfrecuentes en los lagos y reservorios eutróficos es la presencia en muchas partesdel mundo, de cambios evidentes relacionados con el aspecto y la calidad delagua. Tales alteraciones están asociadas principalmente con una alta concentra-ción de nutrimentos, como el fósforo y el nitrógeno.
Los microorganismos fotosintéticos que pueblan todas las aguas del planetay que son el inicio de la cadena alimentaria se conocen como fitoplancton.Entre los más antiguos identificados en estos ambientes se encuentran lascianobacterias que forman grandes colonias, principalmente en cuerpos de aguacon altos niveles tróficos. Las cianobacterias son consideradas una liga entre losprocariotes y los eucariotes fotosintéticos con la capacidad de sintetizar clorofi-la. Como característica particular se ha identificado su habilidad para sintetizarlos pigmentos ficobilina y ficocianina, que en altas concentraciones, les confie-re el color característico que ha dado lugar a la denominación de algas azul-verde o cianobacterias. Estos organismos tienen una larga historia evolutiva, porlo que la mayoría de geólogos y geoquímicos están de acuerdo en que su origense extiende 3,500 millones de años en la era Proterozoica (2,500 a 570 mA),conocida también como era de las cianobacterias.1
Las cianobacterias se aprecian a simple vista como manchas incrustadassobre la superficie húmeda de las rocas, del suelo o de los árboles; pueden ser decolor verde azuladas, pardas o negras y presentarse en forma de almohadillasmacroscópicas o en capas viscosas. También pueden vivir flotando libremente
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l(planctónicas) en cualquier tipo de medio acuático.2 Son organismos móviles,Gram-negativos,3 cuya velocidad y dirección de movimiento dependen de lailuminación y de la temperatura en la que se encuentren. A pesar de que pre-sentan características de una bacteria Gram-negativa, poseen una capa depeptidoglucanos más gruesa y componentes no comunes en dicho grupo.4
Las cianobacterias muestran una amplia diversidad morfológica, ya quepueden, ser unicelulares (Chroococcus) o filamentosas; éstas últimas, en oca-siones presentan ramificaciones (Anabaena). Pueden aparecer aisladas o agru-padas en colonias (Schizothrix) y cuando las colonias se agrupan pueden ob-servarse como manchas o puntos cafés en las rocas sumergidas (C. fuscus). Laestructura colonial se mantiene por un exo-polisacárido que se aprecia comoun mucílago o una vaina firme. Otra de las estructuras presentes en lascianobacterias son las vacuolas de gas que les ayudan a la flotación y que seencuentran en especies de muy diferentes géneros (Anabaena). Todas las es-pecies que forman filamentos verdaderos presentan hormogonias, definidasen 1959 por Desikachary,5 como cadenas cortas y móviles. Sin embargo, notodas las hormogonias caen exactamente dentro de esta definición; esencial-mente son filamentos modificados relacionados con la reproducción y ladispersión del microorganismo, con altos niveles de nitrógeno, fósforo y otrosnutrimentos. Las colonias de algunos géneros (Rivularia) están constituidaspor la agregación de numerosas hormogonias, mientras que otras (Nostoc) seoriginan de una hormogonia simple.
Las interacciones simbióticas entre las cianobacterias y otros organismosson diversas. Muchas cianobacterias simbiontes comparten características queincluyen la formación de hormogonias, que a menudo actúan como agenteinfectivo. Algunas plantas producen señales químicas que inducen a lacianobacteria a formar hormogonias o como quimio-atrayente para guiar a lahormogonia al interior de la planta. Un gran número de cianobacterias, capacesde fijar nitrógeno atmosférico cuando el ambiente está muy oxigenado, presen-tan heterocistos,6 células con una pared celular delgada y generalmente con unnódulo de cianoficina, polímero de dos aminoácidos situados en uno o enambos lados de la célula. La presencia o ausencia de heterocistos es una caracte-rística importante para diferenciar entre géneros.
Cuando los lagos se tornan eutróficos, la diversidad del fitoplancton dismi-nuye, lo que conduce a que las prevalezcan cianobacterias. Diferentes factoresambientales favorecen el predominio de estas últmas, las temperaturas elevadas(18 y 20 ºC), las condiciones de luz-energía (óptimas de la primavera al otoño),la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, un pH alto (6.5 a 8.5), una baja tasade filtración por el zooplancton y la formación de vesículas de gas.7 Aunque ladiversidad y abundancia de las cianobacterias son mayores a valores altos de pHexisten excepciones al respecto, tal es el caso de las picocianobacterias planctó-
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FIGURA 1. FILAMENTOS DE Anabaena SP.MODIFICADAS GENÉTICAMENTE PARA QUE
LOS HETEROCITOS EXPRESEN UNA PROTEÍ-NA FLUORESCENTE
FIGURA 2. Anabena SP. UTCC-426
Foto: Dr. Bill Buikema, Universidad deChicago, EE.UU.
Foto: Mary Olaveson.
nicas (< 2 µm de diámetro) y las cianobacterias filamentosas ramificadas que sedesarrollan a pH por debajo de 4.5 y 4, respectivamente.
El florecimiento se describe como el incremento, significativamente ma-yor al promedio, en la biomasa del fitoplancton. El florecimiento de las pobla-ciones de cianobacterias se ha estudiado ampliamente ya que representa unproblema para los cuerpos de agua de uso doméstico, industrial y de recreo,debido principalmente al incremento en la producción de metabolitos tóxi-cos, los cuales tienen un efecto letal sobre los diversos organismos habitantesde dichos cuerpos.8 El que estos florecimientos generen sustancias tóxicasplantea su importancia como un problema ambiental con repercusiones so-bre la salud. A pesar de que se ha generado una gran cantidad de informaciónsobre las toxinas producidas por cianobacterias, no es fácil predecir su toxici-dad durante cada florecimiento particular; sin embargo, su detección oportu-na permite minimizar su efecto.9 Los florecimientos pueden ser superficiales("florecimientos de agua") y están restringidos a aquellos organismos quepueden flotar o que presentan movilidad.10 Algunas especies que no pertene-cen a las cianobacterias, como Botryococcus braunii, también pueden dar lugara florecimientos debido a la producción o almacenamiento de aceites, asícomo algunos flagelados como Euglena. Los florecimientos generalmenteestán relacionados con una o dos especies y se identifican por el tipo de
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lFIGURA 3. ASPECTO QUE PRESENTAN LOS FLORECIMIENTOS (BLOOMS)
DE CIANOBACTERIAS EN LOS CUERPOS DE AGUA EUTROFIZADOS
fitoplancton dominante. De esta manera se tienen florecimientos de cianobac-terias, de diatomeas o de Anabaena.
Las toxinas pueden ser dañinas dependiendo de su concentración y su capa-cidad para originar efectos agudos y crónicos en el hombre, en animales y envegetales. Skulberg et al.11 describen cerca de 40 especies toxigénicas decianobacterias basándose en una taxonomía morfológica. La mayoría de lasespecies y cepas toxigénicas pertenecen a géneros filamentosos multicelulares:Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Aphanizomenon y Cylindrospermopsi.12, 13
Otras especies producen compuestos citotóxicos que aunque no son tóxicospara mamíferos, sí lo son para aves y peces, algas, bacterias y virus o bien tienen unefecto sobre las células tumorales de mamíferos, lo que ha permitido su empleocomo antibióticos o anticarcinógenos. De las especies de cianobacterias unicelularesMicrocystis causa la mayoría de los problemas de toxicidad, probablemente por serla más cosmopolita de las cianobacterias. Esto es particularmente evidente du-rante el verano cuando Microcystis domina la sucesión anual de cianobacterias.
Se considera que existe un florecimiento en el agua para uso potable o re-creativo, cuando las concentraciones celulares calculadas están en niveles de
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20,000 células ml-1, lo que corresponde a 10mg m-3 de clorofila-a. La apariciónde este fenómeno depende tanto de las condiciones ambientales como de losrequerimientos específicos del organismo.14,15 Los florecimientos decianobacterias tienen un registro histórico reciente,10 y han adquirido importan-cia por su impacto económico. La preocupación por los efectos de lascianobacterias en aguas continentales, principalmente por repercusión sobre lacalidad de la misma, se intensificó en las décadas de 1980 y 1990 debido a lainformación acumulada sobre la potencia de sus toxinas.16, 17, 18, 19, 20 Desde hacetiempo se tiene conocimiento de la presencia de toxinas cianobacterianas, peroéstas sólo se habían asociado con la muerte de animales domésticos.21 Reciente-mente, en Brasil la muerte de 88 personas y el daño renal en 50 pacientes querequirieron hemodiálisis, se asoció con la presencia de cianotoxinas en el aguade consumo.22, 23 Lo anterior apoya el efecto dañino de estas toxinas y plantea lanecesidad de reevaluar si su presencia en las fuentes de abastecimiento de aguapara consumo humano constituye un peligro para la salud, y si además son unfactor de riesgo para animales silvestres y/o domésticos que puedan estar encontacto con este tipo de aguas.24 Aunque no todos los florecimientos decianobacterias son tóxicos, cuando estos se relacionan con la producción detoxinas su repercusión es alarmante, como se ha reportado en diferentes países(cuadro 1).
MICROFOTOGRAFÍAS DE LUC BRIENT, RENNES, FRANCIA
Correo-e de Luc de Brient: [email protected].
Anabaena sp. Microcystis wesenbergii
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lCUADRO 1. PORCENTAJE DE TOXICIDAD POR FLORECIMIENTOS
DE CIANOBACTERIAS EN DIFERENTES PAÍSES
PAÍS NÚMERO TOXICIDAD REFERENCIA
DE SITIOS
Inglaterra 78 70% Reporte NRA 1990Escandinavia 51 59% Cood y cols. 1989Finlandia 188 44% Sivoen y cols. 1990Mar Báltico 25 72% Sivoen y cols. 1989Wisconsin,EE.UU. 102 27% Rapavich y cols. 1990Países Bajos 10 90% Leeuwang y cols. 1983Países Bajos 29 79% RIZA 1994Hungría 35 82% Törökné-Kozma y Gábor 1988Alemania (Ex RDA) 6 67% Henning y Khol 1981Alemania 1995-96 80 90% Fastner y cols. 1998Dinamarca 96 72% Henriksen 1997
Fuente: 25.
2. FACTORES INVOLUCRADOS EN LA PRODUCCIÓN DE TOXINAS POR
CIANOBACTERIAS DURANTE LOS FLORECIMIENTOS
En las últimas décadas se ha presentado un incremento aparente en la ocu-rrencia de florecimientos de cianobacterias, lo que aunado a la posible pre-sencia de cepas productoras de toxinas, ha dado lugar a que se estudien losposibles factores ambientales que favorecen la presencia y el incremento delas cianobacterias. Aunque éstas generalmente son comunes en los diferentessistemas acuáticos, presentan diferencias en la densidad de células, composi-ción de especies, distribución vertical y longevidad de la población, depen-diendo del tipo de sistema. Lo anterior se puede explicar por el grado de estra-tificación y mezclado, así como por la disponibilidad de nutrimentos y de luzque prevalecen en cada sitio, características determinadas por las condicionesclimáticas de cada región.
