INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE CIENCIAS MARINAS

DEPARTAMENTO DE PLANCTON Y ECOLOGÍA MARINA

INFORME PARCIAL

Programa de investigación: Efectos del enriquecimiento por nutrientes en sistemas costeros de la cuenca Lechugilla-Ohuira-Navachiste, Sinaloa

Clave CGPI 502

Proyecto: Ecofisiología de especies productoras de toxinas del género Pseudo-nitzschia (Navachiste y Topolobampo)

Proyecto individual, mediano plazo, Clave CGPI 20061157

PRESENTA:

DRA. AIDA MARTINEZ LOPEZ

DIRECTORA DE PROYECTO

La Paz, B.C.S. enero de 2007.

4.1 Investigadores participantes

Número Nombre e institución Actividad específica a desarrollar 1 Aída Martínez López Director del proyecto 2 Christine Johanna Band Schmidt

(IPN) Aislamiento de cepas de Pseudo-nitzschia

3 Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza(IPN)

Montaje de técnica para el análisis molecular de cepas de Pseudo-nizchia sp.

4 Ana Elsi Ulloa Pérez (IPN)

Logística de salidas de campo, determinación de nutrientes y clorofila a, colecta de material vivo para el aislamiento

5 José Ricardo Palomares García (IPN)

Pruebas de bioensayos para segunda fase del proyecto

Resumen

Este proyecto estudia la fisiología, toxicología y ecología de las especies de

Pseudo-nitzschia de los sistemas lagunares de la parte norte del litoral de

Sinaloa, una región en la cual, los ingresos de macronutrientes son controlados

en parte por los aportes de los drenes que incorporan aguas residuales de

diversos orígenes a estos sistemas. Estudios recientes sugieren que en estas

lagunas existe un riesgo potencial para la salud pública debido a gran la

cantidad de especies que pueden formar Floraciones Algales Nocivas (FAN),

incluyendo a las diatomeas del género Pseudo-nitzschia. El objetivo de este

estudio fue describir las condiciones ambientales bajo las cuales las especies

del género Pseudo-nitzschia señaladas como potencialmente toxicas, se

registraron en aguas costeras de Sinaloa. Los datos generados entre agosto y

diciembre de 2006 revelan que este género es importante en los sistemas

lagunares estudiados. El análisis cualitativo del fitoplancton usando

microscopia electrónica y de luz muestran que las especies identificadas

Pseudo-nitzschia multistriata, P. pseudodelicatissima, P. fraudulenta, P. sinica,

P. pungens, P heimii, P subfraudulenta y P. australis. Se encuentran

regularmente en el sitio de estudio. Sus mayores abundancias, en el orden de 6

x 106 céls/L se encontraron en noviembre en la estación 2, la cual se encuentra

bajo la influencia directa de las descargas de aguas residuales. La proliferación

observada en noviembre se presento en condiciones de relativamente bajas

concentraciones de nitratos, relación N/F, salinidad y alta concentración de

silicio, Siete de las ocho especies encontradas son productoras potenciales de

toxinas de tipo amnésico. La presencia de estas diatomeas potencialmente

tóxicas, algunas de las cuales se manifestaron en forma de floración en la zona

mas afectada por las descargas de aguas residuales, implica un nuevo

problema para la salud pública, resultando necesario continuar los estudios

sobre taxonomía y ecología de este grupo, como también implementar un

monitoreo de fitoplancton, en la región costera de Sinaloa. Queda para una

segunda fase a partir del material ya colectado, la confirmación de la presencia

de acido domóico por las especies de este género así como la exploración del

impacto que pudieran tener sobre organismos del siguiente nivel trófico.

INTRODUCCION

El reconocimiento de que las Floraciones Algales Nocivas (FANs) se han

incrementado en los últimos años en el mundo (cita). Uno de los géneros que

producen eventos FANs es Pseudo-nitzschia, el cual es un género que

comúnmente forma proliferaciones. El estudio de estas diatomeas toxigenicas,

las cuales pueden producir eventos de envenamiento amnesico por moluscos

debido a la producción de Acido domóico, cobro auge a finales de los 80s y

principios de los 90`s, cuando ocurrieron varios eventos de intoxicaciones y

muerte de varias personas que consumieron mejillones, así como de

mamíferos marinos y aves en Canadá y en California. Posteriormente la

ocurrencia de estos eventos se ha extendido a otras regiones del mundo. No

obstante la relevancia del género Pseudo-nitzschia , hasta la fecha existe un

conocimiento limitado de la ecofisiología del mismo. Históricamente, se ha

asumido que el crecimiento del fitoplancton costero (diatomeas principalmente)

