GUA DE LABORATORIO MICROBIOLOGA INDUSTRIAL IUBICUIDAD MICROBIANA Y TCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 1. OBJETIVOReconocer la ubicuidad de los microorganismos mediante la toma de muestras de aire, superficie y flora corporal empleando la tcnica de la placa expuesta.2. MATERIALESCajas de petri con agar nutritivo

Mecheros de Alcohol

Alcohol antisptico

Jabn de Manos

3. PROCEDIMIENTO

PRIMERA ETAPA. AISLAMIENTO. Se evaluarn la esterilidad de varias zonas de laboratorio. Retire la tapa de la caja de petriGrupo 1. Cmara de Flujo Laminar y rea de lavado. Tiempo Exposicin 10 minutosGrupo 2. Dedos y manos.

Grupo 3. Sople sobre una caja de petri con agar nutritivo. Batas de Laboratorio,Grupo 4. Mesones del LaboratorioGrupo 5. Incubar las cajas a 37C entre 24 y 48 horas.

SEGUNDA ETAPA. TINCIN Y PURIFICACIN (13 Septiemtre).

3.1 Tincin de Bacterias. Realizar un frotis de las bacterias, para ello tome con un asa un poco de crecimiento bacteriano y sobre una lmina impregnada con una gota de agua esparza la bacteria con ayuda del asa.

2.2. Deje secar a temperatura ambiente

2.3. Flamear con ayuda de un mechero rpidamente.

2.4. Realizar Coloracin de Gram

2.4.1. Esparcir sobre el frotis gotas de cristal violeta, y teir por 1 minuto. Lavar suavemente con agua.2.4.2. Esparcir sobre el frotis gotas de Lugol. Dejar actuar por 1 minuto. Lavar suavemente con agua.

2.4.3. Esparcir sobre el frotis gotas de acetona, dejar actuar por 30 segundos

2.4.4. Esparcir sobre el frotis gotas de Fucsina de Gram. Dejar actuar por 1 minuto.

2.4.5. Escurra las lminas y observe al microscopio, primero en objetivo de 10X, 40X y por ltimo en objetivo de 100X con aceite de inmersin.3.2 Aislamiento de Bacterias. Tcnica de Siembra por Estras en Placa3.2.1 Con un asa de platino, tome una pequea cantidad de bacterias y psela a la superficie el medio de cultivo agar nutritivo y siembre en el medio por estra

Figura 1. Siembra en Placa por Aislamiento por el Mtodo de Dilucin por Estra3.3 Tcnica

3.3.1 Con un lpiz graso divida la caja Petri en 3 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a la inoculacin, se tenga como se indica en la figura:

3.3.2. En condiciones aspticas con un asa tome bacterias, a partir de los cultivos bacterianos obtenidos. 3.3.3 Levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material en el sector 1, trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. 3.3.4 Cerrar la caja y esterilizar el asa flamendola y mientras que se enfra, girar la caja 90 hasta que el sector 1 quede a la izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha.

3.3.5. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las siguientes estras no deben tocar el sector. De esta forma se diluye el material quedando unas bacterias separadas de las otras.

3.3.6 Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90 y ahora el sector 2 estar a la izquierda y el 3 a la derecha.

3.3.7 Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra en el dibujo:

3.3.8 Incubar a 37C por 24-28horas. Al cabo de este tiempo observar las colonias aisladas.4. OBSERVACIONES4.1 Observe las cajas de petri con agar nutritivo, provenientes de los diferentes grupos, describa macroscpicamente los tipos de colonias bacterianas observados. Tenga en cuenta tamao, forma, textura, borde y color. (Figura 2).FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide.TAMAO: Estimar el dimetro en mm.SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc.ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada.BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa.COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.OPACIDAD: Transparente, opaca, brillante.CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa. Usar el asa bacteriolgica para determinar la consistencia.

Figura 2. Descripcin Macroscpica de Colonias Bacterianas4.2 Describa el comportamiento que tienen las bacterias aisladas con respecto a la coloracin de Gram, que microorganismos son ms predominantes?4.3 Existen diferencias en morfologa macroscpica entre la microflora proveniente de los diferentes tratamientos realizados por los grupos?4.4 De acuerdo a los resultados que recomendaciones hara para el trabajo asptico en el laboratorio de microbiologa. PROCEDIMIENTOS DE TINCIN EN BACTERIAS

La coloracin en bacterias tiene como fin aumentar el contraste de las clulas con el medio que las rodea. Lo que implica mejorar la visualizacin de las bacterias y permitir la distincin de formas y tamaos, diferenciar grupos bacterianos por su reaccin frente a determinados colorantes y revelar la presencia de distintas estructuras internas.

Los colorantes utilizados son sales en los que el anin o el catin es el responsable del color; en el primer caso se trata de un colorante cido o aninico y en el segundo, bsico o catinico. La clula bacteriana tiene una dbil carga negativa cuando el medio externo tiene un pH cercano a la neutralidad. La diferencia de carga elctrica determina la afinidad entre el colorante y la clula, las bacterias tendrn afinidad por los colorantes bsicos (ej: cristal violeta y azul de metileno). En algunas ocasiones es necesario utilizar un mordiente, estas sustancia, contribuye a la fijacin del colorante a la clula (ej: cido tnico, sales de Al, Fe).Cuando se utiliza un solo colorante bsico el mtodo se denomina coloracin simple, mientras que se llama coloracin compuesta cuando se usan dos o ms, la coloracin diferencial es un caso particular de coloracin compuesta.

Existe tambin un tipo de tincin negativa o indirecta en este caso el colorante cido no se une a las clulas cargadas negativamente, pero se deposita alrededor de ellas quedando as un fondo coloreado donde contrastan las clulas incoloras.

COLORACIN DE GRAMEs un tipo de tincin diferencial, por este mtodo se clasifican las bacterias en dos grupos: Gram positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram -), en funcin de su reaccin frente a la coloracin.

Las clulas fijadas se tien con cristal violeta, se lavan y se tratan con lugol. El iodo forma un complejo con el cristal violeta, que sirve para fijar ste a la clula. Se agrega un agente decolorante (alcohol, acetona o mezcla de ambos) en el cual el complejo yodo-cristal violeta es soluble. Los microorganismos Gram son decolorados mientras que los Gram + no. Luego de la decoloracin se aplica un colorante de contraste, generalmente safranina, que hace visible los microorganismos Gram que haban sido decolorados. Por tanto Gram positivos (Violetas), Gram negativos (Rosados).Las bacterias Gram positivas poseen paredes gruesas de peptidoglicano, se deshidratan por el alcohol, lo que provoca que se cierren los poros de la pared, impidiendo que el complejo yodo-cristal violeta salga de la clula.

Las bacterias Gram negativas, la fina capa de peptidoglicano no evita el pasaje del solvente, por lo que el complejo yodo-cristal violeta escapa de la clula

Las levaduras, que poseen una pared celular gruesa pero de una composicin qumica diferente, se tien como Gram positivas.

NO SON LOS CONSTITUYENTES QUMICOS, SINO LA ESTRUCTURA FSICA DE LA PARED LO QUE LE CONFIERE LA GRAM POSITIVIDAD.