El tamaño y profundidad de las cuencas lacustres se han modificado entamaño y profundidad durante miles de años, como resultado de eventosclimáticos y geológicos y por los mismos procesos biológicos. El "envejecimien-to" o eutrofización es el resultado del incremento en los nutrimentos y la acti-
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vidad biológica (productividad), así como de la acumulación de sedimentos ymateria orgánica que arrastran las corrientes de agua que llenan la cuenca de unlago. La progresión natural en los lagos es unidireccional y va de la oligotrofia(pobreza en nutrimentos) a la eutrofia (riqueza en nutrimentos y por lo tantoalta productividad). La eutrofización cultural (producida por la actividad hu-mana) se ha convertido en un factor significativo en el envejecimiento de loscuerpos de agua en el mundo. El término hipereutrófico surge como resultadodel efecto de las actividades humanas sobre los cuerpos de agua.26 La informa-ción obtenida de diversas áreas geográficas muestra que la eutrofización cultu-ral, tanto en aguas continentales como marinas, es originada por las descargasdomésticas, industriales y aguas de retorno agrícola.
Las algas y las macrofitas se utilizan frecuentemente como indicadores de laeutrofización de los cuerpos de agua. Se llevan a cabo análisis cualitativos ycuantitativos así como medición de su biomasa mediante la determinación dela concentración de la clorofila, cuyos valores se han estimado de acuerdo conlas condiciones tróficas de un cuerpo de agua, por lo que se considera que en unlago oligotrófico van de 1.5 a 10.5 µg L-1 mientras en un lago eutrófico puedenllegar hasta 300 µg L-1.27
El incremento en la biomasa, además de ocasionar problemas estéticos comola presencia de espumas y olores desagradables, también altera el sabor del aguapotabilizada para el suministro humano. El proceso de descomposición de losflorecimientos acuáticos causa desoxigenación alterando la química del agua,cambios que influyen en la supervivencia de los animales acuáticos. La produc-ción de metabolitos secundarios bioactivos, como las hepatotoxinas y lasneurotoxinas, representan un riesgo para la salud humana.28
Las toxinas son péptidos cíclicos que incluyen potentes alcaloidesneurotóxicos (que se dividen en dos grandes grupos: anatoxina y saxitoxina) yhepatotóxicos (microcistinas, nodularinas y cilindrospermopsina). Lasmicrocistinas son producidas tanto por cianobacterias filamentosas (Anabaena,Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) como coloniales (Microcystis). Los génerosAnabaena y Oscillatoria producen anatoxina, que actúa como un bloqueadorneuromuscular. También producen dos tipos de anatoxina: anatoxina-a yanatoxina-a(s), que no están estructuralmente relacionadas y presentan dife-rentes efectos fisiológicos, la segunda de éstas es un compuesto organofosforadoproducido por el género Anabaena, el único que se conoce en estado natural. Laestructura química de este compuesto es similar a la que tienen los insecticidassintéticos como el paratión-malatión, y al igual que éste, bloquea la actividad dela acetilcolinesterasa.17
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3. COMPORTAMIENTO DE Microcystis PRODUCTORA DE
MICROCISTINA EN EL AMBIENTE
Microcystis se encuentra comúnmente en cuerpos de agua eutróficos ehipereutróficos y puede constituir el fitoplancton dominante; a menudo, de-pendiendo de las condiciones climáticas, puede estar presente durante todo elaño. La microcistina se identificó inicialmente en el género Microcystis y a lafecha se han descrito aproximadamente 50 tipos de esta toxina relacionados ensu mayoría con casos de envenenamiento humano y animal. Aunque Microcystisúnicamente produce microcistina, ésta siempre es toxigénica, a diferencia deotras cianobacterias planctónicas que pueden producir tanto microcistina comoanatoxina, como en el caso de Anabaena y Oscillatoria o microcistina y citotoxinaproducidas por Hapalosiphon. Rinehart et al.29 refieren la existencia de al menos47 variedades de microcistinas, 32 se identificaron en florecimientos deMicrocystis en agua y en algunos aislados de laboratorio. Con respecto a las otrasmicrocistinas, ocho se identificaron en Anabaena, seis en Nostoc y una enOscillatoria. A excepción de la microcistina-HtyR, las microcistinas producidaspor géneros diferentes a Microcystis contienen modificaciones en los aminoácidosdos y cuatro, sitio donde se encontraron la mayoría de los cambios. La toxicidadde las microcistinas se ha evaluado mediante bioensayos en modelos animalesy por una prueba de inhibición de la actividad de la fosfatasa 1 o 2A. La dosis letalmedia (LD
50) de la microcistina administrada por vía intraperitoneal en ratones
es de 50 a 100 µg kg-1.30
4. EFECTO DE LAS MICROCISTINAS SOBRE LA SALUD ANIMAL
Aunque la mayoría de los envenenamientos por microcistinas se presentan enanimales terrestres después de ingerir agua de suministros infestados concianobacterias, los animales marinos, y particularmente los peces en cultivo,también pueden verse afectados.31 La muerte por microcistinas se presenta comoconsecuencia de un shock hipovolémico secundario o hemorragia del hígado.El estudio post mortem muestra incremento en el peso del hígado y en la con-centración de hemoglobina hepática y de hierro. En los animales que no mue-ren rápidamente se observa hipercalemia y/o hipoglucemia, insuficiencia hepá-tica y la muerte en pocos días.
En el envenenamiento por microcistina, uno de los primeros efectos (15 a30 minutos.) es la elevación en la concentración de ácidos biliares, fostafasaalcalina, gama-glutamil-transferasa y la aspartato amino-transferasa. La cuenta
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de glóbulos blancos se incrementa (leucocitosis), se activan factores que pro-mueven la formación de coágulos y puede presentarse diarrea acuosa y/o consangre. La muerte puede darse en un lapso de algunas horas (4 a 24 h) o días,dependiendo del individuo afectado y generalmente es precedida por una res-puesta neuro-muscular.
5. EFECTOS EN LA SALUD HUMANA
La información con respecto al daño en humanos ocasionado por microcistinases escasa. 32,33 Las principales fuentes de exposición son lagos y ríos durante suuso recreativo (ruta oral o dérmica) y el consumo de agua potable y tabletasalimenticias de concentrados de algas (ruta oral). Una ruta de exposición demenor importancia la constituyen las regaderas durante el baño (inhalación).En países como Estados Unidos y Canadá el periodo de exposición durante elaño es menor ya que el crecimiento de los florecimientos de algas son máscortos (3 a 5 meses), comparado con el de países con climas cálidos comoAustralia o Sudáfrica (6 a 10 meses). Los síntomas observados en las personasque sufren intoxicación por microcistinas incluyen irritación de piel y ojos,síntomas parecidos a los producidos por la fiebre del heno, disnea, fatiga ygastroenteritis aguda.
La toxicidad letal en humanos no se presenta con mucha frecuencia, princi-palmente porque los diferentes procesos de tratamiento en los suministros deagua contribuyen a disminuir el número de cianobacterias tóxicas y por ende laconcentración de toxinas. Sin embargo, en ocasiones los florecimientos pre-sentan niveles de microcistina mayores a 1 mg g-1 de células, lo que muestra elefecto que pueden llegar a tener las cianobacterias en la salud del ser humano yde otros animales. Reportes en Estados Unidos y Australia señalan la presenciade casos al ingerir agua proveniente del suministro municipal. Esto se produjoal pretender eliminar con sulfato de cobre las células durante un florecimiento,lo que suscitó la liberación de altos niveles de toxinas hacia el sistema de distri-bución, ocasionando la intoxicación de varios individuos. Solo en casos comoel antes referido se podría alcanzar una dosis letal para los humanos. En estos yotros casos de ingestión accidental los síntomas reportados incluyen dolor ab-dominal, náusea, vómito, diarrea, dolor faríngeo, tos seca, dolor de cabeza, úlce-ras en la boca, neumonía atípica y elevación de las enzimas hepáticas en el suero(especialmente en la gama-glutamil transferasa).
Otro aspecto importante en relación con las cianotoxinas es el efecto can-cerígeno de las microcistinas y nodularinas debido al efecto de inhibición delas proteín-fosfatasas. Este factor adicional de riesgo (promoción de tumores),se ha determinado mediante las observaciones hechas en animales expuestos
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ly a datos toxicológicos y químicos. Aunque no han sido determinados losniveles de toxinas que ocasionen efectos adversos, algunos países han pro-puesto concentraciones que pueden considerarse como aceptables, para evi-tar riesgos a la salud.
En 1994, Falconer et al.34 utilizaron diferentes procedimientos para estable-cer que 1.0 µg l-1 es la concentración máxima de microcistina o nodularinaaceptable para prevenir la inducción de tumores. Dicha concentración de toxi-na corresponde a 5,000 células de Mycrocistis ml-1, determinada en experimen-tos con cerdos. Un estudio similar en Canadá reportó 0.5 µg L-1 para microcistina-LR (la más común de las microcistinas encontradas en suministros de agua), o1 µg l-1 del total de microcistinas en agua potable. Este valor es el que actual-mente considera la Organización Mundial de la Salud (OMS) como valor guíaa nivel internacional.35
6. ESTRUCTURA QUÍMICA Y CARACTERÍSTICAS
Bishop et al.36 realizaron el primer reporte de una hepatotoxina de la cepa NRC-1 de Microcystis aeruginosa identificada como un péptido. Esta toxina fue deno-minada microcistina por Konst et al.37 y Carmichael et al.38 Posteriormente serealizaron otros aislamientos de microcistinas a partir de la misma cepa,39, 40 yde florecimientos de M. aeruginosa en Sudáfrica41 y en Australia.42 Botes et al.43
aislaron varias microcistinas de cepas de M. aeruginosa en Sudáfrica y fueron losprimeros en determinar la estructura de una de ellas (denominada cómocianoginosina) en 1984; al siguiente año el mismo grupo publicó la estructurade las demás toxinas (figura 1).
Una vez que se determinó la estructura básica, aparecieron rápidamentemuchos reportes de microcistinas, a la fecha se han aislado más de 50microcistinas (cuadro 2).
7. RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y TOXICIDAD
La relación entre las modificaciones estructurales y la hepatotoxicidad de lasmicrocistinas se estableció por observaciones en diferentes investigacio-nes.43,47,48,49 en las cuales se encontró que existen modificaciones en diferentessitios de la molécula de microcistina (cuadro 3), como es el caso de dos L-aminoácidos variables; grupos Metil en Mdha y/o β-Me-Asp; Adda; Glu yMdha.
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Fuente: 44.
FIGURA 2. TOXINA DE CIANOBACTERIA (Microcystis),FOSFATASA-1/-2A INHIBIDOR, NMR MOLÉCULA: MICROCISTINA-LR
Fuente: 46.
