“DIAGNÓSTICO DE LA

DIVERSIDAD GENÉTICA DE RAZAS

Y VARIEDADES DE MAÍZ NATIVO

PARA LA TOMA DE DECISIONES Y

LA EVALUACIÓN DE PROGRAMAS

DE CONSERVACIÓN”.

June Simpson

Contenido de la presentación

• Desarrollo de una estrategia para análisis en

escala grande de SSRs de variedades criollos

de maíz sembradas actualmente en México.

Prueba de concepto

• Etapas 1 y 2

• Análisis global

• Detección de genotipos con transgenes

Diversidad de materiales criollos de maíz

Definición de criollo (Wikipedia)Un cultivo, variedad o raza que ha sidodesarrollado a traves de prácticas agronómicasdurante muchos años en un sitio específico sinintervención de métodos agronómicos modernos.

Image from O´Leary 2016, Maize: from Mexico to the world, CIMMYT publication

Al menos 59 criollos de maíz hansido descritos en México

Importancia de la Biodiversidad en México

AGRICULTURA

CONABIO

SINAREFI

INIFAPSNICS

SENASICA

CIBIOGEMEAMBIENTE Y

RECURSOS

NATURALES

SALUD

ECONOMIA

FINANZAS Y

CREDITO

PUBLICOEDUCACIÓN

CIBIOGEM – Comisión Intersecretarial para la Bioseguridad de Organismos

genéticamente Modificados -mandato incluye conservación de biodiversidad-

conservación in situ

Contexto

• Conservación in situ

• Evaluación de diversidad en materiales criollos sembrados actualmente

• Consideraciones de biodiversidad de maíz en México cómo centro de origen; necesidad de conservar materials con propósitos científicos, de mejoramiento y culturales.

• Problema complejo con varios factores: muchas variedades criollas cultivadas según necesidades específicas locales, poblaciones aisladas geográficamente, agricultores de edad avanzada y falta de continuidad, exacerbado con reportes de contaminación con material transgénico.

• Diversidad en términos reales desconocida.

Estrategia del Proyecto

• Aprovechar muestreos recientes disponibles

• Seleccionar cuidadosamente muestras en términos de

región geográfica y caracterización morfológica.

• Hasta donde fuera posible incluir muestras de las

regiones más importantes en términos de diversidad:

Oaxaca, Guerrero, Puebla, Michoacán, en donde el

germoplasma criollo está ampliamente cultivado.

Etapa 2 cubrió región norte del país

• Información mínima requerida para cada muestra:

Localización con GPS, datos morfológicos (raza, color

y características de semillas).

• Eficiente en costos

Variedades criollos son poblaciones

heterogéneos

Pop 1

Pop 2

Pop n

Pop x Acc 1 Acc 1

(Figure courtesy of Dr. R. Sawers,

LANGEBIO, Cinvestav, Irapuato.)

Como determinamos cual será una muestra representativaPara cada variedad y accesión?

Estrategia: número de individuos/accesión

60 alleles=30 plants

3 bulks individual DNAs of 10 plants/accession

Humberto Reyes-Valdés

UAAAN, Coahuila

mathgenome@gmail.com

Data from Amalio

Santacruz-Varela,

Colegio de

Posgraduados

Sampling strategy:Determination of most informative

SSRs

LOCUS NUMERO

BIN

PHI427913 1.01

PHI064 1.11

PHI96100 2.00-2.01

PHI127 2.07

PHI053 3.05

PHI072 4.01

PHI093 4.08

PHI109188 5.03

PHI031 6.04

PHI034 7.02

PHI051 7.06

PHI015 8.08

PHI033 9.02

PHI96342 10.02

DNA isolated from individual plants then pooled, 14 SSRs

were amplified individually then analyzed on a 96 capillar ABI

sequencer with Genemapper software in groups of 4 SSRs

Validation of bulk sampling strategy

• DNAs from bulks/marker combinations with highest (9) and lowest (1*)

numbers of alleles per bulk were analyzed individually

• High number allele bulks were identical over individual samples-no new

alleles were found

• In apparently monoallelic bulks, rare alleles could sometimes remain

unidentified.

