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M. C. Productos Naturales y Alimentos Análisis Químico Cuantitativo
Cromatografía de gases
Dr. Raúl Salas Coronado
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Diagrama esquemático para un cromatógrafo
de gases típico
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Fase móvil
En GC, las fases móviles más frecuentes son H2, He, Ar y N2, que ofrecen la
ventaja de ser químicamente inertes tanto para la muestra como para la fase
estacionaria. La elección del gas por tador suele depender del detector del
aparato.
En las columnas empacadas, F = 25-150 mL/min
En las columnas capilares, F = 1-25 mL/min
La velocidad del flujo real se mide con un medidor de flujo colocado a la
salida de la columna.
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Medidores de flujo de gases
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Gas del cromatógrafo
Jabón
Electrónico digital De película de jabón
Gases acarreadores
Por excelencia el gas acarreador más utilizado es el He.
La pureza del gas es muy importante.
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Calidad Pureza Precio
Grado investigación 99.9999 % $ 424 US
Ultrapuro 99.999% $ 211 US
Pureza alta 99.995% $ 94 US
Especificaciones y precios del helio (Cilindro tamaño K)
Tamaños estándares de cilindros
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Comparación de tamaño de cilindros
Eficiencia como una función de la velocidad
lineal del gas acarreador
Curvas típicas de van Deemter
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(valores promedio)
Velocidades lineales promedio (cm/s) Cambio en la viscosidad con T (°C) V
isco
sid
ad (
Pa
x s
)
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Introducción de muestra
El método de inyección más común consiste en usar una micro-jeringa para
inyectar una cantidad pequeña de muestra en solución, por ejemplo 0.5 L, a
través de una septa de goma a un puerto de vaporización “flash” en la cabeza
de la columna.
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Tipo émbolo en aguja Aguja “émbolo en aguja”
Barril de la jeringa
Aguja “abierta” Tipo émbolo en barril
Automuestreador de líquidos
Existen sistemas que se pueden configurar para
6, 12 ó 150 muestras.
También existen autoinyectores con inyección
en columna, y de volúmenes grandes de
inyección con inyección múltiple.
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Inyectores
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El inyector, tiene diferentes funciones.
1. Entrada de la muestra
2. Vaporizar la muestra y mezclarla con el gas acarreador
3. Trasladar muestra a la cabeza de la columna.
Las características de los inyectores difieren de acuerdo al tipo de
columna.
El uso de un sistema de inyección automático puede significativamente
incrementar la precisión de las mediciones
Inyector de vaporización directa para
columnas empacadas
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Septa de
goma Fin de la jeringa
Gas acarreador
Liner
Barril del inyector Columna
Una septa hecha
de goma de
silicona
Sección cruzada de una
septa de pico de pato
Septa
O-ring que sella la
aguja de la jeringa
durante la inyección
Abertura pico de pato que abre
fácilmente y sella confiablemente
Roscado
superior
Inyector con split calentado durante una
inyección
La muestra debe vaporizarse y homogenizarse cuando alcance la columna.
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Flujo de split
Flujo de columna
Entrada de columna
Jeringa
Gas acarreador
Muestra evaporándose
Liner del inyector
Purga de salida
La mayor porción del gas acarreador
y la muestra que entran al inyector
son venteados a la atmósfera.
Mientras que una fracción menor es
enviada a la columna.
Inyección splitless
La inyección splitless es más adecuada para el análisis de trazas de solutos de
alto punto de ebullición que pueden ser inyectados con un disolvente de bajo
punto de ebullición
Temperaturas recomendadas para inyecciones splitless
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Split
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Splitless
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En el modo de split una velocidad de flujo alta de un gas acarreador arriva a
la cámara de vaporización donde se mezcla con los vapores de la muestra
inyectada. Una válvula de venteo, regulada a flujos de 50-100 mL/min, separa
este flujo en dos fracciones, de las cuales la porción más grande se ventea
desde el inyector, llevándose con ella la mayor parte de la muestra
introducida.
La relación de split típicamente varía entre 1:20 y 1:500.
Relación de split = vel. de flujo a la salida del 𝑠𝑝𝑙𝑖𝑡 + vel.de flujo a la salida de la columna
Vel. de flujo a la salida de la columna
Energía requerida para evaporar 1 L de
disolvente y calentarlo a 250 °C
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Disolvente Calentamiento Vaporización Total
Energía consumida en kcal
K. Grob and M. DeMartin, J. High Res. Chromatogr. 15, 335 (1992)
En análisis cuantitativo …
El uso de la inyección split/splitless puede resultar en errores en concentración
propio de la fuerte discriminación entre compuestos que tienen diferente
volatilidad.
La composición de la fracción entrante a la columna es diferente a la eliminada
desde el inyector. Este modo de operación se debe evitar cuando se usa un
estándar externo. No obstante, este problema se puede corregir parcialmente
con una buena elección de un liner.