FIGURA 1. ESTRUCTURA DE CINCO MICROCISTINAS
Glu (Iso)
18
15
OH2 OAc
109
8
7
6
5
4 3
2
1
OCH3 H
HH
HH
NH
Isómerosgeométricos
Esterificado
Adda
H
H3C
11HN
HCO
2H
O
R2
O
OO
O
H R3
H CO2H
R1
HN
H
H3C
Ala
Mdha
NH
Hidratado(Ser)
N
R4
CO3 o
H
CH2
β-Me-Asp (Iso)CH
2 o H
^^
^
^ ^
^
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lCUADRO 2. VARIACIONES ESTRUCTURALES DE MICROCISTINAS
AISLADAS Y SUS PESOS MOLECULARES
R1
R2
R3
R4
R5
PM
Microcistina LA Leu Ala CH3
CH3
CH3
909Microcistina LR Leu Arg CH
3CH
3CH
3994
Microcistina YR Tir Arg CH3
CH3
CH3
1044Microcistina RR Arg Arg CH
3CH
3CH
31037
Microcistina YM Tir Met CH3
CH3
CH3
1019Microcistina YA Tir Ala CH
3CH
3CH
3959
Microcistina LY Leu Tir CH3
CH3
CH3
1001Microcistina FR Fe Arg CH
3CH
3CH
31028
Microcistina Laba Leu Aba CH3
CH3
CH3
923Microcistina HtyR Hty Arg CH
3CH
3CH
31058
Microcistina AR Ala Arg CH3
CH3
CH3
953Microcistina M(O)R Met(O) Arg CH
3CH
3CH
31028
Microcistina WR Tir Arg CH3
CH3
CH3
10673-desmetilmicrocistina LR Leu Arg H CH
3CH
3980
7-desmetilmicrocistina LR Leu Arg CH3
H CH3
9803,7-didesmetilmicrocistina LR Leu Arg H H CH
3966
3-desmetilmicrocistina YR Tir Arg H CH3
CH3
10307-desmetilmicrocistina YR Tir Arg CH
3H CH
31030
3-desmetilmicrocistina RR Arg Arg H CH3
CH3
10237-desmetilmicrocistina RR Arg Arg CH
3H CH
31023
3,7-didesmetilmicrocistina RR Arg Arg H H CH3
10093-desmetilmicrocistina HtyR Hty Arg H CH
3CH
31044
7-desmetilmicrocistina HtyR Hty Arg CH3
H CH3
10443,7-didesmetilmicrocistina HtyR Hty Arg H H CH
31030
7-desmetilmicrocistina HphR Hph Arg CH3
H CH3
1028(Mser7)microcistina LR Leu Arg CH
3CH
3CH
31012
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CUADRO 2. VARIACIONES ESTRUCTURALES DE MICROCISTINAS
AISLADAS Y SUS PESOS MOLECULARES
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3CH
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3CH
3COCH
31038
Fuente: 45.
CUADRO 3. RELACIÓN ENTRE LA ESTRUCTURA Y HEPATOTOXICIDAD DE MICROCISTINAS
LD50
(µG KG-1 INTRAPERITONEAL
EN RATÓN)
L-L-L-L-L-AMINOÁCIDOSAMINOÁCIDOSAMINOÁCIDOSAMINOÁCIDOSAMINOÁCIDOS (R1, R2) (R1, R2) (R1, R2) (R1, R2) (R1, R2)Microcistina-LR, microcistina-YR, microcistina-LA <100Microcistina-WR 100-400Microcistina-RR, microcistina-M(O)R 400-800
GGGGGRUPOSRUPOSRUPOSRUPOSRUPOS METILMETILMETILMETILMETIL ENENENENEN M M M M MDHADHADHADHADHA YYYYY/////OOOOO -M -M -M -M -MEEEEE-A-A-A-A-ASPSPSPSPSP
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AAAAADDADDADDADDADDA
O-demetil-Adda-microcistina-LR <100O-acetil-O-demetil-Adda-microcistina-LR <1006(Z)-Adda microcistina-LR (RR) >800
EEEEESTERSTERSTERSTERSTER
D-Glu(C3H7O) ester microcistina-LR >800D-Glu (CH3O) ester microcistina-LR >800
MMMMMDHADHADHADHADHA
Dihidromicrocistina-LR 100-400microcistina-LR-GSH 400-800
Fuente: 45.
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8. ESTABILIDAD
Las microcistinas son heptapéptidos cíclicos muy estables y resistentes a lahidrólisis enzimática, y su vida media es de alrededor de tres semanas en solu-ción a pH 1 y 40 °C. Para degradarlas completamente se requiere un tratamien-to a reflujo con ácido 6N-hidroxiclórico y ácido trifluroacético. Sin embargo, enmediciones en campo se encontró que la degradación primaria de la microcistina-LR ocurrió en una semana.50
Experimentos realizados en laboratorio para determinar la velocidad de degrada-ción tanto de nodularina como microcistinas, mostraron que la primera era másresistente a la degradación.51 Para evaluar las implicaciones que tienen las microcistinassobre la salud es necesario realizar estudios de campo. Para establecer la pérdida detoxicidad de estos metabolitos se deben tomar en cuenta los siguientes factores:
• Dilución
• Adsorción
• Descomposición térmica con ayuda del pH
• Fotolisis
• Degradación biológica
9. REMOCIÓN DE CIANOTOXINAS MEDIANTE LOS PROCESOS DE
TRATAMIENTO DE AGUAS
Los procesos que se combinan para eliminar las microcistinas de aguas conta-minadas son: coagulación-filtración, oxidación con cloro y ozono y, por últi-mo, la adsorción con carbón activado (cuadro 4). Aunque previamente se habíademostrado que la cloración era ineficiente para eliminar las toxinas prove-nientes de las algas,52,53,54 estudios más recientes señalan que las microcistinas ylas nodularinas son destruidas rápidamente con una solución de cloro ehipoclorito de calcio y con menor efectividad con hipoclorito de sodio. El cloroy el hipoclorito de calcio en una concentración de 1 mg L-1 eliminaron cerca del95% de las toxinas en 30 minutos. Por otro lado el hipoclorito de sodio a lamisma concentración solo quitó el 40% y con 5 mg L-1 o más, del 70% al 80%.55
El ozono es uno de los oxidantes más poderosos que se conocen y se ha utilizadoefectivamente para la desinfección y oxidación de una amplia gama de com-puestos en el tratamiento del agua. Keijola et al.53 mostraron que la pre-ozonización a 1 mg l-1 fue suficiente para eliminar completamente la toxicidad
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causada tanto por las hepatotoxinas como por la anatoxina-a. Himberg et al.54
observaron posteriormente que la eficiencia de eliminación dependía de la con-centración de ozono.
Aunque la degradación de microcistina-LR y nodularina da como resultadoproductos inactivos, es necesario asegurarse de que no se formen productosnocivos durante este proceso. El carbón activado es una medida efectiva pararemover una gran variedad de contaminantes, incluyendo las toxinas de lasalgas acuáticas. Sin embargo, su efectividad depende de factores como la presen-tación (polvo o granular) y el método de adición del mismo.
10. LA EXPERIENCIA EN MÉXICO
A la fecha existe una gran cantidad de información sobre los daños ocasionadospor cianobacterias tóxicas (no todos los géneros de cianobacterias son tóxicas)presentes tanto en cuerpos de agua con fines recreativos como en aquellos quesirven de suministro para consumo humano. Sin embargo, este problema espoco atendido en los países latinoamericanos.
Con relación a la presencia de florecimientos de cianobacterias en fuentesde abastecimiento de agua para consumo humano en México, se ha reportadosu presencia en el Lago de Chapala, en el estado de Jalisco y en Valle de Bravo, enel Estado de México. De esta última zona se tienen registros de florecimientosde 1998 a la fecha y de la presencia de microcistina-LR. La presa Valle de Bravoy los diferentes cuerpos de agua que conforman el sistema Cutzamala proveencerca del 30% del agua potable a los habitantes (aproximadamente 6,000,000)de la Ciudad de México. En estos sitios, durante casi seis meses al año se apreciala presencia de cianobacterias con florecimientos durante el verano y se detectóla presencia de microcistina-LR en los meses de junio, septiembre y noviembrede 1999. Las concentraciones más altas se observaron en el mes de junio convalores de 2,551 mg kg-1, peso en base seca. El valor más bajo se determinó ennoviembre, cuando aparentemente el florecimiento había desaparecido; en estemes el valor máximo fue de 109 mg kg-1, peso en base seca (figura 4).56, 57
En el año 2000 no se registraron florecimientos de cianobacterias, pero du-rante 2001 1as concentraciones de microcistina-LR se incrementaron de eneroa julio y la mayor concentración fue de 3,761 µg de toxina g-1. Aunque en agostose identificó un decremento en la concentración de microcistina-LR, los nive-les observados en julio se alcanzaron en septiembre y octubre, para disminuirnuevamente en noviembre (figura 5).
Una situación similar podría presentarse en otros cuerpos de aguaeutrofizados en nuestro país, como es el caso del Lago de Chapala. Ante estaevidencia surge la necesidad de establecer un programa de vigilancia y monitoreo
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Microfotografía: Nancy García Roa. Cyma-Lab. Bacteriología UNAM-FESICorreo-e: [email protected].
FIGURA 3. Anabaena sp. (40X) EN CULTIVO DE LABORATORIO (MEDIO BG-11)
en los cuerpos de agua, ya que debido a los procesos de eutrofización es factiblela presencia de florecimientos de cianobacterias con niveles de microcistina-LRpor arriba del valor guía recomendado por la OMS de 1 µg L-1.35
También es importante diseñar estrategias adecuadas de remoción de toxi-nas y de control de cianobacterias, en el proceso de tratamiento del agua con elfin de proteger a la población a la exposición aguda o crónica. Por otro lado, serequiere hacer un inventario a nivel nacional de los florecimientos decianobacterias y establecer el número de géneros productores de toxinas y susdiferentes tipos que podrían liberarlas al ambiente acuático, para tomar medi-das preventivas de acuerdo al uso al que se destine el cuerpo de agua. Se requiereel establecimiento de una método estandarizado para la identificación y lacuantificación de las toxinas, incluyendo aquéllas que se han identificado re-cientemente.58 Finalmente, se debe informar al público usuario de los cuerposde agua, tanto de uso recreativo como de abastecimiento, sobre los riesgos queimplica el hacer uso del agua con evidente presencia de cianobacterias tóxicas.
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FIGURA 4. VALORES DE MICROCISTINA OBTENIDOS EN 1999EN LA PRESA DE VALLE DE BRAVO
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250
200
150
100
50
0
Punto 3Punto 5
Punto 6Punto 7
Noviembre 1999
Septiembre1999Junio 1999
PUNTO 3 PUNTO 5 PUNTO 6 PUNTO 7
Noviembre 109 No detectable 30 93Septiembre No detectable 651 653 199Junio No detectable 923 683 2,551
ppm
FIGURA 5. VALORES DE MICROCISTINA OBTENIDOS EN 2001EN LA PRESA DE VALLE DE BRAVO
ENE 01 MAR 01 MAY 01 JUN 01 JUL 01 AGO 01 SEP 01 OCT 01 NOV 01
µgg-1 140 48 1,270 2,509 3,761 59 2,951 3,102 12
4,000
ppm
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3,000
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LA ECOLOGÍA MICROBIANA:UNA NUEVA CIENCIA PARA
UN NUEVO SIGLO
Valeria Souza, Ana Escalante, Ana Noguez,Laura Espinosa-Asuar, René Cerritos y Luis Eguiarte
1. ¿QUÉ ES LA ECOLOGÍA MICROBIANA Y QUÉ ESTUDIA?