• Reyes-Valdés et al. PLoS ONE 8(11): e79936. doi:10.1371/journal.pone.0079936

Marker PHI093/Population PL149

Allele 1 Frequency Allele 2 Frequency Allele 3 Frequency Allele 4 Frequency No. Plants in bulk

Bulk 1 present present

Individual Plants Bulk 1 3 0.15 17 0.85 10

Bulk 2 present

Individual plants Bulk 2 1 0.05 18 0.9 1 0.05 10 *

Bulk 3 present present present

Individual plants Bulk 3 4 0.22 13 0.72 1 0.05 9

Allele Frequency population 0.02 0.13 0.82 0.03

Comparison of genetic distances within and between

accessions

The distance within accessions is significantly lower than the distance between

accessions, suggesting congruence between the genetic data and the morphological

data and a well defined population

Octavio Martínez de la Vega

Langebio, Cinvestav Irapuato

omartine@langebio.cinvestav.mx

Testing the strategy with samples from Puebla

Distributionof samplescollected inPuebla

http://computational.biology.langebio.cinvestav.mx/GenoMaiz/index.html

A B

PA

TE

PL

No strong correlation between geographical and genetic distance at local level

Puebla, Palomero, Teosinte Palomero, Teosinte

Summary of samples analyzed

Puebla 185 accessions

Guanajuato 84 accessions

Tabasco 20 accesions

Tlaxcala 50 accessions

Michoacán 226 accessions

Guerrero 227 accessions

Oaxaca 117 accessions

Palomero 32 accessions

Teosinte 24 accessions

TOTAL NUMBER of ACCESSIONS 965TOTAL NUMBER of BULKS 2895TOTAL NUMBER of SAMPLES 2895014 SSRs

Corina Hayano Kanashiro

José Luis

Pons Hernández

Genotypes associate with geographic

regions on a wider scale

Association with different traits

A. Race B. Kernel color

C. Height above sea level

*

*

Números de solicitudes para sembrar maíz transgénico por año en diferentes estados.

Por lo tanto es importante obtener una evaluación inicial de la diversidad demateriales criollos en estas áreas y continuar el monitoreo en años posteriores.

En el caso que eventualmente se permitan siembras comerciales de maíztransgénica, nuestra metodología será útil para monitorear cualquier cambio en laspoblaciones de maíces criollos que puede indicar su erosión o posible pérdida.

ETAPA 2

Resumen de muestras analizadas

CHIHUAHUA 117

COAHUILA 88

NAYARIT 78

SINALOA 44

SONORA 75

TAMAULIPAS 40

NUEVO LEON 14

DURANGO 40

Número de muestras

TOTAL NUMBER of ACCESSIONS 496TOTAL NUMBER of BULKS 1488TOTAL NUMBER of SAMPLES 1488014 SSRs

Adriana Ceniceros

Análisis global 2 etapas

• Número total de accesiones analizados: 1338

• Número total de plantas individuales:40,140

Razas de maíz/teosinte analizadas

• 47 Razas de maíz: Pepitilla, Tuxpeno, Elotes Occidentales, Conejo, Elotes Conicos, Ancho, Olotillo, Perla, Celaya, Vandeño, Arrocillo, Tepecintle, Tuxpeno Norteno, Zapalote Grande, Raton, Onaveño, Bolita, Chalqueno, Tehuacanero, Maiz Dulce, Mushito, Conico Norteno, Tabloncillo Zamorano, Mil granos, Tablilla de Ocho, Amarillo de montana, Complejo Serrano de Jalisco, Elotero de Sinaloa, Palomero Toluqueno, Reventador, Comiteco, ZapatoleChico, Cacahuacintle, Apachito, Cristalino de Chihuahua, Palomero de Chihuahua, Gordo, Azul, Bofo, Jala, Dulce de Jalisco, Elotero de Sinaloa, Tabloncillo Perla, Dulcillo del Noroeste, Blando de Sonora, Chapalote, Morado Oaxaca

• 3 Razas de Teocintle: Raza Chapala (nuevo) Zea mays-subspecies Mexicana, Raza Mesa central-Zea mays-subspecies Mexicana, Raza Balsas- Zea mays-subspecies Parviglumis

Comparison of numbers and size ranges of alleles

Marker # alleles

(Gethi et al, 2002 )- IN

Allelic range

(Gethi et al, 2002) - IN

# alleles

(Matsuoka et al, 2002) -

LR/IN

Allelic range

(Matsuoka et al, 2002) - LR/IN

# alleles

(Present study) -

LR

Allelic range

alleles (Present

study)- LR

phi015 3 86-104 21/11 76-113/83-104 24 63-140

phi031 NR NR NR NR 24 173-241

phi033 3 236-251 16/12 237-270/224-263 23 224-302

phi034 6 117-144 13/8 123-160/123-148 26 95-166

phi051 4 134-143 13/8 137-154/139-148 11 127-152

phi053 3 169-194 9 169-212 30 127-210

phi064 5 78-98 20/14 75-121/75-110 41 65-151

phi072 3 134-155 19/9 134-163/143-163 27 121-170

phi093 NR NR 19/12 272-296/284-294 20 249-303

phi109188 3 164-170 17/10 148-180/148-171 22 112-182

phi127 3 112-126 10/7 105-128/112-128 20 93-154

phi427913 3 122-131 9/9 117-135/117-207 21 104-164

phi96100 3 278-296 18/11 219-301/235-300 24 226-305

phi96342 2 241-250 20/10 223-256/233-250 20 205-259

IN: Inbred Line, LR: landrace. NR: Not reported.Número total de alelos:333

Análisis global de diverisdad6

810

12

14

16

18

20

Accession origin by color:

CH CL DG GR GT MC NL NT PA PL SL SR TB TE TL TS

Evaluación de robustez de “cluster”

68

1012

1416

1820

Accession origin by color:

CH CL DG GR GT MC NL NT PA PL SL SR TB TE TL TS

Martnez O and Reyes-Valdes MH (2018) Evaluation of presumed cluster structure bysegregation of distances (internal report 1 of the project \cluster evaluation", september 6). Technical report, Computational Biology Lab., Langebio, Cinvestav.

Análisis de clusters no bien definidos8

10

12

14

16

Dendrogram of NL and DG accessions

NL

DG

TE

MC

CH

CL

TS

SR

SL

NL−

DG

NT

TB

TL

GT

PL

GR

PA

15

16

17

18

19

Cluster Dendrogram

810

12

14

16

18 Dendrogram of NL−DG and NT accessions

NL−DG

NT

Selección de clusters bien definidos6

810

12

14

16

18

20

Accession origin by color:

CH CL DG GR GT MC NL NT PA PL SL SR TB TE TL TS

Análisis de clusters bien definidos6

810

12

14

16

Dendrogram of GT and PL accessions

GT

PL

81

012

14

16

18

20

Dendrogram of MC and TE accessions

MC

TE

Distribución finalT

E

MC

CH

CL

TS

SR

SL

NL−

DG

NT

TB

TL

GT

PL

GR

PA

15

16

17

18

19

Cluster Dendrogram

CentroNorte

Éxito de la estrategia1) The use of 3 bulks per accession combined with 14 SSRs was adequate to

genotype the germplasm in a simple efficient and relatively cost effective manner.

2) Population structure and genotype phenotype associations were congruent.

3) Claramente se distinguen las muestras del Centro y Norte y además se observa que las muestras de Michoacán son muy distintas de las otras accesiones-posiblemente debido a hibridación con teocintle.

4) Estos datos de manera muy general muestran que en términos de conservación el estado de Michoacán debe ser una región de prioridad

5) En cambio los genotipos de Nayarit y Nuevo León no se pueden distinguir basado en localidad y las muestras de Durango también son cercanamente relacionadas, sugieriendo que para la conservación de genotipos de estas entidades se podría tomar en conjunto.

DIAGNÓSTICO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE RAZAS

Y VARIEDADES DE MAÍZ NATIVO PARA LA TOMA DE

DECISIONES Y LA EVALUACIÓN DE PROGRAMAS DE

CONSERVACIÓN

No hay muchos antecedentes de metodología para definir criterios en poblaciones criollos

Identification of rare maize genotypes based on a novel algorithm

• Rare or unusual genotypes could be produced by the presence of very rare alleles, by novel combinations of alleles or by both of these factors together.

• Since the primary aim of the present work was to identify rare maize germplasm and provide a basis for criteria to determine priorities for conservation in situ of maize landraces, a “coefficient of rareness” (RA) and new algorithm (AMA) were developed in order to select a small set of in situ accessions that will include all marker allele combinations present in the complete collection.

• A secondary function of the algorithm is to prioritize rare combinations over the most common combinations.

Hayano-Kanashiro C, Martnez de la Vega O, Reyes-Valdes MH, Pons-Hernandez JL, Hernandez-Godinez F, Alfaro-Laguna E, Herrera-Ayala JL, Vega-Sanchez MC, Carrera-Valtierra JA, and Simpson J (2017) An ssr-based approach incorporating a novel algorithm for identication of rare maizegenotypes facilitates criteria for landrace conservation in mexico. Ecology and evolution, 7, 1680-1690.

Figure 4

A B

Identification/distribution of rare germplasm

Tabla 4. Lista de accesiones “raras” encontradas en el estado de Puebla.

