eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo · ii agradecimiento a dios por haberme...

UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

CARRERA DE QUÍMICA FARMACÉUTICA

EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL TOMILLO

(Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA EMULSION O/W DE

USO TÓPICO.

Trabajo de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título

de Químico Farmacéutico

Autor: Guerrero Rivadeneira Yéssica Patricia

Tutor: Mgs Dayana Paulina Borja Espín

Quito, Marzo 2017

I

Dedicatoria

A mis padres por haberme enseñado que el esfuerzo, la dedicación y el no dejarse

vencer, valen la pena.

II

Agradecimiento

A Dios por haberme dado la sabiduría, la fuerza y sobre todo la bendición en cada paso

dado.

A mis padres, quienes me han dado la mejor educación y que con su ejemplo me han

sabido fomentar que está en uno el querer lograr algo, que los problemas y las

dificultades no son limitantes para alcanzar las metas planteadas, por su apoyo

incondicional, sus consejos y su persistencia.

A mi ñaña que con su carácter y sus locuras siempre ha estado junto a mí, siendo mi

alegría y mi fuerza en momentos difíciles.

A mis abuelitos, que con su humildad y sencillez han velado a través de sus oraciones

para que Dios guie siempre mi camino.

A Verito, por ser una amiga incondicional que ha formado parte de mi vida desde el

momento que decidimos empezar esta gran lucha en la Universidad. Gracias amiga por

formar parte de mi vida y por tu aporte en la realización de este proyecto de

investigación.

A Migue, por haber llegado a mi vida en el momento justo, por ser mi compañero, mi

amigo y sobre todo por estar conmigo en los momentos buenos y en los malos,

dándome aliento cuando me he sentido derrotada, levantándome cuando he tropezado.

Gracias por su ayuda incondicional para la culminación de esta etapa de mi vida.

A mis maestros de la facultad, por darnos las herramientas necesarias para defendernos

como profesionales, en especial agradezco al Dr. Javier Santamaría, que con sus

conocimientos y exigencias me ha sabido guiar durante la realización de este trabajo de

investigación, del cual he aprendido que la preparación nunca termina y que un título

profesional debe ir de la mano de una gran calidad humana; a la Dra. Liliana Naranjo,

por ser una excelente docente y por velar por sus estudiantes.

A mi tutora Dra. Dayana Borja por la orientación y todo su apoyo durante el desarrollo

de este trabajo de investigación.

III

AUTORIZACIÓN DE AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, Guerrero Rivadeneira Yéssica Patricia en calidad de autor del trabajo

de investigación: EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL

DEL TOMILLO (Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA

EMULSION O/W DE USO TÓPICO autorizo a la Universidad Central del

Ecuador a hacer uso de todos los contenidos que me pertenece o parte de los que

contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6,8, 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la

digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual,

de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación

Superior.

…………………………………………….

Yéssica Patricia Guerrero Rivadeneira

CI: 172099425-8

IV

ACEPTACIÓN DEL TUTOR

Yo Dayana Paulina Borja Espin.en calidad de tutor del trabajo de investigación

titulado EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL

TOMILLO (Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA

EMULSION O/W DE USO TÓPICO, elaborado por la estudiante Yéssica

Patricia Guerrero Rivadeneira de la Carrera de QUÍMICA FARMACÉUTICA,

Facultad de CIENCIAS QUIMICAS de la Universidad Central del Ecuador,

considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo

metodológico y en el campo epistemológico, por lo que lo APRUEBO, a fin de que

sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.

En la ciudad de Quito, a los 08 días del mes de Marzo de 2017

……………………

Mgs Dayana Paulina Borja Espín

C.I. 1710993849

V

ACEPTACIÓN DEL TUTOR

El Tribunal constituido por: Javier Santamaría Aguirre, Inés Catalina Echeverría

Llumipanta, y Dayana Borja Espín, luego de revisar el trabajo de investigación

titulado EFICACIA ANTIMICROBIANA DEL ACEITE ESENCIAL DEL

TOMILLO (Thymus vulgaris L.) COMO CONSERVANTE EN UNA

EMULSION O/W DE USO TÓPICO, previo a la obtención del título de

QUÍMICO FARMACÉUTICO presentado por la señorita Guerrero Rivadeneira

Yéssica Patricia, APRUEBA el trabajo presentado.

Para la constancia de lo actuado firman.

…………………………………..

Javier Rodrigo Santamaría Aguirre

C.I. 1802467132

…………………………………..

Dayana Paulina Borja Espín

C.I. 1710993849

…………………………………..

Inés Catalina Echeverría Llumipanta

C.I. 1715966741

VI

Índice de Contenidos

Resumen ........................................................................................................................XI

Introducción ................................................................................................................... 1

Capítulo I: El problema ................................................................................................ 2

Planteamiento del problema ................................................................................... 2-3

Formulación del problema ....................................................................................... 3

Objetivos de la investigación ................................................................................... 3

Objetivo General .................................................................................................. 3

Objetivos específicos ............................................................................................ 3

Importancia y justificación del problema .............................................................. 3-4

Capítulo II: Marco Teórico .......................................................................................... 5

Antecedentes de la investigación .......................................................................... 5-6

Fundamento teórico ................................................................................................. 6

Presencia y análisis de microorganismo en un producto terminado .................. 6-7

Calidad microbiológica en medicamentos ........................................................ 8

Conservantes ........................................................................................................ 8

Tipos de conservantes .................................................................................. 8-9

Selección del conservantes .............................................................................. 9

Análisis de eficacia de los conservantes .............................................................. 9

Microorganismos de prueba ....................................................................... 9-11

Prueba de eficacia antimicrobiana ................................................................. 11

Aceites esenciales ............................................................................................. 12

Caracterización de los aceites esenciales ....................................................... 12

Factores que afectan la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales

……………………………………………………………………………...12-13

Especie vegetal ................................................................................................. 13

Descripción botánica del tomillo ................................................................... 13

Composición química .............................................................................. 13-14

Acción Farmacológica .................................................................................. 14

Actividad antimicrobiana ......................................................................... 14-15

Formulaciones ..................................................................................................... 15

Emulsiones ...................................................................................................... 15

Componentes de las emulsiones ..................................................................... 16

Contaminación microbiológica de las emulsiones ..................................... 16-17

Estudios de estabilidad ........................................................................................ 17

Estabilidad acelerada y parámetros de evaluación ..................................... 17-18

Fundamento Legal ................................................................................................. 18

Constitución de la República del Ecuador ......................................................... 18

Ley Orgánica de Salud ....................................................................................... 18

Buenas prácticas de manufactura para la industria de productos cosméticos .... 18

Buenas prácticas de manufactura ....................................................................... 18

Secretaría General de la Comunidad Andina (CAN) .......................................... 19

Cosmetics - European Commission (Cosing) ..................................................... 19

VII

USP-36 ................................................................................................................ 19

Hipótesis ................................................................................................................ 19

Sistema de variables ........................................................................................... 19-20

Capítulo III: Metodología ........................................................................................... 21

Diseño de la investigación .................................................................................... 21

Población y muestra ............................................................................................... 21

Métodos y materiales ............................................................................................ 21

Materiales. .......................................................................................................... 21

Materias primas ............................................................................................ 21-22

Microorganismos de prueba ............................................................................... 22

Equipos ............................................................................................................... 22

Diseño experimental ........................................................................................ 22-25

Operacionalización de variables ............................................................................ 25

Procedimientos ..................................................................................................... 25

Control de calidad del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.). ...... 25-26

Características Organolépticas ...................................................................... 26

Densidad relativa ........................................................................................... 26

Índice de refracción ................................................................................. 26-27

Reacciones de coloración para aceites esenciales .................................... 27-28

Cromatografía en capa fina .......................................................................... 28

Elaboración de la emulsión o/w de uso tópico (loción) ...................................... 28

Elaboración de una emulsión o/w con el conservante sintético. .................... 29

Elaboración de una emulsión o/w con aceite esencial de tomillo, como

conservante antimicrobiano. ........................................................................... 30

Metodología analítica para el producto terminado (emulsión o/w de tipo loción).

............................................................................................................................ 31

Ensayos organolépticos .................................................................................. 31

Ensayos físicos ............................................................................................. 31

Metodología microbiológica. ................................................................................. 31

Examen microbiológico de productos no estériles: Aptitud del método de

recuento en presencia del producto ................................................................ 31-32

Método de Recuento en Placa ....................................................................... 32

Prueba de eficacia antimicrobiana .......................................................... 33-35

Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico) ....................................... 35

Diseño experimental ............................................................................................ 35

Análisis de varianza ANOVA ................................................................. 35-36

Decodificación general del estudio .......................................................... 36-37

Capítulo IV: Análisis y discusión de resultados ....................................................... 38

Análisis fisicoquímico cualitativo del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris

L.) ....................................................................................................................... 38

Reacción de caracterización ...................................................................... 38-39

Cromatografía en capa fina del aceite esencial de tomillo .............................. 39

Medición del espectro IR del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.)

............................................................................................................................ 40

VIII

Control de calidad del producto terminado (emulsión o/w: loción) ......... 40-44

Examen microbiológico de productos no estériles: Método de recuento en

placa… ........................................................................................................ 44-45

Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante

(método USP-36) ....................................................................................... 46-59

Análisis estadístico de la eficacia antimicrobiana del aceite esencial de tomillo

(Thymus vulgaris L.) .................................................................................... 59-60

Tratamiento estadístico (Análisis 1) ......................................................... 60-65

Tratamiento estadístico (Análisis 2) ....................................................... 65-72

Análisis estadístico ANOVA de dos factores .......................................... 72-76

Capítulo V: Conclusiones y Recomendaciones ........................................................ 77

Conclusiones ......................................................................................................... 77

Recomendaciones ................................................................................................. 78

Bibliografía ....................................................................................................... 79-81

IX

Índice de Ilustraciones

Ilustración 2.1 Period After Opening (PAO) ................................................................. 7

Ilustración 2.2 Planta de tomillo (Thymus vulgaris L.) ................................................ 13

Ilustración 2.3 Componentes principales del aceite esencial de (Thymus vulgaris L). 14

Ilustración 4.1 Espectro IR del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) ......... 40

X

Índice de Gráficas

Gráfica 4.1 Extensibilidad vs tratamientos ................................................................... 42

Gráfica 4.2 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y

T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisís1 ......................... 52


T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 1. ....................... 52

Gráfica 4.4 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los a los intervalos

T14 y T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 1 .............. 53


T14 y T28 vs mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno). Análisis 1 ....... 54


T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisis 2 ........................ 54


T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 2 ....................... 55


T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 2 ........................ 55


T28 vs mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno). Análisis 2. ................. 56

Gráfica 4.10 Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T14 vs

concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1. ............. 56


concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1 .............. 57


concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis. .............. 58


concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis2 ............. 59

Gráfica 4.14 Gráfica de caja: concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de

parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa .............................. 60

Gráfica 4.15 Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de

tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli. ............ 61


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus. .. 62


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans. .......... 64

Gráfica 4.18 Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial

de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans. ..... 64


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa

........................................................................................................................................ 66


de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas

aeruginosa ..................................................................................................................... 66

XI


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli. ............ 67


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus .. 69


de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus

........................................................................................................................................ 69


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans. .......... 71


de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans ..... 71


tomillo y mezcla de parabenos, y tiempo de análisis vs Reducción logarítmica de

Pseudomonas aeruginosa. .............................................................................................. 72



Escherichia coli.. ............................................................................................................ 73



Staphylococcus aureus ................................................................................................... 74



Candida albicans. ........................................................................................................... 75

XII

Índice de Tablas

Tabla 2.1 Conservantes utilizados habitualmente en productos farmacéuticos y

cosméticos ..................................................................................................................... 8-9

Tabla 2.2 Características de los microorganismos de prueba. Prueba de eficacia

antimicrobiana USP-36 ............................................................................................... 9-11

Tabla 2.3 Categorías de productos Farmacopeicos ...................................................... 11

Tabla 2.4 Criterios para microorganismos evaluados. Prueba de eficacia antimicrobiana

(USP-36). ................................................................................................................... 11-12

Tabla 2.5 Características botánicas del tomillo ............................................................ 13

Tabla 2.6 Concentración mínima inhibitoria para diferentes microorganismos de

acuerdo a estudios investigativos. .................................................................................. 15

Tabla 2.7 Componentes de las emulsiones. ................................................................... 16

Tabla 2.8 Parámetros de referencia del estudio de estabilidad. ..................................... 17

Tabla 3.1 Diseño experimental: Relación función y tipo de factor. .............................. 23

Tabla 3.2 Diseño factorial: dos factores y dos niveles ................................................. 23

Tabla 3.3 Tratamientos experimentales ........................................................................ 23

Tabla 3.4 Microorganismos de prueba ......................................................................... 24

Tabla 3.5 Concentración de aceite esencial de tomillo ................................................ 24

Tabla 3.6 Tratamientos experimentales ....................................................................... 24

Tabla 3.7 Condiciones del estudio de estabilidad ........................................................ 25

Tabla 3.8 Operacionalización de variables ................................................................... 25

Tabla 3.9 Análisis de calidad organoléptica y fisicoquímica para el aceite esencial de

tomillo (Thymus vulgaris L.) .......................................................................................... 25

Tabla 3.10 Condiciones de cultivo para la preparación de inóculos ............................ 32

Tabla 3.11 Test de eficacia del preservante ............................................................. 33-34

Tabla 3.12 Decodificación ANOVA de un solo factor ................................................ 36

Tabla 3.13 Decodificación ANOVA de dos factores ................................................... 37

Tabla 4.1 Análisis físico y organoléptico del aceite esencial Thymus vulgaris L) ....... 38

Tabla 4.2 Resultado de las reacciones de coloración del aceite esencial de (Thymus

vulgaris L.) ................................................................................................................ 38-39

Tabla 4.3 Cromatografía en capa fina del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris

L.) ................................................................................................................................... 39

Tabla 4.4 Formulación de la emulsión o/w (loción) ................................................. 40-41

Tabla 4.5 Ensayo fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de una emulsión o/w

(loción). .......................................................................................................................... 41

Tabla 4.6 Resultado de los ensayos fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de

una emulsión o/w (loción). ............................................................................................. 42

Tabla 4.7 Resultado de las características fisicoquímicas y organolépticas del producto

terminado. ....................................................................................................................... 43

Tabla 4.8 Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total de

microorganismos aerobios (RTMA) ............................................................................... 44

Tabla 4.9 Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) en el producto ........ 45

XIII

Tabla 4.10 Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total

de levaduras (RTL) ......................................................................................................... 45

Tabla 4.11 Recuento total de levaduras (RTL) en el producto ...................................... 45

Tabla 4.12 Descripción de las formulaciones desarrolladas. ........................................ 46

Tabla 4.13 Intervalos de comprobación de supervivencia de los microorganismos

ATCC, USP-36 ............................................................................................................... 46

Tabla 4.14 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al

intervalo de tiempo T0 y T14 ......................................................................................... 47


intervalo de tiempo T28.................................................................................................. 48


intervalo de tiempo T0 y T14 ......................................................................................... 49


intervalo de tiempo T28.................................................................................................. 50

Tabla 4.18 Reducción logarítmica. Análisis 1 y análisis 2 ............................................ 51

Tabla 4.19 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas

aeruginosa ..................................................................................................................... 60

Tabla 4.20 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli ....... 61

Tabla 4.21 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus

........................................................................................................................................ 62

Tabla 4.22 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans ..... 63

Tabla 4.23 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida albicans. .......... 63


aeruginosa. Análisis 2 .................................................................................................... 65

Tabla 4.25 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa

........................................................................................................................................ 65

Tabla 4.26 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli.

Análisis………………………………………………………………………………...67

Tabla 4.27 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus.

Análisis 2. ...................................................................................................................... 68

Tabla 4.28 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus .... 68


Tabla 4.30 Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida

albicans…………………………………………………………………………………………..70


aeruginosa ..................................................................................................................... 72

Tabla 4.32 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli ........ 73

Tabla 4.33 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus

aureus………………………………………………….…………………………….…74


XIV

Índice de Anexos

Anexo 1 Ficha técnica del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.). ................. 82

Anexo 2 Control de calidad en el producto final ........................................................... 83

Anexo 3 Control organoléptico y fisicoquímico del producto terminado (loción de tipo

emulsión o/w) de uso tópico. ..................................................................................... 84-85

Anexo 4 Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante en el

producto final (emulsión O/W de uso tópico). Método USP-36 ............................... 86-87

XV

TÍTULO:

Eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) como

conservante en una emulsión o/w de uso tópico.

AUTOR: Guerrero Rivadeneira Yéssica Patricia

TUTOR: Mgs Dayana Paulina Borja Espín

Resumen

Los cosméticos y productos farmacéuticos requieren conservantes antimicrobianos que

sean capaces de reducir la proliferación microbiana a niveles aceptables durante el

tiempo de vida útil del producto; es importante la investigación de conservantes de

origen natural, como sustitutos de los sintéticos, siempre y cuando tengan por lo menos

la misma eficacia antimicrobiana, y presenten un menor riesgo para la salud.

El presente trabajo de investigación, tuvo como objetivo determinar la eficacia

antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) como conservante

en una emulsión o/w de uso tópico.

