INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

EFECTO DE LA LUZ SOBRE LA EXPRESIÓN DE GENES CAROTENOGÉNICOS Y LA SÍNTESIS Y ACUMULACIÓN DE PIGMENTOS MEDIANTE EL ANÁLISIS DE IMÁGENES DURANTE LA FLORACIÓN DE

CEMPAXÚCHIL

INFORME TÉCNICO FINAL

Avance reportado 100%

PROYECTO DIRIGIDO POR:

Dr. Pablo Emilio Vanegas Espinoza

PARTICIPANTES:

Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez

Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz

Biól. Verónica Pérez Escalante

IBQ Leticia Betsaida Ríos Salomé

Diciembre 2008

RESUMEN

Durante siglos, el color ha sido importante en diversos aspectos relacionados

con la vida del ser humano, uno de ellos y talvez el mas importante es el de los

alimentos. El color es la primera impresión que se percibe de un alimento y

posiblemente la sensación que determina el primer juicio sobre la calidad de un

producto alimenticio y casi siempre se le asocia con otras sensaciones como el

olor y el sabor. Los carotenoides han cobrado un gran auge como sustitutos de

pigmentos de origen sintético debido a su capacidad pigmentante, fácil

incorporación y gama de tonalidades que pueden ofrecer. Adicionalmente, son

compuestos imprescindibles en la dieta humana como precursores de la

vitamina A, debido a que los vertebrados no tienen la capacidad de

sintetizarlos; por lo que es necesario adquirirlos de los alimentos para la

producción de los retinoides involucrados en el proceso de la visión.

Los avances en el estudio de la biología molecular en la expresión de genes

son sustanciales; se han clonado y caracterizado los genes que codifican para

las enzimas que participan en la ruta de biosínteis de carotenoides

provenientes de diferentes sistemas, incluyendo cempaxúchil. Estudios previos

respecto al análisis de expresión de los genes de la ruta de biosíntesis en esta

planta, apuntan hacia la regulación transcripcional y los puntos clave en la ruta

se ubican en el sitio donde ocurre la ciclación del licopeno.

Durante el ciclo de vida de las plantas, las células responden a señales que

alteran su fisiología, morfología y desarrollo. Entre los estímulos internos y

externos que confieren información a las plantas están: luz, nutrientes,

gravedad, agua, calidad de suelo, tensión mecánica, heridas, calor, frío,

reguladores de crecimiento, etc., las condiciones ambientales cambian el tipo

de señales y pueden variar en calidad y cantidad, minuto a minuto.

Se sabe que la determinación floral está influenciada por factores ambientales

y ha sido difícil establecer las condiciones óptimas para fijar el rendimiento y la

producción de flor y por ende la cantidad de pigmento que se puede obtener

del cultivo. La arquitectura floral depende de cuándo y dónde se generan las

flores, muchas especies tienen una fase vegetativa de crecimiento, en la cual

se generan los primordios florales en la periferia. A partir de las axilas de las

hojas se forman meristemos secundarios que pueden permanecer en estado

de latencia o crecer formando yemas laterales. Una vez que reciben las

señales ambientales y de desarrollo apropiadas, las plantas pasan a una fase

reproductiva dando lugar a flores o inflorescencias con patrones bien

determinados. En cempaxúchil la información al respecto es escasa, lo que

hace urgente la búsqueda de nuevas estrategias para abordar los diferentes

aspectos referentes al desarrollo de las flores así como determinar los factores

genéticos que están involucrados en este proceso. En este sentido el

cempaxúchil representa una alternativa sumamente atractiva e interesante

debido a que de manera natural las flores de esta planta acumulan una

cantidad importante de carotenoides, principalmente luteína.

INTRODUCCIÓN

Los carotenoides son una familia de compuestos derivados de los isoprenoides

y están ampliamente distribuidos en la naturaleza con más de 600 estructuras,

estos compuestos son sintetizados por todos los organismos fotosintéticos

teniendo dos funciones principales, primero actuar como pigmentos accesorios

transfiriendo la energía a la clorofila; la segunda función es proteger al tejido

fotosintético de un exceso de luz disipando la energía luminosa evitando daños

fotooxidativos. En tejidos no fotosintéticos los carotenoides son los

responsables de proporcionar la coloración amarilla, anaranjada y/o roja a

diversas flores y frutos, lo cual es logrado por su acumulación en los

cromoplastos.

Se tiene gran interés en estudiar cierto tipo de plantas con flores que presentan

pigmentación amarilla intensa debido a que acumulan gran cantidad de

carotenoides. Estos pigmentos se localizan primordialmente en los plástidos,

observándose que durante el desarrollo de la flor los cloroplastos se

transforman a cromoplastos, organelos especializados para almacenar los

carotenoides. Durante este proceso se disminuye el contenido de clorofila y se

incrementa la cantidad de pigmentos en los cloroplastos, proporcionando la

coloración amarilla o anaranjada a las flores.

.

En plantas de cempaxúchil (Tagetes erecta) los carotenoides se acumulan

principalmente en las lígulas proporcionándole coloración anaranjada, de los

cuales un 85% es luteína, es por ello que tienen gran importancia a nivel

industrial, las plantas son cultivadas a gran escala con el propósito de extraer

carotenoides para la elaboración de alimento con el fin de pigmentar la piel de

las aves de corral y peces. Además de que el cempaxúchil es una planta anual

y nativa de México, y ha sido usado por mucho tiempo como planta ornamental

y en la medicina tradicional.