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Inyector de vaporización de temperatura controlada
Este inyector llamado PTV, es conceptualmente similar al modelo de
split/splitless. La temperatura del inyector se puede programar para realizar un
un gradiente, por ejemplo de 20 a 300 °C, en una pocas décimas de segundo.
Por consiguiente, las ventajas de la inyección split/splitless se combinan con
aquellas de una inyección en frio a la columna.
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Liners
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Horno controlado termostáticamente
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Columnas
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Hay dos tipos de columnas, las cuales difieren en su desempeño: Las columnas empacadas y las columnas capilares. Para columnas empacadas la fase estacionaria se deposita o enlaza por reacción química a un soporte poroso. Para las columnas capilares una capa delgada de fase estacionaria se deposita en, o enlaza a la superficie interna de la columna.
(a) Columna empacada de acero de 3.18 mm (b) Columna ‘530’ de 0.53 mm (c) Columna capilar de 0.2 mm (d) Detalles de una columna capilar
Imágenes de columnas empacadas (izquierda)
y capilares (derecha)
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Columnas empacadas
Estas columnas, hoy en día son poco usadas, tienen diámetros de 1/8” ó ¼”
(3.18 y 6.35 mm) y una longitud de entre 1 y 3 m. Se fabrican en acero o
vidrio, la pared interna del tubo se trata para evitar efectos catalíticos con la
muestra. Ellas pueden resistir una velocidad de flujo acarreador en el intervalo
de 10 a 40 mL/min. Contienen un soporte poroso estable e inerte en el cual una
fase estacionaria se puede impregnar o enlazar (entre 3 y 20 %)
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Sección longitudinal de una columna
empacada
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Fase móvil
(Gas acarreador) Soporte
sólido Fase líquida (estacionaria)
Columnas capilares (tubular abierta)
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Estas columnas están hechas de sílice fundida de la más alta pureza
obtenida por la combustión de SiCl4 en una atmósfera rica en oxígeno. El
diámetro interno del tubo usado para esas columnas varía de 100 a 530
m, su espesor es de 50 m y la longitud de 12 a 100 m. Esas columnas
se vuelven flexibles por la aplicación de una cubierta externa de
poliimida, un polímero térmicamente estable (Tmax = 370 °C) o una
película de aluminio delgada.
Columnas 530 m
Constituida de un capilar de 0.53 mm de diámetro interno con longitud que
varía de 5 a 50 m, Requieren de una velocidad de flujo de gas acarreador de al
menos 5 mL/min y puede ser tan alto como 15 mL/min, flujos cercanos usados
en columnas empacadas.
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Columnas capilares
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Columna tubular abierta de pared recubierta
1. WCOT
2. SCOT
3. PLOT
Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha
recubierto con una finísima capa de fase estacionaria líquida.
Comparación de columnas empacadas y
WCOT
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Columnas capilares SCOT y PLOT
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Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material
adsorbente como el empleado en las columnas empacadas (tierra de
diatomáceas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las
SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta última.
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Efectos del diámetro de columna
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Soportes sólidos representativos*
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* Fabricados por una marca comercial exclusiva de la compañía Celita
NA = no disponible
Características de los soportes de tierras
diatomáceas
La superficie de los soportes de tierras diatomáceas es muy activa para
muestras polares. Estos soportes contienen grupos hidroxilos libres que pueden
formar enlaces de hidrógeno indeseables con las moléculas de soluto y causar
picos con cola. De igual manera, el material más inerte (Chromosorb White)
necesita lavarse con ácido (designado AW) y silinizarse para hacerlo todavía
más inerte.
Algunos reactivos silinizantes típicos son el dimetildiclorosilano y el
hexametildisililazano. Los soportes blancos desactivados se conocen por
nombres tales como Supelcoport®, Chromosorb W-HP®, Anachrom Q®. Una
desventaja de la desactivación es que esos soportes llegan a ser hidrofóbicos, y
su recubrimiento con una fase estacionaria líquida puede dificultarse.
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Tamaño de partícula y malla
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Soportes sólidos representativos
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Fases estacionarias líquidas recomendadas
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Cargas equivalentes de fase estacionaria
(porciento en peso) para tres soportes sólidos
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Fases estacionarias seleccionadas para
cromatografía Gas-Líquido
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Volúmenes de muestra para diferentes tipos
de columnas
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Parámetros operacionales para una fase
estacionaria en GC
L = longitud de la columna
u = velocidad de la fase móvil
T = temperatura de la columna
β = relación de fases, que afecta el factor de capacidad k
Las condiciones de operación de los cromatógrafos permiten modificaciones
en términos de T y u.
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Relación de fases
Para comparar o predecir el comportamiento de las columnas capilares es útil calcular la relación de fases (β).
dc = diámetro interno de la columna
df = es el espesor de la película depositada en la superficie interna.
Si los compuestos a ser separados son volátiles, se debe elegir una columna con una β < 100 y viceversa. Una columna de 320 m con un df = 1 m, tiene una β = 80. Mientras que una de 250 m con un df = 0.2 m, tiene una β = 310.