La eficacia antimicrobiana del aceite esencial, se ensayó en la emulsión o/w a 3

concentraciones: 0,5%, 1,0% y 1,5%, usando como organismos de prueba Escherichia

coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans. Además se

comparó su eficacia frente a la combinación de metilparabeno (0,18%) y

propilparabeno (0,02%).

Los resultados demostraron que el aceite esencial de tomillo en las concentraciones

estudiadas, redujo el crecimiento de los microorganismos de prueba, cumpliendo con

los criterios de aceptación USP-36 para productos de categoría 2. Además mediante el

estudio de estabilidad microbiológica acelerada, se determinó que a una concentración

del 1,5%, se mantiene su comportamiento antimicrobiano durante el tiempo de estudio.

Mostrando una mejor eficacia antimicrobiana que la combinación de parabenos.

PALABRA CLAVES

CONSERVANTE, PARABENOS, ACEITE ESENCIAL, THYMUS VULGARIS L.,

ANTIMICROBIANO.

XVI

Abstract

The Cosmetics and pharmaceuticals products requires antimicrobial preservatives that

are capable of reducing microbial proliferation to acceptable levels over the shelf life of

the product. It is important to investigate preservatives of natural origin, as substitutes

for synthetics. As long as they have at least the same antimicrobial efficacy, and present

a lower health risk.

The present research work, it took as a target to determine the antimicrobial efficacy of

the essential oil of the thyme (Thymus vulgaris L.) as a preservative in an emulsion o/w

for a topical use.

The antimicrobial efficacy of the essential oil was tested in the o/w emulsion at 3

concentrations: 0.5%, 1.0% and 1.5%, using as test organisms such as Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida albicans. It has also

been proven effective against the combination of methylparaben (0.18%) and

propylparaben (0.02%).

The results showed that the essential oil of thyme in the concentrations studied, reduced

the growth of micro-organisms of trial,fulfilling with the criteria of USP-36 for

products of category 2. Also through the study of accelerated microbiological stability

,it was determined that at a concentration of 1.5%, it maintains its behavior

antimicrobial during the study period. Showing a better antimicrobial effectiveness that

the combination of parabens.

Keywords

PRESERVATIVE, PARABENS, ESSENTIAL OIL, THYMUS VULGARIS L.,

ANTIMICROBIAL.

1

INTRODUCCIÓN

La adición de conservantes en productos farmacéuticos y cosméticos es esencial

para evitar la alteración y degradación por microorganismos durante su

almacenamiento, además ayudan a proteger el producto contra la contaminación

accidental por parte del consumidor durante su uso, siendo los conservantes

sintéticos los más empleados. Sin embargo en los últimos años se ha incrementado

el interés investigativo de varias especies vegetales debido a su alto contenido de

agentes antimicrobianos tales como polifenoles es decir, flavonoides, taninos y

alcaloides presentes en los aceites esenciales.

Independientemente de las propiedades sensoriales de los aceites esenciales, su

actividad antimicrobiana y antifúngica genera un campo prometedor de aplicación

como conservantes en cosméticos y productos farmacéuticos. Llevándose a cabo

varios estudios en condiciones in vitro, que evidencia la actividad antimicrobiana de

los extractos y aceites esenciales de varias especies vegetales. (Olivares Cruz, 2013)

El propósito de este trabajo investigativo es determinar la eficacia antimicrobiana

del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) como conservante en una

emulsión o/w de uso tópico mediante la prueba de eficacia antimicrobiana

establecida en la USP 36- NF 30, en la cual se determinará mediante el

procedimiento de recuento en placa el número de unidades formadoras de colonia

(ufc) presentes en cada preparación de prueba, en los intervalos de tiempo

correspondiente (14 y 28 días), expresando los cambios en términos de reducciones

logarítmicas.

La investigación consta de 5 capítulos: el primer capítulo contiene el

planteamiento, formulación, justificación e importancia del problema, además de los

objetivos del estudio.

En el segundo capítulo se detalla la hipótesis nula y alternativa planteada para

dicha investigación, además de la base teórica necesaria para llevar a cabo el

estudio.

En el tercer capítulo se describe la metodología utilizada durante el desarrollo de

la presente investigación, para lo cual se da a conocer las técnicas y métodos usados;

además del diseño experimental a aplicarse. En el cuarto capítulo se presenta el

análisis y discusiones de los resultados. Finalmente en el capítulo cinco se describen

las conclusiones más relevantes de la investigación acorde a los objetivos

establecidos y las recomendaciones.

2

Capítulo I

El problema

Planteamiento del problema

La mayoría de productos farmacéuticos, cosméticos y fórmulas magistrales deben

estar debidamente conservados, principalmente aquellos que contienen agua en su

formulación ya que son más propensos a contaminarse con microorganismos, llevando

a un deterioro del producto, pérdida de rendimiento del mismo y posiblemente

irritación, infecciones u otras reacciones adversas que afecten la salud del consumidor.

Los conservantes se incorporan principalmente para reducir la contaminación

microbiana del producto, evitando su deterioro y asegurando que el producto siga

siendo adecuado y seguro durante su vida útil.

Dentro de los conservantes más utilizados a nivel farmacéutico y cosmético están los

conservantes sintéticos principalmente los parabenos, los cuales han generado dudas

importantes sobre su seguridad. A pesar de estar presentes en mínimas concentraciones

en los productos cosméticos y farmacéuticos, en comparación con los otros excipientes,

son fácilmente absorbidos por el cuerpo y pueden entrar en el torrente sanguíneo

después de ser aplicado tópicamente a la piel. (Díaz & Asencios, 2008). Tanto el

metilparabeno como el propilparabeno pueden ser irritantes para la piel, los ojos y las

membranas mucosas. (Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn, 2009).

Debido a estos posibles efectos irritantes, alérgicos y dañinos, que ponen en riesgo

el bienestar del consumidor, es importante el estudio de conservantes naturales como

alternativa para reemplazar los conservantes sintéticos. A partir de lo anterior, una de

las líneas de investigación se ha centrado en los aceites esenciales por sus propiedades

antimicrobianas y antimicóticas.

Estos aceites esenciales pueden provenir de especias y hierbas como el orégano

(género Origanum), romero (Rosmarinus officinalis), menta (Mentha piperita), tomillo

(Thymus vulgaris L.), etc, Existen múltiples reportes que demuestran la actividad

antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) frente a

Propionibacterium acnes, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus con una

concentración mínima inhibitoria de 600 ppm, 200ppm y 500ppm respectivamente,

alcanzando la más baja concentración mínima inhibitoria en relación a otras hierbas en

estudio. (Prestes, 2008) Otros estudios mencionan que el tomillo al ser una fuente de

moléculas timol y carvacrol que constituyen 40 a 50 % del aceite esencial, presenta

actividad antimicótica principalmente contra Cryptococcus neoformans y especies de

Candida, Aspergillus, Saprolegnia y Zygorhynchus. (Mesa Arango, 2004).

3

Estos estudios han podido mostrar la eficacia antibacteriana del aceite esencial del

tomillo (Thymus vulgaris L.), además es importante mencionar que en investigaciones

sobre la irritabilidad/ corrosión dérmica realizadas con el aceite esencial al 1% en

conejos, no mostró algún signo de toxicidad. (Carlos Andrés Coy Barrera, Gema

Eunice Acosta, 2013).

Formulación del problema

¿Es el aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) eficaz como conservante en

una emulsión o/w de uso tópico, demostrando su eficacia antimicrobiana?

Objetivos de la investigación.

Objetivo General.

Determinar la eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo (Thymus

vulgaris L.) como conservante en una emulsión o/w de uso tópico.

Objetivos Específicos.

Desarrollar una formulación (emulsión o/w) que presente las mejores

características organolépticas, químicas y físicas.

Realizar la prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del

preservante (Método USP-36) en una emulsión o/w de uso tópico, usando

como conservantes una mezcla de parabenos y aceite esencial de tomillo a

concentraciones del 0,5%, 1,0% y 1,5%.

Efectuar el estudio de estabilidad microbiológica acelerada en el producto

final (emulsión o/w usando como conservante aceite esencial de tomillo)

sometiéndola a condiciones de temperatura y humedad relativa de acuerdo a

la zona climática IVb.

Importancia y justificación de la investigación

En la actualidad la demanda de productos cosméticos se ha incrementado a nivel de

nuestro país y de todo el mundo, convirtiéndose en una necesidad estética, preventiva y

curativa; conllevando a una creciente preocupación en torno a las sustancias químicas

que están presentes en estos productos, ya que pueden estar relacionados con ciertos

problemas de salud, irritación, alergias, daños cutáneos e infecciones, dentro de estas

posibles sustancias agresivas están los conservantes antimicrobianos sintéticos que

pueden provocar aberraciones cromosómicas y estimular el crecimiento de células

tumorales. (Raymond C Rowe, Paul J Sheskey, Marian E Quinn, 2009).

Debido a esto la seguridad y calidad de los cosméticos y productos farmacéuticos,

son puntos de gran importancia para la salud de la población. La seguridad de dichos

productos está relacionada con su calidad microbiológica, que depende del

4

cumplimiento de las normas de buenas prácticas de manufactura y la eficacia de los

conservantes incorporados en su formulación. Si el sistema conservante no es el

apropiado se pueden producir alteraciones indeseadas en el producto, alterando sus

características organolépticas como aspecto, olor, e incluso se pueden inactivar drogas

activas dando lugar a un producto ineficaz e inseguro. (Eurofins, 2008)

Estas causas han llevado a evaluar la capacidad antimicrobiana de productos

naturales, de varias especies vegetales. Siendo Thymus vulgaris L. una de las plantas

más estudiada, con numerosas publicaciones que hacen referencia especialmente a su

aceite esencial (AE), debido a sus propiedades antimicrobianas, siendo activo frente a

bacterias Gram positivas y Gram negativas, fungistático y funguicida. En cuanto a su

toxicidad a nivel dérmico no se ha mostrado investigaciones que comprueben la

generación de reacciones alérgicas, irritaciones e hipersensibilidad.

5

Capítulo II

Marco teórico

Antecedentes de la investigación

Entre los conservantes más utilizados en una amplia gama de productos cosméticos,

preparaciones farmacéuticas están los parabenos otorgándole el segundo puesto dentro

de los ingredientes más comunes en las formulaciones cosméticas, siendo superados

únicamente por el agua, según la FDA (Food and Drug Administration).

A pesar de que los parabenos son utilizados como conservantes en múltiples

productos, se ha puesto en duda su “no toxicidad” debido a que investigaciones sobre

los posibles riesgos que puede generar los parabenos, como por ejemplo en el año 2004

oncólogos en la University of Reading, en Edimburgo llevaron a cabo estudios con

tejidos cancerígenos en el cual el 90% de las muestras analizadas que venían de

biopsias realizadas a mujeres con cáncer de mama, se habían encontrado rastros de

parabenos, sin embargo al realizarse más estudios sobre lo mismo, éstos no arrojaron

ninguna conclusión que estableciera de qué manera los parabenos afectan en el cáncer

de mama, pero algunos de los científicos afirman que los parabenos simulan la acción

de los estrógenos (hormona femenina que sí puede llegar a producir cáncer de mama ) y

eso podría ser lo que contribuye a la formación de tumores cancerígenos. También se le

atribuye reacciones alérgicas, sensibilización, generación del envejecimiento prematuro

según lo informado por live-naturally.co.uk, investigadores de la Kyoto Prefectural

University of Medicine en Japón, que encontraron que el metilparabeno aumenta la

sensibilidad a los daños causados por el sol, es decir, cuando se expone a los rayos

ultravioleta, las células de la piel mueren a un ritmo mucho más rápido de lo normal.

(Nungaray, 2014). Es importante establecer que existe mucha controversia sobre sus

posibles riesgos, ya que por lo general se lo ha caracterizado por ser un conservante “no

tóxico” , debido a que se lo utiliza a una baja concentración, generalmente se formulan

los parabenos a una concentración de (0,1-0,3%).(Blanca Díaz Ley, 2006 ).

Todos los problemas vinculados a estas sustancias han permitido llevar a cabo una

serie de investigaciones que evalúen la actividad antimicrobiana de especies vegetales

como por ejemplo Thymus vulgaris L. conocido comúnmente como tomillo, que

pueda ser utilizado como conservante antimicrobiano natural. En un estudio realizado

en el 2015 sobre el aceite esencial de Thymus vulgaris L. (tomillo) combinado con

EDTA contra Candida albicans, en una crema contenida con el AE suplementado con

derivados terpénicos naturales, determinaron que dicho aceite esencial presentó

actividad inhibitoria sobre Candida albicans a una concentración de 100 mg/mL, con

halos de inhibición de 30,33 ± 0,58 mm, mientras que la adición de EDTA produjo

halos de 35,33 ± 0,58 mm, incrementando su actividad. La

6

concentración mínima inhibitoria para el AE y AE + EDTA fue de 8 mg/mL y 0,5

mg/mL. (Juan Rojas Armas, 2015).

Actividad antibacteriana y determinación de la composición química de los aceites

esenciales de romero (Rosmarinus officinalis), tomillo (Thymus vulgaris L.) y cúrcuma

(Curcuma longa) de Colombia, Dr. C. Carlos Andrés Coy Barrera, MSc. Gema Eunice

Acosta, 2013. En este estudio se determinó que en el aceite de tomillo, de los 30

componentes encontrados, 43 % corresponden a monoterpenos no oxigenados, 40 % a

monoterpenos oxigenados y porcentajes más pequeños a compuestos de tipo

sesquiterpeno, a los cuales se le atribuye la capacidad antimicrobiana que presenta. En

la evaluación de la actividad antibacteriana frente a la cepa de S. aureus, se pueden

observar porcentajes de inhibición de 70 %, con respecto a E. faecalis, otra bacteria

grampositivas 20 %, sin embargo no presentan porcentajes de inhibición

representativos frente a las cepas gramnegativas E. coli y S. typhi.

Actividad de extractos de orégano y tomillo frente a microorganismos asociados con

otitis externa, Luciana de Souza Prestes, Ricardo Frascolla, Rosema Santin, Marco

Aurelio Ziemann dos Santos; Renata Costa Schram, Maria Regina Alves Rodrigues,

Luiz Filipe Damé Schuch, Mario Carlos Araújo Meireles, 2008. Se evaluaron la

actividad antimicrobiana in vitro de 3 tipos de extractos de las plantas Origanum

vulgare L. (orégano) y Thymus vulgaris L. (tomillo), un aceite, una tintura y una

decocción, frente a microorganismos asociados con esa enfermedad, teniendo como

resultado que para el aceite de tomillo la CIM fue > 2,0 % para P. aeruginosa y para

Staphylococcus aureus 0,25 %.

Fundamentación teórica

Presencia y análisis de microorganismos en productos farmacéuticos y

cosméticos.

La contaminación microbiana de los productos farmacéuticos y cosméticos ha sido

extensamente estudiada. Existen formas farmacéuticas que deben ser estériles y otras

no obligatoriamente estériles que se usan por vía oral, tópica, nasal, vaginal, etc,

fabricadas con ingredientes que pueden ser substratos adecuados para los

microorganismos. Las preparaciones farmacéuticas y los cosméticos pueden

contaminarse con hongos filamentosos, levaduras y bacterias. Las materias primas

naturales, el equipamiento, el agua, los operadores, el aire, y el material de empaque

pueden ser fuentes de contaminación de dichos productos. La presencia de

microorganismos puede alterar la calidad, eficacia y seguridad del producto.

La U.S. Food and Drug Administration (FDA) reconoce tres categorías de

microorganismos: patógenos, oportunistas y objetables:

- Patógenos son aquellos microorganismos o toxinas responsables de enfermar

o infectar al hombre (Salmonella spp, Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Clostridium spp, etc).

7

- Se consideran oportunistas a aquellos microorganismos que producen

enfermedad en pacientes inmunocomprometidos y;

- son objetables aquellos microorganismos que pueden inactivar drogas activas

y/o deteriorar el producto provocando una posible falta de eficacia de los

productos farmacéuticos y seguridad en cosméticos. (Salk , 2016)

El producto debe llegar al consumidor con un contenido bajo o nulo de

microorganismos; para conseguir este objetivo se utilizan tres procedimientos: control

microbiológico de las materias primas (con especial atención al agua), buena higiene en

la fabricación y envasado, y utilización de conservantes. Los tres son necesarios y

complementarios. (Elsevier, 2008).

La contaminación microbiana en los productos cosméticos es de gran importancia

para la industria ya que además de generar el deterioro del producto y pérdidas

económicas puede convertirse en un producto peligroso para el consumidor. Para lo

cual la séptima modificación de la Directiva cosmética efectiva en marzo de 2005,

aprobó e incorporó un nuevo concepto basado en los criterios microbiológicos: el

PAO (Period After Opening).

El PAO es el periodo después de que el producto ha sido abierto y utilizado por

primera vez, el cual especifica el tiempo en que el producto cosmético se puede utilizar

sin ningún deterioro vinculado a la contaminación microbiana que pueda perjudicar la

salud del consumidor. El requisito PAO no es relevante cuando no hay riesgo de

deterioro microbiano (es decir, en el caso de recipientes a presión reducida o productos

de un solo uso). (Orus, 2005)

El PAO aparece tanto en el envase primario como secundario del producto,

indicando el tiempo de vida útil por un número seguido de la letra "M" que significa

meses, que puede aparecer en o junto al símbolo del recipiente abierto. (Europe)

Ilustración 2.1 Period after Opening (PAO)

Por: Cosmetics Europe

8

Calidad microbiológica en medicamentos.