En estudios anteriores, se ha evaluado la expresión de algunos genes que

participan en la síntesis de carotenoides en cempaxúchil, algunos de ellos son

la fitoeno sintasa (psy), fitoeno desaturasa (pds), beta licopeno ciclasa (lcy-b) y

epsilon licopeno ciclasa (lcy-e), demostrando que la mayoría se expresa

durante el desarrollo de las lígulas.

En otro estudio con cempaxúchil, se reportó la expresión de genes

carotenogénicos, la síntesis de carotenoides y su relación con el cambio

ultraestructural durante la diferenciación de los plástidos en la morfogénesis de

la flor. De los estudios realizados demostraron que los pigmentos se depositan

en estructuras específicas llamadas vesículas lipídicas y que el nivel de

expresión del gen lcy-b es evidente en plantas con pigmentación anaranjada y

ausente en inflorescencias sin coloración; durante el desarrollo, por lo que

sugieren que el gen lcy-b tiene un papel importante en la síntesis y

acumulación de pigmentos en las plantas de cempaxúchil.

OBJETIVO

Estudiar el efecto de la luz sobre la expresión de genes carotenogénicos y la

síntesis y acumulación de pigmentos mediante el análisis de imágenes en

diferentes etapas de floración de cempaxúchil.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron semillas de cempaxúchil (Tagetes erecta) material “Porte Bajo”

donado por el Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz, de la Universidad Autónoma

Chapingo. En una segunda etapa del trabajo se utilizaron plantas de la

variedad comercial “Nana” en etapa de floración.

Desinfestación de semillas

Se seleccionaron las semillas de cempaxúchil que presentaron buenas

características físicas como lo son el color oscuro y la firmeza, una vez

seleccionadas las semillas se realizaron cuatro lavados con agitación de la

siguiente manera: etanol al 100% durante 1 min, etanol al 70% por 5 min,

hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, hipoclorito de sodio al 2% durante 15

min, entre cada lavado se enjuagaron con agua destilada estéril para eliminar

residuos de las soluciones empleadas. Una vez que se terminó de aplicar los

lavados se eliminó el exceso de agua colocando las semillas en papel filtro

estéril. Posteriormente se colocaron en una cámara húmeda la cual se preparó

previamente colocando en una charola toallas de papel absorbente

humedecidas con solución nutritiva la cual contiene nitrógeno, fósforo y potasio

(40:40:40). Las semillas se dejaron en cámara húmeda una semana hasta que

germinaron, aplicando diariamente por aspersión la solución nutritiva, con la

finalidad de evitar que se perdiera humedad.

Una vez germinadas las semillas se preparó sustrato orgánico compuesto por

Peat moss, vermiculita y agrolita en relación 3:1:1, se reguló el pH con una

solución de cal (hidróxido de calcio) al 0.1%, se agregó un litro de solución por

cada kilogramo de sustrato. Se utilizaron macetas con capacidad para 170 g

aproximadamente. Se lavaron con una solución de hipoclorito de sodio al 75%;

se colocó el sustrato dentro y las plántulas se transfirieron de la cámara

húmeda a las macetas.

Acondicionamiento del invernadero

Plantas de cempaxúchil en etapa de floración, adquiridas en vivero de la

variedad “Nana”, fueron trasladadas al invernadero del Centro, en donde fueron

sometidas a los diferentes tratamientos de iluminación.

Antes de transplantar el material al invernadero, se cortaron las inflorescencias

y botones florales, con el fin de que los brotes y flores que se formaran fueran

resultado de la exposición al estímulo luminoso (Fig. 1).

Figura 1. Corte de botones e inflorescencias de las plantas.

Las camas del invernadero fueron acondicionadas con el sustrato adecuado y

con las lámparas de luz fluorescente de los diferentes tratamientos (blanco,

azul y rojo), con un fotoperiodo de 12 horas luz, por 12 horas de oscuridad. Se

colocaron ocho plantas en cada cama acomodadas en zig-zag. Se dejaron

cuatro plantas dentro del invernadero sin iluminación artificial y otras tres se

dejaron fuera del invernadero para que desarrollaran al aire libre. Se evaluaron

parámetros físicos de las plantas como son: la altura y el diámetro de la fronda.