LA VISIÓN GENERAL SOBRE LA ECOLOGÍA es meramente antropocéntrica y estárelacionada con los problemas de contaminación, y en el mejor de los casoscon la interacción que el hombre tiene con su ambiente. Sin embargo, lasrelaciones de los organismos con su entorno comenzaron desde el origen dela vida y han moldeado a nuestro planeta. Por esto entender el pasado y elfuturo evolutivos de la vida en la Tierra requiere de una compensión de lanaturaleza de la vida y de los modos en los que ésta ha surgido y evolucionadoen el ambiente con sus componentes bióticos y abióticos. En este sentido, paralos ecólogos bacterianos la tarea principal es tratar de discernir porqué losorganismos están en un sitio dado con ciertas abundancias en un tiempodeterminado. Dentro del marco de estudio de la ecología es importante eva-luar la diversidad, la abundancia y la distribución de los organismos a diferen-tes escalas que van desde el paisaje, el ecosistema, las comunidades y, final-mente, las poblaciones de las diversas especies.
¿Por qué es importante estudiar la ecología? Analizar la ecología de cual-quier organismo nos permite entender muchos aspectos, no sólo relacionadoscon el organismo en cuestión sino del ecosistema al que pertenece, los datosecológicos nos dan información sobre la historia de los organismos y de suentorno así como sobre las cadenas tróficas y los procesos demográficos. Todoesto permite formular teorías sobre los cambios ecológicos que ha sufrido ysufrirá nuestro planeta. En otras palabras, entender la ecología ayuda a com-prender cómo interaccionan los organismos con su ambiente y cómo amboscambian debido a estas interacciones; significa entender los sutiles cambios enel tiempo que constantemente llevan a la adaptación de los organismos. Así,comprender la ecología es entender, en parte, la evolución.
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Sin embargo, si este tema es tan importante ¿por qué hay tan poca informa-ción para los microorganismos? La principal razón es que ver, caracterizar ycontar bacterias no es tan fácil como estudiar plantas o mamíferos. Sin embar-go, gracias al descubrimiento de diferentes estrategias moleculares que permi-ten identificar a los microorganismos a partir de su ADN, ahora es posible carac-terizar y contar bacterias casi tan fácilmente como lo hace un ecólogo de plantaso animales. Además, los métodos moleculares han abierto nuevas posibilidadesde análisis de la función bacteriana. En este capítulo se verá cómo se ha avanza-do en algunos de los aspectos que consideramos más interesantes de la ecologíamicrobiana en los albores del siglo XXI.
2. DIVERSIDAD Y COEXISTENCIA
Se estima que la biomasa de microorganismos terrestres en la superficie denuestro planeta es igual a la de todas las plantas marinas y terrestres y tal vez seael constituyente principal de la biomasa de nuestro planeta.1, 2 A pesar de que ladiversidad ecológica de los microorganismos en el agua y en el suelo puede serdistinta, el número máximo de individuos que integran el taxón dominante essimilar: ˜ 104-105 individuos por gramo o mililitro. Este hallazgo sugiere quedeben existir mecanismos que controlan la densidad de los taxa y que debenfuncionar de manera más o menos similar en todos los ambientes, mientrasque los que controlan la diversidad total de la comunidad bacteriana trabajan demodos distintos en el agua y el suelo. Existen algunas ideas sobre los mecanis-mos que controlan la diversidad procarionte y ambas tienen que ver con laecología.
INTERACCIONES TRÓFICAS
Hutchinson3 se preguntaba por qué hay tantas especies de fitoplancton en unmedio aparentemente homogéneo, en donde todas las especies presentes pare-cen competir por el mismo tipo de nutrimentos. Dentro de los procariontes loscompetidores pueden coexistir si hay algún mecanismo de pérdida selectiva deespecies que evite que los competidores más exitosos concentren todos los re-cursos.4, 5, 6 Por ejemplo, existe depredación selectiva en tamaño, llevada a cabopor protozoarios, lo que permite la coexistencia de bacterias y fitoplancton dediferentes tallas; esta interacción determina cómo se distribuye la biomasa engrupos funcionales. Otra interacción frecuente en el mundo de las comunida-des microscópicas es la que se da entre virus y bacterias, este parasitismo esgeneralmente específico y ello permite la coexistencia de varios taxa de bacte-
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rias en una comunidad. Este tipo de interacción ha sido asociado con laespeciación dentro de grupos funcionales,7 pues la transferencia horizontalmediada por fagos favorece la diversificación.
B. HETEROGENEIDAD AMBIENTAL
La complejidad estructural del suelo y los sedimentos es importante para ladiversificación a nivel de poblaciones ya que permite que los recursos seanfraccionados, y de esta manera se creen nuevos nichos con los que se incrementala especialización y la división en especies ecológicas nuevas.7
La mayoría de las comunidades terrestres sufren perturbaciones intermiten-temente como: escasez de alimento, sequía, congelamiento/descongelamientoo los resultados de la actividad humana. Estas condiciones ambientales altera-das y los recursos que se liberan crean oportunidades para que se establezcannuevas especies. Así, la perturbación asegurará que las comunidades incluyanuna mezcla de los diferentes estadios de sucesión.8 Sin embargo, cambios fuer-tes y frecuentes causarán la desintegración de los microhabitats y la disrupciónde los límites entre poblaciones, lo que permitirá que los recursos locales esténdisponibles para una mayor proporción de la masa microbiana total7 es decir,más individuos pero menos especies.
3. UNA SOLUCIÓN MOLECULAR PARA DESHACER EL NUDO DE LA
ECOLOGÍA MICROBIANA
Sin embargo, si se quiere hacer ecología microbiana se tendrá que identificar ycontar a los microbios ¿Cómo se podra “ver” lo invisible y contar lo que no sepuede cultivar? Este es el problema fundamental de la ecología microbiana. Acontinuación se presenta diversas técnicas para resolver estos problemas.
CULTIVAR O NO CULTIVAR
El número de especies microbianas existentes ha sido estimado entre 105 y 106;9
sin embargo, sólo se han aislado, descrito o caracterizado algunos miles. Esto sedebe, en parte, a que sólo unos cuantos organismos de las muestras ambientalescrecen en medios nutritivos en cajas de Petri.10, 11, 12, 13
Se han hecho muchos intentos para mejorar la recuperación en cultivo,consistentes, de manera general, en manipular cuidadosamente los medios de
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cultivo y aumentar el número de interacciones entre especies dentro de unamisma caja14 pero el éxito ha sido moderado y el problema del mundo no culti-vable sigue siendo un reto importante de la microbiología .10
Kaeberlein et al.14 probaron si los organismos no cultivables crecerían si seles proveía de los componentes químicos de su ambiente natural. Para permitirel acceso a estos componentes, colocaron a los microorganismos en cámaras dedifusión, mismas que se incubaron en un acuario que simulaba el lugar nativode estos organismos (figura 1). Con este método lograron recuperar en cultivoalrededor del 40% del inóculo original (se contó el número de colonias forma-das en relación al número de células inoculadas), lo cual representa una recu-peración órdenes de magnitud mayor que en los intentos tradicionales de cul-tivo. Además de esta extraordinaria recuperación “primaria” en cultivo, se in-tentó aislar colonias de la comunidad cultivable y con este experimento se logróel resultado más significativo del trabajo. La mayoría de las colonias aisladastransferidas a cajas de Petri no crecieron (86%) y las microcolonias que logra-ron crecer (14%) eran cultivos mixtos. Unas pocas colonias grandes y que cre-cieron rápidamente fueron puras y representaron el 0.054% del inóculo origi-nal, lo cual es consistente con lo reportado previamente en relación con larecuperación en cultivo. Esta información lleva a conclusiones interesantessobre la ecología de los microorganismos, pues parece resaltar la importancia deposibles señales específicas originadas por los organismos vecinos que indicanla presencia de un ambiente familiar. Esto significa que los microorganismosno crecerán en un ambiente extraño (sin sus vecinos) aunque existan losnutrientes apropiados.14 Lo que podría explicar el por qué no es posible aislar ala mayoría de los microorganismos en medios artificiales como cultivos puros.No obstante, aquí habría que abrir la discusión sobre si realmente son los veci-nos o hemos sido incapaces de determinar los micronutrientes necesarios paralograr cultivos puros de la mayoría de los microorganismos.
4. ¿COMO HACER ECOLOGÍA DE COMUNIDADES SIN OBTENER CULTIVOS
PUROS DE LA MAYORÍA DE LOS MICROORGANISMOS? (MÉTODOS
MOLECULARES PARA EL ANÁLISIS DE LO NO CULTIVABLE)
PFLA (PHOSPHOLIPID FATTY ACID ANALYSIS)
En todos los microorganismos encontramos fosfolípidos, principalmente en lasmembranas celulares, las cuales pueden ser degradadas fácilmente dejando libreel componente fosfolipídico. Los fosfolípidos de las membranas son indicadores
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importantes de la biomasa microbiana activa y además se sabe que existen lípidosúnicos en grupos específicos de organismos, por lo que este análisis ha sido usadopara determinar la diversidad y abundancia microbianas.15, 16 El PFLA requiereque la muestra ambiental de estudio sea analizada cuantitativamente porcromatografía de gases (GC) y espectrometría de masas (MS), lo que genera datossobre la presencia y abundancia de diferentes fosfolípidos.17, 18 Los datos obtenidossobre los ácidos grasos de las muestras pueden ser comparados con bases de datospúblicas18 lo que permite la asociación de ciertos PFLA con organismos o gruposespecíficos. Las diferencias en los patrones de PFLA pueden ser interpretadas conrelación a cambios en la composición de las comunidades. Este método ha sidoutilizado con éxito en estudios que demuestran grandes cambios en comunida-des micro-bianas asociadas a prácticas de manejo de suelos.19, 20
A pesar de la utilidad de este método de análisis existen algunas limitacionesimportantes.21 La primera es que no se conocen los patrones de ácidos grasospara todos los organismos, por lo que los datos obtenidos de muchas muestrasno pueden relacionarse con algún grupo de microorganismos. La segunda limi-tación es que los patrones de ácidos grasos son muy susceptibles a cambios nonecesariamente debidos a la composición de la comunidad, por lo que puedenobtenerse patrones falsos que originen interpretaciones incorrectas. La tercerarestricción es que bacterias y hongos producen diferentes cantidades de ácidosgrasos dependiendo de las condiciones de crecimiento o estrés, por lo que apesar de que los patrones de PFLA puedan correlacionarse con la presencia dealgunos organismos, esto no significa necesariamente que esos patrones seanúnicos para esos grupos en todas las condiciones.
TÉCNICAS BASADAS EN ÁCIDOS NUCLÉICOS
De entre todas las moléculas probadas hasta ahora, los ácidos nucléicos handemostrado ser las moléculas más útiles, pues han contribuido con una nuevaperspectiva y entendimiento sobre la estructura de las comunidades. Una de lasprincipales ventajas asociadas a los métodos moleculares con ácidos nucléicoses que puede analizarse a la comunidad microbiana en su totalidad, incluyendoa aquellos organismos que no han podido ser cultivados en el laboratorio. Es porello que estos métodos se han vuelto cada vez más importantes en la ecologíamicrobiana.22,23,24,25 Aún los análisis de baja resolución y amplia escala, como lareasociación de ADN, permiten la determinación una aproximación de la di-versidad genética total de la comunidad bacteriana.26
La electroforesis de productos de PCR (por las siglas en inglés de PolymeraseChain Reaction) de genes de rARN en geles desnaturalizantes de gradiente (DGGE)permite tener mayor resolución y provee información sobre cambios en el grueso
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de la estructura de la comunidad.27 Cuando se combinan análisis de genes derARN en DGGE con hibridación, usando sondas filogenéticas o secuenciando,se obtiene la afiliación filogenética de los miembros dominantes en númeroque se encuentran en la comunidad.28 La hibridación fluorescente in situ (FISH)de células microbianas con sondas filogenéticas provee información acerca dela composición taxonómica de la comunidad.29,24
Finalmente, la clonación de productos de PCR de genes de rARN de la comu-nidad arroja información específica de la comunidad microbiana no cultivable.Esta estrategia también permite la comparación de la estructura de la fraccióncultivable con respecto a la no cultivable.30 De esta manera, los ácidos nucléicosse han utilizado de diferentes maneras para caracterizar a las comunidades. Acontinuación ampliaremos la descripción sobre las estrategias mencionadas.