Es importante realizar en los productos farmacéuticos (medicamentos) un

seguimiento del contenido de conservante antimicrobiano, por lo menos al principio y

al final del período de vida útil estipulado para el medicamento. Conjuntamente con

esta evaluación se puede efectuar la prueba de desafío microbiológico (ensayo de la

USP sobre la eficacia antimicrobiana de los agentes de conservación), la que es

aplicable a recipientes no abiertos. (Ministerio de la Protección Social, 2009)

Conservantes.

Los conservantes antimicrobianos son sustancias añadidas a los productos

farmacéuticos y cosméticos, para protegerlos del desarrollo microbiano o de

microorganismos que se introducen sin ser advertidos durante el proceso de fabricación

o después de este, ya que dichos productos son una fuente excelente de nutrientes para

bacterias, hongos y levaduras. Sin embargo, es todo un reto, encontrar el tipo de

conservante o sistema conservante adecuado a incorporar en cada fórmula, que

satisfaga todo criterio de conservación y seguridad toxicológica.

Se debe considerar que la concentración del conservante que se indique como eficaz

en el producto final debe ser inferior al nivel que pueda resultar toxico para el

consumidor, por lo que la concentración del conservante puede mantenerse al mínimo

si los ingredientes activos de la formulación poseen eficacia antimicrobiana intrínseca.

Hay que considerar que los conservantes antimicrobianos no deben emplearse en lugar

de las buenas prácticas de manufactura o simplemente para disminuir la población

microbiana. (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia

antimicrobiana, 2013)

Tipos de conservantes.

En la tabla 2.1 pueden observarse los agentes antimicrobianos, utilizados como

conservantes en las formulaciones farmacéuticas y cosméticas, siendo los parabenos los

más utilizados.

Tabla 2.1 Conservantes utilizados habitualmente en productos farmacéuticos y

cosméticos.

9

Por: (Aulton M. , 2004)

Selección del conservante.

El conservante ideal debe ser compatible con los componentes de la formulación y

envasado, no producir ninguna reacción de sensibilización, ser irritante o toxico;

además debe sea resistente a condiciones extremas de pH y temperatura. Al ser la fase

acuosa la más susceptible de contaminación microbiana, el conservante debe ser capaz

de alcanzar una concentración protectora en dicha fase, asimismo no debe alterar las

características organolépticos del producto al cual se ha incorporado.

Análisis de eficacia de los conservantes.

Microorganismos de prueba.

Los microorganismos contaminantes más comunes investigados en productos

farmacéuticos y cosméticos son las bacterias Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa y Staphylococcus aureus (utilizadas para analizar todo los tipos de

productos en el análisis de la USP), junto a los hongos Candida albicans y Aspergillus

niger; que son microorganismos patógenos.

Tabla 2.2 Características de los microorganismos de prueba. Prueba de eficacia

antimicrobiana USP-36

MICROORGANISMO CARACTERÍSTICAS

Pseudomonas aeruginosa -Bacilo gram negativo

-No fermentador

-Oxidasa positivo

-Fuente de contaminación: Sistemas de purificación de

agua donde forman biofilms, en cañerías y otras

10

superficies inertes como acero inoxidable de equipos y

mesadas.

-Afecta mayoritariamente a individuos

inmunocomprometidos produciendo infecciones

externas y leves a nivel de oído o folículo pilosos o bien

infecciones internas o graves, afectando los pulmones,

torrente sanguíneo, o válvulas cardiacas. (Larry M.

Bush)

Escherichia coli - Bacilo gram negativo.

-Fermentador de glucosa

-Bacteria ubicua de una gran variedad de ecosistemas

incluida el tracto gastrointestinal del ser humano y de los

animales de sangre caliente.

-Se asocian con muchos tipos de infecciones como

abscesos, neumonía, meningitis, septicemia e

infecciones intestinales, urinarias y heridas. (Vila

Estapé, 2011)

-Su presencia en un producto farmacéutico implicaría

presencia de contaminación fecal en especial de

productos de consumo oral y en materias primas de

origen natural.

Staphylococcus aureus -Coco gram positivo en forma de racimo.

-Catalasa y coagulasa positivo

-Microorganismo ubicuo que puede colonizar la

nasofaringe, la piel y las mucosas de hombres y

animales, y puede establecerse en un medio ambiente

propicio.

-Produce infecciones agudas, piogénicas, osteomielitis,

neumonía, endocarditis aguda, síndrome del shock

tóxico, síndrome de piel escaldada entre otros. (Seija)

-Presencia de este microrganismo en una materia prima

o producto farmacéutico o cosmético indica que la

fuente de contaminación puede ser de origen humano, es

decir de los operadores.

Candida albicans -Hongo dimórfico, es decir que se desarrolla de forma

distinta en función de la temperatura, como levadura,

normalmente a 37ºC en el huésped, y como hongo de

aspecto filamentoso, a 25ºC en la naturaleza.

-Pertenece al filo Ascomycota y se reproduce de forma

asexual por gemación.

-Los reservorios más importantes son el tracto digestivo

y respiratorio, mucosa genital y superficies húmedas.

11

-Puede producir infecciones superficiales que afectan a

piel, uñas y mucosas. (Berkhout, 2002)

Elaborado por: la autora

Prueba de eficacia antimicrobiana.

El principio fundamental del análisis de los conservantes consiste en inocular

envases separados del producto con concentraciones conocida (1x105 y 1x10

6 ufc/mL

de producto) de los microorganismos de prueba, a continuación tomar muestras de cada

envase en intervalos de tiempo especificados en la tabla 2.4 de acuerdo a la categoría

del producto (ver tabla 2.3) y determinar la proporción del inóculo que sobrevive,

mediante el recuento en placa. Empleando las concentraciones calculadas de ufc/mL

presentes al inicio de la prueba, se calcula el cambio en valores en log10 de la

concentración de ufc/ml en los intervalos de prueba correspondientes y se expresan los

cambios en términos de reducción logarítmica, los cuales son comparados con los

criterios para microorganismos evaluados especificados en la tabla 2.4. (USP-36,

Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana, 2013)

Tabla 2.3 Categorías de productos Farmacopeicos

Categoría Descripción del Producto

1 Inyectables, otros parenterales incluyendo emulsiones,

productos óticos, productos nasales estériles y productos

oftálmicos preparados con bases o vehículos acuosos.

2 Productos empleados de manera tópica preparados con bases o

vehículos acuosos, productos nasales no estériles y emulsiones,

incluyendo aquellos que se aplican a membranas mucosas.

3 Productos orales a excepción de antiácidos, preparados con

bases o vehículos acuosos.

4 Antiácidos preparados con una base acuosa.

Por: (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana, 2013)

Tabla 2.4 Criterios para microorganismos evaluados. Prueba de eficacia antimicrobiana

(USP)

En productos de la categoría 1

Bacterias: A los 7 días, una reducción logarítmica de no

menos de 1,0 desde el recuento calculado en

el inicio; a los 14 días, una reducción

logarítmica de no menos de 3,0 del recuento

inicial; y a los 28 días ningún incremento del

recuentro de los 14 días.

12

Levaduras y Hongos

filamentosos:

Ningún incremento a los 7,14 y 28 días

respecto del recuento inicial.




el inicio; y a los 28 días ningún incremento

del recuentro de los 14 días.

Levaduras y Hongos

filamentosos:

Ningún incremento a los 14 y 28 días respecto

del recuento inicial.




el inicio; y a los 28 días ningún incremento

del recuentro de los 14 días.

Levaduras y Hongos

filamentosos:




Levaduras y Hongos

filamentosos:



Por: (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia antimicrobiana, 2013)

Aceites esenciales.

Características de los aceites esenciales.

Los aceites esenciales son productos de intenso olor que se extraen de plantas

aromáticas, son solubles en alcoholes y disolventes orgánicos (éter, cloroformo) y muy

poco solubles en agua, pero son arrastrables por el vapor de agua. Son importantes en la

industria alimenticia, farmacéutica y cosmética. (Martínez , 2003)

Muchos de ellos poseen propiedades terapéuticas como antimicrobianas, en donde la

inactivación microbiana de los aceites esenciales es causada por daño en la pared

celular de los microorganismos, desórdenes en la membrana citoplasmática,

agotamiento de la fuerzas motrices de los protones, coagulación de los contenidos

celulares o alteración en el flujo de electrones, en el flujo del contenido celular y en el

transporte activo.

Factores que afectan la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales.

El espectro de actividad antimicrobiana de los aceites esenciales depende en gran

medida de los microorganismos a inhibir, ya que los microorganismos difieren en su

13

resistencia. Además, cuando el aceite es incluido en un alimento, cosmético,

medicamento, este puede interactuar aumentando o disminuyendo la capacidad

antimicrobiana y la eficacia del aceite esencial. Algunos factores intrínsecos y

extrínsecos están asociados con la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales.

Estos incluyen temperatura, pH, potencial de óxido-reducción y actividad de agua.

(Portocarrero, 2009).

Especie vegetal.

Descripción botánica del tomillo.

Clasificación científica:

REINO: Plantae

DIVISIÓN: Magnoliophyta

CLASE: Magnoliopsida

ORDEN: Lamiales

FAMILIA: Lamiaceae

GÉNERO: Thymus

Tabla 2.5 Características botánicas del tomillo

ESTRUCTURA CARACTERISTICA

Altura 15 a 30 cm

Tallo Ascendentes, cuadrangulares, de color grisáceo o pardo

purpúreo

Hojas Opuestas, lineal lanceoladas, bordes arrollados,

brevemente pecioladas o sentadas, de color verde grisáceo.

Flores Diminutas, agrupadas en racimos terminales muy densas,

rosadas o blanquecinas.

Por: (Gimeno Gasca, 2001)

Composición química.

La planta de tomillo (Thymus vulgaris L.) está constituido entre el 0,8 al 2,5 % de

aceite esencial; este rendimiento porcentual varía de acuerdo al método de extracción,

época de recolección de la planta, sección utilizada, entre otros factores. El aceite

esencial está formado por el 40% de timol, 15-50% de p-cimeno, 11-15% de alcanfor,

2.5-14.6% de carvacrol, 45% de linalol, 3% de 1,8-cineol, 1-5% de γ-terpineno.

Ilustración 2.2 Planta de tomillo (Thymus

vulgaris L.)

Por: Alonso, 2004

14

Ilustración 2.3 Componentes principales del aceite esencial de Thymus vulgaris L.

Por: Rojas, 2014, Antibacterial activity of essential oils against pectobacterium

carotovorum subsp. carotovorum

También contiene borneol, acetato de bornilo, acetato de linalino, geraniol, α y β-

pineno, limoneno; flavonoides (timonina, cirsilineol, narnigenina, erodictol, etc);

aminoácidos (isoleucina, cistina, valina, glicina), vitaminas (B1, B2, B3 y vitamina C)

y minerales (calcio, potasio, hierro, magnesio, fósforo, sodio, zinc, selenio). (NaturVall,

2015)

Acción farmacológica.

La acción farmacológica que muestra esta planta es atribuida a su composición

química, siendo utilizada por su actividad antiespasmódica y antitusiva, otorgado por la

presencia de flavonoides y compuestos fenólicos (carvacrol y timolol) las cuales están

presenten en mayor cantidad en el aceite esencial. También presenta actividad

anticatarral, expectorante, antimicrobiana, estimulante del apetito, antiparasitaria,

antihelmíntica, antiséptica, cicatrizante, antioxidante, carminativas, estimulante de

algunas funciones cerebrales, depurativo, entre otros.

Actividad antimicrobiana.

El aceite esencial de tomillo debido a sus componentes fenólicos, timol y carvacrol,

tienen actividad antibacteriana frente a bacterias gram positivas y gram negativas,

actuando sobre la membrana bacteriana; antifúngica frente a Candida albicans,

Aspergillus spp, Cripotococcus neoformans, entre otros y antivírica.

El agente activo del tomillo (Thymus vulgaris L.) es el timol, extraído por la

industria farmacéutica por su acción antimicrobiana y antiviral. Es utilizada en

formulación de diversos enjuagues bucales, pastas de dientes, etc. Así mismo una

disolución de 5% de timol en etanol se utiliza para la desinfección dermal y contra

infecciones con hongos (ALONSO, 2004)

De acuerdo a información bibliográfica el aceite esencial de tomillo está indicado

tópicamente como antibacteriano y antifúngico en lociones, cremas y ungüentos en

concentración de 0.1-1.0%. Además en diversas investigaciones realizadas sobre la

15

actividad antimicrobiana del aceite esencial del tomillo, se han obtenido los siguientes

resultados:

Tabla 2.6 Concentración mínima inhibitoria para diferentes microorganismos de

acuerdo a estudios investigativos.

MICROORGANISMO CMI Cita del articulo

Colletotrichum acutatum duna 350 ppm (Alzate, 2008)

Botrytis cinerea 500 ppm (92,2% de inhibición)

Candida albicans 8 mg/mL (8000ppm)

Salmonella spp 1.56% (analizado como como

bioconservador en carne de

pollo)

(Solís Campoverde, 211)

Hongos 1mg/mL (timol para el control

antifúngico sobre películas de

pintura)

( Bogdan , 2015)

Shigella spp 0,5 %. (Aceite esencial para

descontaminación de lechuga).

(Bagamboula, 2004)

Pseudomonas aeruginosa y

Staphylococcus aureus.

5 % y 1,25% respectivamente

(extracto frente a

microorganismos asociados

con otitis externa)

(Souza Prestes, 2008)


Formulación.

Emulsiones.

Es un sistema constituido por dos fases líquidas inmiscibles en forma de gotitas

pequeñas, una fase dispersante, continua o externa y una fase dispersa o interna. La

mayoría de las emulsiones incluye gotitas de 0,1-100 µm de diámetro. Existen dos

tipos fundamentales: de aceite en agua (o/w) y de agua en aceite (w/o), dependiendo de

que la fase continua sea acuosa u oleosa. Además se ha desarrollado emulsiones

múltiples de tipo agua en aceite en agua (w/o/w) donde la fase acuosa se encuentra

entre dos fases oleosas y de tipo aceite en agua en aceite (o/w/o) donde la fase interna y

externa están separadas por una fase oleosa, y tienen interés como sistemas de

administración de fármacos de acción retardada.

Las emulsiones se utilizan principalmente para la aplicación externa. Las emulsiones

semisólidas se denominan cremas y los preparados más fluidos se llaman lociones o, si

están destinadas al masaje cutáneo, linimentos. Existen en ambas modalidades, o/w y

w/o. (Aulton , 2004)

16

Componentes de las emulsiones.

Al ser las emulsiones sistemas inestables, es importante tener un buen conocimiento

de los ingredientes básicos que componen la emulsión, desarrollando formulaciones

estables durante el tiempo de vida útil del producto. A continuación se describe en la

tabla 2.7.

Tabla 2.7 Componentes de las emulsiones.

COMPONENTE CARACTERÍSTICAS

Fase oleosa Constituido por ingredientes no polares.

Generalmente no es compatible con el agua.

Incluye materias primas grasas, aceites y ceras, y todos sus

derivados, incluyendo el alcohol y los ácidos grasos, los

ésteres, los hidrocarburos, los glicéridos y las siliconas

Fase acuosa Parte de la emulsión constituida por el agua y por los demás

materiales hidrofílicos del sistema.

Formada por ingredientes humectantes, como la glicerina o

el propilenglicol; polímeros hidrosolubles, preservantes,

colorantes, electrólitos o ingredientes activos, como extractos

botánicos o proteínas hidrolizadas.

Interface Son los tensioactivos con propiedades emulsionantes,

fundamentales para la formulación ya que aumentan la

estabilidad de las emulsiones, reduce la tensión interfacial entre

la fase acuosa y oleosa y permite obtener una dispersión

homogénea.

Los tensioactivos tienen estructura anfifílica, es decir una

parte polar, soluble en agua (hidrofílica), y una parte no polar,

insoluble en agua (hidrofóbica).

Por: (Santos , 2010)

Contaminación microbiológica de las emulsiones.

La contaminación de las emulsiones por microorganismos puede alterar las

propiedades organolépticas y fisicoquímicas del producto, provocando problemas como

la modificación del color, olor y aspecto, producción de gas, hidrólisis de las grasas y

aceites, alteración del pH en la fase acuosa y separación de fases. A pesar que en

algunos casos no exista signos visibles de contaminación, la emulsión puede contener

bacterias oportunistas, objetables y, si entre ellas se incluyen patógenos, puede

constituir un grave riesgo para la salud. La mayoría de los hongos y muchas bacterias

se incrementan fácilmente a temperatura ambiente en la fase acuosa de una emulsión y

17

también a un intervalo de pH amplio. Algunas especies de bacterias del género

Pseudomonas pueden utilizar como un medio nutritivo algunos componentes de la

formulación como polisorbatos e hidrocarburos alifáticos.

Las emulsiones de aceite en agua (o/w) tienden a ser más susceptibles al deterioro

microbiano que las emulsiones agua en aceite (w/o), ya que la fase externa o continua

es oleosa, actuando como barrera ante la dispersión de los microorganismos a través del

producto; es decir que entre menos agua esté presente en la emulsión, menor será el

crecimiento de microorganismos.