Extracción de DNA

Se utilizó una muestra de 0.2 g tejido de cempaxúchil, se colocó en un mortero

el cual fue lavado previamente con etanol al 70% y secado, se agregó 1 mL de

buffer de extracción CTAB (bromuro de hexadeciltrimetilamonio), se molió

perfectamente y enseguida se agregaron 5 µL de β-mercapto etanol y se

colocaron en un tubo eppendorf de 2 mL, se incubó a 65 °C durante 15

minutos, posteriormente se agregó un volumen de 500 µL de fenol: cloroformo:

alcohol isoamílico (24:24:1), se centrifugó a 10500 rpm a 4° C durante 5

minutos, se formaron dos fases se recuperó la fase acuosa la cual se pasó a

un tubo limpio y se agregaron 800 µL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1),

se centrifugó nuevamente con las condiciones anteriormente descritas, se

agregaron 500 µL de etanol absoluto frío, como no se obtuvo ningún

precipitado se añadieron 100 µL de acetato de sodio 3 M y nuevamente se

centrifugó, el sobrenadante se desechó y al precipitado que se obtuvo se le

realizaron dos lavados con etanol al 70% y nuevamente se centrifugó, el etanol

se desechó y el precipitado obtenido fue resuspendido en 30 µL de agua

estéril. Después se tomaron muestras de 3 y 5 µL del material resuspendido y

se combinaron con 6 µL de una solución que contiene buffer de carga (0.25%

de azul de bromofenol 40% w/v de sacarosa en agua) y bromuro de etidio, para

ver el corrimiento del DNA en gel de agarosa en concentración del 1%.

Electroforesis en gel de agarosa

Se preparó un gel de agarosa a una concentración de 1% en solución TAE,

para preparar el gel con una concentración del 1%, el gel fue calentado hasta

obtener un líquido transparente, se dejó enfriar y se vació en el portageles,

enseguida se colocó el peine para formar los pozos, una vez que solidificó, se

retiró el peine y la cámara se llenó con TAE, se tomaron las muestras de DNA

obtenidas del material biológico y se cargaron los pozos con éstas, la

electroforesis se corrió a 70 V durante 40 minutos. Posteriormente el gel se

observó en transiluminador de luz UV para analizar el DNA que teñido con

bromuro de etidio.

Extracción de RNA

Como primer paso para el análisis molecular es necesario extraer el RNA de

las muestras a estudiar, para esto se utilizó la extracción fenólica de la cual la

metodología se describe a continuación. Se pesaron 0.2 g de muestra se

colocaron en un tubo Eppendorf de 2 mL y se agregaron 750 µL de buffer de

lisis (Apéndice 1), 2 µL de β-mercaptoetanol, 120 µL de etanol absoluto, 100 µL

de acetato de potasio (5 M) y 750 µL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico

(25:24:1), se agitó vigorosamente y se centrifugó por 20 min a 4° C a 12000

rpm, la fase acuosa se transfirió a otro tubo, se realizaron 2 lavados con 750 µL

de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se centrifugó por 15 min a 4° C a 5000

rpm, recuperando la fase acuosa, se agregaron 700 µL de etanol absoluto, se

incubó por 30 min a –20° C, posteriormente se centrifugó por 15 min a 4° C a

5000 rpm, se desechó el sobrenadante y se agregó 1 mL de etanol al 70% y se

incubó a –20° C por 10 min; se centrifugó por 15 min a 4° C a 5000 rpm, se

desechó el sobrenadante. La pastilla obtenida se resuspendió en 1 mL de agua

estéril y se agregaron 350 µL de LiCl (8 M) y se dejó precipitar toda la noche a -

70° C, después se centrifugó por 40 min a 4° C a 12000 rpm, el sobrenadante

se desechó y se dejó solo la pastilla obtenida a la cual se le agregaron 600 µL

de agua estéril y se resuspendió completamente. Se centrifugó por 15 min a 4°

C a 5000 rpm, se recuperó el sobrenadante al cual se le agregaron 600 µL de

fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para precipitar, se centrifugó por 15 min a 4°

C a 5000 rpm, se recuperó la fase acuosa a la cual se le realizó otro lavado con

cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se centrifugó y nuevamente se recuperó la

fase acuosa a la cual se le agregó 1 mL de etanol absoluto y se dejó precipitar

por 20 min a –20° C, después se centrifugó por 15 min a 4° C a 5000 rpm, para

obtener la pastilla se agregaron 100 µL de acetato de potasio (5 M) y se dejó

precipitar por 10 min incubando a –20° C, pasado este tiempo se centrifugó por

15 min a 4° C a 5000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se dejó solo la pastilla

la cual se resuspendió en 30 µL de agua estéril, con el material resuspendido

se corrieron 3 µL de muestras en un gel de agarosa al 1%, para observar la

cantidad de RNA en las muestras.

Análisis subcelular de lígulas

Para la colecta del material biológico se determinaron cuatro etapas de

desarrollo: (etapa 1) botón cerrado, (etapa 2) botón semiabierto, (etapa 3) flor

semiabierta y (etapa 4) flor abierta; (Del Villar-Martínez y col., 2005) cada etapa

floral se colectó y se congeló con nitrógeno líquido almacenado en tubos

Falcon de 50 ml; las muestras se almacenaron a -70º C para su análisis. Para

el análisis estructural de los plástidos, se colectaron lígulas de las cuatro

etapas de desarrollo y de los cuatro tratamientos. Las muestras se procesaron

inmediatamente después de la colecta y se realizó de acuerdo a la técnica

reportada por Del Villar-Martínez y col. (2005).