Cinética de reasociación de ADN
El ADN de una comunidad microbiana es una mezcla de genomas de diferentesespecies que están presentes en diferentes proporciones. Una curva dereasociación de ADN nos da una idea de que tan compleja es esa mezcla. Latécnica consiste en desnaturalizar con calor la mezcla total de ADN y mediantela lectura de un espectrofotómetro (la monohebra de ADN y el ADN de doblecadena tienen picos de absorbancia a diferentes longitudes de onda),31 lo quepermite generar una cinética de reasociación de ADN, que es de segundo ordeny cual quiera de este tipo de curvas tiene una constante de reasociación C0t1/2.Bajo condiciones definidas, C0t1/2 es proporcional a la complejidad del ADN.(heterogeneidad).32 Estos valores son siempre relativos a la cinética dereasociación de ADN de una sola especie (ADN de Escherichia coli); esta se con-sidera la curva ideal y una curva de una comunidad siempre tendrá pendientesmenores a la ideal (ver figura 2). Aunque en estos experimentos C0t1/2 no tieneun significado preciso, este valor ha sido usado como similar a índices de diver-sidad de especies.31
RAPD´s (Random Amplified Polymorphic ADN)
El fingerprint o huella de ADN puede obtenerse de diferentes maneras, una deellas es la conocida como RAPD. Dentro de los métodos de huellas de ADNbasados en PCR quizás sea este el más ampliamente usado. El PCR de RAPDutiliza oligonucléotidos de 10 a 12 pares de bases para amplificar segmentos alazar de ADN. Este método funciona porque sólo un pequeño número de frag-mentos (de 5 a 10) se amplificarán en un rango de longitud que puede ser
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fácilmente amplificado por PCR (comúnmente menor a 3 o 4 kilobases).33
Cuando el ADN que se encuentra entre las secuencias amplificadas consta derepeticiones en tandem y hay variaciones en su longitud, el fragmento amplifi-cado será de longitud variable o polimórfico en la población o comunidad (verfigura 3).
Esta estrategia puede servir para dar un primer vistazo a la composición dedistintas comunidades; sin embargo, debemos mencionar que esta técnica espoco reproducible debido a que cualquier variación mínima en las condicionesde PCR o del ADN original puede generar cambios en los patrones, por lo que esrecomendable utilizar técnicas adicionales para fortalecer los datos sobre laestructura de las comunidades.
Técnicas relacionadas con la diversidad de genes de rARN (SSU)
De las diferentes técnicas que usan ácidos nucléicos para estimar la diversidadde comunidades microbianas, la más útil y ampliamente utilizada es la deter-minación de secuencias o patrones del gen que codifica para la subunidadpequeña de los ribosomas (16S para procariontes y 5S o 18S para eucariontes).34
Esta subunidad pequeña (SSU) de rARN es adecuada para este tipo de estudiospor varias razones. La primera es que se encuentra en los tres dominios de lavida conocidas: bacteria, Archaea y Eucarya.35 La segunda es que son moléculasque tienen regiones altamente conservadas y regiones con variación considera-ble en su secuencia,36 y debido a estas tasas de evolución diferentes se puedenestablecer relaciones a diferentes niveles jerárquicos en un análisis comparati-vo de secuencias.15 La tercera razón es que el rADN puede amplificarse fácil-mente por PCR y ser secuenciado. Varios estudios han demostrado que más del90% de los microorganismos que pueden observarse microscópicamente insitu pueden ser extraídos y analizados,37, 38, 39, 40, 41, 42 en comparación con menosdel 0.1% que pueden cultivarse.15 Una vez amplificado el gen de rARN por PCRes posible analizar la diversidad de este gen en la comunidad para tener una ideade la complejidad de la misma, siguiendo diferentes estrategias que se explica-rán a continuación.
DGGE/TGGE (Denaturing Gradient/ Temperature Gradient Gel Electrophoresis)
Esta técnica permite separar mezclas de productos del PCR que son de la mismalongitud pero que difieren en secuencia. El poder de separación de este tipo deelectroforesis se basa en que el comportamiento de desnaturalización del ADNestá determinado de manera importante por la secuencia de nucléotidos. Al
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correr el ADN en el gel, la molécula se mantiene como doble cadena hasta quealcanza la concentración o temperatura desnaturalizante, reduciendo su movi-lidad en el gel.15 En teoría, cualquier gen de rARN que se encuentre en el ADNtotal de la comunidad puede ser amplificado por PCR y resuelto en un gelDGGE/TGGE, ya que en este tipo de análisis cada banda en el gel es consideracomo una especie distinta en la comunidad y la intensidad de las bandas estomada como un reflejo de la abundancia de esa secuencia en la comunidad(figura 4).
Existen algunas consideraciones importantes sobre esta técnica y tienenque ver con la interpretación de los datos obtenidos. En particular, es posibleque diferentes especies generen una misma banda por lo que los estimados dediversidad serán subestimaciones. Por ello lo ideal es hacer estimaciones dediversidad relativa entre comunidades y considerar “filotipos” o OTU (unidadestaxonómicas operacionales) en lugar de especies.
T-RFLP´s (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism)
El análisis de fragmentos de restricción terminales es actualmente uno de losmétodos más poderosos que existen dentro del campo de la ecología microbianapara comparar rápidamente la diversidad de secuencias de ADN bacterianoamplificado por PCR de muestras ambientales.43, 44. El método se basa en lavariación en la posición de sitios de restricción entre las secuencias y en ladeterminación de la longitud de fragmentos terminales de restricción (TRF)marcados con fluorescencia y analizados por medio de electroforesis en gelesde alta resolución en secuenciadores de ADN.45, 46 El resultado es una distribu-ción de abundancia de fragmentos de diferentes tamaños (figura 5). Dentro delas características más importantes de este método está la gran velocidad deanálisis de las muestras, lo que permite hacer réplicas de los experimentos y conello lograr análisis estadísticos.47 El método de TRF puede ser usado para iden-tificar diferenciación de comunidades, para comparar ha riqueza relativa defilotipos y estructura de comunidades, y para identificar organismos específicosen una comunidad,47 a partir de la clonación y secuenciación de fragmentosespecíficos de 16S rARN de dicha comunidad.
A pesar de que éste es un método rápido de análisis comparativo de comuni-dades tiene relativamente baja resolución. Esto se debe a que existe cierta pro-babilidad de que varios filotipos se encuentren representados por un solo tama-ño de fragmento y representen un solo pico en la distribución; esto puede llevar,nuevamente, a subestimar la riqueza de especies, la cual puede ser calculadapor otros métodos con mayor resolución filogenética, pero a mucho mayorcosto. Esta situación fue puesta a prueba por Dunbar,47 al comparar los estima-
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dos de riqueza obtenidos de una librería de clonas de 16S y de TRFLP obtenidosde la misma muestra de donde se construyó la librería. Dunbar et al. concluye-ron que los patrones de TRFLP subestiman la riqueza relativa del total de losfilotipos; sin embargo, permite descubrir similitudes entre comunidades y tie-ne una buena sensibilidad (detecta genomas que se encuentran en concentra-ciones tan bajas como el 1% del total de la comunidad). Es por ello que estemétodo se recomienda como útil para análisis rápidos de muestras de campoque quieran compararse en cuanto a su composición y es una herramienta útilpara investigaciones de ecología microbiana.
ARDRA (Amplified Ribosomal ADN -Restriction Análisis)
ARDRA es una técnica de fingerprint o huella de ADN que se usa para caracte-rizar comunidades y poblaciones. Consiste en amplificar por PCR el gen de16S rARN de la comunidad total, aislar las diferentes copias que se encuentranen la mezcla y, posteriormente, someter a cada una de las copias a digestionesenzimáticas (restricción); también puede digerirse la muestra total (sin sepa-rar las copias).48 La manera más común de separar las diferentes copias del el16S rARN (o cualquier otro ) de la comunidad es clonando los diferentesfragmentos en cepas especiales de Escherichia coli que son capaces de transfor-mar e incorporar el fragmento en un plásmido con marcadores molecularesde color (i.e., operon lactosa) y resistencia a múltiples antibióticos. Esto sehace al mezclar el PCR total con bacterias susceptibles a adquirir ADN extraño(competentes); de esta manera, cada bacteria obtendrá una sola copia del geny así quedarán separadas las diferentes copias de la mezcla total. Las bacteriasque contienen los fragmentos se dejan crecen en cajas de Petri con antibióticosy posteriormente se aisla el ADN plasmídico junto con el gen de interés que sepuede separar del ADN bacteriano. Cada gen obtenido de esta manera se so-mete a una digestión enzimática que da como resultado un patrón de bandasen electroforesis en geles de agarosa (figura 6). Los patrones de restricciónpermiten identificar diferentes grupos (diferentes patrones de restricción nosignifican necesariamente especies diferentes) o identificar comunidades dis-tintas. Si el ARDRA se hace con copias separadas del gen 16S rRNA, el análisisde los diferentes patrones permite hacer estimaciones de diversidad y/o elegirrepresentantes de los patrones distintos para obtener las secuencias e identifi-car los grupos taxonómicos específicos a los que pertenecen o con los que serelacionan. El problema principal de esta técnica es que dado el número declonas que se deben obtener por comunidad para determinar su diversidad yabundancia por restricción, los costos son casi iguales que si se secuencia lacomunidad completa.
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Secuencias
Cualquiera de las estrategias de ácidos nucléicos mencionadas puede concluircon la secuenciación de una muestra de las copias del gen 16S rARN por sitio. Sinembargo, se pueden evitar los análisis antes mencionados y hacer el PCR del ADNtotal, e inmediatamente después secuenciar todas las copias con clonación previa.El análisis de secuencias en comunidades microbianas requiere siempre separarlas diferentes copias de la muestra, ya sea por clonación o cortando las diferentesbandas de geles TGGE. Obtener la secuencia de 16S rARN de los diferentes organis-mos de la muestra tiene varias ventajas. Una de ellas es que se construye unalibrería de clonas que mantiene las copias separadas y listas para otros análisis enel futuro. Otra ventaja, y quizás la más importante para el análisis de comunidadesmicrobianas, es que la obtención de secuencias de librerías de clonas es la únicamanera de contar con estimados robustos sobre diversidad de comunidades com-plejas (como muchas comunidades microbianas).49
La principal limitante encontrada hasta ahora para la aplicación general deanálisis de comunidades con secuencias es su costo (el cual está reduciéndoseconstantemente debido a la gran demanda de estos métodos) y el tiempo que latécnica requiere, ya que cada una de las secuencias debe de ser “curada”, es decir,confirmar que cada pico del electrofenograma sea el correcto. Posteriormente,las secuencias deben ser sometida a Blast con el GenBank y alineadas conside-rando la estructura terciaria del 16S.