esta limitado por la disponibilidad de nitrógeno, no obstante recientemente se

ha reconocido que la disponibilidad de silicatos podrían ser otro factor

regulador entre otros de la respuesta fisiológica asociada con la formación de

proliferaciones. De igual forma se ha sugerido que las condiciones limitantes de

nutrientes pueden desencadenar un incremento en la concentración de toxinas

por estas diatomeas. En México de igual forma que en el mudo, se ha

reconocido el incremento de los eventos FAN`s (Morquecho et al., 2002),

incluyendo género Pseudo-nitzschia. Este género desarrolla proliferaciones en

el Golfo de California (Alonso-Rodríguez y Ochoa, 2004). Sin embargo, las

observaciones de estos eventos son limitados por la falta de estudios en

general. En particular para la parte norte del litoral de Sinaloa, se ha

documentado la ocurrencia de un componente importante de especies

potencialmente toxicas o nocivas, sobretodo a principios de invierno-primavera.

Este componente incluye a Pseudo-nitzschia, para quien hace falta resolver la

identificación de las especies que solo se han documentado a nivel de

morfotipos. Su correcta identificación requiere de técnicas especiales, como es

el caso del uso de la microscopia electrónica o de la biología molecular. Una

vez resuelto el problema de la identificación a nivel de especie, se tendrá una

idea mas precisa del riesgo potencial que existe en la zona de estudio de que

ocurran eventos tóxicos. (Anderson et al. 1990; Bates et al. 1991, Bates and

Douglas 1993). Por lo tanto, el objetivo de este proyecto fue describir las

condiciones ambientales bajo las cuales las especies del género Pseudo-

nitzschia señaladas como potencialmente toxicas, se registraron en aguas

costeras de Sinaloa

MATERIALES Y METODOS

Trabajo de campo

Se realizarán monitoreos mensuales durante agosto hasta diciembre del 2006

en 5 puntos del sistema lagunar Topolobampo. En cada sitio se determinó in

situ la temperatura, salinidad y pH mediante un medidor de calidad de agua

marca Horiba modelo U-10. En las estaciones seleccionadas se recolectarán

muestras de agua con un tubo muestreador segmentado (TMS) descrito por

Sutherland et al. (1992), modificado por Orellana et al. (1999) y validado

estadísticamente por Montiel Nieves (1998), que permite obtener un perfil

vertical de la columna de agua por segmentos. Del agua colectada por el tubo

segmentado se tomaron muestras para el análisis de nutrientes (nitratos,

nitritos, amoniaco, fósforo reactivo y silicatos) y clorofila a. Las muestras de

agua se almacenaron en hielo en un contenedor plástico y se transportaron al

Laboratorio de Análisis Ambiental del IPN-CIIDIR Sinaloa, para su posterior

análisis. Adicionalmente, de cada segmento se tomó una muestra de agua de

125 ml para la estimación de la abundancia del fitoplancton fijándose con una

solución de Lugol al 1%, a la cual después de 24 horas se les agregó una

solución de formol al 4%, neutralizado con borato de sodio.

Análisis de laboratorio

Las muestras para la determinación de nutrientes, se analizaron de acuerdo a

la metodología y recomendaciones de Strickland y Parsons (1972). La

determinación del amoniaco se llevó a cabo inmediatamente después del

muestreo siguiendo el método de Solórzano (1969), la de los nitratos según la

técnica de Morris y Riley (1963) modificada por Grasshoff (1964). Para los

nitritos se siguió el método de Shinn (1941), aplicado al agua de mar por

Bendschneider y Robinson (1952). Para el fósforo reactivo se siguió la

metodología de Murphy y Riley (1962), mientras que el silicato reactivo se

determinó de acuerdo a Riley (1963). Todas las lecturas de los nutrientes se

realizaron en un espectrofotómetro Termo Spectronic Genesys 2.

Las muestras de agua para determinar la concentración de clorofila a (Cla)

fueron filtradas con filtros de fibra de vidrio Whatman (GF/F 0.7 µm), los cuales

se congelaron a -20º C hasta efectuar la extracción del pigmento con acetona

al 90% durante 24 h, según lo recomendado por Strickland y Parsons (1972).

Los cálculos de la concentración de Cla se realizaron de acuerdo a las

ecuaciones propuestas por Jeffrey y Humprey (1975).

Fitoplancton (análisis cuantitativo)

Se realizo siguiendo el método de Utermöhl (Hasle, 1978). Para ello se

tomaron 10 cm3

de la muestra los cuales se depositaron en una cámara de

sedimentación con tapa de vidrio por 24 h, con la finalidad de que todo el

material que compone la muestra se sedimente en el fondo para su posterior

identificación y cuantificación. Posteriormente se procedió a realizar el análisis,

en un microscopio invertido Olympus® CK2 con objetivos Olympus® 10x, 20,

40x y 100x, con contraste de fases.