Para el procesamiento del material biológico primeramente se realizó la fijación,

la cual consiste en mantener a las células con sus características intactas, para

ello se utilizó glutaraldehído un compuesto químico que va a fijar las proteínas

del tejido, el glutaraldehído se preparó al 2.5% en un buffer de cacodilato de

sodio pH 7.4 con sacarosa al 1O% o solución amortiguador. Las lígulas se

colocaron en cajas petrí y se cortaron con una navaja en fragmentos de

aproximadamente 5 mm, inmediatamente se colocaron 100 µL de

glutaraldehído al 2.5 %, cada corte se realizó de un solo tajo sin dañar el tejido,

posteriormente se colocaron de 10 a 15 fragmentos de tejido en tubos de 2 mL

cubriendo los fragmentos con glutaraldehído, se dejaron incubando durante 1 h

a temperatura ambiente; posteriormente se retiró el glutaraldehído con pipeta

pasteur y se hicieron tres lavados con 1 mL de cacodilato de sodio, por

periodos de 5 min y se incubó en esta solución amortiguadora o lavadora

(cacodilato de sodio) para el siguiente paso. En esta etapa el tejido puede

permanecer por varios días únicamente cambiando la solución de cacodilato

periódicamente para evitar que se contamine por hongos.

El siguiente paso fue la postfijación, la cual consistió en fijar los lípidos de la

célula, y se llevó a cabo con el tetraóxido de osmio (OsO4) al 1% en solución

amortiguadora. Primeramente, se retiró la solución amortiguadora del paso

anterior y en seguida se colocó aproximadamente 50 µL de (OsO4) y se dejó

incubando por 1 h. Este paso se realizó en campana de extracción debido a

que este compuesto es tóxico. Posteriormente se hacen tres lavados con 1 mL

de la solución preparada con sacarosa al 10% y CaCl2 al 1% por 5 min (anexo

2), los dos primeros lavados se desecharon en aceite vegetal para que el

tetraóxido de osmio termine de reaccionar oxidando los lípidos. El siguiente

paso fue la deshidratación y la finalidad de este proceso fue eliminar el agua

del tejido para después sustituirlo por resina, éste se realizó con etanol, para

ello se utilizaron soluciones de etanol absoluto en concentraciones

ascendentes: 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100% por un periodo de tiempo de 10 min

en cada solución y a temperatura ambiente. Las muestras pueden quedarse en

alcohol al 70% para continuar al siguiente día o dejarlo por más de dos días, la

deshidratación con etanol al 100% se realizó tres veces por un periodo de 10

min. Después se retiró el alcohol con pipeta pasteur y se colocaron 100 µL de

óxido de propileno por 20 min dos veces, el intercambio del alcohol por el óxido

de propileno se realizó para eliminar los residuos de alcohol debido a que el

alcohol no es soluble en resina. Si no se cuenta con alcohol para la

deshidratación se puede usar acetona en los mismos porcentajes y para este

caso no se utiliza el óxido de propileno pues la acetona es soluble en la resina.

Posteriormente se prosiguió con la preinclusión en resina, en este proceso las

muestras se tienen que incluir en una sustancia dura que permita hacer los

cortes. Se inició con la preinclusión lo que consistió en integrar la resina

gradualmente en la célula para su posterior corte. Se preparó la mezcla de

óxido de propileno y la resina EPON 812 en tres proporciones la primera

relación fue 2:1, seguida de 1:1 y 1:3, respectivamente, en cada caso se dejó

incubando 1 h, como mínimo, si se deja por más tiempo la resina se integrará

perfectamente en la célula, la muestra se puede dejar de 12 o 24 h máximo a

temperatura ambiente en resina para este caso se dejó 12 h en resina al 100%

a temperatura ambiente.

Con un aplicador de madera se sacaron los fragmentos de tejido y se colocaron

cuidadosamente sin dañar el tejido en los moldes de inclusión y se llenaron con

resina EPON 812 se cercioró que no se hicieran burbujas de aire cerca del

tejido para evitar que se queme la muestra cuando se observe al microscopio

electrónico. Se dejó reposar 1 h a temperatura ambiente y después se

colocaron en una estufa a 60º C para que polimerice por 24 h como tiempo

mínimo, después se prosiguió a hacer los cortes piramidales de cada muestra

para facilitar posteriormente los cortes en el ultramicrotomo; el espesor de los

cortes fue de 65 nm, con una cuchilla de diamante y se colocan sobre rejillas

metálicas de cobre para observar las estructuras celulares.

Debido a que el microscopio electrónico emite un haz de electrones que pasan

por un tubo en vacío, este permite la observación de las estructuras interiores

de las células, los electrones atraviesan la muestra y en función de la opacidad

obtenemos una imagen con tonalidades grises, con el paso de los electrones la

muestra se puede deteriorar, para favorecer y remarcar las diferencias de

coloración en grises se recurre a tinciones con metales pesados con acetato de

uranilo y citrato de plomo, que se depositan en los lípidos y en las proteínas

respectivamente, este tratamiento permite observar las membranas y los

organelos celulares. La función de los metales pesados es fijarse en diferentes

estructuras celulares y no permiten el paso total de los electrones, por lo tanto,

hay un mayor contraste en las muestras.

El tratamiento de las muestras para el contraste se realizó de la siguiente

manera: los cortes ultrafinos, se colocaron en rejillas de cobre y se trataron con

acetato de uranilo al 1% por 15 min, se lavó con abundante agua, se secó con

papel secante y posteriormente se colocaron en citrato de plomo al 1% por 15

min, se lavó, se secó y se colocó en una caja, rotuladas. Posteriormente las

muestras se observaron en el MET de la marca JEOL, de Japón, a un voltaje

de aceleración de 60 kV que es el ideal para observar muestras biológicas. Si

el voltaje se aumenta, se disminuye el contraste y la muestra puede quemarse

y ya no se logra observar, debido a que el haz de electrones es muy intenso.