Técnicas relacionadas con la expresión de genes (rARN)
Varios análisis se han enfocado recientemente a la caracterización de comunida-des microbianas del suelo basándose en la expresión del rARN en contraste con losgenes que codifican para el ribosoma: el rADN.50, 51, 52, 53, 54, 55 Al igual que el rADN,el ARN tiene regiones tanto variables como muy conservadas que permiten ladiscriminación de taxa a diferentes niveles taxonómicos. Además, el uso de ARNdirecto ofrece varias ventajas principales sobre el uso de técnicas con rADN.
La primera ventaja es que, debido a que los ribosomas son el sitio de síntesis deproteínas, el contenido de ARN se correlaciona con la actividad metabólica y latasa de crecimiento,56 lo que significa que una alta proporción de las secuenciasdetectadas en las muestras corresponderán a microorganismos metabólicamenteactivos, en crecimiento y probablemente importantes ecológicamente.53, 57, 58 Lasegunda ventaja es que debido a que las secuencias de rARN normalmente seencuentran en las células en más copias que las secuencias de rADN teóricamentedeben ser más fáciles de detectar. La tercer ventaja es que cuando los ribosomas se
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extraen directamente de las muestras ambientales solo se incluyen en el estudio alos microorganismos vivos y activos. Al igual que con el rADN, cuando los am-pliaciones de rARN se separan en geles DGGE/TGGE, el patrón de bandas sirvecomo una huella digital de la comunidad microbiana. Si se supone que no haysesgo en la amplificación, la intensidad de las bandas indica la abundancia en lacomunidad de la secuencia de rARN correspondiente.50
Sin embargo, un factor importante que complica las interpretaciones sobrela abundancia de un taxon es que el número de operones de rARN dentro de ungenoma puede variar entre los grupos taxonómicos59 por ello es posible queexista heterogeneidad en las secuencias de rARN dentro de una misma cepa y,en consecuencia, no puede suponerse que cada producto de PCR en el gel co-rresponda a un organismo diferente, y un mismo organismo puede estar repre-sentado por varias secuencias distintas.15 Por otro lado, la intensidad de la bandapuede deberse a muchas copias de una misma secuencia en el mismo organis-mo o a que existen muchas células del organismo que posee la secuencia. Unamanera de distinguir entre estas dos posibilidades es mediante hibridización insitu.60 Otra forma es correr el mismo gel con productos de PCR de rARN y rADNy comparar la intensidad de las bandas para determinar si esta se encuentrarelacionada con el número de copias del gen.57
A pesar de que esta técnica puede ser muy útil para estudiar comunidadesmicrobianas, existen limitaciones técnicas en ella debido a lo lábil que es el ARN.Por lo tanto es necesario tener mucho cuidado con el almacenamiento y procesa-miento de las muestras ambientales, ya que cualquier mínimo cambio en las con-diciones ambientales originales puede alterar la actividad metabólica de losmicrobios.61Esto se puede evitar con el procesamiento inmediato o congelamientode las muestras. Otra restricción se presenta con respecto a la eficiencia de extrac-ción52 y amplificación de rARN.62, 63, 61 Existe la posibilidad de que la amplificaciónsea sesgada por mayor abundancia de algunas secuencias en el rADN original o pormayor homología de ciertas secuencias por los oligonucleótidos del PCR. La mayo-ría de los estimados son en procariontes y, aunque en teoría debería poder analizarsela comunidad eucarionte de rARN de la misma manera que procarionte, losribosomas eucariontes parecen ser más complejos en cuanto a los genes que loscodifican y su regulación, además de que las bases de datos públicas con secuenciasde rARN prácticamente no tienen representantes eucariontes, por lo que resultaproblemático identificar especies eucariontes con las secuencias de su rARN.15
FISH (Fluorescent in situ hybridization)
FISH es un método usado principalmente con comunidades procariontes ypermite la identificación y cuantificación directas de grupos taxonómicos ge-
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nerales o específicos dentro de su ambiente natural.24, 64, 65, 66 Con FISH todas lascélulas son fijadas y su 16S o 23S rARN se hibridiza con sondas de oligonucleótidosde un taxón específicos y marcados con fluorescencia. Posteriormente, las célu-las que hibridaron y quedaron marcadas pueden verse en un microscopio ópti-co de fluorescencia. Con este método y gracias a que las células completas sehibridan, se evitan artefactos generados por sesgos en la extracción de ADN,amplificación por PCR y clonación.67, 68, 58
FISH puede usarse para observar organismos no cultivados y es útil paraestudiar la distribución ecológica de los organismos a través de habitats diver-sos.67, 69, 70 Tal vez el aspecto en el que se debe tener más cuidado cuando se utilizael FISH es en el diseño de la secuencia de las sondas de hibridación, ya que deello depende que se logre una buena caracterización de la comunidad. Es nece-sario hacer una selección cuidadosa de las secuencias de los organismos repre-sentativos del taxón o taxa que se desea visualizar, pues la sonda será tan buenacomo lo sea esta selección.24 Errores en este diseño podría ocasionar que nopuedan observarse organismos no cultivables que pertenezcan al grupo de inte-rés o que se den hibridaciones cruzadas con organismos de otros grupos.29, 65, 58
5. Y AHORA QUE SE PUEDE CONTAR ¿QUÉ ES LO QUE SE CUENTA?
Ya que puede estimar indirecta y directamente la diversidad y abundancia de lasespecies de los microbios en las comunidades llegamos a un problema difícil deresolver ¿qué es una especie bacteriana? Esto no es trivial y adquiere rápidamen-te tintes filosóficos que se revisarán más adelante. En términos más prácticos,Hughes et al.,71 publicaron recientemente una revisión sobre el problema queimplica determinar el número de especies en una comunidad, y evaluaron eltamaño de muestra que en general se requiere para tener un estimado útil sobrela diversidad de las comunidades. Además analizaron la utilidad de variosestimadores de diversidad para el caso de comunidades bacterianas. La relaciónentre el número de tipos (OTU = Operational Taxonomic Unit, un eufemismopara no explicar si lo que se analizan son especies, clonas, filotipos u otra cate-goría taxonómica jerárquica) observados y el esfuerzo del muestreo nos propor-ciona información sobre el total de la diversidad de la comunidad que ha sidomuestreada. Este patrón puede visualizarse graficando una curva de acumula-ción que consiste en relacionar el número acumulativo de OTU observadoscontra el esfuerzo de muestreo. Este tipo de curvas revelan la calidad del muestreo,ya que, como todas las comunidades por definición deben de tener un númerofinito de especies, si se continúan muestreando individuos, las curvas eventual-mente tenderán a esta valor máximo, es decir alcanzarán una asíntota en elvalor real del número total de OTU en la comunidad.
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En la gran mayoría de las comunidades microbianas revisadas en el estudiode Hughes,72 no se alcanza la asíntota de las curvas debido a la gran diversidadque existe. Sin embargo, aunque sería útil conocer la diversidad total real de lascomunidades microbianas, la mayor parte de las preguntas relacionadas con ladiversidad se refieren a cambios en ésta que suceden por alteraciones ambien-tales bióticas o abióticas, por lo que las respuestas a estas preguntas requierenúnicamente estimados de diversidades relativas. De esta manera, se encontróque aunque los valores dependen del tamaño de la muestra, la mayoría de losestimadores de riqueza se estabilizan con los tamaños de muestra que, en gene-ral, tienen estos estudios, esto es con muestras de 200 a 1,000 clonas, que sugie-ren comunidades con sólo cientos a pocos miles de especies importantes (nomiles o millones, como se había sugerido previamente).
Es importante señalar que todas las estimaciones estadísticas presentan li-mitaciones y una de las más importantes y frecuentes es que no existe rigor enla definición de los OTU que se analizan ni de su relación con las especiesreales,73 por lo que diferentes estudios que calculan los mismos estimadoresgeneralmente no son del todo comparables. De igual manera, la mayoría deestas aproximaciones requieren datos sobre frecuencias relativas de los diferen-tes OTU y muchos estudios han revelado que los análisis genéticos de diversi-dad microbiana van acompañados de sesgos de muestreo. Sin embargo, el he-cho de que la mayoría de las preguntas sobre estructura y función de las comu-nidades requieran comparaciones relativas sobrepasa muchos de los problemassobre definición de especies y sesgos de muestreo.71 Mientras que la unidad demedida sea definida y constante, puede compararse la diversidad entre sitios otratamientos. De igual manera, para minimizar el efecto del sesgo de muestreose pueden usar varias técnicas o genes que fortalezcan las comparaciones.
De aquí deriva el problema de fondo en la ecología bacteriana. Un OTUanalizado ¿es una especie, parte de una especie o varias especies relacionadas?¿Qué es una especie bacteriana y cuáles son sus límites? Resolver este problemaes fundamental para estimar la diversidad y sus patrones geográficos.
Históricamente, el concepto de especie que se aplica en microbiología ha sidomás práctico que natural. La práctica ha llevado a considerar especies estáticas,cuyas características son atributos típicos o esenciales, y por tanto, supone que elfenotipo y genotipo son iguales para todos los organismos pertenecientes a laespecie. En este caso, las características que se toman pueden ser morfológicas,fisiológicas, bioquímicas e incluso genéticas. Por otro lado, el concepto natural deespecie pretende ser reflejo de una población en donde hay dinamismo y endonde existe cohesión debido a una organización interna.74 El concepto naturalde especie más usado en sistemática es el biológico, el cual supone la existencia deentrecruzamiento entre los miembros de una misma especie, de tal manera queal existir tal entrecruzamiento se asegura, de manera indirecta, que entre ese
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conjunto de organismos haya cohesión y por tanto se supone que el investigadorse encuentra ante una especie natural. La desventaja que tiene este concepto esque no es aplicable para todos los organismos, principalmente para aquellos quetienen reproducción asexual (Fungi, Protoctista, Archaea, Bacteria).
Desarrollar un concepto natural de especie para organismos con reproduc-ción asexual es uno de los mayores retos en sistemática microbiana. En la ac-tualidad se reconocen dos tipos de especie natural, la especie genética o genoespeciey la especie evolutiva o filoespecie. La primera usa como carácter único los índicesde hibridación. El establecimiento de similitud en la secuencia del ADN de dosorganismos se logra mediante análisis de reasociación de ADN y de secuenciasdel gen 16SrARN. En el caso de reasociación de ADN, si las secuencias de las dosmuestras de ADN son homólogas, se formarán hélices dobles híbridas. Única-mente las muestras que tengan 70% de reasociación bajo condiciones modera-damente restrictivas pueden considerarse como una especie genética.75, 76 Sihablamos de secuencias de 16SrADN el porcentaje de similitud de organismosde una misma especie es mayor a 97%.
El concepto de genoespecie ha sido muy cuestionado. La idea de tener un 70%de reasociación o 97% de similitud en 16SrADN es muy ambigua, sobre todo si sequiere extrapolar a macroorganismos. Por ejemplo, si se toma la definición del70% de homología genómica, todos los primates podrían ser considerados miem-bros de una sola especie.73 Además, se ha encontrado que en especies procariontesla frecuencia de transferencia horizontal, así como de eventos parasexuales esmuy alta y por tanto podría dar resultados filogenéticamente erróneos al influiren el grado de reasociación del ADN,77 y en la secuencia de genes como 16SrARN.