Identificación por microscopia electrónica

Para la observación de células de Pseudos-nitzschia en el microscopio

electrónico de barrido (MEB) se el material colectado fue tratado de acuerdo

con la técnica de Hasle y Fryxell (1970) para eliminar la materia orgánica. El

material limpio se filtro en membranas nucleopore y se seco a temperatura

ambiente. Posteriormente estas membranas se montaron sobre los soportes

para observar al MEB y se recubrieron con oro para su análisis. Las

identificaciones se basaron en características morfométricas

Aislamiento

Se colectaron muestras de fitoplancton vivo mensualmente mediante arrastres

verticales utilizando una red de 20 μm de luz de malla, se tamizaron a través de

una malla de 60 μm para eliminar organismos de mayor tamaño. Las células se

inocularon en 250 mL de medio f/2 modificado (Anderson et al. 1984). Las

células vegetativas se aislaron mediante la técnica de micropipeta utilizando un

microscopio invertido Carl Zeiss, se transferieronn a celdas de poliestireno

conteniendo medio de cultivo y se mantuvieron a 21 + 1°C, en un ciclo de luz-

oscuridad (12:12) a 150 μEm2s1 de intensidad luminosa. Una vez que se

obtuvo una densidad adecuada se transferireron las células a tubos de cultivo

de 50 mL de capacidad con 20 mL de medio f/2.

RESULTADOS Durante agosto la distribución de las variables fisicoquímicas evidenciaron un

gradiente positivo con los mayores valores de temperatura, salinidad y

concentración de nutrientes en Laguna Santa Maria en coincidencia con los

menores valores de pH (Fig. 1)

Fig. 1. Distribución espacial de la temperatura superficial del mar (TSM),

salinidad, pH, silicatos (SiO2), nitrógeno inorgánico disuelto (NID) y fosfatos

(PO4) durante agosto 2006.

En septiembre se observo un patrón similar sin embargo, las concentraciones

mayores de silicio se observaron en la Laguna Ohuira (Fig. 2), en donde se

determinaron valores similares a los observados en Santa Maria en agosto.

Fig. 2. Distribución espacial de la temperatura superficial del mar (TSM),

salinidad, pH, silicatos (SiO2), nitrógeno inorgánico disuelto (NID) y fosfatos

(PO4) durante septiembre 2006.

Para octubre se repite la distribución de agosto con las máximas

concentraciones en Laguna Santa Maria, las cuales decrecen hacia Laguna

Topolobampo donde se encontraron las concentraciones mínimas de nutrientes

(Fig. 3).

Fig. 3. Distribución espacial de los silicatos (SiO2), nitrógeno inorgánico

disuelto (NID) y fosfatos (PO4) durante octubre 2006.

Durante noviembre los máximos de todas las variables medidas y estimadas se

localizaron en Laguna Santa Maria con la excepción de la salinidad y los

fosfatos (Fig. 4). La concentración de clorofila a presento valores de 8 mg m-3.

Estos valores fueron 4 veces más altos que los encontrados en Laguna

Topolobampo (Fig. 4).

Fig. 4. Distribución espacial de la temperatura superficial del mar (TSM),

salinidad, pH, oxigeno disuelto,), nitrógeno inorgánico disuelto (NID), silicatos

(SiO2), clorofila a (CL a), y fosfatos (PO4) durante noviembre 2006.

Para el mes de diciembre los valores mas altos de NID se ubicaron en la zona

de la boca de Topolobampo, en tanto que los silicatos, fosfatos y clorofila

exhibieron los mayores valores en Laguna Santa María (Fig. 5).

Fig. 5. Distribución espacial del nitrógeno inorgánico disuelto (NID), silicatos

(SiO2), clorofila a (CL a), y fosfatos (PO4) durante diciembre 2006.

Temporalmente las mayores concentraciones de NID y silicatos se observaron

en agosto en Santa Maria, decreciendo a valores similares en el resto de los

meses. Los fosfatos presentaron valores similares en los meses analizados,

notándose un ligero incremento en noviembre (Fig. 6). Se observaron valores

medios de la razón N/F en octubre en todas las estaciones y los menores se

calcularon para noviembre (Fig.6). En tanto que los valores de la razón N/Si se

encontró en general por debajo de 1, lo cual implica condiciones limitantes por

nitrógeno para el crecimiento del fitoplancton. En cuanto a las abundancias del

género Pseudo-nitzschia este se presento desde agosto con abundancias en el

orden de 103 céls/l, incrementando sus valores hasta el máximo en noviembre

cuando alcanzo 6 x 106 céls/l (Fig. 6). Este máximo de abundancia coincidió

con el máximo de clorofila (8 mg m-3).