Las imágenes se capturaron con el programa AMT Image Capture, a diferentes

magnitudes de distancia en nm.

Procesamiento de imágenes

Para determinar la morfometría de los plástidos, las imágenes de MET se

transfirieron al programa de Corel PHOTO PAINT 11. En este programa los

plástidos recibieron el primer tratamiento, se aislaron como nuevo objeto a

escala de grises para su mejor manejo, posteriormente todos los objetos

separados se binarizaron y en el programa de Sigma Scan se prosiguió a hacer

las mediciones, los parámetros que se midieron fueron, área, perímetro,

diámetro mayor, diámetro menor, factor de compacidad, factor de forma y

factor elíptico. Estos parámetros se analizaron para cada plástido en cada

etapa de desarrollo y para cada tratamiento.

Parámetros morfométricos de los plástidos

Todos los parámetros morfométricos se calcularon con el programa de Sigma

Scan versión 5.0. Los descriptores que se evaluaron en los plástidos fueron: el

área (extensión que ocupa un objeto determinado); el perímetro (longitud del

contorno que delimita al objeto); el factor elíptico (Fe), se determinó

relacionando el eje longitudinal mayor (Lmax) y el eje menor transversal (Lmín)

de un objeto. Este factor tiene la característica de describir que tan elíptico es

un objeto, de tal manera que cuando la relación Lmax/Lmín es superior a la

unidad, el objeto es elíptico; por el contrario, si esta relación tiende a la unidad,

el objeto es circular. El factor de forma se refiere a qué tan circular es un

objeto, de tal forma que un círculo perfecto tiene un valor de 1.0. El factor de

compacidad, en un circulo perfecto tiene un factor de compacidad de 4 Π

(aprox 12.57). Para el análisis estadístico de los datos se aplicó un ANOVA de

una vía con una comparación de medias y con un nivel de significancia del 5%.

Análisis de pigmentos

Para el análisis de los pigmentos en cada etapa de desarrollo y en los

diferentes tratamientos; se realizó la extracción de pigmentos y se analizó por

cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) y se cuantificó por

espectrofotometría por (luz/visible). La extracción de pigmentos se realizó

según la técnica reportada por Delgado-Vargas y Paredes-López, 1996. Las

muestras de tejido fresco se pulverizaron en nitrógeno líquido con la ayuda de

un mortero, se pesaron 0.2 g y se colocaron en matraces de 250 mL,

posteriormente se adicionaron 15 mL de la mezcla de solventes orgánicos

compuesta por hexano:etanol:acetona:tolueno (H: A: E: T) en una proporción

de 10:6:7:7 (v/v/v/v) (anexo 4) y se agregaron 2 mL de KOH al 40% en metanol

al 80% (anexo 5). Los matraces se cubrieron con papel aluminio para evitar

que la luz oxide los pigmentos y se incubaron a 20º C, en agitación orbital a

200 rpm durante 16 h en oscuridad.

Posteriormente, la mezcla se trasfirió a un matraz volumétrico de 100 mL y se

adicionaron 5 mL de hexano, se aforó a 100 mL con Na2SO4 al 10% (anexo 6)

y se dejó reposar por 1 h en oscuridad. Después se separó la fase orgánica

para ser pasada por una columna preparada en una jeringa de 5 mL con

Na2SO4 anhidro y algodón, entre cada material se colocó un papel filtro y en la

parte terminal de la columna se colocó una membrana de 0.2 µm (Syringe

Filter, SFCA, Nalgene Company). El volumen se recuperó en tubos eppendorf y

posteriormente se concentró a sequedad con un gas inerte (helio) para el

análisis posterior (Delgado-Vargas y Paredes-López, 1996). Para prevenir la

oxidación y la polimerización de los pigmentos deben analizarse de inmediato o

guardarse congeladas en la oscuridad a -70° C hasta el momento de ser

analizadas por HPLC o espectrofotometría.

Cuantificación de pigmentos por espectrofotometría

Para la determinación de carotenos y xantófilas totales se leyó la absorbancia

en cada una de las muestras en el espectrofotómetro UV-Vis Lobomed Modelo

UVD-3500 previamente calibrado, usando acetona como blanco a una longitud

de onda (436 y 474 nm), que son las longitudes de onda a las cuales absorben

los carotenoides (Larcher, 1995). Las muestras se resuspendieron en acetona

en un volumen de 500 µL y se realizó un barrido de 300 a 700 nm en el

espectrofotómetro, las muestras muy concentradas se diluyeron en una

proporción de 1:10 y 1:100.