En este punto comienza la discusión acerca de la importancia de larecombinación genética (homóloga y no homóloga) en la dinámica evolutiva de laspoblaciones. La recombinación genética homóloga presenta dos efectos fundamen-tales en las poblaciones: impide la divergencia entre subpoblaciones, las homogenizay, al mismo tiempo, aumenta la diversidad de genotipos en la población.
Por otro lado, los efectos de la recombinación no homóloga originan nuevasvariantes y, potencialmente, nuevas especies. La adquisición de nuevos genesque sean funcionales y de carácter adaptativo en el ambiente puede producirespeciación express en los organismos; se ha sugerido que tal es el caso de Yersiniapestis y Y. tuberculosis.
Cuando la frecuencia de la recombinación homóloga y no homóloga es muyalta en un grupo de poblaciones naturales, el efecto combinado puede ser muydiferente a las consecuencias planteadas previamente. En este caso las especiespueden presentar una gran cantidad de nichos producto de la adquisición denuevas funciones; sin embargo, como la recombinación homóloga es alta, laspoblaciones de la especie se mantienen homogéneas. Escherichia coli y Vibriocholerae son ejemplos de este caso.
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Como podemos observar, la delimitación de las especies microbianas no esun asunto trivial y la practicidad no va acompañada de grupos naturales. Sinembargo, en términos de comparación y estimaciones aproximadas de la diver-sidad y distribución de microorganismos, el uso de marcadores molecularescomo el 16S rADN u otros genes particulares a ciertos grupos resuelve el proble-ma inmediato sobre la estimación de la diversidad, siempre que haya consisten-cia en cómo se define la unidad de análisis u OTU.
6. LOS PATRONES EN COMUNIDADES BACTERIAS: ¿EXCEPCIONALES O
COMUNES?
Dejando a un lado los problemas taxonómicos en el caso de las bacterias, losdatos ecológicos sobre microorganismos aún son escasos lo que ha generadodiversas especulaciones sobre la posibilidad de que los microorganismos seanorganismos de excepción. En otras palabras, los pocos datos han generado unfuerte debate en cuanto a la universalidad de las reglas ecológicas, esto es, si losmicroorganismos se distribuyen y organizan de manera similar o al menossiguen las mismas “reglas” o principios ecológicos que los organismos grandescomo plantas y animales. Esta discusión resulta extraordinariamente relevanteya que, como se menciono, hoy en día los principios y reglas ecológicas sefundan en observaciones hechas en macroorganismos, y el hecho de que estospudieran ser distintos implicaría que más de dos terceras partes de la vida en laTierra se rige por otros principios ecológicos. Se cree que los microorganismosdeben regirse básicamente por los mismos principios ecológicos que losmacroorganismos, ya que que siguen los mismos principios evolutivos y bioló-gicos. De cualquier manera, los resultados que se obtengan con las herramien-tas moleculares actuales nos permitirán comparar la ecología del mundomacroscópico y microscópico y evaluar la universalidad de las reglas ecológicas.
Algunos autores defienden que todos los organismos pequeños son muy abun-dantes y se distribuyen por todo el mundo, sin barreras ecológicas. Esto puede sercierto para algunos microorganismos, como con adaptaciones extraordinariaspara la dispersión y gran resistencia a cambios en el ambiente (protozoarios,diatomeas, bacterias formadoras de esporas, hongos, bacterias marinas). Tambiénparásitos humanos que pueden generar epidemias mundiales pueden encontrasecasi en todas partes (Escherichia coli, Vibrio cholerae). Sin embargo, existen otrasobservaciones que apuntan a la existencia de fuertes barreras ecológicas que limi-tan la dispersión de los microorganismos, generando divergencias genéticas entrepoblaciones de las mismas especies debido al aislamiento, lo cual se ajusta más alos principios ecológicos y evolutivos observados en macroorganismos.
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La aparición de las herramientas moleculares ha dejado abierta la puerta aestudios ecológicos como los que se han realizado durante décadas conmacroorganismos. Recientemente, han aparecido varios trabajos en donde seevalúa la diversidad y distribución de microorganismos usando modelos desa-rrollados especalmente para este grupo. Los resultados de dichos estudios hanconducido al debate sobre la posibilidad de distribuciones biogeográficas enmicroorganismos (distribución geográfica asociada a ciertas condiciones ecoló-gicas) y sobre las barreras reales a la dispersión de microorganismos.
Mientras que algunos autores presentan resultados en donde no hay asocia-ción obvia entre la distribución de los microorganismos y la geografía, otrosparecen demostrar lo contrario. Estos estudios contradictorios plantean la pre-gunta de si existen realmente patrones de distribución en microorganismos.
Hillebrand y colaboradores,78 comparan la diversidad en diferentes organis-mos, desde protistas hasta vertebrados, bajo la visión de relaciones que han sidoestudiadas en macroorganismos (relación entre el número de especies y el áreade estudio, entre el número de especies y de individuos). La conclusión delestudio es que no hay razón para pensar que existan límites para la dispersión demicroorganismos; es decir, pueden existir en todo el mundo, como ha sidosugerido por Finlay.79 Sin embargo, este tipo de trabajos no son concluyentes niabsolutos debido a la falta de consideración de los diferentes hábitos y formas devida de los microorganismos. No es lo mismo un organismo de vida libre concapacidades extraordinarias de dispersión (como formadores de esporas), queun organismo parásito y ni qué decir de los microorganismos altamente espe-cializados y con capacidad limitada de dispersión, como los que habitantes delas ventilas hidrotermales en el fondo del mar o simbiontes estrictos asociados aorganismos sésiles, como a gusanos lofoforados de fondos marinos o en corales.
Apenas comienzan a plantearse preguntas sobre la distribución geográficade los microbios y las respuestas pueden ser muy interesantes, tanto para losecólogos de organismos macroscópicos como para los ecólogos demicroorganismos. En el primer caso, las respuestas pueden contribuir al enri-quecimiento de la teoría existente y en segundo las respuestas pueden llevar a laintroducción de un soporte teórico sólido.
7. ECOLOGÍA EXTREMA: CICLOS BIOGEOQUÍMICOS Y ECOLOGÍA FUNCIONAL
BACTERIANA
El hecho de que los procariontes hayan sido de los primeros pobladores terrestresy que hayan vivido en un inicio en condiciones extremas (luz ultravioleta, tempe-raturas extremas, condiciones anóxicas y un ambiente químico cambiante), les
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confirió una serie de estrategias metabólicas que les ha permitido vivir en muydiversas condiciones ambientales. Estas estrategias los conservan íntimamenteinvolucrados en el movimiento y la transformación (ciclos biogeoquímicos) delas diferentes formas químicas de muchos elementos, pero especialmente de aque-llos esenciales para la vida como: el oxígeno (O), el carbono (C), el nitrógeno (N),el azufre (S) y el fósforo (P). A continuación se explican algunos de ellos.
Desde el inicio de la vida en la Tierra, los procariontes (Bacteria y Archaea)han jugado un papel preponderante, moldeando las características físico-quí-micas del ambiente que nos rodea. La formación de la atmósfera en la Tierra fueun proceso que duró varios millones de años y se cree que las cianobacterias(únicos organismos capaces de tomar la energía del sol y el bióxido de carbonopara transformarlos en azúcares liberando oxígeno la fotosíntesis aerobia fue-ron las responsables, en un inicio, de la producción del oxígeno atmosférico,hace aproximadamente 2.3 millones de años. Por su capacidad para vivir tantoen condiciones anaeróbicas, como aeróbicas y de fijar en nitrógeno insolubledel aire a nitrógeno soluble como amonio, las cianobacterias fueron los orga-nismos predominantes del mar Precámbrico durante miles de millones de años,creando a su paso gran cantidad de fósiles conocidos como estromatolitos. Conel paso del tiempo la atmósfera se fue enriqueciendo con el oxígeno de la foto-síntesis, lo que dio paso a un cambio en su composición química y en lascondiciones climatológicas prevalecientes; es decir la Tierra dejó ser un planetaanaranjado cálido con una atmósfera de metano y bióxido de carbono paraconvertirse en un planeta azul donde el oxígeno predomina y donde la capa deozono protege al planeta de los rayos ultravioleta.
Aún hoy la fotosíntesis, y en consecuencia la producción de oxígeno en lossistemas terrestres que se lleva a cabo por las plantas superiores, es realizadaexclusivamente por los cloroplastos, los cuales son producto de la endosimbiosiscon cianobacterias.80 Sin embargo, este oxígeno liberado a la atmósfera por lossistemas terrestres es consumido nuevamente mediante la respiración. De talforma que las cianobacterias fotosintéticas marinas son las responsables engran medida del mantenimiento del oxígeno atmosférico.
Este cambio atmosférico realizado por las bacterias a escala geológica tal vezsea el más evidente. Pero los cambios físicos y químicos han sido muchos y dediferentes magnitudes, y resultan esenciales para la vida, ya que procesos comola fijación de nitrógeno, y el ciclo de carbono son parte esencial del reciclamientode nutrientes y sólo realizan los procariontes. Asimismo, los cambios en lascondiciones químicas de los cuerpos de agua, la intemperización y la precipita-ción de minerales y la remineralización del carbono orgánico también sonresponsabilidad de las bacterias.
El carbono es un elemento esencial para la formación de compuestos orgá-nicos y la obtención de energía la concentración más grande de este elemento se
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encuentra en la corteza terrestre en forma de carbonato de calcio y de magnesio.La tasa de cambio de este almacén es extremadamente lenta, por lo que es elcarbono (C) orgánico (proveniente de los restos de vegetales, animales,microorganismos y la respiración) el que tiene importancia dentro de nuestraescala temporal. Los productores primarios, es decir, las plantas superiores, lascianobacterias fotosintéticas y procariontes quimioautótrofos son los encarga-dos de transformar el CO
2 existente en la atmósfera en materia orgánica (prin-
cipalmente polisacáridos). El C incorporado puede regresar nuevamente a laatmósfera como CO
2 o CH
4 (metano), formar parte de la biomasa microbiana
del suelo o ser mineralizado por los microorganismos. Además los polisacáridosproducidos por los microorganismos son un elemento de cohesión muy im-portante de las partículas del suelo, que les dan estructura, resistencia y capaci-dad de almacenamiento de nutrientes, necesarios para el crecimiento de lasplantas.
El nitrógeno es un elemento clave en las células ya que forma parte de losaminoácidos, de ciertas vitaminas, enzimas, proteínas y del ADN. El nitrógenoconstituye aproximadamente el 79% de la atmósfera y se encuentra en unaforma muy estable (N
2). Esto implica que molecularmente se requiere mucha
energía para su rompimiento y aprovechamiento. Sin embargo, la capacidad defijar nitrógeno atmosférico es exclusiva de algunas bacterias. Especies comoAzotobacter, Azomonas, Klebsiela, Citrobacter, Thiobacillus son capaces de fijar Natmosférico en forma aeróbica; Clostridium, Desulfovibrio, Chromatium,Thiocapsa, Heliobacillus y Heliobacterium, entre otras, lo hacen en formaanaeróbica. Existen también algunas especies de bacterias (Rhizobium,Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium) que fijan N y viven en formasimbiótica con algunas plantas, muchas de ellas leguminosas. Una vez fijado, elN es transformado en amonio (NH
4), forma química que puede ser aprovecha-
da por las plantas y otras bacterias. El amonio también es transformado porbacterias del género Nitrosomonas en nitritos (NO
2-) y posteriormente en nitra-
tos (NO3
-), proceso a cargo de las bacterias del género Nitrobacter. El nitratoformado puede ser lavado a capas inferiores del suelo y alcanzar el manto freáticoy eventualmente el mar o utilizado por Pseudomonas y Achromobacter (bacteriasdenitrificantes). Durante el proceso de denitrificación se produce óxido nitroso(N
2O) que puede ser liberado a la atmósfera o ser reducido nuevamente a N
2.