Por tanto, es importante incluir sustancias con actividad antimicrobiana para

prevenir el crecimiento de cualquier microorganismo que pudiera contaminar el

producto y genere un riesgo para la salud. (Aulton , 2004)

Estudios de estabilidad.

El propósito del estudio de estabilidad de los cosméticos según la Asociación

Europea de Cosméticos (COLIPA) es asegurar que un producto nuevo o modificado

cumpla con los estándares físicos, químicos y microbiológicos de calidad, dichos

parámetros también son considerados en el caso de productos farmacéuticos.

Ya sea en tiempo real o bajo condiciones aceleradas, las pruebas en el producto

cosmético y farmacéutico deben realizarse con el fin de asegurar:

Estabilidad y la integridad física de los productos tanto cosméticos como

farmacéuticos en condiciones apropiadas de almacenamiento, transporte y uso.

Estabilidad química.

Estabilidad microbiológica.

Compatibilidad entre el contenido y tipo de envase. (CTFA, 2004)

Tabla 2.8 Parámetros de referencia del estudio de estabilidad.

Tipo de estudio Temperatura (°C) Humedad relativa (%)

Natural (largo plazo) 25±2 60±5

Acelerado 40±2 75±5

Por: Farmacopea Argentina 7ma

edición

Estabilidad acelerada y parámetros de evaluación.

Los ensayos acelerados, son reconocidos como una forma de predecir

aproximadamente el tiempo de validez de un producto. Generalmente, las pruebas se

realizan a una temperatura de 30°C, 40°C o 45°C, durante 1, 2 y 3 meses; acelerando la

velocidad de envejecimiento del producto, y lograr observar cualquier alteración a

18

nivel organoléptico, físico, químico, toxicológico y microbiológico en tiempos

reducido. (CTFA, 2004)

De manera general, los parámetros que deben ser evaluados son los parámetros

organolépticos como el aspecto, color, sabor y olor, cuando sean aplicables; parámetros

físico-químicos como el pH, viscosidad, densidad y en algunos casos evaluación de los

activos o excipientes de la formulación; y parámetros microbiológicos que consta en el

conteo microbiano y prueba de desafío del sistema conservante, en la cual deben ser

conservadas las características microbiológicas, conforme los requisitos especificados.

El cumplimiento de las Buenas Prácticas de Fabricación y los sistemas conservantes

utilizados en la formulación pueden garantizar estas características.

Fundamento Legal

Constitución de la República del Ecuador.

TITULO VII: REGIMEN DEL BUEN VIVIR

Art. 363.- El Estado será responsable de: Garantizar la disponibilidad y acceso a

medicamentos de calidad, seguros y eficaces, regular su comercialización y promover

la producción nacional y la utilización de medicamentos genéricos que respondan a las

necesidades epidemiológicas de la población.

Ley Orgánica de Salud.

Capítulo III: DE LOS MEDICAMENTOS

Art. 154.- El Estado garantizará el acceso y disponibilidad de medicamentos de

calidad y su uso racional, priorizando los intereses de la salud pública sobre los

económicos y comerciales.

Buenas prácticas de manufactura para la industria de productos cosméticos.

Deben adoptarse todas las medidas que aseguren la aplicación y cumplimiento de los

procedimientos e instructivos de cada etapa del proceso de fabricación. En todo

momento deben poder identificarse los equipos, instrumentos, materias primas, material

de envase-empaque, productos de limpieza, documentos, componentes o sustancias

consumidas durante el proceso.

Buenas prácticas de manufactura.

PRIMERA PARTE. Administración de la calidad en la industria farmacéutica

Garantía de calidad.- Es el conjunto de medidas adoptadas con el fin de asegurar que

los productos farmacéuticos sean de la calidad necesaria para el uso al que están

destinados. Por tanto, la garantía de la calidad incorpora las BPM y otros factores,

incluyendo aquellos que van más allá del alcance de esta guía, tales como el diseño y la

elaboración del producto.

19

Secretaría General de la Comunidad Andina (CAN).

RESOLUCIÓN N° 1482

Que mediante Resolución 1418, de fecha 9 de junio de 2011, se dispuso modificar el

artículo 4 y el Anexo I de la Resolución 797 “Reglamento de la Decisión 516 sobre

Control y Vigilancia Sanitaria de Productos Cosméticos”, a fin de incluir parámetros

que especifiquen los límites de contenido microbiológico, de acuerdo con los riesgos de

los productos cosméticos.

Cosmetics - European Commission (Cosing).

ICCR Working Group on Cosmetic Product Preservation: Los consumidores de

productos cosméticos y de cuidado personal están protegidos por fuertes requisitos de

seguridad establecidos en la normativa de cosméticos. Al mismo tiempo, los fabricantes

deben utilizar los mejores conocimientos científicos y de investigación últimos datos

disponibles para demostrar la seguridad de un producto cosmético antes de que se

introduzca en el mercado. Algunos productos cosméticos merecen atención especial por

parte de los reguladores debido a su complejidad científica o de mayor riesgo potencial

para la salud del consumidor.

USP-36

Pruebas microbiológicas.

Estipula pruebas para demostrar la actividad de protección antimicrobiana. Los

conservantes antimicrobianos deben estar indicados en la etiqueta. Las pruebas y

criterios de eficacia se aplican al producto en su envase original cerrado, en el que fue

distribuido por el fabricante.

Hipótesis

Ho: El aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) tiene eficacia como

conservante antimicrobiana en una emulsión o/w de uso tópico.

Hi: El aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) no tiene eficacia como

conservante antimicrobiana en una emulsión o/w de uso tópico.

Sistema de variables

Independientes.

Segunda etapa (elaboración de la emulsión o/w)

Agente surfactante (Polisorbato 20)

Agente emulsificante (Span 60)

20

Cuarta etapa (evaluación de la eficacia conservante)

Concentración de aceite esencial de tomillo.

Tiempo

Dependientes.

Segunda etapa (elaboración de la emulsión o/w)

Cumple/ no cumple estabilidad de la emulsión

Cuarta etapa (evaluación de la eficacia conservante)

Contaje de microorganismos de prueba (ATCC)

21

Capítulo III

Metodología

Diseño de la investigación

El presente estudio corresponde a una investigación de tipo bibliográfica,

experimental y explicativa ya que se ha manipulado diferentes tipos de variables

como son dependientes e independientes. Primero con los conocimientos teóricos

para su desarrollo, seguido con la parte experimental basado en la determinación de

la eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo como conservante

microbiológico, para la cual se parte del desarrollo y elaboración de una emulsión

o/w seguido del análisis de eficacia antimicrobiana del preservante (Método USP

variando el porcentaje de aceite esencial de tomillo en dicha formulación y su

estudio de estabilidad microbiológica acelerado.

Población y muestra

No aplica para el presente estudio debido a que no se va a trabajar con un conjunto

de personas, registros médicos, objetos u otros elementos; por lo cual tampoco se

manejará una muestra en la que se lleve a cabo la investigación.

Métodos y materiales

Materiales.

- Vasos de precipitación

- Varillas de agitación

- Envase primario

- Medios de cultivo (TSA y SAB)

- Cajas monopetri

- Micropipetas THERMO SCIENTIFIC

- Tubos de ensayo con tapa rosca

- Pipetas graduadas

- Erlenmeyer

- Papel empaque

Materia prima.

- Aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.)

- Metilparabeno

- Propilparabeno

- Agua destilada.

22

- Lanolina hidrosoluble

- Vaselina líquida

- Alcohol cetílico

- Trietanolamina

- Acido esteárico

- Span 60

- Polisorbato 20

- Cloruro de sodio

Microorganismos de prueba.

- Escherichia coli ATCC 25922

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

- Staphylococcus aureus ATCC 25293

- Candida albicans (CÓDIGO RTB 012)

Equipos.

- Vortex CLASSIC - VELP Scientifica

- Incubadora de bacterias INDUCELL-MMM GROUP

- Incubadora de hongos INDUCELL-MMM GROUP

- Balanza semianalítica METTLER TOLEDO

- Potenciómetro METTLER TOLEDO- Seven Multi

- Centrífuga

- Cámara climática HERAEUS

- Espectrofotómetro

- Autoclave DAIHAN SCIENTIFIC- WISD

- Refractómetro de ABBÉ

Diseño experimental

La presente investigación consta de una etapa bibliográfica y cinco etapas

experimentales.

Primera etapa: caracterización del aceite esencial del tomillo.

Para la caracterización del aceite esencial del tomillo se realizará las siguientes

determinaciones:

Control organoléptico

Control físico-químico

Segunda etapa: elaboración y selección de la mejor formulación de una emulsión

o/w. Inicialmente se realizará un ensayo preliminar para establecer la concentración

de cada una de las materias primas seleccionadas, que se mantendrán fijas,

observando las mejores características en cuanto a aspecto y a estabilidad de la

emulsión.

23

Tabla 3.1 Diseño experimental: Relación función y tipo de factor.

MATERIA PRIMA FUNCIÓN TIPO DE FACTOR

Vaselina líquida Emoliente Fijo

Lanolina hidrosoluble Agente emulsificante Fijo

Alcohol cetílico Emoliente Fijo

Acido esteárico Agente solubilizante Fijo

Monoestearato de

sorbitano (Span 60)

Agente emulsificante Variable

(Monolaureato de

sorbitano polioxietileno)

Polisorbato 20

Surfactante no iónico Variable

Trietanolamina Agente emulsificante Fijo

Agua Solvente Fijo

Elaborado por: La autora

Posteriormente se elaborará la emulsión o/w variando la concentración de

polisorbato 20 (surfactante) y span 60 (emulsificante), considerando cada uno de los

tratamientos establecidos en la tabla 3.2, a partir del cual se seleccionará la

formulación más idónea mediante el ensayo de estabilidad de la emulsión.

Tabla 3.2 Diseño factorial: dos factores y dos niveles

VARIABLES NIVEL

1 Surfactante (Polisorbato 20)

P1 2%

P2 4%

2 Emulsificante (Span 60)

S1 2%

S2 4%


Tabla 3.3 Tratamientos experimentales

S1 S2

P1 P1S1 P1S2

P2 P2S1 P2S2


Tercera etapa: elaboración de la formulación selecciona, incorporando el

conservante (aceite esencial de tomillo) a las diferentes concentraciones a utilizarse

(0,5%, 1,0%; 1,5%) y la mezcla de parabenos.

Cuarta etapa: realización de la prueba de eficacia antimicrobiana (método USP-36)

en el producto final utilizando como conservante antimicrobiano una mezcla de

parabenos y aceite esencial de tomillo. Para la cual se determinará mediante el

procedimiento de recuento en placa (extensión) el número de unidades formadoras

24

de colonia (ufc) presentes en cada preparación de prueba, en los intervalos de tiempo

correspondiente (14 y 28 días), expresando los cambios en términos de reducciones

logarítmicas.

Tabla 3.4 Microorganismos de prueba

MICROORGANISMO DE PRUEBA

E Escherichia coli

P Pseudomonas aeruginosa

S Staphylococcus aureus

C Candida albicans


Tabla 3.5 Concentración de aceite esencial de tomillo

VARIABLE Aceite esencial de tomillo

(Thymus vulgaris L.)

C1 0,5%

C2 1,0%

C3 1,5%


Tabla 3.6 Tratamientos experimentales

C1 C2 C3

E EC1 EC2 EC3

P PC1 PC2 PC3

S SC1 SC2 SC3

C CC1 CC2 CC3


Quinta etapa: realización del estudio de estabilidad microbiológica acelerada

siguiendo lo establecido por la normativa ICH Q1AR (Estudio de estabilidad de los

principios activos y productos nuevos declarados) en el envase original.

25

Tabla 3.7 Condiciones del estudio de estabilidad

Temperatura 30°C ± 2

Humedad

relativa

75% ± 5

Tiempo 0 meses

3 meses


Matriz de operacionalización de variables

Tabla 3.8 Operacionalización de variables

VARIABLE NIVELES INDICADOR

Concentración de aceite

esencial de tomillo.

0,5% Reducción logarítmica



Porcentaje de

emulsificante (Span 60)

2% Estabilidad de la emulsión

Cumple/ No cumple 4%

Porcentaje de surfactante

no iónico (polisorbato 20)

2% Estabilidad de la emulsión

Cumple/ No cumple 4%


Procedimientos

Control de calidad del aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.).

En la siguiente tabla se describe los parámetros organolépticos y fisicoquímicos

evaluados en el aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.), como parámetros de

calidad.

Tabla 3.9 Análisis de calidad organoléptica y fisicoquímica para el aceite esencial de

tomillo (Thymus vulgaris L.)

ANÁLISIS DE CALIDAD PARÁMETRO

Características

organolépticas

Olor

Color

Aspecto

Ensayos físicos Densidad

Índice de refracción

26

Reacciones de coloración Presencia de alcohol

Presencia de aldehídos y cetonas

Presencia de ésteres

Presencia de carbonilos de aldehídos

Presencia de fenoles

Presencia de insaturaciones

Ensayos cualitativos Cromatografía en capa fina


Características Organolépticas.

1. Tomar una alícuota de 1ml de aceite esencial y colocarlo en un tubo de ensayo.

2. Mediante análisis sensorial, utilizar los órganos de los sentidos como la vista

para determinar el color y la apariencia y el sentido del olfato para el olor.

Densidad relativa.

1. Determinar el peso del picnómetro vació con exactitud de 0,1mg. (El

picnómetro debe estar limpio y seco).

2. Llenar el picnómetro con agua destilada, asegurándose que el capilar este lleno

de agua y que no existan burbujas de aire.

3. Determinar su peso en la balanza analítica.

4. Llenar el picnómetro con la muestra, y repetir el procedimiento anterior.

La densidad relativa o peso específico del líquido es el cociente que se

obtiene al dividir el peso del líquido contenido en el picnómetro por el peso del agua

contenida en éste, ambos determinados a 25°C.

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐í𝑓𝑖𝑐𝑜 =𝑊𝑃𝑖𝑐.+𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 − 𝑊𝑃𝑖𝑐.𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜

𝑊𝑃𝑖𝑐.+𝐻2𝑂 − 𝑊𝑃𝑖𝑐.𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜

Índice de refracción.

Para la determinación del índice de refracción del aceite esencial del tomillo (Thymus

vulgaris L.) se utilizó un refractómetro de ABBÉ.

1. Ajuste de la escala:

Colocar de 2 a 3 gotas de agua destilada en la superficie del prisma principal

con una jeringa.

Cerrar el prisma secundario y observar a través del ocular.

Ajustar la escala, a 1.333 (Brix 0%).

27

2. Medición del índice de refracción de las soluciones:

Abrir el prisma secundario y colocar de 2 a 3 gotas de la muestra en el

centro de la superficie del prisma.

Cerrar cuidadosamente el prisma secundario

Observar por el ocular, girar la perilla de compensación de color hasta que

aparezca una línea clara y definida en el campo de visión.

Girar la perilla de medición alineando la línea delimitadora con las líneas de

intersección.

Leer en la escala superior el índice de refracción.

Reacciones de coloración para aceites esenciales.

Presencia de ésteres

1. En un tubo de ensayo agregar una o dos gotas de aceite esencial.

2. Adicionar en caliente una solución alcalina de hidroxilamina, dejar enfriar y

acidular con ácido clorhídrico.

3. Añadir gotas de cloruro férrico y agitar.

4. Observar una coloración púrpura lo que indica que la prueba es positiva.

Presencia de aldehídos y cetonas

1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas de aceite esencial.

2. Adicionar dos gotas de etanol y una gota de una solución de 2,4-

dinitrofenilhidrazina.

3. Agitar el tubo.

4. Observar un precipitado de color rojo, amarillo o anaranjado lo que indica que

la prueba es positiva.

Reactivo de Tollen:


2. Adicionar unas gotas del reactivo de Tollen y calentar a baño maría.

3. Observar un precipitado negro o la formación del espejo de plata lo que indica

que la prueba es positiva.

Presencia de carbonilos de aldehídos


2. Agregar la misma cantidad de Fehling A y fehling B.

3. Agitar el tubo y llevar a baño maría.

4. Observar un precipitado de color rojo lo que indica que la prueba es positiva

Presencia de insaturaciones

1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas del aceite esencial.

28

2. Agregar gota a gota una solución acuosa de permanganato de potasio (KMnO4)

al 1%.

3. Agitar el tubo después de cada gota

4. Observar un precipitado de color café lo que indica que la prueba es positiva.

Presencia de fenoles

1. Colocar en un tubo de ensayo una o dos gotas del aceite esencial.

2. Agregar dos gotas de una solución de cloruro férrico.

3. Agitar el tubo.

4. Observar una solución de color azul verdosa, roja verdosa o violeta verdosa lo

que indica que la prueba es positiva. (Domínguez, 1973)

Cromatografía en capa fina.

Las técnicas de separación cromatográfica son métodos de separación de

múltiples etapas en los que los componentes de una muestra se distribuyen entre dos

fases, una de las cuales es estacionaria y la otra móvil. Para lo cual se utilizó como

fase estacionaria (placa de silicagel de 20x20cm) y como fase móvil tolueno: xileno

2:4

1. Siembra: aplicar la muestra (aceite esencial de tomillo) y soluciones estándares

(carvacrol y timolol) sobre la superficie de la fase estacionaria (placa) en

porciones lo suficientemente pequeñas para obtener manchas circulares de 2-5

mm de diámetro.