Para la cuantificación de los carotenoides se utilizó el coeficiente de extinción

molar específico para carotenoides, relacionando la absorbancia a una

determinada longitud de onda (λ) con un valor expresado como coeficiente de

absorción; el coeficiente de extinción específico se define como la absorbancia

teórica de la dilución de concentración 1% (P/V) en una cubeta de 1 cm de

paso de la luz. En la literatura existen tablas en las se indican los valores de los

coeficientes de extinción, generalmente el específico, para distintos

carotenoides en varios disolventes especificándose asimismo la λ a la que

debe leerse la absorbancia. En este caso se usó el coeficiente de extinción

arbitrario de 2500 debido a que no se ha determinado el coeficiente de

extinción molar específico para la luteína (Britton y Young, 1993).

Análisis de pigmentos por HPLC

Para el análisis de los pigmentos se utilizó la cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC), lo cual es un tipo de cromatografía en columna utilizada

frecuentemente en bioquímica y química analítica para separar los

componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones

químicas entre las substancias analizadas y la columna cromatográfica. Cada

extracto de cempaxúchil concentrado se resuspendió en 500 µL de acetato de

etilo y se filtraron a través de una membrana de nylon con un poro de 0.45 µm;

posteriormente, se inyectaron 50 µL en un cromatógrafo compuesto por un

detector UV/visible, una interfase serie Link, serie 200 Ic Pum, una columna

C18 Perkin Elmer y Binary Lc Pum, a una longitud de onda de 450 nm. Se usó

un sistema de elusión en gradiente con acetato de etilo 100% como fase A y

acetonitrilo: metanol (9:1 v/v) como fase B. La velocidad de flujo fue de 1.0

mL/min.

RESULTADOS

Desinfestación y germinación de semillas

En cuanto a la germinación de semillas se obtuvo un 80% de germinación, una

vez que se obtuvieron las plántulas se trasplantaron a macetas con sustrato

orgánico, estas plántulas fueron regadas con solución nutritiva, posteriormente

se empezaron a regar con agua, de las plántulas obtenidas un 67.5% lograron

adaptarse a las condiciones de invernadero y en un periodo de

aproximadamente 6 semanas empezaron a brotar los primeros botones y

obtenerse las primeras flores.

Extracción de DNA

En la figura 2 se pueden observar las bandas de DNA y RNA, las bandas

superiores corresponden al DNA, se puede observar la diferente concentración

del bandeo de acuerdo a la cantidad de muestra cargada en cada uno de los

carriles; las bandas inferiores corresponden a RNA.

Figura 2. Corrimiento electroforético de la

extracción de ácidos nucleicos de cempaxúchil. Carril A: 3 µL; B: 5 µL, C: 8 µL.

Desarrollo de las plantas

Se analizó el desarrollo de las plantas expuestas a las diferentes condiciones

de iluminación durante cuatro semanas, en la figura 3 se puede observar el

aspecto de las camas en las que se desarrollaron las plantas hasta floración.

Las plantas respondieron directamente a las condiciones ambientales (Tabla

1), se observan los datos en cuanto al número de botones; el análisis

estadístico indicó que existen diferencias significativas en la inducción de

botones entre tratamientos. La producción de botones en invernadero fue de

23.5±2.90 en promedio por planta, en la luz blanca se produjo un promedio de

24.5±3.07 botones por planta y en la roja 22.08±2.87 botones, en las

irradiaciones de luz blanca y roja no hubo diferencias significativas con el

control ni entre ellas, pero si con la luz azul. En esta longitud de onda se

observó un efecto muy claro para la inducción de botones, en promedio las

plantas tuvieron 16.58±2.26 botones.

En esta misma tabla también se muestran los datos de la producción de

inflorescencias, el análisis estadístico demostró que existen diferencias

significativas. En la luz azul la producción de inflorescencias en promedio fue

de 16.25±1.72 como ya se había observado en la inducción de botones, esto

indica que la luz azul ya no indujo más la producción de inflorescencias,

comparada con el control que tuvo un promedio de 22.3±2.25, la luz blanca de

23±2.73 y roja de 21.6±2.89. Los resultados fueron similares a la inducción de

botones, los mismos que llegaron a la etapa de floración. En cuanto al

desarrollo vegetativo y la apariencia física de las plantas a los 30 días de

exposición a la luz blanca, roja, azul y luz natural en invernadero. Todas las

plantas tuvieron un crecimiento de 2 cm en promedio, ninguna longitud de onda

indujo el crecimiento excesivo. Con el análisis estadístico se observó que no

existen diferencias significativas entre tratamientos, observándose en presencia

de la luz azul un efecto en el crecimiento, pues su desarrollo fue menor en

comparación con los otros tratamientos, probablemente pudo deberse a que la

planta ya había terminado el proceso de desarrollo, además de que con este

experimento se pretendía que se indujera la producción de botones e

inflorescencias y no el crecimiento.

Figura 3. Desarrollo de plantas al inicio del experimento y en la etapa de floración.

Desarrollo floral

Una vez expuestas las plantas a las diferentes condiciones de iluminación, se

obtuvieron inflorescencias desarrolladas en las mismas, así se colectaron

cuatro diferentes etapas de desarrollo de las inflorescencias de las cuatro

condiciones de iluminación.