Las emisiones volcánicas, la lluvia y los desechos gaseosos producidos por laindustria son fuente de diferentes compuestos del azufre (H
2S, SO
4, SO
2). Este
elemento forma parte de aminoácidos y vitaminas como la cisteína, la metionina,la biotina y la tiamina, como grupo sulfhidrilo (-SH). Sin embargo, para suabsorción debe encontrarse en forma de sulfato (SO
42-) o tiosulfato (S
2O
32-). Tal
vez el azufre (S) es el elemento con uno de los ciclos biogeoquímicos máscomplicados debido al gran número de pasos en su oxidación y reducción,
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todos realizados por bacterias, que pueden ser aerobias (Thiobacillus, Beggiatoa)o anaerobias (Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfomonas).
El fósforo es un elemento primordial para los seres vivos, pues a diferenciadel O, N, S y N carece de fase gaseosa. Gran parte del P utilizado por las plantasproviene de la mineralización de rocas sedimentarias. El ciclo del fósforo esmuy parecido al ciclo del N y del S, en el que los microorganismos, junto con losagentes ambientales físicos y químicos, realizan la mayor parte de la minerali-zación de este elemento.
Como ya se mencionó, las bacterias fueron los primeros productores demateria orgánica, por lo que forman la base original de la cadena alimenticia,permitiendo la evolución de nuevas especies que utilizaban esta materia comofuente de energía, creando así las primeras redes tróficas. En todos los ecosistemasexistentes la cadena trófica varía en su longitud y complejidad, pero en todosempieza por los productores primarios que capturan la energía del sol (fotosín-tesis aeróbica o anaeróbica) o la energía química de los compuestos inorgánicosde los minerales y termina con los degradadores de detritus y de la materiamuerta. En ambos extremos de la cadena las bacterias son predominantes, in-clusive es tal el acoplamiento existente entre las diferentes comunidadesbacterianas que los productos de desecho de algunos microorganismos consti-tuyen la fuente nutrimental de otros. Estos productos de desecho también pue-den acumularse en los ecosistemas produciendo cambios físicos y químicosgraduales.
En el mar se han encontrado algunos ejemplos interesantes de estas cadenasalimenticias, donde las bacterias también tienen papeles importantes al inicio yal final de las cadenas, ya que contribuyen a la producción de alimento a partirde sustratos orgánicos disueltos en el agua y son las responsables de romper lamateria orgánica, regresando así los nutrientes al mar.81 En el fondo del martambién cumplen funciones que comienzan a entenderse, formando parte delas cadenas que involucran oxidar o reducir moléculas inorgánicas.82 Estos des-cubrimientos han sido sorprendentes, ya que el mar era un ambiente pocoestudiado y donde se pensaba encontrar poca diversidad de bacterias en lascostas; por otra parte, en las zonas alejadas y de gran profundidad no era imagi-nable encontrar habitantes, debido a las altas concentraciones de sal, la pocacantidad de luz, oxígeno y nutrientes. Las nuevas técnicas moleculares a las queya se ha hecho referencia han permitido descubrir, contrario a lo que se creía,que incluso en el mar profundo existen una gran cantidad de bacterias, distintasentre sí, con novedosas y raras propiedades.
En las costas se halla una gran diversidad y mayor proliferación de distintostipos de microorganismos, ya que en la superficie hay disponibilidad de oxígenoy la cercanía con la tierra las hace ricas en nutrientes, como resultado predomi-nan sobre todo bacterias que utilizan la luz como energía para producir materia
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orgánica (esto es, fotosintéticos) y que pueden vivir con oxígeno (también lla-mados aeróbicos), por ejemplo las algas eucarióticas y las cianobacterias. Tam-bién se han encontrado arqueas, hasta hace poco conocidas únicamente comomicroorganismos exclusivos de ambientes muy especializados; por ejemplo,hay arqueas que se creían exclusivas de ambientes muy calientes (Cenarchaeumsymbiosum) de las que se han encontrado parientes cercanos que viven en lasaguas del Antártico a -1.5º.83 Si no hay corrientes que revuelvan el agua y lahagan homogénea, en el fondo cercano a la costa existe menos oxígeno, por loque allí se han encontrado principalmente bacterias fotosintéticas anaeróbicas.
Por otra parte, en las capas superiores del mar profundo hay luz y oxígeno,pero hay pocos nutrientes por la lejanía de las costas y del suelo. En esta zona, elfondo del mar se caracteriza por una reducida cantidad de nutrientes, la presiónes extremadamente alta, no hay luz ni oxígeno y la temperatura es muy fría.Con estas características, en un principio se creía que mar adentro no se encon-trarían microorganismos, o se hallabán pocos capaces de vivir en la superficie oen el fondo. Sorprendentemente los hay, y uno de los ejemplos más comunesson las bacterias adaptadas a altas presiones, conocidas como barofílicas.
Otros ambientes marinos muy interesantes en este sentido son las ventilashidrotermales y las chimeneas negras, zonas en el mar a gran profundidad enlas que existen salidas de agua que ha estado en contacto con magma y basalto,por lo que brota mezclada con minerales calientes, dando lugar a temperaturastibias o calientes dentro del agua marina (de 6 ºC a 23 ºC en las ventilas, y 270 ºCa 380 ºC en las chimeneas). En estos ambientes sin luz, con grandes presiones, sinoxígeno y altas temperaturas se han encontrado invertebrados y distintas varie-dades de microorganismos adaptados a vivir en estos sitios.84 Incluso se les haencontrado viviendo dentro de los mismos invertebrados en asociaciones muyespecíficas, por lo cual es muy posible que existan procesos coevolutivos entrelos invertebrados y sus bacterias simbiontes.
8. PRÁCTICAS DE LA ECOLOGÍA MICROBIANA
Pero el papel de las bacterias no termina aquí, la disciplina de la bioremediaciónse basa en la diversidad de especies y metabolismos microbianos. La capacidadque tienen las bacterias para alimentarse de los compuestos químicos másrecalcitrantes las ha convertido en los candidatos perfectos para resolver desdeproblemas de contaminación (derrames petroleros) hasta de purificación deciertos metales de importancia minera. La concentración de uranio, cobre y oroen yacimientos con bajos contenidos, se puede llevar a cabo utilizando bacte-rias acidófilas. Algunas otras especies bacterianas logran separar de los minera-les, los metales pesados que contienen, como el mercurio, el cobalto, el zinc, el
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níquel y el molibdeno. Con el advenimiento de la Revolución verde el uso depesticidas se convirtió rápidamente en un problema, ya que su permanencia enlos suelos puede ser de varias semanas o de varios años. Aunque parte de suscompuestos se pierden en forma volátil o como lixiviados, existen microorganis-mos que los pueden degradar fácilmente.
Por otra parte, con el estudio de bacterias marinas es posible descubrir nue-vas moléculas o procesos que tienen aplicaciones útiles para la medicina o laindustria. Por ejemplo en el caso de las bacterias que viven a muy bajas tempe-raturas el objetivo es encontrar moléculas con propiedades anticongelantes obiocatalizadores activos a bajas temperaturas. Como son bacterias o archaeasque viven en concentraciones de sal muy altas (por ejemplo, en el Mar Muerto)una meta posible es aislar metabolitos halotolerantes.84
De las bacterias marinas también ha sido posible aislar nuevos compuestoscon propiedades antibióticas, antivirales, anticancerígenas y farmacológicas.Muchos de estos compuestos se presentan acumulados en invertebrados comoesponjas o moluscos, y tienen gran similitud con metabolitos de bacterias, porlo que se cree que son compuestos producidos por simbiontes bacterianos deestos organismos.85 Recientemente, se ha reportado que además de existiractinomicetos terrestres (el 70% de los antibióticos en el mundo se originan deestas bacterias), existen otro tipo de actinomicetos adaptados específicamente almar. Trabajando con los actinomicetos terrestres, la industria farmacéutica haestado reaislando el mismo tipo de compuestos, sin poder encontrar distintos, yel descubrimiento de los actinomicetos marinos abrió un nuevo campo deestudio para obtener otro tipo de drogas, diferentes a las que hoy se conocen,como son los compuestos anticancerígenos.86
9. PERSPECTIVAS
La microbiología ha tenido un pasado tortuoso; hubo años donde no se abrió lamateria de microbiología en varias universidades de los EE.UU. y no se impartíaen la facultad de ciencias de la UNAM; pero ahora tiene un futuro prometedor yresulta especialmente luminoso para la ecología microbiana. Las aplicacionesbiomédicas y biotecnológicas en donde las bacterias son las pequeñas industriasdel futuro, productoras de medicinas y de procesos industriales en condicionesextremas, se hallan a la vuelta de la esquina. Las bacterias también son unespecie de vórtice de conocimiento ya que de su estudio podemos saber másacerca de ellas mismas; la biotecnología nos da productos que nos ayudan aentenderlas mejor y por lo tanto producir nuevos productos que cada vez hacenel conocimiento más fácil y rápido de adquirir. Un claro ejemplo de esto fue eldescubrimiento de la Taq polimerasa en una poza termal en Yellowstone, sin la
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cual la biología molecular asociada al ADN sería imposible. Más aún, son losconsorcios bacterianos los que nos permiten revertir la contaminación produ-cida por las industrias. Por otro lado, las bacterias son los enemigos acérrimos dela humanidad cada vez hay bacterias resistentes a nuevos antibióticos y hay cadavez más posibilidades de una guerra bacteriológica.
Pero el lector pensaría que ninguna de esas maravillas o pesadillas implicasaber de ecología microbiana. Se equivoca cada vez más investigadores estánconvencidos de que las bacterias interaccionan entre ellas y con el ambiente yesa es la razón de las enfermedades o de que funcione un proceso industrial.Son consorcios de micorrhizas y bacterias las que pueden ayudar a mejorar unsuelo erosionado y son los productos de la competencia natural entre patógenos(colicinas) los que nos pueden librar de enfermedades crónicas como la cistitiscausada por Escherichia coli.
También desde el punto de vista teórico, la incorporación gradual de lasbacterias al paradigma de la ecología a todos los niveles (evolutivo, eco-fisio-lógico, funcional y de poblaciones, comunidades y ecosistemas) permitiráentender de manera jerárquica el papel de la diversidad microbiana en lavariedad de macroorganismos. Y ayudará a resolver, a través del uso de mode-los más sencillos, cómo se arma la enorme complejidad del mundo en quevivimos. Todo esto gracias a que las herramientas moleculares hacen posible«ver» a las bacterias.
10. BIBLIOGRAFÍA
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Microbiología ambientalse terminó de imprimir
en los talleres gráficos dela empresa Programe, S.A.
en diciembre de 2004.
Se tiraron 1,000 ejemplares.