2. Colocar la placa en la cámara, asegurando que las manchas o bandas estén por

encima de la superficie de la fase móvil.

3. Cerrar la cámara.

4. Dejar que la fase móvil ascienda en la placa hasta que el frente de la fase móvil

haya recorrido tres cuartos de la longitud de la placa o la distancia indicada en la

monografía.

5. Retirar la placa, marcar el frente de la fase móvil con un lápiz, y dejar que se

seque.

6. Visualizar los cromatogramas según se indica.

7. Determinar los valores del factor de retardo cromatográfico (RF) para las

manchas o zonas principales. (USP-36, Pruebas físicas/ Cromatografía, 2013)

Nota: A menudo se usa una fuente de luz ultravioleta (UV) adecuada para

observaciones bajo luz UV de longitud de onda corta (254 nm) y larga (365 nm).

Elaboración de la emulsión o/w de uso tópico (loción).

La elaboración de la emulsión o/w se lleva a cabo bajo el cumplimiento de

las buenas prácticas de manufactura, en la cual se incorporó como conservante

antimicrobiano aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) a una concentración

del 0,5%, 1,0% y 1,5% y como conservante sintético una mezcla de parabenos

(metilparabeno y propilparabeno).

29

Elaboración de una emulsión o/w con el conservante sintético.

EMULSIÓN O/W

Agua destilada (10% en exceso por evaporación) CALENTAR RECIPIENTE 1T°:91°C

DISOLVERPolisorbato 20

Trietanolamina Agitación Manual RECIPIENTE 1

Lanolina hidrosolubleVaselina liquidaAlcohol cetilico Acido esteárico Span 60

ENFRIAR

FUNDIR

EMULSIFICAR RECIPIENTE 2

REALIZAR ENSAYOS FISICOS

pH Viscosidad (viscosímetro de Ostwald). Densidad Producto final

CONTROL ORGANOLÉPTICO Color

Olor Apariencia

ENVASAR

RECIPIENTE 1

T°: 70-75°CV: Agitación manual

ENFRIAR RECIPIENTE 2T°: 30-35°C

V: Agitación manual

T°: 70-75°C

RECIPIENTE 2

DISPERSAR Metilparabeno y

propilparabenoAgitación Manual

30

Elaboración de una emulsión o/w con aceite esencial de tomillo, como

conservante antimicrobiano.

EMULSIÓN O/W

Agua destilada Polisorbato 20 DISOLVER RECIPIENTE 1

Agitación Manual

DISOLVERTrietanolamina Agitación

Manual RECIPIENTE 1

Lanolina hidrosolubleVaselina liquidaAlcohol cetilico Acido esteárico Span 60

CALENTAR

FUNDIR

EMULSIFICAR RECIPIENTE 2

REALIZAR ENSAYOS FISICOS

pH Extensibilidad Estabilidad de la emulsión.

Producto final

CONTROL ORGANOLÉPTICO Color

Olor Apariencia

ENVASAR

RECIPIENTE 1

T°: 70-75°CV: Agitación manual

ENFRIAR RECIPIENTE 2

T°: 30-35°CV: Agitación

manual


manual

RECIPIENTE 2

DISPERSAR Aceite esencial de tomillo


manual

RECIPIENTE 2

31

Metodología analítica para el producto terminado (emulsión O/W de tipo

loción).

Ensayos organolépticos.

Igual al realizado en el control organoléptico del aceite esencial

Ensayos físicos.

Determinación del pH

1. Determinar el pH con un potenciómetro marca Mettler Toledo modelo Seven

Multi, calibrado y capaz de reproducir valores de pH con variaciones menores a

0,02 unidades de pH.

2. En un vaso de precipitación colocar una cantidad suficiente del producto e

introducir el electrodo, cuidando que el electrodo no toque las paredes ni el

fondo del recipiente.

3. Efectuar la lectura de pH.

4. Realizar la determinación de pH por triplicado (la diferencia no debe exceder de

0,1 unidades de pH, en caso contrario, debe repetirse la determinación).

Extensibilidad

1. Colocar el producto en una jeringuilla, asegurándose de eliminar el aire.

2. Depositar, en el centro de la cruz marcada en una placa de vidrio, 1ml de

producto formando una mancha circular sin espacios vacíos.

3. Colocar la placa de vidrio superior y medir el diámetro vertical y horizontal

4. Con el promedio del diámetro calcular el área del círculo. (A=π * r2)

Estabilidad de la emulsión

1. En un tubo de ensayo de vidrio con tapa rosca colocar 5g de la emulsión.

2. Llevar a baño maría a 45+/- 2°C, durante 30 minutos.

3. Centrifugar a 4000rpm durante 30 minutos

4. El sobrenadante no debe ser mayor a 2mm

Metodología microbiológica.

Examen microbiológico de productos no estériles: Aptitud del método de recuento

en presencia del producto.

Muestra: emulsión O/W sin preservante

1. Disolver 1g del producto a examinar en un tubo con 9ml de TSB

2. Agregar un volumen suficiente de suspensión microbiana de Pseudomonas

aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans para

obtener un inóculo de no más de 100ufc. El volumen de la suspensión del

inóculo no debe exceder del 15 del volumen del producto diluido.

Para verificar las condiciones de prueba realizar:

32

Un control positivo de crecimiento, a 9 ml TSB (sin incluir la muestra) inocular

con una dilución apropiada de microorganismo para obtener no más de 100 Ufc

en el tubo de muestra. Repetir este procedimiento por separado, con cada cepa

bacteriana y fúngica.

Un control negativo de crecimiento, incubar 9 ml de TSB con y 1 g de muestra

(sin incluir el inóculo). No debe observarse crecimiento de microorganismos.

Del tubo del paso 2 sembrar en 2 cajas TSA (para bacterias) por extensión y 2 por

vertido. En el caso de la Candida albicans sembrar en SAB.

Métodos de Recuento en Placa.

Método de Vertido en Placa

1. Agregar a la placa 1 mL de la muestra preparada y de 15 a 20 mL de Agar

Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud Dextrosa, manteniendo la

temperatura de ambos medios a no más de 45º.

2. Incubar las placas según se indica en la Tabla 3.10.

3. Tomar la media aritmética de los recuentos obtenidos en cada medio y calcular

el número de ufc en el inóculo original.

Tabla 3.10 Condiciones de cultivo para la preparación de inóculos

Por: (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba de eficacia

antimicrobiana, 2013)

Método de Extensión en Superficie

1. Agregar de 15 a 20 mL de Agar Digerido de Caseína y Soja o Agar Sabouraud

Dextrosa a cada placa de Petri de 9 cm de diámetro, aproximadamente a 45°C y

dejar solidificar.

2. Secar las placas en un gabinete con flujo de aire laminar o en una incubadora.

3. Esparcir un volumen medido de no menos de 0,1 mL de la muestra preparada

sobre la superficie del medio. Incubar y realizar el recuento según se indica en

Método de Vertido en Placa.

4. Contar las colonias y comparar con el contaje del inóculo inicial.

33

PARTE II: Prueba de recuento en producto

1. Disolver 1g del producto a examinar en un tubo con 9 ml de TSB.

2. Sembrar en 2 cajas TSA (para bacterias) por extensión y 2 por vertido. En el

caso de la Candida albicans sembrar en SAB.

3. Contar las colonias en caso de haber crecimiento. (Téran Soto, 2016)

Prueba de eficacia antimicrobiana.

Preparación del inóculo

1. Medir la turbidez de la escala 0,5 McFarland y preparar la suspensión bacteriana

de una turbidez similar en el tubo con 5ml de solución de NaCl 0,85%.

2. De esta solución calcular cuánto se debe tomar para que en la muestra haya una

concentración de microorganismos de aproximadamente 1x105 a 1x10

6 ufc/ml

de emulsión O/W. (Téran Soto, 2016)

Inoculación en el producto

1. La inoculación puede realizarse asépticamente en el recipiente original

directamente con una jeringa estéril.

2. El volumen de inóculo empleado es de entre 0,5% y 1,0% del volumen del

producto.

Luego de la inoculación del producto se procede a la incubación para lo cual se debe

seguir el siguiente procedimiento:

Tabla 3.11 Test de eficacia del preservante

S. aureus P. aeruginosa E. coli C. albicans

Preparación del

inóculo

microbiano

0,5McFarland

5ml NaCl

0,85%+

microorganismo

5ml NaCl

0,85%+

microorganismo

5ml NaCl

0,85%+

microorganismo

5ml NaCl

0,85%+

microorganismo

Preparación de la

muestra

Producto+

inóculo= 1x106

ufc/ml de

producto

Producto+

inóculo= 1x106

ufc/ml de

producto

Producto+

inóculo= 1x106

ufc/ml de

producto

Producto+

inóculo= 1x106

ufc/ml de

producto

Incubación de la

muestra

preparada

Incubar a 20-25°C por 14 y 28 días

A los 14 días

34

Preparación de las

diluciones

Dilución 10-1=

1ml de muestra

preparada+ 9ml

NaCl 0,85%

Dilución 10-1=

1ml de muestra

preparada+ 9ml

NaCl 0,85%

Dilución 10-1=

1ml de muestra

preparada+ 9ml

NaCl 0,85%

Dilución 10-1=

1ml de muestra

preparada+ 9ml

NaCl 0,85%

Dilución 10-2 Dilución 10-2 Dilución 10-2 Dilución 10-2





Pase a caja TSA

para bacterias y a

SAB para

levaduras+

neutralizante por

extensión

Diluciones 10-2,

10-4 y 10-6

Diluciones 10-2,

10-4 y 10-6

Diluciones 10-2,

10-4 y 10-6

Diluciones 10-2,

10-4 y10-6

Incubación Incubar a 35°C

por 48-72 horas

Incubar a 35°C

por 48-72 horas

Incubar a 35°C

por 48-72 horas

Incubar a 20°C

por 5 a 7 días

Repetir el procedimiento que se hizo a los 14 días pero ahora a los 28 días

Por: (Téran Soto, 2016)

4. La concentración inicial de microorganismos viables en cada preparación de

prueba se calcula a partir de la concentración de microorganismos de cada

inóculo normalizado determinado mediante el método de recuento de placas.

5. Registrar todos los cambios observados en apariencia en estos intervalos de

tiempo.

6. Determinar mediante el procedimiento de recuento en placas (método de

extensión en superficie) el número de ufc presentes en cada preparación de

prueba.

Cálculo de Ufc/ml mediante recuento en placa:

𝑈𝑓𝑐

𝑚𝑙=

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠

𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑥 0,1

7. Empleando las concentraciones calculadas de ufc por mL presentes al inicio de

la prueba, calcular el cambio en valores en log10 de la concentración de ufc por

mL de cada microorganismo en los intervalos de prueba correspondientes y

expresar los cambios en términos de reducciones logarítmicas.

35

Cálculo de la reducción logarítmica:

𝑅𝑒𝑑. 𝐿𝑜𝑔 = log[𝑁0] − log[𝑁𝑋]

Donde:

𝑁0: Número de microorganismos inoculados al T0

𝑁𝑋: Número de microorganismos supervivientes en cada intervalo de tiempo.

Criterios de eficacia antimicrobiana.

Los requisitos de eficacia antimicrobiana se cumplen si se aceptan los

criterios especificados en la tabla 3. (Producto de categoría 2). La expresión “ningún

incremento” se define como no más de 0,5 unidades de log10 por encima del valor

medio previamente. (Ver tabla 2.4). (USP-36, Pruebas microbiológicas. <51>Prueba

de eficacia antimicrobiana, 2013)

Técnicas de procesamiento de datos (análisis estadístico)

Diseño experimental.

Análisis de varianza ANOVA

En el presente estudio se realizará un análisis de varianza (ANOVA) que

evalúan la importancia de un factor (ANOVA unifactorial) o más factores (ANOVA

multifactorial) al comparar las medias de la variable de respuesta en los diferentes

niveles de los factores. La hipótesis nula establece que todas las medias de la

población (medias de los niveles de los factores) son iguales mientras que la

hipótesis alternativa establece que al menos una es diferente. Ademas se utilizará la

gráfica de caja y de valores individuales.

Hipótesis nula 𝐻𝑂: 𝜇1 = 𝜇2 = 𝜇3 = 𝜇4 =

Hipótesis alternativa 𝐻𝑎: 𝜇1 ≠ 𝜇2 ≠ 𝜇3 ≠ 𝜇4 ≠

El anova de dos factores busca determinar diferencias entre medias de dos o

más grupos, pero al mismo tiempo detectar si existe diferencias entre los datos

debidas a algun tipo o tipos de factores que afecten interiormente a cada grupo

(tratamientos).

36

Factores

Los factores para el presente estudio corresponde a 2 tipos: la concentracion

de aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) utilizado como conservante

microbiológico en el producto final, Factor 1 y el tiempo de análisis correspondiente

al estudio de estabilidad microbiológico acelerado, Factor 2. Se realizarán 3

repeticiones por cada tratamiento.

Niveles

Los niveles para cada factor de estudio corresponde a: 3 niveles para la

concentracion de aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.). asi como 2 niveles

para el tiempo de analisis del estudio de estabilidad microbiológico acelerado.

Prueba de Tukey.

El método de Tukey se utilizará para crear intervalos de confianza para todas

las diferencias en parejas entre las medias de los niveles de los factores mientras

controla la tasa de error por familia que especifique. Además se utilizará la gráfica

de intervalos de confianza de 95% de Tukey.

Decodificación general del estudio.

Tabla 3.12 Decodificación ANOVA de un solo factor

Microorganismo de prueba ATCC

Concentración 0,5% 1,0% 1,5% M-P

R1 R1 R1 R1

R2 R2 R2 R2

R3 R3 R3 R3

R: número de replica. Elaborado por: la autora

0,5%, 1,0%,1,5%: concentración de aceite esencial del tomillo.

M-P: conservante sintético (metilparabeno y propilparabeno)

NOTA: Diseño estadístico aplicado para cada microorganismo de prueba ATCC ,

siendo la variable respuesta la reducción logarítmica del análisis realizado a T28: a los

28 dias desde la inoculación.

37

Tabla 3.13 Decodificación ANOVA de dos factores

Microorganismo de prueba ATCC

FACTOR 2

TIEMPO DE ANÁLISIS

FACTOR 1 CONCENTRACIÓN Análisis 1

(día 0)

Análisis 2

( día 90)

0,5% R1,R2,R3 R1,R2,R3

1,0% R1,R2,R3 R1,R2,R3

1,5% R1,R2,R3 R1,R2,R3

M-P R1,R2,R3 R1,R2,R3


NOTA: El análisis 1, corresponde al análisis de eficacia del preservante realizado una

vez elaborado el producto final y el análisis 2, es el análisis de eficacia del preservante

realizado después de un periodos de 3 meses (90 días) de haber sido sometidas las

muestras a condiciones extremas de temperatura y humedad relativa 40°C±2°C/75%

H.R±5%H.R.

38

Capitulo IV

Análisis y discusión de resultados

Análisis fisicoquímico cualitativo del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris

L.)

Los resultados de las pruebas de control físico y organolépticos realizadas al

aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 4.1 Análisis físico y organoléptico del aceite esencial Thymus vulgaris L.

ENSAYO ORGANOLÉPTICO RESULTADO

Olor Característico

Color Amarillo

Apariencia Líquido aceitoso

ENSAYO FÍSICO RESULTADO

Índice de refracción 1,5080 a 20°C

Densidad relativa 0,9468g/ml a 25°C


Interpretación

De acuerdo al valor de índice de refracción y densidad relativa que presenta el aceite

esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.), se puede deducir que presenta compuestos

oxigenados aromáticos o alicíclicos, debido a que presenta densidades e índices de

refracción superior a 0,9g/ml y 1,47 respectivamente. (Domínguez, 1973)

Reacciones de caracterización.

Tabla 4.2 Resultado de las reacciones de coloración del aceite esencial de (Thymus

vulgaris L.)

FUNCIÓN

QUÍMICA

REACCIÓN COLOR DE LA

REACCIÓN

RESULTADO

Ésteres Con solución alcalina de

hidroxilamina

Roja Positivo

Cetonas y Con 2,4- Precipitado color Positivo

39

aldehídos dinitrofenilhidracina amarillo

Tollens Precipitado negro Positivo

Carbonilo de

aldehídos

Tollens Espejo de plata Negativo

Fehling Precipitado rojo Negativo

Instauraciones Con permanganato de

potasio

Precipitado color café Positivo

Fenoles Con cloruro férrico Azul-verdosa Positivo


Interpretación

De acuerdo a los resultados obtenidos en la tabla 4.2 se puede deducir que el aceite

esencial del tomillo usado en la presente investigación, presenta compuestos con

insaturaciones (alquenos), grupos fenólicos, cetonas, aldehídos y ésteres. Reportándose

que compuestos con estructuras fenólicas tienen una alta actividad antimicrobiana

seguido por aldehídos, cetonas, alcoholes y otros hidrocarburos. (Rosas Gallos, 2011)

Cromatografía en capa fina del aceite esencial del tomillo.

Tabla 4.3 Cromatografía en capa fina del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris

L.)