Análisis ultraestructural por TEM

Lo que observamos en la estructura de los plástidos es que cambia en cada

etapa de desarrollo y en cada tratamiento por lo que se caracterizan por ser

plástidos con características específicas y con tendencia a ser alargados

(Figura 4). En la primera etapa de desarrollo del plástido que mostró mayor

diferencias con relación al control fue la luz azul (350-480 nm) ya que presentó

Tabla 1. Desarrollo fenológico de las plantas de cempaxúchil expuestas a diferentes longitudes

de onda durante 30 días.

un tamaño pequeño, de forma elíptica y un perímetro más rugoso comparado

con los otros plástidos; en cuanto a la acumulación de pigmentos fue menor. El

control presentó mayor acumulación de pigmentos seguida de la luz blanca,

roja y azul.

En la etapa 2, en general los plástidos tienden a ser más alargados que en la

etapa 1, con membranas tilacoidales en el interior además presentan una forma

elíptica similar y con diferencias en la estructura, los plástidos de la luz azul no

presentaron una estructura bien definida, el perímetro del plástido fue menos

rugoso, en cuanto a la acumulación de pigmentos presentó mayor

acumulación, el plástido desarrollado en luz natural en invernadero fue

alargado y con un perímetro rugoso.

En la luz blanca (400-700 nm) el plástido fue más elíptico y con una

acumulación de carotenoides fue menor en comparación con el control. El

plástido desarrollado en luz roja presentó un perímetro más rugoso y una

acumulación de pigmentos menor en comparación con los otros tratamientos.

Evaluación de la morfometría de los plástidos

Área: Se observó que en promedio, los plástidos en luz de invernadero

(control) inician con un tamaño de 0.467±0.151 µm2 en la etapa 1 y disminuyen

Trata- miento

Longitud

de onda λ (nm)

Cantidad

de luz (Kluxes)

Crecimiento

(cm)

Número de

botones

Número de

inflorescencias

Apariencia física

de las plantas

Luz natural

400-700 5600 2.25±0.94(a) 23.5±2.90 (a) 22.3±2.25 (a) Tejido verde y algunas plantas amarillas

Blanca 400-700 5880 2.08±0.65(a) 24.5±3.07 (a) 23.0±2.73 (a) Tejido verde y vigorosa

Roja 600-700 5050 2.16±0.91(a) 22.08±2.87 (a) 21.6±2.89 (a) Tejido verde, vigorosas y algunas hojas amarillas

Azul 350-480 5010 1.75±0.60(a) 16.5±2.26 (b) 16.2±1.72 (b) Plantas con hojas amarillas, y secas, algunas muertas

hasta 0.219±0.076 µm2 en la E4. En la luz azul los plástidos mantienen su

tamaño de 0.486±0.123 µm2 en la etapa 1 a la 3 y disminuyen a 0.372±0.095

µm2 en la E4; por lo tanto la, incidencia de la luz azul en los plástidos no

provocó un cambio importante en cuanto al tamaño durante el desarrollo del

plástido. Por otra parte, los plástidos desarrollados en luz blanca, destacaron

en cuanto a los cambios en su tamaño, con relación a los demás tratamientos.

Estos plástidos inician con un tamaño de 0.773±0.134µm2 disminuyendo

considerablemente hasta 0.162±0.053 µm2 en la etapa 4; este cambio se dio

conforme el plástido se fue diferenciando a cromoplasto. Referente a la luz roja

la tendencia en el cambio de tamaño, contrasta con los otros tratamientos ya

que el área es menor al inicio (0.295±0.830 µm2) experimentando un

crecimiento sostenido hasta la etapa 4 (0.433±0.192 µm2). Este efecto pudiese

ser atribuido a la longitud de onda de la luz roja (λ ≈ 700 nm) más que a la

cantidad de luz que hayan recibido debido a que en todos los tratamientos la

intensidad luminosa fue de aproximadamente 5.0 luxes.

Perímetro: Se encontró que en todos los casos el perímetro está entre 2 a 4

µm y que los plástidos en luz roja, nuevamente experimentaron un crecimiento

sostenido para cada una de las etapas. Por el contrario, los plástidos con un

mayor perímetro inicial fueron los que se iluminaron con luz blanca, pero

también fueron los que experimentaron una mayor disminución en la última

etapa. El análisis estadístico demostró que existen diferencias significativas en

cuanto a la longitud del perímetro de cada plástido. De acuerdo a éste, las

luces azul y roja desarrollaron un perímetro mayor, comparado con el control;

aunque la luz blanca también presentó un efecto sobre el perímetro en las

primeras etapas de desarrollo, disminuyendo en la 3 y 4.

Factor elíptico: Los resultados obtenidos indicaron que la mayoría de los

plástidos presentaron valores superiores a la unidad, lo que significa que

tienden a ser elípticos. Se observó que sólo los cloroplastos de la E1 en

invernadero y luz blanca presentaron valores cercanos a la unidad, lo que

indica que su forma se acerca a la de circular; conforme el plástido se

transforma, éstos se hacen más elípticos, particularidad que pudiera deberse al

inicio de la formación de las vesículas lipídicas en la periferia de la membrana

plasmática.

A 1 2 3 4

B

C

D

Figura 4. Efecto de diferentes longitudes de onda sobre la estructura

B)

C)

D)

A)

. A)

control; B) luz roja; C) luz blanca; D) luz azul. 1(etapa 1); 2 (etapa 2); 3 (etapa

3); 4 (etapa 4). La barra indica 500 nm.