IDLan Loc Tipo Color Alt

PL014 AcatlandeOsorio Oloton Blanco 1196

PL021 Atlixco Conico Blanco 2325

PL038 TeteladeOcampo Conico Amarillo

PL039 Tlachichuca Conico Amarillo 2626

PL046 Aljojuca Conico Rojo 2481

PL048 Chignahuapan Elote-Conico Negro 2400

PL059 Tlachichuca Elote-Conico Azul 2630

PL070 SanJeronimoXayacatlan Elote-Conico Azul 1287

PL078 Chila Pepitilla Blanco 1670

PL093 Axutla Olotillo Blanco 861

PL094 Xicotepec Tuxpeno Blanco-Ahumado 177

PL100 Tehuitzingo Vandeno Blanco 1056

PL102 Chignahuapan Chalqueno Blanco 2560

PL107 SanNicolasBuenosAires Chalqueno Blanco 2412

PL108 Soltepec Chalqueno Cremoso 2464

PL112 Tepatlaxco Bolita Rojo 2390

PL131 Tochimilco Arroceno Blanco 1988

PL135 Altepaxi Tehucanero Azul 1314

PL139 AlbinoZertuche Cristalino-Ocho Blanco 1295

PL150 SanNicolasBuenosAires Ochenteno Blanco

PL153 Ahuehuetitla Blanco Blanco

PL169 Pantepec Mezcla Blanco 202

PL180 San Nicolas Buenos Aires Arrocillo Blanco-cremoso 2401

PL181 San Nicolas Buenos Aires Arrocillo Blanco-cremoso 2387

Figura 6. Mapa de la distribución de los materiales con perfiles genéticos menos

comunes.

Determinación de colección mínima

• Hayano-Kanashiro et al., 2017 presentó el análisis AMA para el estado de Puebla-identificando 40 accesiones (16.7%) del total que fueron necesarios para cubrir todos los alelos (diversidad) en la muestra (278 combinaciones alelo/marcador).

• Para la muestra completa de 1315 accesiones (sin teosintes) AMA identificó 58 (4.4%) del número total de accesiones para cubrir la diversidad-solamente 16 accesiones adicionales.

• Si incluimos muestras de teosinte en la colección, el número de accesiones necesarias para cubrir la diversidad de alelos es 56.

• Este análisis es la base de un criterio que indica que las 58 accesiones identificadas deben tener prioridad para apoyar su conservación in situ y en bancos de germoplasma.

Colección mínimaC

L08

8T

S0

22

TS

035

CH

124

CH

01

0C

H0

15

CH

00

7C

H0

69

TE

004

TE

03

9T

E06

3T

E0

05

TE

01

7M

C1

21

MC

11

3M

C0

70

MC

05

9M

C1

03

MC

112

MC

08

0M

C0

83

MC

16

9M

C2

24

MC

38

5M

C3

10

MC

37

8M

C0

28

MC

11

8M

C14

0G

R1

60

GR

191

GR

166

GR

170

GR

29

8G

R0

50

GR

51

8G

R5

21

PL

131

PL

135

PA

007

PA

02

2P

A0

47 PA

03

1PA

02

7PA

03

5P

L09

9G

T0

70

PL

04

7T

L0

19

PL

10

7P

L01

5P

L07

5P

L1

02

TL

032

TL0

42

TL0

44

10

12

14

16

18

20

TE PA MC GR PL CH TL TS CL GTTopología muy distinta al la colección generalSolamente accesiones de 10 de los 16 estados representados en el análisis fueron identificados Por el algoritmo AMA - Durango, Nuevo León, Nayarit, Sonora, Tabasco y Sinaloa no presentaron genotipos “raros”.

Detección de transgenes

• Incluimos 2 marcadore para transgenes en el

análisis: Promotor 35S y 3´NOS.

• Cultivares MON810, NK603 y MON863

fueron controles positivos

• Inicialemente se analizaron las mezclas y

algunas muestras seleccionadas fueron

analizadas a nivel individual para confirmar

la presencia de transgenes.

Detección de transgenes en muestras

de mezclas de la región centro

ESTADO 35S

(MUESTRAS

POSITIVAS)

% NOS(MUESTRAS

POSITIVAS)

% COMUNES35y

NOS(MUESTRAS

POSITIVAS)

% NRO.TOTALDEMUESTRAS

(3mezclaspor

accesión)

PUEBLA 61 10.99 50 9.01 10 1.8 555

GUANAJUATO 29 11.51 14 5.55 2 0.79 252

TABASCO 5 8.33 0 0 0 0 60

TLAXCALA 5 3.33 1 0.67 0 0 150

TEOCINTLE 4 5.56 0 0 0 0 72

PALOMERO 2 2.08 2 2.08 0 0 96

MICHOACAN 27 3.98 14 2.07 0 0 678

GUERRERO 46 6.75 10 1.47 3 0.44 681

OAXACA 4 1.14 11 3.13 0 0 351

Confirmación en plantas individuales

Tabla 6. Resumen de números de plantas individuales con marcadores de

transgenes por accesión (30 plantas/ accesión).