BANDA DE COMPUESTO VALOR DE Rf

Timol muestra 0,82

Timol estándar teórico 0,82

Carvacrol muestra 0,81

Carvacrol estándar teórico 0,81


Interpretación

En la tabla 4.3 se muestra el factor de retención de los metabolitos mayoritarios

presentes en el aceite esencial del tomillo, observándose la presencia de carvacrol y

timol al ser comparados con los valores estándares de dichos compuestos. A estos

compuestos con estructuras fenólicas se le atribuye una mayor actividad antimicrobiana

en relación a los otros compuestos que constituyen el aceite esencial, además la

presencia y localización de grupos hidroxilo es un factor importante en esta actividad.

(Rosas Gallos, 2011)

40

Medición del espectro IR del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.).

Ilustración 4.1 Espectro IR del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.)

Por: Laboratorio OSP- Universidad Central del Ecuador

Interpretación

La absorción a 2874,49 cm-1

caracterizado por una banda ancha muestra una tensión C-

H. El doblete (un par de picos) de la absorción N-H alrededor de 3300 cm-1

sugiere una

amida primaria, R-CONH2. Como no hay absorción C-H por encima de 3300 cm-1

,

probablemente se trate de una amida saturada. La presencia de tensiones C=C alrededor

de 1500 cm-1

indica la presencia de un anillo aromático. Además la absorción entre

2100 y 2200 cm-1

puede corresponder a una señal de tensión C ≡ C entre 2100 y 2200

cm-1

, sin embargo la absorción de un alquino interno puede ser débil o estar ausente,

debido a la simetría de triple enlace disustituido que genera un momento dipolar muy

pequeño o nulo.

Control de calidad del producto terminado (emulsión o/w: loción).

Tabla 4.4 Formulación de la emulsión o/w (loción)

Formula

porcentual

Formula

manufactura

MATERIA PRIMA % g

Vaselina liquida 3,00 0,80

Lanolina hidrosoluble 4,50 1,20

4000,0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400,0

3,2

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100,0

cm-1

%T

3957,81

3397,96

2874,49

2728,02

2561,34

2362,70

2345,06

2234,42

1884,50

1618,27

1587,24

1515,89

1458,96

1420,64

1382,17

1363,80

1341,95

1290,63

1263,04

1228,64

1180,72

1153,62

1113,26

1089,01

1060,88

1020,37

995,20

946,42

888,00

859,85

809,13

782,19

738,72

721,11

705,62

626,07

592,39

582,03

545,16

41

Alcohol cetílico 0,80 0,32

Acido esteárico 1,60 0,64

Span 60 S S

Polisorbato 20 P P

Trietanolamina 0.40 0,16

Agua Solvente c.s.p

Total 100 40,00

S y P: variables Elaborado por: La autora

Tabla 4.5 Ensayo fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de una emulsión o/w

(loción).

Tratamiento P1S1 P1S2 P2S1 P2S2

N° de

repeticiones

Estab.

emulsión

pH Estab.

emulsión

pH Estab.

emulsión

pH Estab.

emulsión

pH

R1 C 8,10 C 8,06 C 8,06 C 8,00

R2 C 8,09 C 8,15 C 8,08 NC 8,01

R3 C 8,11 C 8,07 NC 7,98 NC 8,00

�̅� 8,10 8,09 8,04 8,00

R: número de repeticiones

P1S1: 2% Polisorbato 20/ 2% Span 60; P2S2: 2% Polisorbato 20/ 4% Span 60

P2S1: 4% Polisorbato 20/ 2% Span 60; P2S2: 4% Polisorbato 20/ 4% Span 60

C: cumple; NC: no cumple.

Cálculo de la extensibilidad

Ejm Tratamiento: P1S1 Emulsión O/W (2% Polisorbato 20/ 2% Span 60)

Diámetro: 9,7cm=97,0 mm

𝐴 = 𝜋. 𝑟2

𝐴 = 𝜋 ( 97,0 𝑚𝑚

2)2

𝑨 = 𝟕𝟑𝟖𝟗, 𝟏𝟏𝒎𝒎𝟐


42

Tabla 4.6 Resultado de los ensayos fisicoquímico de la formulaciones desarrolladas de

una emulsión o/w (loción).

Tratamiento

experimental

Extensibilidad

(mm 2)

Estab.Emuls.

C/NC

pH

P1S1 7389,81 C 8,10

P1S2 4778,36 C 8,09

P2S1 5607,94 NC 8,04

P2S2 5607,94 NC 8,00


Gráfica 4.1 Extensibilidad vs tratamientos


Interpretación

En la gráfica 4.1 se observa que el tratamiento P1S1 (2% polisorbato 20: 2% span 60)

presenta una mayor extensibilidad en relación a los otros tratamientos, además en la

tabla 4.6 se evidencia que cumple con la prueba de estabilidad al igual que el

tratamiento P1S2 (2% Polisorbato 20/ 4% Span 60), sin embargo el tratamiento P1S1

presenta la relación del menor porcentaje de agente emulsificante y surfactante por lo

que dicha formulación fue la seleccionada para el desarrollo de la presente

investigación a la cual se incorporó como conservante natural (aceite esencial de

tomillo) a concentraciones del 0,5%, 1,0% y 1,5% y como conservante sintético una

mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno).

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Ext

ensi

bil

idad

mm

2

Tratamientos

Extensibilidad vs Tratamiento

P1S1

P1S2

P2S1

P2S2

43

Tabla 4.7. Resultado de las características fisicoquímicas y organolépticas del producto terminado.

En la presente tabla se muestra las características organolépticas y fisicoquímicas del producto terminado (loción de tipo emulsión o/w),

realizados al final de la elaboración (C1: control 1) y luego de ser sometidos a condiciones extremas de temperatura y humedad,

especificados para el estudio de estabilidad acelerada (C2: control 2). Los controles se efectuaron por triplicado de cada una de las

formulaciones elaboradas, por lo que los resultados indicados corresponden a la media de las réplicas. (Ver Anexo 5)

FORMULA

UNITARIA/CARA

CTERISITICAS

COLOR

OLOR

ASPECTO

pH

Estabilidad

de la

emulsión

C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2

1 (0,5%) Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Tenue a

especia

Tenue a especia Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,77 7,65 C C

2 (1,0%) Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Ligeramente a

especia

Ligeramente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,81 7,63 C C

3 (1,5%) Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Fuertemente a

especia

Fuertemente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,82 7,62 C C

4 Metilparabeno y

propilparabeno

Blanco Blanco Característico Característico Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,81 7,57 C C

5 (Sin preservante) Blanco Blanco Característico Característico Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,91 7,65 C C

C: cumple NC: no cumple Elaborado por: la autora

44

Interpretación

Las características organolépticas reportadas, están dentro de lo esperado para la

formulación desarrollada, en cuanto al color, al haber desarrollado la formulación sin

adición de colorante es de esperarse que sea de color blanco como en el caso de la

fórmula 4 y 5, sin embargo el tono amarillento es otorgado por el aceite esencial de

tomillo y el olor característico va aumentando a medida que la concentración de aceite

esencial incrementa. En cuanto a la estabilidad de la emulsión se puede establecer que

las formulaciones desarrolladas son estables y no presentan ningún indicio de

separación que ocasione una reformulación. Los valores reportados para pH poseen

diferencias mínimas entre ellos y se encuentran dentro del rango de pH aceptados para

productos de uso tópico que es de 4,5 a 8,5. Además los controles organolépticos y

fisicoquímicos realizados al tercer mes del estudio de estabilidad acelerado, no reportan

algún tipo de alteración organoléptica y en cuanto al pH no hay una variabilidad alta

con los valores reportados al inicio del estudio.

Examen microbiológico de productos no estériles: Método de recuento en placa

Tabla 4.8 Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total de

microorganismos aerobios (RTMA)

Microorganismo Método de extensión.

TSA ufc/caja

Método de vertido.

TSA ufc/caja

Recuento

inicial

Recuento

final

Recuento

inicial

Recuento

final

Pseudomona aeruginosa 100 93 100 97

Escherichia coli 100 95 100 95

Staphylococcus aureus 100 97 100 95


45

Tabla 4.9 Recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) en el producto

Método de extensión.

TSA ufc/caja

Método de vertido.

TSA ufc/caja

Recuento final

Recuento final

NC NC

NC: no hubo crecimiento de microorganismos.

Tabla 4.10. Aptitud del método de recuento en presencia del producto: Recuento total

de levaduras (RTL)

Microorganismo


SAB ufc/caja

Método de vertido. SAB

ufc/caja

Recuento

inicial

Recuento

final

Recuento

inicial

Recuento

final

Candida albicans 100 95 100 97


Tabla 4.11. Recuento total de levaduras (RTL) en el producto


SAB ufc/caja

Método de vertido.

SAB ufc/caja

Recuento final

Recuento final

NC NC

NC: no hubo crecimiento de levaduras Elaborado por: La autora

Interpretación

En las tablas 4.8 y 4.10 que muestra los resultados de la aptitud del método de recuento

en presencia del producto, permite establecer que el método es apto para el recuento de

microorganismos en el producto ya que se puede evidenciar en el recuento final de

microorganismos expresado en ufc/caja una recuperación de microorganismos similar

al recuento inicial, estableciéndose que los excipientes o los factores intrínsecos de la

formulación, no inhiben el crecimiento de los microorganismos que pudieran estar

presente en la forma farmacéutica o de aquellos que pudieran contaminarla

posteriormente. Además en la tabla 4.9 y 4.11 se determina que en la prueba de

recuento en producto no hubo crecimiento de microorganismos, asegurando que el

proceso de elaboración se realizó en condiciones lo más asépticamente posible evitando

una contaminación microbiológica del producto.

46

Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante en el

producto final (emulsión o/w de uso tópico) de categoría 2 (método USP-36).

La prueba de eficacia antimicrobiana en el producto final, fue realizada una vez

elaborado las 4 formulaciones descritas en la tabla 4.12 (Análisis 1) y después de un

periodos de 3 meses (90 días) de haber sido sometidas las muestras a condiciones

extremas de temperatura y humedad relativa 40°C±2°C/75% H.R±5%H.R (Análisis 2).

En cada uno de las evaluaciones una vez inoculado los microorganismos de prueba se

homogeniza y se dejan a temperatura entre 20 y 25° C, examinándose luego de los

tiempos establecidos en la tabla 4.13. Además la prueba de eficacia antimicrobiana fue

realizado por triplicado (R1: replica 1, R2: replica 2, R3: replica 3) tomando 3 muestras

del lote elaborado respectivamente para cada una de las formulaciones.

Tabla 4.12 Descripción de las formulaciones desarrolladas.

N° de

Formulación

Descripción

1 Formula de loción, emulsión tipo O/W, que contiene como conservante

aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) al 0,5%.






una mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno,

0,18%:0,02%)


Tabla 4.13 Intervalos de comprobación de supervivencia de los microorganismos

ATCC, USP-36

Código intervalo

de Tiempo

Intervalo de tiempo

T0 Inmediatamente después de la inoculación

T14 A los 14 días, desde la inoculación

T28 A los 28 días, desde la inoculación


47

Tabla 4.14. Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al intervalo de tiempo T0 y T14.


Microorganismo/

Réplicas

T0

Ufc/ml

T14

Ufc/ml

Red.

Log

T0

Ufc/ml

T14

Ufc/ml

Red.

Log

T0

Ufc/ml

T14

Ufc/ml

Red.

Log

T0

Ufc/ml

T14

Ufc/ml

Red.

Log

Pseudomonas aeruginosa

R1 2,60E+06 1,04E+03 3,4 2,30E+06 4,58E+02 3,7 2,10E+06 NC 6,0 2,45E+06 1,55E+03 3,2

R2 2,26E+06 5,68E+04 1,6 1,43E+06 NC 6,0 2,43E+06 4,84E+02 3,7 1,98E+06 9,92E+04 1,3

R3 2,33E+06 1,47E+03 3,2 1,10E+06 4,37E+02 3,4 1,50E+06 NC 6,0 2,01E+06 5,05E+04 1,6

Escherichia coli

R1 6,33E+05 3,99E+02 3,2 5,67E+05 1,13E+02 3,7 5,47E+05 NC 6,0 4,43E+05 1,11E+04 1,6

R2 5,67E+05 3,57E+02 3,2 5,25E+05 1,04E+02 3,7 4,67E+05 1,86E+02 3,4 5,25E+05 3,31E+02 3,2

R3 6,00E+05 4,67E+02 3,1 5,33E+05 NC 6,0 4,33E+05 1,72E+02 3,4 5,89E+05 7,41E+02 2,9

Staphylococcus aureus

R1 8,33E+05 1,66E+02 3,7 1,19E+06 2,37E+02 3,7 1,56E+06 9,84E+02 3,2 8,69E+05 1,73E+02 3,7

R2 1,30E+06 2,59E+02 3,7 9,65E+05 NC 6,0 1,29E+06 8,13E+02 3,2 7,56E+05 1,51E+02 3,7

R3 1,40E+06 NC 6,0 8,75E+05 NC 6,0 1,00E+06 6,30E+02 3,2 8,00E+05 2,01E+04 1,6

Candida albicans

R1 1,07E+06 2,69E+04 1,6 9,29E+05 7,37E+03 3,1 1,63E+06 NC 6,0 1,42E+06 5,65E+04 1,4

R2 1,21E+06 6,06E+04 1,3 1,13E+06 1,13E+03 3,0 1,54E+06 3,07E+02 3,7 1,33E+06 4,21E+04 1,5

R3 1,10E+06 5,51E+04 1,3 9,08E+05 1,14E+03 2,9 1,28E+06 NC 6,0 1,37E+06 5,45E+04 1,4

NC: Ningún crecimiento del microorganismo Elaborado por: La autora

48

Tabla 4.15. Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 1 al intervalo de tiempo T28.


Microorganismo/Réplicas

T28

Ufc/ml Red. Log

T28

Ufc/ml Red. Log

T28

Ufc/ml Red. Log

T28

Ufc/ml Red. Log


R1 1,64E+03 3,2 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0

R2 8,99E+02 3,4 2,85E+02 3,7 NC 6,0 NC 6,0

R3 NC 6,0 4,37E+02 3,4 NC 6,0 NC 6,0

Escherichia coli

R1 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0

R2 3,58E+02 3,2 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0

R3 2,39E+02 3,4 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0


R1 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0

R2 2,59E+02 3,7 NC 6,0 2,57E+02 3,7 3,00E+02 3,4

R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0

Candida albicans

R1 NC 6,0 9,29E+04 1,0 NC 6,0 4,49E+04 1,5

R2 NC 6,0 NC 6,0 3,07E+02 3,7 4,21E+04 1,5

R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 4,32E+04 1,5


49

Tabla 4.16 Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 2 al intervalo de tiempo T0 y T14.


Microorganismo/

Réplicas

T0

Ufc/ml

T14

Ufc/ml

Red.

Log

T0

Ufc/ml T14

Ufc/ml

Red.

Log

T0

Ufc/ml T14

Ufc/ml

Red.

Log

T0

Ufc/ml T14

Ufc/ml

Red.

Log


R1 1,32E+06 5,25E+03 2,4 1,30E+06 2,59E+03 2,7 9,86E+05 1,96E+03 2,7 1,34E+06 5,33E+02 3,4

R2 1,06E+06 2,66E+04 1,6 1,53E+06 3,84E+04 1,6 1,13E+06 2,84E+04 1,6 1,59E+06 3,99E+04 1,6

R3 1,28E+06 5,09E+03 2,4 1,22E+06 2,43E+03 2,7 1,32E+06 1,66E+03 2,9 9,37E+05 3,73E+02 3,4

Escherichia coli

R1 2,33E+06 4,64E+02 3,7 1,67E+06 3,33E+02 3,7 1,77E+06 3,53E+02 3,7 2,34E+06 1,86E+03 3,1

R2 1,69E+06 6,72E+02 3,4 1,86E+06 3,71E+02 3,7 2,07E+06 NC 6,0 1,75E+06 4,40E+04 1,6

R3 2,31E+06 1,46E+03 3,2 2,96E+06 NC 6,0 1,93E+06 NC 6,0 2,11E+06 2,66E+03 2,9


R1 7,29E+05 1,83E+04 1,6 8,93E+05 1,78E+02 3,7 8,63E+05 1,72E+02 3,7 9,49E+05 2,38E+03 2,6

R2 8,03E+05 5,06E+02 3,2 8,25E+05 NC 6,0 7,89E+05 1,57E+02 3,7 8,86E+05 1,40E+03 2,8

R3 7,96E+05 5,02E+02 3,2 7,77E+05 NC 6,0 8,00E+05 1,59E+02 3,7 8,36E+05 1,67E+03 2,7

Candida albicans

R1 9,71E+05 4,87E+04 1,3 1,17E+06 2,33E+03 2,7 1,23E+06 NC 6,0 1,20E+06 6,01E+03 2,3

R2 1,05E+06 6,62E+03 2,2 1,00E+06 1,58E+03 2,8 1,09E+06 2,17E+02 3,7 9,98E+05 3,97E+03 2,4

R3 9,66E+05 9,66E+03 2,0 9,80E+05 7,78E+02 3,1 1,10E+06 NC 6,0 1,16E+06 5,81E+03 2,3


50

Tabla 4.17. Contaje microbiano (Ufc/ml) y reducción logarítmica del análisis 2 al intervalo de tiempo T28.