Factor de compacidad: valores superiores a 12.59 (4π) indican que el objeto

tiene un borde rugoso o sinuoso. Los resultados obtenidos en este trabajo

indican que todos los datos analizados fueron superiores a 12.59, por lo que

ningún plástido presenta un perímetro liso. Se encontró que los plástidos en luz

roja, tuvieron un perímetro más rugoso para cada una de las etapas. Mientras

que los plástidos que presentaban un mayor Fc inicial fueron los que se

iluminaron con luz blanca, pero también fueron los que experimentaron una

mayor disminución en la última etapa.

Factor de forma: Los resultados obtenidos mostraron que todos los plástidos

en cuanto a su forma ninguno alcanzo la unidad; los cloroplastos de la etapa 1

fueron los más circulares. Conforme se fueron diferenciando se hacen más

elípticos, comportamiento que se observó en todos los tratamientos aunque

con diferencias entre las mismas etapas y entre tratamientos.

Cuantificación de pigmentos por espectrofotometría

En la Figura 6 se muestran las diferencias en la acumulación de pigmentos.

Como se observa, en todos los tratamientos la acumulación de carotenoides

fue gradual desde la E1 a la E4. En el control el total de carotenoides osciló de

los 900 a 14000 µg/gpf observándose un importante incremento de pigmentos

de la etapa 2 a la etapa 3 y 4. En cuanto a la luz blanca, la acumulación fue

gradual en cada etapa de desarrollo oscilando de los 400 a 11000 µg/gpf sin

embargo no se observó diferencia con el control pero si con la roja y azul. En

la luz roja la acumulación menor que el control oscilando de los 300 a 12000

µg/gpf; y de 200 a 12000 µg/gpf en luz azul. En la luz roja y azul la

acumulación fue similar en las etapas 3 y 4. Mediante el análisis estadístico se

demostró que existen diferencias significativas respecto al control. El control

tiende a acumular más pigmentos en comparación con la luz roja, azul y en la

luz blanca esta diferencia se puede observar en la Figura 6.

INVERNADERO BLAN ROJO AZUL

Figura 6. Contenido total de carotenoides en las cuatro etapas de desarrollo de

las inflorescencias crecidas en la luz blanca, roja, azul y el control. (P=<0.001,

E1), (P=0.002, E2), (P=0.009, E3), (P=0.028, E4). Las columnas representan el

promedio de los carotenoides totales, las barras ± la desviación estándar

Análisis de los extractos de cempaxúchil mediante HPLC, plantas

desarrolladas bajo la longitud de onda de la luz blanca, roja, azul.

Las plantas expuestas a la luz blanca mostraron un perfil cromatográfico similar

al control. En la Figura 7A se observa un pico principal que corresponde a la

luteína identificado a los 4.46 min y otros dos picos en mayor tiempo de

retención, los cuales pudieran corresponder a precursores de luteina o a algun

otro carotenoides no identificados por falta de los estándares. En la Figura 7B

se observa el perfil cromatográfico de pigmentos de inflorescencias

desarrolladas bajo la luz roja en este caso se observa un pico principal que

corresponde a la luteína al min 4.59 un pico adyacente que corresponde a un

isómero de luteína y picos adicionales con muy baja respuesta en mayor

tiempo de retención no identificados. En la Figura 7C se muestra el perfil de los

Etapas de desarrollo

extractos obtenidos de las lígulas desarrolladas en la luz azul, en este se

identificó el pico principal que corresponde a la luteína con un tiempo de

retención a los 4.30 min y un pico adicional muy pequeño a los 6.58 min. En la

literatura no se encontraron trabajos similares con el que pudieran comparar

estos resultados, es este sentido es importante realizar estudios más profundos

para poder identificar exactamente a qué carotenoide corresponden estos

picos. Con estos resultados podemos concluir que en general la longitud de

onda específica de la luz afectó el perfil de los carotenoides. Sin embargo de

manera general en todos los extractos se identificó la presencia de luteína en

todos los tratamientos como pigmento principal.

IMPACTO

El conocimiento generado por los resultados del presente proyecto, permiten

reconocer que en las inflorescencias de cempaxúchil, la longitud de onda tiene

un efecto preponderante, tanto en la conformación de estructuras subcelulares

tan importantes como son los plástidos (cloroplastos y cromoplastos), como en

la acumulación de los pigmentos. De aquí se generan preguntas muy

importantes como son el hecho de qué genes, de la ruta de biosíntesis de los

carotenoides, se ven modificados a nivel de expresión, por efecto de las

longitudes de onda que incidan en la planta, qué ocurrirá si la radiación

específica se dosifica únicamente por pulso, etc. este estudio es la base para

posteriores análisis y la posible implementación de cultivos en condiciones

controladas de este tipo, con la finalidad de incrementar la producción de

pigmentos y la posibilidad de salvar la estacionalidad del cultivo.

Figura 7. Comparación del perfil cromatográfico de los extractos de cempaxúchil de la etapa 4. A) luz blanca, B) luz roja, C) luz azul. (1) luteína, (2,3) carotenoides, (4) isómeros de luteína.

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo de retención (min) Tiempo de retención (min) 2 4 6 8 10 12 14 16

Tiempo de retención (min) 2 4 6 8 10 12 14 16

A) B)

C)