NID

y P

O 4 (u

M)0

10

20

30

40

SiO 2

(uM)

0

20

40

60

80

100NIDPO4SiO2

Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre

2 4 8 9 2 4 8 9 2 4 8 9 2 4 8 9 2 4 8 9

N/F

02468

101214

N/Si

0

1

2

3

4N/F N/Si

Estación

Célul

as/L

0

5x106

6x106

mg

cla

m-3

0

2

4

6

8

10Pseudo-nitzschia Clorofila a

Fig. 6 Distribución temporal de los nutrientes y razones N/F, N/Si (panel

superior y medio). Variabilidad temporal de la abundancia del género Pseudo-

nitzschia de agosto a diciembre de 2006

Las especies identificadas hasta el momento son 8 e incluyen a Pseudo-

nitzschia multistriata, P. pseudodelicatissima, P. fraudulenta, P. sinica, P.

pungens, P heimii, P subfraudulenta y P. australis. Siete de estas han sido

reportadas como productoras de envenamiento de tipo amnésico debido a la

producción de Acido domóico. Debido a la dificultad para identificarlas es

necesario combinar observaciones al microscopio de luz y de microscopia

electronica de barrido y de transmisión. Las láminas 1 y 2 ilustran un par de las

8 especies identificadas.

Lámina 1. Pseudo-nitzschia fraudulenta; observaciones con microscopio

electrónico de barrido (1) y con microscopio de luz (2 y 3)

Lámina 1. Pseudo-nitzschia pungens; observaciones con microscopio

electrónico de barrido (1) y con microscopio de luz (2)

DISCUSION el género Pseudo-nitzschia, quien presentó varias especies, durante los meses

analizados, desarrollo sus máximas abundancias hacia finales de otoño (noviembre

2006) y principios de invierno con valores que en el orden de 6 x 106 céls/L. Varias

especies de este género han sido identificadas en el Golfo de California (Hernández,

1987 y 1998; Gómez et al., 2004) como responsables de algunas proliferaciones en

esta región (Licea et al., 1999). Actualmente el grupo de Pseudo-nitzschia está sujeto

a revisión profunda, sobre todo a raíz de que se ha reconocido su potencialidad en la

producción de toxinas. El ácido domóico provoca el envenenamiento amnésico por

ingestión de mariscos (ASP, Amnesic Shellfish Poisoning, por sus siglas en inglés)

(Helle, 1995), condición que provoca la muerte en la población humana. Entre las 29

especies de este género descritas en la literatura, se han demostrado que once son

capaces de producir esta biotoxina (Subba et al., 1988; Bates et al., 1989; Fritz et al.,

1992; Martin et al., 1993; Bates, 2000; Scholin et al., 2000; Lundholm et al., 2003).

Este dato cobra relevancia para la zona ya que hasta el momento se han identificado 7

especies que potencialmente pueden producir ácido domóico. Las concentraciones de

silicio fueron propicias para la proliferación de este género en la estación 2 de Laguna

Santa Maria, donde se observaron cantidades importantes de silicio y nitrógeno, así

como la reducción de la salinidad del agua. En este sitio el incremento en los

nutrientes se puede explicar por los aportes de las escorrentías derivadas de la

actividad agrícola de la región, las cuales aportan cantidades importantes de fósforo y

amonio provenientes de los fertilizantes, además del arrastre de silicio por el lavado de

las tierras de siembra (Escobedo et al., 2003; Magaña, 2004). Al respecto para aguas

costeras se ha minimizado la importancia de la relación Si:N o Si:P debido a que se ha

puesto mayor énfasis en el aporte de N y P proveniente de las actividades humanas

(Alonso et al., 2004). En este sentido, éste estudio demuestra que la inclusión del

silicio como una variable ambiental es fundamental para comprender la dinámica del

fitoplancton. Sobretodo en los casos de las diatomeas que son potencialmente toxicas,

ya que se observado el impacto que han tenido sobre aves, mamíferos marinos

(Ochoa et al., 1997;1998; Sierra et al., 1997; 1998) y sobre la población humana. Las

diatomeas requieren de Si y N en una relación molar de aproximadamente 1:1

(Redfield et al., 1963; Dortch y Whitledge, 1992). En la medida en que esta relación

cambia de >1 a <1, el ambiente químico pasa de un estado que permite a las

diatomeas competir efectivamente con otra clase de algas. La presencia de estas

diatomeas potencialmente tóxicas, algunas de las cuales se manifestaron en forma de

floración en la zona mas afectada por las descargas de aguas residuales, implica un

nuevo problema para la salud pública, resultando necesario continuar los estudios

sobre taxonomía y ecología de este grupo, como también implementar un monitoreo

de fitoplancton, en la región costera de Sinaloa.