Microorganismo/Réplicas

T28

Ufc/ml Red. Log

T28

Ufc/ml Red. Log

T28

Ufc/ml Red. Log

T28

Ufc/ml Red. Log


R1 3,32E+04 1,6 6,51E+03 2,3 NC 6,0 1,06E+03 3,1

R2 2,66E+03 2,6 3,84E+03 2,6 NC 6,0 1,59E+03 3,0

R3 4,05E+03 2,5 2,43E+03 2,7 NC 6,0 1,49E+03 2,8

E. coli

R1 4,64E+02 3,7 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0

R2 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,39E+03 3,1

R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,33E+03 3,2


R1 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,89E+02 3,7

R2 1,60E+02 3,7 NC 6,0 NC 6,0 2,22E+04 1,6

R3 NC 6,0 NC 6,0 NC 6,0 1,66E+02 3,7

Candida albicans

R1 4,87E+04 1,3 NC 6,0 NC 6,0 2,39E+03 2,7

R2 2,64E+04 1,6 NC 6,0 NC 6,0 2,51E+04 1,6

R3 1,22E+03 2,9 NC 6,0 NC 6,0 1,84E+03 2,8


51

Tabla 4.18. Reducción logarítmica. Análisis 1 y análisis 2.

Concentración de aceite de


Concentración de aceite de


Microorganismo de

prueba

0,5% 1,0% 1,5% M-P 0,5% 1,0% 1,5% M-P

Análisis 1 Análisis 2

T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28 T14 T28

Pseudomonas aeruginosa 2,7 4,2 4,3 4,3 5,2 6,0 2,1 6,0 2,2 2,3 2,3 2,5 2,4 6,0 2,8 2,9

Escherichia coli 3,1 4,2 4,4 6,0 4,2 6,0 2,6 6,0 3,4 5,2 4,4 6,0 5,2 6,0 2,5 4,1

Staphylococcus aureus 4,4 5,2 5,2 6,0 3,2 5,2 3,0 5,2 2,7 5,2 5,2 6,0 3,7 6,0 2,7 3,0

Candida albicans 1,4 6,0 3,0 4,3 5,2 5,2 1,4 1,5 2,8 1,9 2,8 6,0 5,2 6,0 2,3 2,3

T14: análisis realizado a los 14 días desde la inoculación; T28: análisis realizado a los 28 días desde la inoculación. Elaborado por: La autora

Interpretación

En la tabla 14.18 se describe la reducción logarítmica microbiana considerando el microorganismo de prueba, concentración del aceite esencial

de tomillo, mezcla de parabenos (Metilparabeno y propilparabeno) y el tiempo de estudio, evidenciándose que a una concentración de aceite

esencial de tomillo del 0,5%, 1,0% y 1,5% evaluados en el análisis 1 y análisis 2 cumple con los criterios establecidos en la USP-36 para la

prueba de eficacia antimicrobiana, dándose a los 14 días una reducción logarítmica no menos de 2,0 y a los 28 días ningún incremento del

recuento de los 14 días para bacterias y ningún incremento a los 14 y 28 días del recuento inicial para levaduras.

52

Gráfica 4.2. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los intervalos T14 y

T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisís1


Interpretación

En la gráfica 4.2 se puede observar que la eficacia antimicrobiana a una concentración

del 0,5% de aceite esencial de tomillo frente a los microorganismos de prueba, aumenta

con el tiempo, teniendo una mayor reducción logarítmica a los 28 días desde la

inoculación; además cumple con los criterios establecidos para bacterias y levaduras

descritos en la tabla 2.4 para productos de categoría 2.


T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,0%). Análisis 1.


0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días

ACEITE ESENCIAL Thymus vulgaris L. al 0,5%


Escherichia coli


Candida albicans

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días



Escherichia coli


Candida albicans

53

Interpretación

En la gráfica 4.3 se puede observar que a una concentración del 1,0% de aceite esencial

de tomillo cumple con los criterios establecidos por la USP-36 para todos los

microorganismos de prueba. Además se evidencia que transcurrido 28 días desde la

inoculación para Pseudomonas aeruginosa, la reducción logarítmica se mantuvo igual

a la evaluada a los 14 días, además de existir una reducción total de Escherichia coli y


Gráfica 4.4. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano a los a los intervalos

T14 y T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (1,5%). Análisis 1


Interpretación

En la gráfica 4.4 se puede observar que a una concentración del 1,5% de aceite esencial

de tomillo, cumple tanto para bacterias como para levaduras con los criterios

establecidos en la USP-36 para productos de categoría 2 (ver tabla 2.4). Además se

evidencia que transcurrido 28 días desde la inoculación para Candida albicans la

reducción logarítmica se mantuvo igual a la evaluada a los 14 días. Tambien presenta

un efecto letal a los 28 días después de la inoculación para Pseudomonas aeruginosa y

Escherichia coli.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días



Escherichia coli


Candida albicans

54


T14 y T28 vs mezcla de parabenos (Metilparabeno y propilparabeno). Análisis 1


Interpretación

En la gráfica 4.5 se puede observar que la reducción logarítmica de Pseudomonas

aeruginosa evaluado a los 14 días desde la inoculación, se encuentra muy cercano a los

criterios establecidos por la USP-36, para eficacia del conservante, sin embargo a los 28

días después de la inoculación alcanza una mayor eficacia, que puede deberse a un

mayor tiempo de contacto entre el preservante y el microorganismo a evaluarse.


T28 vs concentración de aceite esencial de tomillo (0,5%). Análisis 2


0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días

METILPARABENO Y PROPILPARABENO


Escherichia coli


Candida albicans

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días



Escherichia coli


Candida albicans

55







0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días



Escherichia coli


Candida albicans

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días



Escherichia coli


Candida albicans

56


T28 vs mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno). Análisis 2


Interpretación

En las gráficas 4.6, 4.7, 4.8 y 4.9 se puede determinar que al ser sometido el producto

de ensayo a condiciones extremas de temperatura y humedad relativa, las diferentes

concentraciones de aceite esencial usadas como conservante antimicrobiano, cumple

con los criterios establecidos en la USP-36 para la prueba de eficacia antimicrobiana,

dándose a los 14 días una reducción logarítmica no menos de 2,0 y a los 28 días ningún

incremento del recuento de los 14 días para bacterias y ningún incremento a los 14 y 28

días del recuento inicial para levaduras.

Gráfica 4.10. Reducción logarítmica del crecimiento microbiano al intervalo T14 vs

concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1.

M-P: mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno)


0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

4,5

14 28

RE

DU

CC

IÓN

log

TIEMPO, días

METILPARABENO Y PROPILPARABENO


Escherichia coli


Candida albicans

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0,50% 1,00% 1,50% M-P

RE

DU

CC

IÓN

lo

g

Concentración de aceite esencial

REDUCCIÓN DEL CRECIMIENTO MICROBIANO A LOS 14 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN (ANÁLISIS 1)


Escherichia coli

Staphylocuccus aureus

Candida albicans

57

Interpretación

Como se puede observar en la tabla 14.18 y en la gráfica 4.10 la reducción logarítmica

de los microorganismos de prueba varia con la concentración de aceite esencial de

tomillo, obteniéndose una mayor reducción de Escherichia coli, Staphylococcus aureus

a una concentración del 1,0% de aceite esencial de tomillo y al 1,5% para Pseudomonas

aeruginosa y Candida albicans.


concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos.Análisis1


Interpretación

En la gráfica 4.11 se evidencia una mayor reducción logarítmica de Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli a una concentración del 1,5% de aceite esencial de

tomillo, presentando un comportamiento similar a la mezcla de parabenos frente a estas

dos bacterias; mientras que al 1,0% presenta una mayor eficacia antimicrobiana frente

a Staphylococcus aureus y al 0,5% para Candida albicans.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0,50% 1,00% 1,50% M-P

RE

DU

CC

IÓN

lo

g


REDUCCION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO A LOS 28 DÍAS DESDE LA INOCULACIÓN (ANÁLISIS 1)


Escherichia coli


Candida albicans

58


concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis 2


Interpretación

Como se puede observar en la gráfica 4.12 al realizar el test de efectividad del

preservante después de haber sido sometiendo el producto final a una temperatura de

40°C±2°C y a 75%±5% de humedad relativa por 3 meses, se evidencia que existe una

mayor reducción de Escherichia coli, Candida albicans a una concentración del 1,5%

de aceite esencial de tomillo, al 1,0% para Staphylococcus aureus y en el caso de

Pseudomonas aeruginosa presenta una mayor reducción con la mezcla de parabenos

(metilparabeno y propilparabeno), sin embargo no muestra una variación alta en

relación a las diferentes concentraciones de aceite esencial.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

0,50% 1,00% 1,50% M-P

RE

DU

CC

IÓN

lo

g




Escherichia coli


Candida albicans

59


concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de parabenos. Análisis2


Interpretación

En la Gráfica 4.13, se observa que a los 28 días desde la inoculación en el producto

final, existe una reducción total de Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,

Staphylococcus aureus y Candida albicans a una concentración del 1,5% de aceite

esencial de tomillo, sin embargo al 1% también se muestra una reducción similar al

1,5% frente a Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.

Además se evidencia que a las concentraciones de 1,0% y 1,5% de aceite esencial

muestra una mayor eficacia antimicrobiana en relación a la mezcla de parabenos (M-P)

Análisis estadístico de la eficacia antimicrobiana del aceite esencial de tomillo

(Thymus vulgaris L.).

Los datos serán evaluados mediante un análisis estadístico de varianzas de tipo

ANOVA que pruebe la hipótesis de que las medias de dos o más poblaciones son

iguales, con un factor (concentración de aceite esencial de tomillo) con 3 repeticiones

para cada ensayo, siendo un total de 3 tratamientos, además de compararlo con una

mezcla de parabenos (metilparabeno y propilparabeno), midiendo como variable

respuesta la reducción logarítmica de bacterias (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia

coli, Staphylococcus aureus) y levadura (Candida albicans). Además como análisis

funcional se utilizará la prueba de Tukey al 5% con ayuda del programa MINITAB y

Microsoft Excel 2016.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

0,50% 1,00% 1,50% M-P

RE

DU

CC

IÓN

lo

g




Escherichia coli


Candida albicans

60

Los datos también serán evaluados por ANOVA de dos factores: concentración de

aceite esencial de tomillo y tiempo de análisis (análisis 1 y análisis 2), y como variable

respuesta reducción logarítmica de microorganismos.

Tratamiento estadístico (Análisis 1).

Tabla 4.19. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Pseudomonas

aeruginosa

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio de

los

cuadrados F Probabilidad

Valor crítico

para F

Entre grupos 9,166614832 3 3,055538277 2,65454934 0,119872134 4,066180551

Dentro de los

grupos 9,208458036 8 1,151057254

Total 18,37507287 11


Interpretación

El valor P (0,12) al ser mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado

(2,6545) es menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de

tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción logarítmica

de Pseudomonas aeruginosa y presenta un comportamiento similar al conservante

sintético (metilparabeno-propilparabeno). Lo que significa que se acepta la hipótesis

nula entre los tratamientos.

Gráfica 4.14 Gráfica de caja: concentración de aceite esencial de tomillo y mezcla de

parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa

61

Interpretación

En el diagrama de caja se puede observar la media y la distribución de los datos para

cada muestra, se observa una mayor respuesta (reducción logarítmica) para la

concentración de 1,5% de aceite esencial de tomillo y para la mezcla de parabenos

(metilparabeno y propilparabeno), también se puede evidenciar una mayor dispersión

de los datos a una concentración del 0,5% y 1,0% de aceite esencial de tomillo por la

anchura de la caja.

Tabla 4.20. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio

de los


Valor crítico

para F

Entre grupos 7,48494696 3 2,49498232 3,9876103 0,05225802 4,066180551

Dentro de los

grupos 5,00546871 8 0,62568359

Total 12,4904157 11


Interpretación

Siendo el valor P (0,052) mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F

calculado (3,9876) menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite

esencial de tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la

reducción logarítmica de Escherichia coli. Lo que significa que se acepta la hipótesis

nula entre los tratamientos, es decir que la concentración de aceite esencial de tomillo

no influye sobre la variable respuesta (reducción logarítmica para Escherichia coli.)

Gráfica 4.15. Gráfica de valores individuales: concentración de aceite esencial de

tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli

M-P1,5%1,0%0,5%

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Concentración del conservante

Reducció

n L

og

Gráfica de valores individuales

62

Interpretación

En la gráfica de valores individuales, se compara la reducción logarítmica transcurrido

28 días desde el recuento inicial para Escherichia coli en relación a las diferentes

concentraciones de aceite esencial de tomillo y el conservante sintético (M-P).

Presentando a una concentración del 1,0% y 1,5% un comportamiento antimicrobiano

similar al M-P, además a una concentración del 0,5% hay una mayor variación

(dispersión de los puntos) de los datos.

Tabla 4.21. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de

los cuadrados F Probabilidad

Valor crítico

para F

Entre

grupos 1,3591001 3 0,45303337 0,33342284 0,80174755 4,066180551

Dentro de

los grupos 10,869882 8 1,35873525

Total 12,2289821 11


Interpretación

Siendo el valor P (0,80) mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado

(0,3334) es menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de

tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la reducción

logarítmica de Staphylococcus aureus. Lo que significa que se acepta la hipótesis nula

entre los tratamientos.


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus.

M-P1,5%1,0%0,5%

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

Concentración

Reducció

n L

og.


63

Interpretación

Como se puede observar en la gráfica 4.16 la media de la reducción logarítmica

correspondiente a una concentración del 1,0% de aceite esencial, frente a

Staphylococcus aureus es mayor en relación a las otras concentraciones ensayadas,

presentando una mayor eficacia antimicrobiana frente al microorganismo de prueba.

Tabla 4.22. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los


Valor crítico

para F

Entre grupos 34,6422443 3 11,5474148 4,54213577 0,03863178 4,066180551

Dentro de los

grupos 20,3382996 8 2,54228745

Total 54,9805438 11


Interpretación

Siendo el valor P (0,04) menor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado

(4,5421) mayor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de

tomillo tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la reducción

logarítmica de Candida albicans. Lo que significa que se acepta la hipótesis alternativa

entre los tratamientos.

Prueba de Tukey para Candida albicans

Se utilizara el Test HSD (Diferencia significativamente honesta) de Tukey ya que

permite comparar las medias de los niveles de un factor después de haber rechazado la

Hipótesis nula de igualdad de medias mediante la técnica ANOVA.

Tabla 4.23. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida albicans

HSD= 4,17013295

Multiplicador= 4,53

MSe= 2,542287446

n= 3

0,50% 1,00% 1,50% M-P

0,50%

1,7 0,8 4,5

1,00% 1,7

-0,9 2,8

1,50% 0,8 0,9

3,7

M-P 4,5 2,8 3,7


64

Interpretación

Mediante la diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey, se puede establecer

que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuanto al valor de reducción

logarítmica de Candida albicans entre la concentración de 0,5% de aceite esencial de

tomillo y la mezcla de parabenos (Metilparabeno y propilparabeno).


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans.


de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans

Interpretación

La gráfica 4.18 muestra un símbolo de la media con una barra de intervalos de

confianza del 95%, identificando tres grupos homogéneos, es decir a la concentración

de aceite esencial de tomillo de 0,5%, 1,0% y 1,5% todas las barras de intervalos son

fácilmente superponibles entre sí, lo que estadísticamente significaría homogeneidad

entre estos tratamientos, sin embargo la barra del intervalo de la mezcla de parabenos

M-P1,5%1,0%0,5%

6

5

4

3

2

1

Concentración

Reducció

n L

og.

6

4,33333

5,21774

1,50369


M-P1,5%1,0%0,5%

12

10

8

6

4

2

0

-2

-4

Concentración

Reducció

n L

og.

0

6

4,333335,21774

1,50369

95% IC para la mediaGráfica de intervalos

65

(M-P) no se sobrepone con respecto a la concentración de 0,5% por lo que la diferencia

entre las medias son significativamente diferentes. Además en la gráfica 4.17 se puede

observar que las medias entre los tres primeros grupos (0,5%, 1,0% y 1,5%) son

próximos, identificándose un mayor rango de dispersión entre las medias del 0,5% y M-

P.

Tratamiento estadístico (Análisis 2).


aeruginosa.

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de


Valor

crítico

para F

Entre grupos 27,1978885 3 9,06596282 97,009013 1,2472E-06 4,06618

Dentro de los

grupos 0,74763881 8 0,09345485

Total 27,9455273 11


Interpretación

Siendo el valor p (0.00) menor que 0,05 con un nivel de confianza del 95% y el valor

de F calculado (97,0090) mayor que el valor F tabulado (4,0662), se rechaza la

hipótesis nula, determinando que la concentración de aceite esencial de tomillo tiene un

efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta (reducción logarítmica

de Pseudomonas aeruginosa).

Prueba de Tukey para Pseudomonas aeruginosa

Tabla 4.25. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa

HSD= 0,79953688

Multiplicador= 4,53

MSe= 0,09345485

n= 3


0,50% 1,00% 1,50% M-P

0,50% -0,3 -3,7 -0,7

1,00% 0,3 -3,5 -0,4

1,50% 3,7 3,5 3,1

M-P 0,7 0,4 -3,1

66

Interpretación


que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuando al valor de reducción

logarítmica de Pseudomonas aeruginosa entre la concentración de 0,5% de aceite

esencial de tomillo con 1,5%; 0,5% con la mezcla de parabenos (M-P), 1% con 1,5% de

aceite esencial de tomillo y entre 1,5% con mezcla de parabenos (M-P).