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Relaciones de fase (β) para algunas columnas típicas
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Temperatura
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DETECTORES
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Aplicaciones de detectores comercialmente
disponibles para GC
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Detector de Ionización de Flama (FID)
El detector de ionización de flama es el más comúnmente usado en GC. Es casi
universal y consiste en la combustión de los solutos en una flama de H2/aire para
producir una corriente mensurable.
La mayoría de los átomos de carbono, salvo los carbonilos y carboxilos, generan
señales.
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• No resulta útil para detectar la gran
mayoría de los compuestos
inorgánicos y muchos gases tales
como CO2 y H2O.
Detector de fósforo nitrógeno (NPD)
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• Comparado con el FID, este detector termoiónico tiene una flama más
pequeña en la cual la descomposición catalítica de compuestos
conteniendo nitrógeno (N), o fósforo (P), producen, muy específicamente,
iones negativos los cuales se reciben en un electrodo colector.
• Este detector comprende un pequeño cilindro de cerámica dopado con
sales alcalinas (por ejemplo sulfato de rubidio) .
• Se aplica un voltaje para conservar un plasma pequeño de 800°C en la
combustión de una mezcla aire/hidrógeno.
• En esas condiciones el nitrógeno presente en el aire no produce iones. La
sensibilidad del detector está típicamente entre 0.1 y 4 pg/s para analitos
conteniendo nitrógeno y fósforo, con un intervalo de linealidad de cinco
órdenes de magnitud.
Detectores FID y NPD
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Los electrómetros usados con los detectores permiten la medición de muy pequeñas
intensidades. La respuesta de esos flujos de masa dependientes de los detectores no
se afectan por el gas “make-up”.
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Detector de Captura de Electrones
• Es un detector selectivo que proporciona una respuesta muy alta para aquellos
compuestos que capturan electrones. Estos incluyen materiales halogenados tales
como los pesticidas.
• El detector requiere de un emisor de partículas beta (electrones) y generalmente se
usa 63Ni, aunque algunas veces también se usa tritio. Se prefiere el níquel debido a
que se puede usar a temperaturas incluso superiores a los 400°C y es muy seguro de
usar.
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• Los electrones emitidos por el
emisor ionizan al gas acarreador
(N2), provocando la emisión de
electrones adicionales que
originan una corriente eléctrica
entre un par de electrodos.
• Cuando un soluto con capacidad
de captura de electrones eluye
decae la corriente.
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Detector de Conductividad Térmica (TCD)
• El TCD es un detector universal en el que la señal es un cambio de la conductividad térmica de la fase móvil.
• Cuando la fase móvil sale de la columna, pasa sobre un filamento de wolframio-renio. La resistencia eléctrica de este filamento depende de su temperatura, que a su vez, es función de la conductividad térmica de la fase móvil.
• El Helio es la fase móvil de elección cuando se utiliza un TCD, debido a su conductividad térmica alta.
Detector de Conductividad Térmica (TCD)
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Detector de fotoionización (PID)
• Un detector de fotoionización es un detector de iones que utiliza fotones de alta
energía, en la región del ultravioleta (UV), para romper las moléculas en forma de
iones cargados positivamente.
• La luz UV excita las moléculas, dando como resultado la pérdida temporal de
electrones de las moléculas y la formación de iones con carga positiva. El gas
adquiere carga eléctrica y los iones producen una corriente eléctrica , que es la señal
de salida del detector.
• La corriente se amplifica y se muestra en un amperímetro. Los iones se recombinan
de nuevo con los electrones después de pasar el detector para volver a formar las
moléculas originales.
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Comparación de los intervalos de trabajo
para detectores para GC comunes
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APLICACIONES
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EJEMPLO
Importancia del estándar interno
Marriot y Carpenter publicaron los datos siguientes referidos a cinco inyecciones de
una mezcla de metilisobutilcetona 10 % v/v (pico 1) y p-xileno al 1 % v/v (pico 2):
70 Marriot, P. J.; Carpenter, P. D. J. Chem. Educ. 1996, 73, 96-99
Pregunta:
Admitiendo que el p-xileno es el
analito y la metilisobutilcetona el
estándar interno, determinar el
intervalo de confianza del 95 %
para la estandarización con un
punto, usando y sin usar un patrón
interno.
Solución
Para un patrón externo de un punto (omitiendo el patrón interno), la relación entre el
área del pico, A2, y la concentración, C2 de p-xileno es:
A2 = kC2
Sustituyendo la concentración conocida de patrón de p-xileno y las áreas del pico
adecuadas, se obtienen los valores siguientes para la constante k:
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Inyección A B C D E
k 78.112 135.404 132.332 112.889 91.287
Promedio = 110.005
C2 = 1 % (v/v) Desv. Std. = 25.097
CV (%) = 22.81
Valores de t para el 95 % de intervalo de
confianza
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Promedio = 110.005
Desv. Std. = 25.097
CV (%) = 22.81
𝜇 = 110.005 ± 2.78 ∗25.097
5 = 110.005 ± 31.202