Accesión Número de Plantas

positivos para 35S Número de Plantas

positivos para NOS Número de Plantas

positivos para 35S y

NOS

GT011 5 0 0

GT061 3 1 1

PL053 1 0 0

MC027 1 1 0

MC083 4 0 0

MC265 1 0 0

Distribución de muestras con transgenes

Detección de transgenes en muestras de mezclas de la región norte

Confirmación en plantas individuales

1

2

3

35S

Figura 6. Alineación de las secuencias obtenidas de las amplificaciones del 35S de 1) Guanajuato, 2) Sinaloa y 3) vector pCambia.

Secuenciación de fragmentos tambiénconfirma identidad de transgene

Nos

35S

35/Nos

Distribución de muestras con transgenes

Comparison región Centro/Norte

Región P35 NOS Ambos

Centro 1-12% 0-9% 0-2%

Norte 10-60% 0-36% 0-11%

Claramente presencia de transgenes mas alto en la región norte

Variedades criollos mantienen su fenotipo

Muestras región centro Muestras región norte

B73 y B73 x Mo17

Conclusiones

• Se detectaron transgenes en análisis de mezclas en todos los estados probados

• Los niveles de presencia de transgenes son diferentes en la región norte y en la región centro.

• No hay evidencia que material transgénco desplaza a criollos-fenotipos no cambien drasticamente.

• Regiones asociados con pruebas de campo de transgenes no muestran altos índices de presencia de transgenes

• Probablemente diseminación de transgenes es asociadocon migración y en la región fronteriza es más comun y más facil la introducción de material transgénico aunqueno sea de manera consciente

CONCLUSIONES GENERALES1) La estrategia de emplear mezclas de muestras para cada accesión con 14 SSR´s

distribuídos a través del genoma de maíz fue muy adecuada para determinar los perfiles genéticos de los materiales de manera sencilla, eficiente y relativamente bajo en costo.

2) El índice Ri desarrollado a través del proyecto por el Dr. Octavio Martínez de la Vega es una herramienta de mucha utilidad para identificar materiales geneticamente raras, los cuales son candidatos importantes para entrar en programas de conservación. Será aplicable a otros cultivos y dado el interés actual en el manejo y conservación de germplasma vegetal a nivel mundial tendra aplicaciones .

3) El uso del índice Ri en conjunto con los datos de GPS y la información morfológica mas amplia de las colectas permite identificar precisamente las accesiones de mayor interés para dar seguimiento en programas de conservación.

4) Será posible basado en la estrategia empleada diseñar una metodología para el monitoreo de la presencia y dispersión de materiales geneticamente diversos en términos de tipos y combinaciones de alelos.

Gracias!

Dr. Efraín de la Cruz (Germplasm Tabasco)Dr. José Luis Herrera and the “maize master plan” (Germplasm Tlaxcala, Puebla)Dr. Alfredo Carrera Valtierra (Germplasm Michoacán)Dr. Noel Gómez Montiel (Germplasm Guerrero)

Dr. Amalio Santacruz-Varela: Access to data

Beatriz Jiménez, Guillermo Corona and the Genomics team at Langebio for support and use of their “obsolete” sequencer.

CONACyT/CIBIOGEM: Financial support

The SSR team!

Emigdia AlfaroFernando HernándezLucrecia ContrerasAlejandra NúñezJesica OchoaLorena OrduñaBrenda GuerreroMónica RamosSilvestre TorresMaría de Jesús GonzálezDra. Adriana Ceniceros Dra. Corina HayanoDr. Octavio MartínezDr. José Luis PonsDr. Humberto Reyes

Gracias!

INIFAP

Moisés García Holguín Froylán Rincón Sánchez,

Francisco Zamora Cancino Morales Esparza Anastacio

Juan Apolinar Aguilar Castillo

Víctor Vidal M. José Ron Parra

J. Arahón Hernández Guzmán Pedro Sánchez Peña, Iván de Jesús Sánchez

S. Manuel de Jesús Guerrero Herrera,

Alejandro Ortega Corona Pablo Medina Santiago

Manuel Raymundo Garza Castillo Juan Manuel Hernández Casillas

Centro Internacional de Mejoramiento Maiz y Trigo

Bautista R., Neftali Del Foro Stodelly, Rogelio

Programa Interamericano de Maiz Herrera Serrano, Alfredo

Antiguo Instituto de Investigaciones Agricolas GG Collector 7, ALJ

Hernandez Xolocotzin, Efrain Dra. Oralia Antuna Grijalva

ETAPA 2