M-P1,5%1,0%0,5%

6

5

4

3

2

1

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.



tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas aeruginosa

M-P1,5%1,0%0,5%

6

5

4

3

2

1

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.

95% IC para la media

Gráfica de intervalos

Gráfica 4.20. Gráfica de intervalos. Prueba de Tukey concentración de aceite esencial

de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Pseudomonas

aeruginosa

67

Interpretación

La gráficas 4.19 y 4.20 muestra intervalos de confianza del 95% para cada una de las

medias. A partir de los cual se puede identificar dos grupos homogéneos, es decir a la

concentración de aceite esencial de tomillo de 0,5%, donde es fácilmente superponible

entre sí con la concentración al 1,0% y mezcla de parabenos (M-P), y el límite superior

es prácticamente superponible al límite inferior de la mezcla de parabenos (M-P), lo

que estadísticamente significaría homogeneidad entre estos tratamientos.

Tabla 4.26 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio de


Valor

crítico

para F

Entre grupos 7,45012612 3 2,48337537 2,1516148 0,17182461 4,06618

Dentro de los

grupos 9,23353157 8 1,15419145

Total 16,6836577 11


Interpretación

Siendo el valor P (0,17) mayor que 0,05 al 95% de confianza y que el valor F calculado

(2,1516) menor que el F tabulado (4,0662), la concentración de aceite esencial de

tomillo no tiene un efecto estadísticamente significativo sobre sobre la reducción

logarítmica de Escherichia coli. Lo que significa que se acepta la hipótesis nula entre

los tratamientos.

M-P1,5%1,0%0,5%

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.



tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Escherichia coli

68

Interpretación

En la gráfica 4.21 se puede evidenciar que a una concentración del 1,0% y 1,5% de

aceite esencial de tomillo, presentan un comportamiento antimicrobiano similar frente a

Escherichia coli, por otra parte la eficacia antimicrobiana de la mezcla de parabenos

(M-P) frente a Escherichia coli es menor en comparación con el aceite esencial a las

concentraciones ensayadas.


Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de


Valor

crítico

para F

Entre grupos 18,308452 3 6,10281733 7,6749824 0,00968946 4,06618

Dentro de los

grupos 6,36125744 8 0,79515718

Total 24,6697094 11


Interpretación:

Siendo el valor p (0,01) menor que 0,05 con un nivel de confianza del 95% y el valor

de F calculado (7,6750) mayor que el valor F tabulado (4,0662), se rechaza la hipótesis

nula determinando que la concentración de aceite esencial de tomillo tiene un efecto

estadísticamente significativo sobre la variable respuesta (reducción logarítmica de

Staphylococcus aureus).

Prueba de Tukey para Staphylococcus aureus

Tabla 4.28. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Staphylococcus aureus

HSD= 2,33219074

Multiplicador= 4,53

MSe= 0,79515718

n= 3

0,50% 1,00% 1,50% M-P

0,50% -0,8 -0,8 2,2

1,00% -0,8 0,0 3,0

1,50% -0,8 0,0 3,0

M-P 2,2 3,0 3,0


69

Interpretación


que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuanto a la reducción

logarítmica de Staphylococcus aureus entre la concentración del 1,0% y 1,5% de aceite

esencial de tomillo con la mezcla de parabenos (M-P) como se indica en la tabla 4.28 y

se observa en la gráfica 4.22.

M-P1,5%1,0%0,5%

6

5

4

3

2

1

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.



tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus

M-P1,5%1,0%0,5%

9

8

7

6

5

4

3

2

1

0

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.




de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Staphylococcus aureus

70

Interpretación

La gráfica 4.23 muestra intervalos de confianza del 95% para cada una de las medias. A

partir de los cual se puede identificar tres grupos homogéneos, es decir a la

concentración de aceite esencial de tomillo de 0,5%, donde su límite superior es

fácilmente superponible entre sí con la concentración al 1,0% y 1,5% y su límite

inferior es superponible con la mezcla de parabenos, y el límite superior es

prácticamente superponible al límite inferior de la mezcla de parabenos (M-P), lo que

estadísticamente significaría homogeneidad entre estos tratamientos.

Tabla 4.29. Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los


Valor

crítico

para F

Entre grupos 44,8214639 3 14,940488 56,759031 9,798E-06 4,06618

Dentro de los

grupos 2,10581295 8 0,26322662

Total 46,9272768 11


Interpretación:

Siendo el valor p (0.00) menor que 0,05 con un nivel de confianza del 95% y el valor

de F calculado (56,759031) mayor que el valor F tabulado (4,0662), se rechaza la

hipótesis nula determinando que la concentración de aceite esencial de tomillo tiene un

efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta (reducción logarítmica

de Candida albicans).

Prueba de Tukey para Candida albicans.

Tabla 4.30. Prueba de Tukey para reducción logarítmica de Candida albicans.

HSD= 1,34184539

Multiplicador= 4,53

MSe= 0,26322662

n= 3

0,50% 1,00% 1,50% M-P

0,50% -4,1 -4,1 -0,4

1,00% 4,1 0,0 3,7

1,50% 4,1 0,0 3,7

M-P 0,4 -3,7 -3,7


71

Interpretación


que existe una diferencia estadísticamente significativa en cuando al valor de reducción

logarítmica de Candida albicans entre la concentración del 0,5% de aceite esencial de

tomillo con el 1,0% y 1,5%, mezcla de parabenos (M-P) con el 1,0 y 1,5% de aceite

esencial de tomillo como se puede identificar en la tabla 4.30.

M-P1,5%1,0%0,5%

6

5

4

3

2

1

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.Gráfica de valores individuales


tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans.

M-P1,5%1,0%0,5%

6

5

4

3

2

1

0

Concentración

Re

du

cció

n L

og

.




de tomillo y mezcla de parabenos vs Reducción logarítmica de Candida albicans

Interpretación

La gráfica 4.25 muestra intervalos de confianza del 95% para cada una de las medias. A

partir de los cual se puede identificar dos grupos homogéneos, es decir a la

concentración de aceite esencial de tomillo de 0,5%, donde es fácilmente superponible

entre sí con la mezcla de parabenos (M-P) y las barras de intervalos son fácilmente

72

superponibles al 1,0% con las barras de intervalo al 1,5% ,lo que estadísticamente

significaría homogeneidad entre estos tratamientos.

Análisis estadístico ANOVA de dos factores.


aeruginosa

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los


Valor

crítico para

F

Tiempo 17,3591268 1 17,3591268 27,8970798 7,448E-05 4,49399848

Concentración 29,1509622 3 9,71698741 15,6157379 5,1814E-05 3,23887152

Interacción 7,21354107 3 2,40451369 3,8641869 0,02965711 3,23887152

Dentro del

grupo 9,95609684 16 0,62225605

Total 63,6797269 23


Interpretación

Los valores-P prueban la significancia de cada uno de los efectos, teniendo un valor p

de 0,00 para el análisis 1 y 0,00 para la concentración de aceite esencial de tomillo y

0,03 para la interacción dentro del grupo, siendo menores que 0,05 con un nivel de

confianza del 95% se establece que el tiempo de análisis y la concentración de aceite

esencial de tomillo tienen un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción

logarítmica de Pseudomonas aeruginosa.

Día

Concentración

900

1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%

6

5

4

3

2

1

Re

d.

Lo

g.

Gráfica de valores individuales de Red. Log. vs. Día. Concentración



Pseudomonas aeruginosa.

Nota: 0,00%: hace referencia al metilparabeno y propilparabeno

73

Interpretación

En la gráfica 4.26 se puede observar que hay una diferencia en el comportamiento de la

eficacia antimicrobiana frente a Pseudomonas aeruginosa a una concentración del 0,5%

y 1,0% de aceite esencial de tomillo, con respecto al análisis 1 y 2.

Tabla 4.32 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Escherichia coli

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los


Valor

crítico para

F

Tiempo 0,29212239 1 0,29212239 0,32825045 0,57465528 4,49399848

Concentración 8,04553607 3 2,68184536 3,01352095 0,06081763 3,23887152

Interacción 6,88953702 3 2,29651234 2,58053211 0,0896579 3,23887152

Dentro del

grupo 14,2390003 16 0,88993752

Total 29,4661958 23


Interpretación

Teniendo como resultado un valor p de 0,57 para el tiempo de análisis (análisis 1 y

análisis 2), 0,06 para la concentración de aceite esencial de tomillo y 0,09 para la

interacción dentro del grupo, al ser mayores que 0,05 con un nivel de confianza del

95% se establece que el tiempo de análisis y la concentración de aceite esencial de

tomillo no presentan un efecto estadísticamente significativo sobre la reducción

logarítmica de Escherichia coli.

Día

Concentración

900

1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%

6,0

5,5

5,0

4,5

4,0

3,5

3,0

Re

d.

Lo

g

Gráfica de valores individuales de Red. Log vs. Día. Concentración



Escherichia coli.

74

Interpretación

En la gráfica 4.27 se puede observar que a una concentración de aceite esencial de 1,0%

y 1,5% presentan una mayor eficacia antimicrobiana frente a Escherichia coli, y no se

ve influenciado por el de tiempo de análisis, manteniendo la misma potencia

microbiológica desde su elaboración hasta la terminación del estudio de estabilidad con

respecto a Escherichia coli.


Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los


Valor

crítico para

F

Tiempo 0,80746442 1 0,80746442 0,74977228 0,39934664 4,49399848

Concentración 12,1068246 3 4,03560819 3,74726995 0,03262455 3,23887152

Interacción 7,56072753 3 2,52024251 2,34017491 0,11197205 3,23887152

Dentro del

grupo 17,2311394 16 1,07694622

Total 37,706156 23


Interpretación



interacción dentro del grupo, al ser mayor que 0,05 y menor que 0,05 respectivamente

con un nivel de confianza del 95% se establece que el tiempo no presenta un efecto

estadísticamente significativo sobre la variable respuesta y que la concentración de

aceite esencial de tomillo tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la

reducción logarítmica de Staphylococcus aureus.

Día

Concentración

900

1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%

6

5

4

3

2

1

Re

d.

Lo

g





75

Interpretación

Como se puede evidenciar en la gráfica 4.28 a una concentración de 1,0% y 1,5% de

aceite esencial de tomillo se alcanza una mayor inhibición del crecimiento de

Staphylococcus aureus. Además en las gráficas 4.25, 4.26 y 4.27 se observa una

disminución de la eficacia antimicrobiana de la mezcla de parabenos (metilparabeno y

propilparabeno) en el análisis 2.

Tabla 4.34 Análisis de Varianza para reducción logarítmica de Candida albicans

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de los

cuadrados F Probabilidd

Valor

crítico para

F

Tiempo 0,21938601 1 0,21938601 0,1563963 0,69771923 4,49399848

Concentración 48,8893667 3 16,2964556 11,6174471 0,00027207 3,23887152

Interacción 30,5743414 3 10,1914471 7,26529748 0,00271772 3,23887152

Dentro del grupo 22,4441125 16 1,40275703

Total 102,127207 23


Interpretación



interacción dentro del grupo, al ser mayor que 0,05 y menor que 0,05 respectivamente

con un nivel de confianza del 95% se establece que el tiempo de análisis no presenta un

efecto estadísticamente significativo sobre la variable respuesta y que la concentración

de aceite esencial de tomillo tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la

reducción logarítmica de Candida albicans.

Día

Concentración

900

1,50%1,00%0,50%0,00%1,50%1,00%0,50%0,00%

6

5

4

3

2

1

Re

d.

Lo

g




Candida albicans.

76

Interpretación

Como se puede observar en la gráfica 4.29 hay una reducción notable de la actividad

microbiológica frente a Candida albicans a una concentración del 0,5% de aceite

esencial de tomillo con respecto al tiempo de análisis, puede deberse a una degradación

del aceite esencial o a una disminución de la afinidad micelar del aceite esencial con el

surfactante, lo que pudo haber neutralizado parcialmente su actividad antimicrobiana.

(Nostro, 2004)

77

Capítulo V

Conclusiones y Recomendaciones

Conclusiones

Se determinó que al utilizar como conservante natural microbiológico, una

concentración del 1,5% de aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.) en una

emulsión O/W de uso tópico (loción), protege al producto contra la proliferación

microbiana de Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC

25922) y Staphylococcus aureus (ATCC 25293), y micótica frente a Candida

albicans (ATTC RTB012) durante el periodo de vida útil. Satisfaciendo los criterios

establecidos para la Prueba de Eficacia Antimicrobiana de la USP-36. (Véase

Grafica 4.16)

De acuerdo al estudio de estabilidad microbiológica acelerado, es posible

establecer que al utilizar una concentración de aceite esencial de tomillo del 1,5% no

se ve afectada su actividad antimicrobiana frente Pseudomonas aeruginosa,

Escherichia coli, Staphylococus aureus y Candida albicans durante el periodo de

vida útil de la loción (emulsión O/W) de uso tópico. Además de mostrar una mejor

eficacia antimicrobiana que la mezcla de parabenos (metilparabeno y

propilparbeno).

Se confirma la hipótesis planteada, en la cual el aceite esencial del tomillo

(Thymus vulgaris L.) incorporado como conservante antimicrobiano en una

emulsión o/w de uso tópico a una concentración del 0,5%, 1,0% y 1,5%, tiene

actividad antimicrobiana, ya que cumple con los criterios establecidos para

productos de categoría 2 por la USP-36. Produciéndose a los 14 días desde la

inoculación para el análisis 1 y 2, una reducción logarítmica de no menos de 2,0 de

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y Staphylococus aureus desde el

recuento inicial y a los 28 días desde la inoculación ningún incremento del recuento

de los 14 días, y para Candida albicans ningún incremento a los 14 y 28 días

respecto al recuento inicial.

Las fórmulas de loción del tipo de emulsión aceite en agua (o/w) elaboradas

utilizando como conservante natural aceite esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.)

a concentraciones del 0,5%, 1,0% y 1,5% y como conservante sintético una mezcla

de parabenos (metilparabeno y Propilparabeno), cumplen con las especificaciones

organolépticas y fisicoquímicas, manteniendo su estabilidad durante el tiempo de

estudio.

78

Recomendaciones

Ampliar la investigación del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.),

en su uso como conservante antimicrobiano en otras formulaciones farmacéuticas y

cosméticas.

Realizar un estudio de estabilidad a largo plazo, para determinar si el aceite

esencial de tomillo (Thymus vulgaris L.) mantiene su comportamiento como

conservante antimicrobiano durante el periodo de vida útil del producto.

Efectuar una evaluación toxicológica del aceite esencial de tomillo (Thymus

vulgaris L.), para establecer parámetros de seguridad.

Llevar a cabo un estudio cinético de la combinación del metilparabeno y

propilparabeno, y compararlo con el efecto que tiene sobre su actividad como

conservante antimicrobiano, debido a que en la presente investigación, se evidenció

una reducción de la eficacia antimicrobiana de esta combinación después de haber

sometido al producto final a un estudio de estabilidad microbiológica acelerada.

79

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82

Anexos

Anexo 1. Ficha técnica del aceite esencial del tomillo (Thymus vulgaris L.)

83

Anexo 2. Control de calidad en el producto final

.

84

Anexo 3. Control organoléptico y fisicoquímico del producto terminado (loción de tipo emulsión o/w) de uso tópico.

FORMULA

UNITARIA/CARA

CTERISITICAS

COLOR

OLOR

ASPECTO

pH

Estabilidad

de la

emulsión

C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2

1 (0,5%) R1 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Tenue a

especia

Tenue a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,77 7,65 C C

R2 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Tenue a

especia

Tenue a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,76 7,64 C C

R2 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Tenue a

especia

Tenue a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,77 7,64 C C

2 (1,0%) R1 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Ligeramente a

especia

Ligeramente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,80 7,63 C C

R2 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Ligeramente a

especia

Ligeramente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,82 7,62 C C

R3 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Ligeramente a

especia

Ligeramente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,81 7,63 C C

3 (1,5%) R1 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Fuertemente a

especia

Fuertemente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,82 7,61 C C

R2 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Fuertemente a

especia

Fuertemente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,82 7,62 C C

R3 Blanco

amarillento

Blanco

amarillento

Fuertemente a

especia

Fuertemente a

especia

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,81 7,62 C C

85

4 Metilparabeno y

propilparabeno

R1 Blanco Blanco Característico

Característico Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,80 7,58 C C

R2 Blanco Blanco Característico Característico Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,81 7.55 C C

R3 Blanco Blanco Característico Característico Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,81 7,57 C C

5 (Sin preservante) R1 Blanco Blanco Característico Característico Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,91 7,67 C C

R2 Blanco Blanco Característico Característico

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,92 7,62 C C

R3 Blanco Blanco Característico Característico

Líquido

homogéneo

Líquido

homogéneo

7,92 7,65 C C

R: Número de réplica; C1: control organoléptico y fisicoquímico realizado al inicio del estudio. ; C2: control organoléptico y fisicoquímico realizado al

tercer mes del estudio de estabilidad acelerado; C: cumple con la prueba de estabilidad de la emulsión. ELABORADO POR: La autora

86

Anexo 4. Prueba de eficacia antimicrobiana. Test de efectividad del preservante en el

producto final (emulsión O/W de uso tópico). Método USP-36

Análisis 1 en el intervalo T28

Análisis 2 en el intervalo T28

eficacia antimicrobiana del aceite esencial del tomillo · ii agradecimiento a dios por haberme...

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